题目：Adult sox1 0+ Cardiomyocytes Contribute to Myocardial Regeneration in the Zebrafish

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31644901/

期刊：Cell Reports

研究亮点

· 成年sox10来源的心肌细胞有助于斑马鱼心脏再生

· SOX10来源的心肌细胞具有高增殖指数

· SOX10来源的心肌细胞具有独特的基因表达谱

· sox10衍生细胞的基因消融损害心脏再生

摘要

在斑马鱼心脏再生过程中，纤维化组织会被由原有心肌细胞新生形成的心肌细胞所替代。目前尚不清楚心脏是否由多个心肌细胞群组成，这些细胞群具有不同的心肌丢失替代能力。本研究利用sox10遗传命运图谱技术，在成年斑马鱼心脏中鉴定出一类原有心肌细胞亚群，该亚群具有独特的基因表达谱，且在冷冻损伤后发生扩增。对sox10+心肌细胞进行遗传消融会损害心脏再生能力，这表明这类细胞在心脏再生过程中发挥着重要作用。

图形摘要

引言

人心肌细胞（CM）的更新能力极低，急性心肌梗死后，数百万心肌细胞会不可逆地丢失，并被纤维化瘢痕替代（Prabhu 和 Frangogiannis，2016）。成年哺乳动物心肌细胞的增殖能力很差，且尚未证实成体干细胞库能有效参与心肌组织的替代修复（Lerman 等，2016）。相比之下，斑马鱼在心脏损伤后具有极强的再生能力（Gonza´lez-Rosa 等，2017；Kikuchi，2014）。谱系追踪研究表明，预先存在的心肌细胞是新生心肌的来源（Jopling 等，2010；Kikuchi 等，2010）。损伤发生后，损伤部位附近的心肌细胞会丧失肌节结构，并呈现出更不成熟的表型。与这一结构变化相伴的是，研究发现这些心肌细胞会表达发育相关基因，这提示其分化表型会逆转至更接近胚胎样的状态（Lepilina 等，2006）。事实上，在心脏发育过程中发挥关键作用的 gata4、hand2 和 tbx5a 基因（Garrity 等，2002；Grajevskaja 等，2018；Kuo 等，1997；Molkentin 等，1997；Srivastava 等，1997）是心脏再生所必需的（Grajevskaja 等，2018；Gupta 等，2013；Schindler 等，2014）。此外，参与损伤后心脏再生会激活Gata4和Ctgfa增强子元件（Gupta等人，2013；Kikuchi等人，2010；Pfefferli & Jazwinska，2017）。尽管参与心脏再生的心肌细胞会上调一组特定基因，但目前尚不清楚能否通过未损伤心脏中心肌细胞亚群的表达谱来区分参与再生的心肌细胞亚群。

与哺乳动物一样，斑马鱼心肌细胞来源于第一和第二心野祖细胞（de Pater 等人，2009；Mosimann 等人，2015；Zhou 等人，2011）。然而，在斑马鱼中，神经嵴是第三个为发育中心脏贡献细胞的祖细胞群。细胞移植和荧光染料示踪实验表明，心脏神经嵴细胞不仅像哺乳动物和鸟类一样整合到流出道区域，还整合到心房和心室中（Li 等人，2003；Sato & Yost，2003）。此外，以 sox10 作为神经嵴细胞标记物的遗传谱系示踪研究显示，sox10 阳性细胞对斑马鱼心脏具有细胞贡献（Cavanaugh 等人，2015；Mongera 等人，2013），且表明 sox10 衍生的心肌细胞对心脏的正常发育至关重要（Abdul-Wajid 等人，2018）。值得注意的是，目前仍不清楚 sox10 阳性神经嵴细胞群是否分化为心肌细胞，或者 sox10 阳性心肌细胞亚群是否与心脏发育相关。

本研究在稳态和再生过程中利用sox10:CreERT2命运图谱分析，评估了sox10来源细胞对成年斑马鱼心脏的贡献。研究发现，胚胎期sox10来源细胞构成了成年心脏的重要部分。我们还鉴定出成年sox10阳性心肌细胞，这类细胞在损伤后的增殖程度高于其他心肌细胞，并对心脏再生起到了显著的促进作用。其转录组与心脏内其他心肌细胞存在差异，且对这类细胞的基因敲除会削弱心室冷冻损伤后的恢复能力。

结果

表达sox10的细胞参与再生心肌的形成

Sox10来源的细胞被认为对成年斑马鱼心脏有贡献（AbdulWajid 等人，2018）。由于一种非诱导型本研究使用了sox10:Cre品系，但目前尚不清楚胚胎期的sox10阳性细胞还是成体sox10阳性细胞对成年斑马鱼心脏有贡献。为明确参与成年心脏形成的sox10来源细胞的来源，我们使用了Tg(sox10:CreER ^{T 2})品系（Mongera等人，2013），该品系中CreER由4.9kb的sox10启动子驱动（Carney等人，2006）。将该品系与Tg(ubb:loxP-GFP-loxP-mCherry)品系（Mosimann等人，2011）杂交，该杂交品系后续命名为ubb:Switch（图1A）。在双转基因动物中，4-羟基他莫昔芬（4-OHT）处理会使重组时表达sox10:CreERT2的细胞持续表达mCherry（图1A）。对成年sox10:CreERT2;ubb:Switch斑马鱼进行重组后，心房、心室和瓣膜中的少量心肌细胞被激活表达mCherry（图1B-1G）。我们既观察到了sox10来源的心肌细胞（mCherry+/MHC+）（图1B0-1C000、1D'-1D"和1 F'-1 F^{prime prime prime prime}），也观察到了非心肌细胞（仅表达mCherry）（图1B00），后者主要分布在瓣膜中。由此可见，成年心脏中存在极少量由sox10启动子元件激活的心肌细胞。

接下来，我们希望评估 sox10 来源的细胞是否对心脏再生有贡献。在心室冷冻损伤后不久进行 4-羟基他莫昔芬（4-OHT）处理时（图1H），我们观察到 sox10 来源的细胞发生了扩增（图1I–1O）。免疫染色结果证实，sox10 来源的细胞是心肌细胞（CMs），因为它们共表达心肌标志物肌球蛋白重链（MHC）（图1J0–J000 和 1M0–M00）。为了评估再生过程中 sox10 来源心肌细胞的贡献，我们检测了整个心脏中 sox10 来源心肌细胞（mCherry+/MHC+）与其他心肌细胞（MHC+）的比例（图1O）。当对比冷冻损伤心脏与对照心脏中mCherry阳性心室心肌细胞的比例，我们观察到损伤后14天（dpi），mCherry阳性心肌组织的比例增加了100倍（图1O）。我们探究sox10来源的细胞是在损伤心脏中整体扩增，还是对再生心肌有特异性贡献。为此，我们绘制了sox10来源的心肌细胞从损伤部位（损伤心脏；图1P）或心尖心肌（未损伤心脏；图1Q）到基底心肌的距离分布图谱。sox10来源的心肌细胞对损伤区域的贡献度随距离靠近而升高（图1P；n=6）。而在未损伤的心脏中未检测到这种向心尖区域的偏好性分布（图1Q；n=6）

通过Tg(-4.9sox10:GFP) ^{ba2 }品系（Carney等人，2006；图S1A），证实了成年sox1 0^{+}心肌细胞的存在。我们在受伤和未受伤心脏的心室中均能检测到少量sox10:GFP阳性心肌细胞（图S1B–S1E，00 n=4品系心脏）。此外，RNAScope mRNA检测结果显示，sox10在心脏中存在表达（图S1F–S1I，00）。在未受伤心脏中，我们在心房（3个心脏中有2个）和心室（3个心脏中有1个）中均检测到了其表达。在受伤心脏中，sox10信号出现在皮质和小梁心肌边界附近，以及损伤区域的边缘（3个心脏中有n=3个心脏出现该信号）。这表明损伤后sox10 mRNA表达会升高，或者sox10细胞会在损伤部位聚集。令人意外的是，心脏损伤后我们并未检测到sox10:GFP阳性细胞的扩增（图S1A–S1E，00 n=4品系心脏）。报告基因品系中sox10 mRNA检测结果与sox10:GFP表达之间的不一致性可能是报告基因部分沉默导致内源性sox10表达未能完全重现，这是其结果之一。或者，这可能表明再生心脏中sox10来源的细胞源自未受伤心脏中一小部分sox10+祖细胞，这些祖细胞在细胞扩增和心肌细胞分化后会关闭sox10的表达。

图1. sox10来源的心肌细胞对心脏再生的贡献。(A) 成年斑马鱼心脏中 sox10 衍生细胞的分析。在心脏提取前 1 至 3 周内，对成年 sox10:CreERT2;ubb:loxP-GFP-loxP-mCherry 斑马鱼施用两次 4-OHT 脉冲，以在 sox10:CreERT2 表达细胞中诱导 mCherry。 mCherry（红色），sox10 血统。抗 MHC 标记未受伤心脏 (B–G) 或 14 dpi 心脏 (I–N) 中的 CM（绿色）。 (B–C”) 最后一次 4-OHT 脉冲后 19 天固定未受伤心脏的冷冻切片。上排，mCherry 通道，下排，合并通道。箭头，mCherry+ CM；箭头，房室瓣内的 mCherry+ 非 CM。(D–G) 4-OHT 治疗 11 天后固定的未受伤心脏的整体视图 (D) 和切片 (F 和 G)。 (D 和 E) 整体免疫染色。最大投影 352 μm，44 个 z 平面。 (D′–D″′) D 中盒装区域的缩放视图的最大投影（7 μm，7 z 平面）。 （F 和 G）未受伤心脏冷冻切片的免疫染色。 (F′–F″″) (F) 中方框区域的放大视图。图像被拼接为高分辨率采集（9 个图像拼接在一起）。在心室的心外膜下区域观察到 sox10 衍生的 CM 和非 CM。皮质心肌中的 mCherry+ 细胞（白色箭头），mCherry+ 小梁 CM（黄色箭头）。 (H) 再生心脏中 sox10 衍生细胞的分析。损伤后 1 天和 3 天，对成人 sox10:CreERT;ubb:loxP-GFP-loxP-mCherry 施用两次 4-OHT 脉冲，以诱导 sox10:CreERT2 表达细胞中的 mCherry 表达。在 14 dpi 时提取心脏。(I 和 J) 受伤心脏的整体视图，分辨率为 14 dpi（594 μm，73 z 平面）。显示的是合并的 (I) 和红色 (J) 通道。 sox10 衍生的 CM 可以在心脏的心尖区域观察到。 (J′–J″′) (J) 中方框区域的放大视图。 （K 和 L）I 中心脏的 z 叠加（252 μm，31 z 平面），显示受伤区域。 (K) 中所示的图像由四个拼接的高分辨率采集组成。显示的是合并的 (K) 和红色 (L) 通道。黄色箭头，mCherry+； MHC+ 小梁 CM。白色箭头，mCherry+； MHC+ 皮质 CM。 (M 和 N) 受伤心脏的石蜡切片（14 dpi）。注意 IA 周围 sox10 衍生的 CM 的分布（黄色箭头）。显示的是合并通道 (M) 和红色通道 (N)。 (M) 中方框区域的放大视图如 (M') 和 (M″) 所示。注意与 IA 相邻的皮质（白色箭头）和小梁（黄色箭头）sox10 衍生的 CM。(O) 14 dpi 时，未受伤 (n = 6) 和受伤心脏 (n = 6) 中 mCherry+/MHC+ 细胞相对于所有 MHC+ 细胞的体积百分比。损伤后，sox10 衍生的 CM 体积会扩大。数据为平均值±标准差； p = 0.0022（双尾非参数 t 检验）。 (P) 从损伤部位开始，以 100 μm 的增量对来自整体染色心脏的心室进行数字切片。显示的是不同心脏节段内 mCherry+/MHC+ 细胞相对于所有 MHC+ 细胞的体积百分比。 mCherry+/MHC+ 细胞的百分比在损伤部位附近较高，并向更远的心室区域减少（受伤的心脏，n = 6）。数据为平均值±标准差； *p<0.05； **p < 0.001（单向方差分析测试，然后是 Tukey 事后测试）。(Q) 从心尖开始以 100 μm 的增量对心室进行数字切片。显示的是不同心脏节段内 mCherry+/MHC+ 细胞相对于所有 MHC+ 细胞的体积百分比。 mCherry+/MHC+ 细胞的百分比在未受伤心室的心室区域中分布类似（未受伤心脏 n = 6）。数据为平均值±标准差； p > 0.05（单向方差分析，随后进行 Tukey 事后检验）。 4-OHT、4-羟基他莫昔芬；在，中庭； CI，冷冻损伤； CM，心肌细胞； dpi，受伤后天数； DPT，治疗后天数； IA，受伤部位；五、心室。比例尺，100 μm。另请参见图 S1。

预先存在的Sox10衍生心肌细胞参与心脏再生

为了评估sox10衍生心肌细胞数量增加是否是少量预先存在的sox10+细胞扩增的结果，我们在冷冻损伤前对成年斑马鱼进行了重组诱导（图2及图S1J-S1T）。心脏损伤前2周进行4-OHT处理，使我们能够排除未代谢的4-OHT在损伤后仍具有活性并诱导重组的可能性（图2A）。对照组中，我们再次仅观察到少量细胞分散分布于心室，而在损伤后7天，我们确实观察到sox10衍生的心肌细胞靠近损伤区域（图2B-2C'）。与未损伤心脏相比，损伤后7天有更多的sox10衍生细胞参与心室的构成（图2D）。损伤区域附近的sox10衍生心肌细胞占比高于心室基底区域（图2E）。同胞斑马鱼的未损伤心脏中，并未出现sox10衍生心肌细胞向心尖区域的这种优先分布（图2E）。损伤后，小梁心肌和皮质心肌区域的sox10衍生心肌细胞比例均显著增加（图S1S）。

我们还分析了再生后期sox10来源细胞的比例，以评估这种扩增是暂时性的，还是这些细胞对再生心脏有贡献（图2F-2J及图S1T）。在14天损伤后（dpi），sox10来源的心肌细胞（CMs）仍停留在损伤区域周围（图2F、2G）。即使在再生完成后的210天损伤后（dpi）（González-Rosa等人，2011），在推测为再生心肌的区域仍检测到了mCherry+/MHC+心肌细胞（图2H、2H'）。与冷冻损伤后追踪sox10来源细胞的观察结果类似，损伤后mCherry阳性细胞的体积相较于未损伤心脏增加了100倍以上（图2I）。定量分析显示，与7天损伤后（dpi）的结果一致，在所有分析的再生阶段，损伤心脏中mCherry+/MHC+心肌体积均显著高于未损伤心脏（图2J及图S1T）。

图2. 预先存在的sox10来源心肌细胞在损伤区域增殖并促进心脏再生。(A) 成年 sox 10:CreER ;ubb:loxP-GFP-loxP-mCherry 斑马鱼在冷冻损伤前的第14天和第12天用4-OHT处理。心脏在损伤后7、14或210天固定，并用抗mCherry+（红色，sox10衍生细胞）和抗MHC（绿色，心肌）进行免疫染色处理。(B) 未损伤心脏的整体标本。上排为mCherry通道；下排为肌球蛋白重链（MHC）与mCherry的合并通道。箭头指示sox10衍生细胞。(C和C0) 损伤后7天受伤心脏的冷冻切片。在损伤区域（IA）附近和心肌的心外膜下区域检测到sox10衍生的心肌细胞。白色箭头指示皮质心肌中mCherry+的心肌细胞，黄色箭头指示小梁心肌中mCherry+的心肌细胞。(D) 损伤后7天未损伤心脏(n=4)和受伤心脏(n=6)中sox10衍生心肌细胞比例的定量分析。每个点代表一颗心脏的数值。数据为平均值±标准差；p=0.0095（双尾非参数t检验）。(E) 损伤后7天未损伤和冷冻切片心脏中心室mCherry+心肌细胞分布的定量分析。在受伤心脏中，从损伤位点开始、未损伤心脏中从心尖开始，将心室数字划分为100毫米的增量。显示的是不同心脏节段中mCherry+/MHC+区域相对于整个MHC+区域的百分比。mCherry+/MHC+的百分比在损伤区域（IA）附近较高，并向远离损伤区域的心室区域降低（受伤心脏n=5；未损伤心脏n=4)）。虚线代表统计学差异，红色柱形代表受伤心脏。受伤心脏心室的每个区域（红色柱形）的mCherry+/MHC+细胞百分比均高于未损伤心脏心室（蓝色柱形）。数据为平均值±标准差；p 0.05（双尾非参数t检验）。(F) 损伤后14天心脏的整体标本图像。sox10衍生的心肌细胞分布在损伤区域周围和心室的远端部分。(G–H0) 损伤后210天再生心脏的整体标本视图（G）和冷冻切片（H和H0）。在心脏的心尖区域可观察到sox10衍生的心肌细胞。白色箭头显示皮质心肌中mCherry+的心肌细胞，黄色箭头显示小梁心肌中mCherry+的心肌细胞。(H)中的图像由九张拼接的高分辨率采集图像组成。(I) 未损伤心室与损伤后14天和210天心室中mCherry+心肌细胞百分比的定量分析（整体标本免疫染色的心脏）。显示了单个心脏的测量值（点）以及平均值±标准差（双尾非参数t检验；未损伤心脏n=8；损伤后14天n=6 ; 210 dpl、n=6）。(J) 整体标本免疫染色心脏中mCherry+心肌细胞分布的定量分析。距离计算如(E)所示。数据为平均值±p<0.05：^{*} p<0.01（双尾非参数t检验；n=6)）。缩写：At，心房；dpi，损伤后天数；IA，损伤区域；MHC，肌球蛋白重链；V，心室。比例尺代表100毫米（C'除外，比例尺代表200毫米）。另见图S1。

为探究 sox10 衍生细胞在损伤区域聚集的机制，我们评估了细胞增殖情况（图3）。在冷冻损伤前2周诱导重组，并在损伤后6天（dpi）注射溴脱氧尿苷（BrdU）（图3A）。对标记 sox10 谱系的 mCherry、心肌标志物 MHC 以及增殖细胞标志物 BrdU 进行免疫染色，结果显示存在 mCherry+/BrdU+ 双阳性细胞（图3B-3G）。定量分析显示，与 sox10 谱系阴性心肌细胞相比，增殖的 sox10 衍生心肌细胞数量显著增加了30%（图3H）。在再生的后期阶段，我们也观察到 BrdU+/mCherry+ 细胞的比例高于其他心肌细胞（图3I-3K）。因此，在未损伤心脏中具有活性 sox10 启动子元件的心肌细胞，在损伤刺激下，其分裂速率高于同一解剖区域内的其他心肌细胞。

图3. sox10衍生心肌细胞的增殖(A) Sox10 衍生心肌细胞增殖指数评估。在损伤前14天和12天给予两次4-羟基他莫昔芬（4-OHT）。在损伤后6天（dpi）加入5-溴脱氧尿苷（BrdU），并于损伤后7天收集心脏。(B–E) 心脏切片经抗BrdU抗体（白色）、抗mCherry抗体（红色，Sox10 谱系）和肌球蛋白重链（MHC，绿色）免疫染色。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）复染。展示了多通道合并图像(B)，以及MHC(C)、mCherry(D)和BrdU(E)染色的单通道图像。(F-G ^{N+1}) 为(B)中框选区域的放大视图。黄色箭头指示mCherry⁺、BrdU⁺、MHC⁺ 三阳性细胞。展示了多通道合并图像(F和G)，以及DAPI(F0和G0)、BrdU((F"和G00)、MHC((F'和G ^{prime prime r})和mCherry((F**和G'N'N)染色的单通道图像。(H) 100微米损伤区域（IA）边界区内mCherry⁺、BrdU⁺、MHC⁺ 三阳性细胞相对于所有BrdU⁺、MHC⁺ 双阳性细胞的定量分析。展示了单个心脏的数值以及平均值±标准差（SD）。p 0.05（双尾非参数t检验）；n=6 (I) 再生晚期增殖情况评估。在冷冻损伤前12天和14天向Sox10:CreERT2;ubb:loxP-GFP-loxP-mCherry斑马鱼施加4-OHT。在损伤后6天和29天加入BrdU，并于损伤后30天收集心脏。(J) 损伤后30天心脏的免疫荧光染色。MHC为绿色；mCherry为红色；BrdU为白色；细胞核用DAPI（蓝色）复染。展示了合并图像和单通道图像，虚线框标出放大区域。(K) 损伤后30天BrdU⁺ 心肌细胞的定量分析。数据为平均值±= 0.029；双尾非参数t检验。心房（At）、损伤后天数（dpi）、损伤区域（IA）、肌球蛋白重链（MHC）、心室（V）。比例尺为100微米。

参与再生的sox10衍生细胞的来源

接下来，我们旨在确定这种具有心脏再生能力的sox10阳性心肌细胞亚群出现的发育时间点，并阐明其可能的神经嵴细胞起源。我们在受精后12至48小时内用4-羟基他莫昔芬（4-OHT）处理sox10:CreERT2;ubb:Switch胚胎，这是神经嵴细胞向发育中心脏迁移的时间窗口（Abdul-Wajid等人，2018；Cavanaugh等人，2015；Mongera等人，2013）。我们在一项纵向研究中对单个sox10:CreER;ubb:Switch动物进行了追踪（图S2A）。首先，我们在受精后5天（dpf）进行了活体成像。该品系还包含一个心肌报告基因盒，即由肌球蛋白轻链7（myl7）启动子元件驱动绿色荧光蛋白（GFP）在心肌细胞中表达，这对标记心肌细胞十分有用。我们在幼鱼心脏中检测到了mCherry+/myl7:GFP+阳性细胞，表明存在一部分源自sox10表达细胞的心肌细胞亚群（图S2B、S2C；n=7）。正如sox10:Cre遗传示踪研究的报道（Abdul-Wajid等人，2018），使用sox10:CreER品系，小梁心肌中sox10衍生细胞的比例高于致密心肌，而此阶段的致密心肌仅由原始层构成（Gupta和Poss，2012；图S2D）。活体成像后，幼鱼被单独饲养至成年，以追踪mCherry阳性细胞的命运。在成鱼体内，我们再次检测到了mCherry阳性细胞簇，这表明胚胎期sox10衍生细胞参与了成鱼心脏的构成（图S2E、S2F；n=7），并证实了使用非诱导型sox10:Cre品系的观察结果（Abdul-Wajid等人，2018）。胚胎期sox10衍生细胞占成鱼心室总体积的5%（图S2G）。事实上，免疫荧光染色和荧光激活细胞分选（FAC）证实，大多数mCherry阳性细胞同时也表达myl7:GFP（MHC+），因此属于心肌细胞（图S2H-S2L）。我们在大多数被分析的个体中，均在心室和心房中观察到了mCherry阳性细胞。mCherry信号在心室基部和内侧部分尤为明显，推测是这些区域细胞密度更高所致（图S2M；共分析了n=19个心脏样本）。

为确定胚胎 sox10 衍生细胞群是否会在损伤后扩增，我们对胚胎发育过程中发生重组的成年 sox10:CreER ;ubb:Switch 斑马鱼心室进行冷冻损伤，并比较了损伤和未损伤心脏中 mCherry+ 细胞的比例（图 4A）。在未损伤心脏（图 4B-4E；n=12）和损伤后 14 天（dpi）的心脏（图 4F-4J、n=9；以及图 4K、n=5）中，均检测到相似比例的 mCherry+ 细胞。尽管在损伤区域内观察到 mCherry+ 信号数量有升高的趋势，但该增加未达到显著水平，这最终归因于损伤反应的高度异质性。同样，在未损伤心脏中，未发现顶-基区域存在 mCherry+ 细胞的优先贡献（图 4 n=5）。这些结果表明，在成体心脏中，源自 sox10+ 胚胎细胞的心肌细胞（CMs）不会在损伤后扩增，也不优先参与心肌再生。

图4. 胚胎期sox10来源的心肌细胞在冷冻损伤后不发生增殖。(A) 在胚胎发生阶段（受精后12–48小时）对sox10:CreER ubb:loxP-GFP-loxP-mCherry斑马鱼施用4-OHT，收集未受伤的成鱼心脏或损伤后14天（dpi）的心脏并进行成像。(B–I) 免疫染色心脏共聚焦z-stack的最大强度投影。sox10来源的细胞为mCherry阳性（红色）。整个心肌为MHC阳性（绿色）。心室（箭头）和心房（箭头）中存在mCherry阳性细胞。展示了合并通道视图（C、E、G、I）以及仅mCherry（红色）通道视图（B、D、F、H）。(J) 未受伤的(n=12)和损伤后14天(n=9) dpi的心脏中，胚胎sox10来源的心肌细胞（mCherry+/MHC+）相对于所有心肌细胞（MHC*）的相对体积（n=9）。展示了单个心脏的数值以及平均值±标准差；采用双尾非参数t检验（p=0.0955）。(K和L) 全 mounts免疫染色心脏中mCherry阳性心肌细胞分布的定量分析。从损伤部位或心尖开始，以100微米为增量对心室进行数字切片。展示了不同心脏节段中mCherry+/MHC+细胞相对于所有MHC+细胞的相对体积。各节段的细胞数量无差异（单因素方差分析）。损伤后14天使用n=5个心脏（K），未受伤状态使用n=5个心脏（L）。心房、心室和损伤区域用虚线勾勒。4-OHT，4-羟基他莫昔芬；At，心房；dpi，损伤后天数；IA，损伤区域；CI，冷冻损伤；CMs，心肌细胞；V，心室。比例尺，100微米。另见图S2。

为进一步精准表征 sox10 来源的细胞，我们在幼体中进行了 4-羟基他莫昔芬（4-OHT）重组实验。我们选用了 9 周龄的 sox10 CreER ;ubb:Switch 品系，以及 sox10: CreER ^{T2cn17 } 与 vmhcl:loxP-tagBFP-loxP-mCherry-NTR 品系杂交的个体。(vmBRN)，这一细胞系可通过 mCherry 表达特异性示踪表达 vmhcl 的重组心室心肌细胞（Sa´nchez-Iranzo 等人，2018）。重组后，实验动物17周龄时受冻损伤（图5A）。我们观察到损伤后 sox10 衍生细胞面积增加（图 5B-5S）。这在观察整体心脏时最为明显（图 5D 和 5M）。sox10 来源的心肌细胞主要分布在心室的心外膜下区域（图5H-5J和5Q-5S）。心室 mCherry 信号的定量分析显示未损伤组与损伤组之间存在差异，但未达到统计学显著性（图5T）。此外，对切片心脏的定量分析未观察到 mCherry+ 细胞的整体扩增（图5U）。然而，我们发现，与未损伤心脏相比，不同顶基区域内 mCherry+ 细胞的比例明显增加（图5V）。与在成体中获得的结果类似，mCherry+ 细胞在损伤部位附近积累，表明sox10+细胞群在幼鱼心脏中已存在。重要的是，在未添加4-OHT的对照实验中未发生重组，且幼鱼和成鱼的心脏均完全无mCherry表达（图5W-5Y）。因此，借助sox10:CreER ^{T 2}，我们能完全控制重组事件，从而精准追踪添加4-OHT时sox10:CreER T2活性表达细胞的命运。

综合来看，这些结果表明 sox10:CreER 命运图谱技术能够检测到存在的一部分心肌细胞在斑马鱼中，成年心脏会在损伤后扩张，且优先对心肌再生起到促进作用。

图5. 幼年sox10阳性细胞的命运图谱分析及无渗漏sox10:CreERT2活性的证据（A）在幼鱼阶段（受精后9周）向sox10:CreERT2；vmhcl:loxP-tagBFP-loxP-mCherry-NTR（sox10:CreERT2；vmBRN）斑马鱼施用4-羟基他莫昔芬，收集并成像未受伤的成年心脏或伤后7天的心脏。（B–D）对解剖后的未受伤心脏进行体视荧光显微镜拍摄，显示sox10来源的心肌细胞呈红色（mCherry+），其他心室心肌细胞呈蓝色（vmhcl:BFP+）。展示了合并通道（B）、蓝色通道（C）和红色通道（D）。（E–J）未受伤心脏的冰冻切片。展示了合并图像（E）以及单一绿色通道（MHC+细胞；F）和红色通道（mCherry+细胞；G）。（H–J）为（E）中框选区域的放大视图。同样展示了合并图像（H）以及单一绿色通道（I）和红色通道（J）。在心肌的心外膜下区域检测到了sox10来源的心肌细胞（mCherry+）。（K–M）对解剖后的受伤心脏进行体视荧光显微镜拍摄，显示sox10来源的细胞呈红色（mCherry+），心室心肌细胞呈蓝色（vmhcl:BFP+）。展示了合并通道（K）、蓝色通道（L）和红色通道（M）。（N–S）伤后7天受伤心脏的冰冻切片。在心外膜下区域以及受伤区域附近检测到了sox10来源的心肌细胞。展示了合并图像（N）以及单一绿色通道（MHC+细胞；O）和红色通道（mCherry+细胞；P）。（Q–S）为（N）中框选区域的放大视图。展示了MHC和mCherry信号的合并图像及单通道图像。同样展示了合并图像（Q）以及单一绿色通道（R）和红色通道（S）。

Sox10 衍生的心肌细胞揭示特定基因特征

为探究 sox10 来源的心肌细胞与其他心肌细胞在基因表达谱上是否存在差异，我们开展了转录组分析（图6A和图6B）。为使特征分析针对心肌组织，我们使用了sox10:CreER：vmBRN品系，在4-羟基他莫昔芬（4-OHT）诱导的重组作用下，sox10来源的心肌细胞表达mCherry，其余心室心肌细胞表达蓝色荧光蛋白（BFP）。在损伤前2周和心脏解剖前3周，我们给予了两次4-OHT处理。从未损伤的sox10 '0:CreER ^{T 2} cn17;vmBRN心脏以及损伤后7天（7 dpi）的心脏中，通过荧光激活细胞分选（FAC sorting）分离出mCherry+ BFP+细胞和双阳性mCherry+/BFP+心肌细胞，并对其进行RNA测序（RNA-seq）。生物信息学分析中，我们将mCherry+样本（包含所有mCherry+或mCherry+/BFP+的样本）与mCherry样本（仅包含BFP+的样本）进行了对比。

在未受伤的心脏中，与其余心室心肌细胞（mCherry⁻）相比，sox10 衍生的（mCherry⁺）心肌细胞中有 101 个基因上调、129 个基因下调（图 6A 和 6B；表 S1）。对未受伤心脏中 mCherry⁺和 mCherry⁻心肌细胞的转录组谱进行基因富集分析，发现这两组细胞之间存在多种代谢差异，包括氧化磷酸化和核酸代谢的变化（图6C、图6D及图S3；表S1）。

值得注意的是，损伤后对比mCherry阳性和mCherry阴性组时，sox10来源的细胞转录活性更高；mCherry阳性心肌细胞中有415个基因上调，而mCherry阴性心肌细胞中仅有30个基因上调（图6B；表S2）。重要的是，在损伤后7天的mCherry阳性心肌细胞中，sox10信使RNA显著上调，这表明sox10:CreER品系可用于追踪内源性表达sox10的细胞。编码T盒转录因子tbx20和tbx5a的基因是sox10来源心肌细胞中上调的基因之一（图6B；表S2）。此前研究表明，这些基因在参与心脏再生的心肌细胞群中表达（桑切斯-伊兰佐等人，2018），并在这一过程中发挥积极作用（格拉耶夫斯卡娅等人，2018；向等人，2016）。

针对 mCherry+ 细胞在损伤状态下的基因富集分析而 mCherry 标记的心肌细胞（mCherryCMs）分析显示，在 mCherry 阳性心肌细胞中，与细胞周期负调控相关的基因本体（GO）生物学过程受到抑制。这表明 mCherry 阳性心肌细胞具有促再生特性（图6E-6G及补充图S3；补充表S2）。此外，mCherry 阳性心肌细胞还富集了参与心肌生长的相关通路，包括心肌细胞分化、心肌细胞发育和心肌收缩（图6E-6G；补充表S2）。这一结果与 sox10 衍生的心肌细胞在重建受损心肌组织中所起的作用相符。

图6. sox10来源的心肌细胞揭示特定的转录组特征 用4-羟基他莫昔芬（4-OHT）处理sox10:CreERT2;vmhcl:loxP-tagBFP-loxP-mCherryNTR斑马鱼。一组斑马鱼接受冷冻损伤，并在损伤后7天（7 dpi）收集；未损伤对照组则保持未损伤状态。分离心脏，通过荧光激活细胞分选（FAC）分离sox10来源的心肌细胞（mCherry+）和心脏中其余的心肌细胞（mCherry-），并对26个样本（每个样本含20个心肌细胞）进行转录组测序（RNA-seq）。（A和B）重组与样本收集分别在未损伤心脏（A）或损伤后7天的心脏（B）上进行。（A）火山图展示未损伤心脏（A）或损伤后7天心脏（B）中mCherry+与mCherry-心肌细胞的差异表达基因（DEGs）。在mCherry-心肌细胞中上调的差异表达基因以蓝色标注，这些基因的校正后p值<0.05且对数2倍变化>1；错误发现率<0.05的基因以灰色表示。可见损伤后7天mCherry+细胞中存在大量上调的差异表达基因。部分此前与再生相关的差异表达基因以及sox10基因已被重点标注。（C）红色标注的是mCherry+心肌细胞中上调的差异表达基因所显著富集的生物学过程（分析来源及差异表达基因列表见材料与方法）。（D）对未损伤心脏中mCherry+与mCherry-心肌细胞共有的基因进行基因集富集分析（GSEA）的通路分析，根据标准化富集分数绘制代表性生物学过程并排序。Z分数表示特定功能的上调或下调情况。红色条代表在mCherry+心肌细胞中富集，蓝色条代表在其余心肌细胞中富集。（E）损伤心脏中mCherry+与mCherry-心肌细胞之间差异富集的生物学过程（分析来源及差异表达基因列表见材料与方法）。（F和G）对损伤心脏中mCherry+与mCherry-心肌细胞共有的基因进行基因集富集分析（GSEA）的通路分析（F）及特征分析（G）。根据标准化富集分数绘制代表性生物学过程并排序。Z分数表示特定功能的上调或下调情况。红色条代表在mCherry+心肌细胞中富集，蓝色条代表在其余心肌细胞中富集。 4-OHT：4-羟基他莫昔芬；CI：冷冻损伤；dpi：损伤后天数；dpt：处理后天数；GO：基因本体论。另见图S3-S5及表S1、S2、S3、S4。

我们接下来分析了mCherry+细胞是否与其他心肌细胞（CMs）一样对损伤做出同等反应。为此，我们一方面比较了损伤心脏与未损伤心脏中mCherry+心肌细胞的基因表达变化（图S4），另一方面对比了两种条件下mCherry-心肌细胞的基因表达变化（图S5）。损伤发生后，mCherry+细胞上调了767个基因，仅有26个基因被下调（图S4C；表S3）。因此，总体而言，mCherry+心肌细胞通过增加基因表达来对损伤做出反应。冷冻损伤后，与细胞增殖、细胞运动性及损伤应答相关的生物学过程在mCherry+心肌细胞中显著富集（图S4D；表S3）。 Ingenuity通路分析（IPA）进一步证实，损伤心脏的mCherry+心肌细胞中存在与增殖相关的经典通路富集（图S4E；表S3）。

当我们分析其余心肌细胞（mCherry）在损伤后的基因表达变化时，观察到的差异表达基因（DEGs）数量少于mCherry+细胞检测到的数量（图S5；表S4）。这表明，与其余心肌细胞相比，sox10来源的细胞在更大程度上重新激活了基因表达。

综合来看，这些数据表明，sox10启动子的表达在成年未受伤斑马鱼心脏中定义了一组心肌细胞，这类细胞具有独特的基因表达特征，且在损伤后呈现出促再生的转录组谱。

sox10+ 细胞对于心脏再生是必需的

Sox10来源细胞在再生心肌中的大量积累强烈表明，这些细胞参与了受损心肌的替代过程。为了确定这群细胞在心脏再生过程中的功能，我们利用转基因品系sox10: CreER ^{T 2} : β -actin:loxP-mCherry-loxP-DTA（Wang等人，2011年）对Sox10来源细胞进行基因消融，该品系可在白喉毒素（DTA）过表达时实现细胞消融。我们在冷冻损伤前3天和1天对成年个体施用4-羟基他莫昔芬（4-OHT）（图S6A）。在损伤后21天（dpi），Sox10来源细胞缺失的动物的损伤区域大于对照组（图S6B-S6D；10^{+}为未施用4-OHT组，n=8为施用4-OHT组），这表明Sox10来源细胞是心脏再生所必需的。Sox10细胞消融的动物的存活率和心功能未出现显著下降（图S6E-S6I；n=6）。在发育过程中，Sox10来源细胞参与外周神经系统的形成，而外周神经系统在心脏再生中发挥重要作用（Mahmoud等人，2015年,White等人，2015）。因此，sox10基因敲除细胞动物的再生受损可能是心脏神经支配受损的结果。然而，有研究表明，转基因品系中使用的β-肌动蛋白启动子在心肌细胞（CMs）中表达强烈，但在其他心脏细胞中表达微弱（Kikuchi等人，2010）。尽管如此，我们通过抗酪氨酸羟化酶免疫染色，评估了基于诱导白喉毒素A（iDTA）的sox10+细胞消融对神经支配可能产生的变化。该实验未发现与对照组相比，sox10+细胞消融的心脏神经支配减少的证据（图S6J–S6N），这表明sox10衍生心肌细胞的消融是该表型的成因。

为验证这一推测，我们利用 sox10:CreERT2 cn17;vmBRN 斑马鱼在心室心肌细胞中对 sox10 衍生细胞进行了基因消融处理（图7A）。借助这一双转基因品系，在加入甲硝唑（Mtz）后，心室中 sox10 阳性衍生的心肌细胞可被基因消融——甲硝唑会在表达硝基还原酶（NTR）的细胞中诱导细胞死亡（Curado 等人，2008；图7A）。 我们在冷冻损伤前1周消融了 mCherry 阳性细胞，并通过与未用甲硝唑处理的动物对比 mCherry 阳性细胞的数量，验证了消融效率（图7B和7C；处理组 n=26，未处理组 n=20）。未处理的成年斑马鱼与经处理的成年斑马鱼在 sox10 衍生心肌细胞的数量上存在显著差异（图7D），这证实了消融的有效性。与使用 DTA 消融模型得到的结果一致，不同组的存活率相近（图7E）。 为探究成年斑马鱼心室中 sox10 衍生心肌细胞的缺失是否会影响冷冻损伤后的心脏再生，我们在损伤后30天（dpi）收集心脏，并评估了纤维化组织的沉积情况（图7F-7H）。与对照组（未使用甲硝唑的 cn17;vmBRN 斑马鱼、使用甲硝唑的 cn17;ubb:loxP-mCherry 斑马鱼）相比，心室 sox10 衍生心肌细胞被消融的斑马鱼表现出持续性的纤维化瘢痕，且损伤面积更大（图7F-7I）。 这一结果表明，在未受损伤的成年斑马鱼心脏中，消融占心肌总体积不足1%的少量 sox10 衍生心室心肌细胞，会影响冷冻损伤后心脏的后续再生。

图7. Sox10阳性心肌细胞的基因敲除损害心脏再生。(A) 对 sox10:CreERT2;vmBRN 或 sox10:CreERT2;ubb:Switch 斑马鱼在冷冻损伤前14天和12天用4-OHT处理，在损伤前10天和7天用甲硝唑（Mtz）处理。对照组10:CreER;vmBRN 未用甲硝唑处理。在损伤后30天（dpi）收集冷冻损伤的心脏。(B和C) 经4-OHT处理且(B)有或(C)无甲硝唑处理的 sox10:CreERT2;vmBRN 心脏，在损伤后30天，通过共聚焦显微镜z-stack三维投影的整体视图。(D) 红色荧光蛋白（mCherry）阳性心肌细胞（CMs）占所有心肌细胞的体积百分比：mCherry阳性;肌球蛋白重链 (MHC) 与所有 MHC+ 细胞对比（双尾非参数t检验）。(E) 如(A)所述不同组动物的存活率。费希尔精确检验 (p=1.000) 显示各组间死亡率无差异。(F–H) 损伤后30天冷冻损伤心脏矢状切片的AFOG组织学染色。(F) 经4-OHT和甲硝唑处理的 0:CreER;vmBRN 心脏切片。(G) 经4-OHT处理的 sox10:CreERT2;vmBRN 心脏切片。(H) 经4-OHT和甲硝唑处理的 10:CreER;ubb:Switch 心脏切片。(I) (F-H)所示三种条件下损伤面积（IA）的定量分析。测量损伤面积与心室心肌总面积的比值。图中显示单个心脏的数值以及平均值±标准差（非参数t检验统计分析：sox10:CreERT2;vmBRN 甲硝唑处理组 vs 10:CreER;VmBRN 甲硝唑未处理组，p=0.0078：SoX 10:CreER;VmBRN 甲硝唑处理组 vs sox10: CreER;ubb:Switch 甲硝唑处理组，p=0.0072 sox10:CreER;vmBRN 甲硝唑未处理组 vs sox10: CreER ^{T2 };ubb:Switch 甲硝唑处理组，p=0.1020）。4-OHT：4-羟基他莫昔芬；At：心房；CI：冷冻损伤；dpi：损伤后天数；IA：损伤面积；Mtz：甲硝唑；V：心室。比例尺：(B和C)为100微米，(F–H)为200微米。另见图S6。

讨论

成年斑马鱼的心肌细胞可以增殖（威尔斯等人，2008），而这可能是其具备强大再生能力的基础在受损心脏中被观察到。尽管对于有助于再生的心肌细胞（CM）群体知之甚少，但研究表明，这些细胞会响应损伤激活gata4和ctgfa调控元件（Kikuchi等人，2010；Pfefferli与Jazwinska，2017）。近期利用全心肌谱系追踪技术进行的克隆分析研究表明，在斑马鱼和小鼠中，不同的心肌细胞亚群也可参与心脏再生（Gupta等人，2013；Sereti等人，2018）。本研究通过已存在的心肌细胞的特定启动子元件进行遗传命运图谱分析，这些心肌细胞存在于成年心脏中，且在响应损伤时的增殖幅度超过其他心肌细胞。研究表明，这一由sox10衍生的小群心肌细胞对再生至关重要，因为在冷冻损伤前对其进行基因消融会损害心脏再生。

遗憾的是，从技术层面无法对数量同样少的随机心肌细胞（CM）群体进行消融实验。因此，我们无法充分评估再生相关的影响是否仅由 sox10 衍生的心肌细胞群体消融所导致。

成年斑马鱼色素细胞再生过程中，成年神经嵴干细胞被认为是祖细胞的来源（Iyengar 等人，2015）。此外，在啮齿动物中，神经嵴干细胞被认为参与心肌梗死后的修复机制（Tamura 等人，2016）。sox 10+ 细胞群的神经嵴细胞起源有助于心脏再生，这一推测具有合理性，但需通过使用额外神经嵴标志物的遗传命运图谱进行验证基因。或者，斑马鱼心脏可能含有一小群sox10心肌细胞，这些细胞在冷冻损伤后能高效增殖。探究这种增殖是否也发生在其他损伤模型（如心室切除或基因消融）中将是一件有趣的事。成年sox10+心肌细胞在未损伤心脏和损伤状态下均呈现独特的基因特征。有趣的是，在最近发表的斑马鱼胚胎单细胞转录组研究中（Wagner等人，2018年），也在心肌细胞中检测到了sox10转录本，这进一步支持了我们关于斑马鱼心脏中存在sox10阳性心肌细胞群的发现。此外，本研究还报道了sox10在sox10来源的心肌细胞中的表达，证实我们的驱动系能够模拟内源基因的表达。与心室其他细胞相比，sox10来源的心肌细胞中富集的生物学通路心肌与发育过程、代谢及细胞增殖相关。这种基因特征可能是它们对再生心肌贡献增强的关键。Sox10 衍生细胞在损伤反应中上调的基因数量多于其他心室心肌细胞，这可能表明它们在表观遗传上受到的抑制更少，因此对损伤反应更敏感，且更易参与心脏再生过程。

活性的sox10启动子可能代表心肌细胞的一种特定状态。或者，拥有活性sox10启动子的心肌细胞可能是斑马鱼心脏中具有高再生能力的一类独特心肌细胞群。探究心脏中sox10阳性细胞是该物种特有还是在哺乳动物中也存在，或许有助于我们揭示再生能力的基础。

方法详情

Tg(sox10:CreERT2)cn17 的构建

为了从 Tg(sox10:CreERT2,myl7:GFP)t007 品系（Mongera 等人，2013 年）中剔除 myl7:GFP 报告基因，我们将靶向绿色荧光蛋白（GFP）的向导 RNA sgRNA eGFP1（序列为 GGCGAGGGCGATGCCACCTA，Auer 等人，2014 年）与 Cas9 蛋白共同显微注射到单细胞期胚胎中，随后培育出心脏不表达绿色荧光蛋白的子代个体。 通过将 F0 代与 ubi:Switch 品系杂交，并通过 4-羟基他莫昔芬（4-OHT）处理诱导重组，评估生殖系传递效率。该品系被用于图 5、图 6 和图 7 所示的实验。

4-羟基他莫昔芬给药

4-羟基他莫昔芬（4-OHT；Sigma H7904）在指定时间给药，处理均持续进行过夜。给药前，将10毫摩尔储备液（溶于99.8%乙醇中）在65摄氏度下加热10分钟（Felker等人，2016年）。对于Tg(sox10:CreERT2; ubb:Switch)胚胎的遗传标记，在受精后12至48小时以5-10毫摩尔浓度给予4-OHT。对于成鱼的谱系示踪研究，以10毫摩尔浓度给予4-OHT并持续过夜。

冷冻损伤及损伤区域分析

按照之前描述的方法进行冷冻损伤（Gonza´ lez-Rosa 和 Mercader, 2012）。用 0.032% 三卡因（Sigma，美国密苏里州圣路易斯市）麻醉成鱼，用显微解剖剪打开心包腔以暴露心脏。将在液氮中冷却的铜丝置于心脏心室表面，直至解冻。手术后，用塑料巴斯德滴管轻轻向鱼鳃处冲水，使鱼恢复活力。

为分析再生情况，实验动物在损伤后不同时间通过浸入0.16%三卡因（Sigma公司，美国密苏里州圣路易斯市）实施安乐死，随后在含有2单位/毫升肝素和0.1摩尔/升氯化钾的培养基中解剖心脏。对于图1F和图1G所示的石蜡切片损伤面积定量分析，使用颜色反卷积工具和颜色阈值工具（ImageJ软件）对mu m^{2}中的损伤心肌和未损伤心肌进行分割与测量。

甲硝唑给药

使用甲硝唑（Mtz；Sigma，货号M3761）进行基因消融时，将甲硝唑以10毫摩尔每升的浓度稀释在含0.2%二甲基亚砜（DMSO）的养鱼水中，并处理过夜。

BrdU 给药

实验动物分别在感染后第6天（dpi）或感染后第7天和第29天，腹腔注射30毫升浓度为2.5毫克/毫升的5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU，货号B5002-1G，Sigma公司）。分别在感染后第7天和第30天收集心脏并进行后续分析。为计算增殖指数，按下述方法使用抗BrdU、抗RFP和抗MHC抗体对冷冻切片进行免疫染色。每颗心脏至少选取3个心室切片进行成像。使用ImageJ软件手动计数MHC阳性/mCherry阳性/BrdU阳性心肌细胞（CMs），并与MHC阳性/mCherry阴性/BrdU阳性心肌细胞进行对比统计。

组织学染色

心脏在4℃下于磷酸盐缓冲盐水（PBS）配制的2%或4%多聚甲醛（PFA）中固定过夜。随后将样本用PBS洗涤，经梯度酒精脱水，二甲苯处理后用石蜡包埋。所有组织学染色均在切片机（Leica和Reichert-Jung）上切取的7微米石蜡切片上进行，将切片贴于Superfrost载玻片（Fisher Scientific）上，于37℃干燥过夜。切片经二甲苯脱蜡、复水后用蒸馏水洗涤。使用酸性品红橙G染色法（AFOG）对结缔组织进行染色（González-Rosa等人，2014）。利用ImageJ软件对未受伤和受伤心脏的冷冻损伤面积进行定量分析。

超声心动图心脏成像

心脏组织切片经脱蜡、复水后，用蒸馏水洗涤。通过在柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中于微波炉全功率下煮沸20分钟进行抗原表位修复。切片用0.5%的Triton X-100透化15分钟。将切片置于封闭液（5%牛血清白蛋白、5%山羊血清、0.1%吐温-20）中孵育1小时，封闭非特异性结合位点。使用亲和素-生物素封闭试剂盒（Vector公司，美国加利福尼亚州伯灵格姆市）封闭内源性生物素。进行酪酰胺信号放大时，将切片置于3% H_{2} O_{2} -磷酸盐缓冲液中封闭20分钟。将切片与以下一抗在4℃下孵育过夜：抗肌球蛋白重链（MF20，发育研究混合杂交库，稀释比例1:20）、抗原肌球蛋白（CH1，发育研究混合杂交库，稀释比例1:20）、抗红色荧光蛋白（Abcam公司，稀释比例1:150）、抗5-溴-2'-脱氧尿苷（BD PharMingen公司，稀释比例1:100）、抗mCherry（16D47，赛默飞世尔科技公司，稀释比例1:150）、抗酪氨酸羟化酶（Sigma公司，稀释比例1:150）、生物素化抗兔抗体（赛默飞世尔科技公司，稀释比例1:150）、辣根过氧化物酶（DAKO公司，稀释比例1:250）。将切片在室温下孵育1小时后，使用链霉亲和素或Alexa（488、568、633）标记的二抗（赛默飞Invitrogen公司，每种稀释比例1:250）以及链霉亲和素-Cy3（Molecular Probes公司，货号SA1010）检测抗体信号。进行酪酰胺信号放大（默克公司，TSA Plus 花青3系统，货号NEL744001KT）时，Cy3结合反应持续4分钟。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI，默克公司，稀释比例1:1000）染色，切片使用DAKO荧光封片液（DAKO公司）封片。利用ImageJ软件对图像进行分析和处理。

冷冻切片按上述方法制备，仅作以下修改：心脏切片在37℃的磷酸盐缓冲液（PBS）中孵育30分钟以去除明胶。随后在室温下用磷酸盐缓冲液（PBS）再洗涤两次，之后的免疫荧光实验步骤与石蜡切片的步骤相同。

全 mounts 心脏成像与图像处理

将心脏与封闭液（5%牛血清白蛋白、5%胎牛血清、0.1%吐温-20）孵育两天，随后在4℃振荡条件下与一抗孵育三天。用0.1%吐温-20磷酸盐缓冲液（PBS-Tw）洗涤心脏三次，每次1小时。在4℃振荡条件下进行二抗和三抗孵育，时长为两天。再次用0.1%吐温-20磷酸盐缓冲液洗涤心脏三次，每次1小时。之后，将心脏置于2%多聚甲醛（PFA）中固定过夜。采用CUBIC试剂（Susaki等人，2015年）进行组织透明处理：将心脏在37℃下于CUBIC试剂1中孵育三天，用0.1%吐温-20磷酸盐缓冲液洗涤三次，每次20分钟；进行全 mounts免疫荧光染色后，将样本在室温下于CUBIC试剂2中继续孵育三天。将心脏固定在玻璃底培养皿（MatTek公司）上，用于共聚焦成像。通过蔡司LSM 780、蔡司LSM 880和徕卡TCS SP8共聚焦显微镜，搭配10倍干燥物镜、20倍干燥物镜和40倍水浸物镜获取全心脏图像。图像以512×512、1024×1024和2048×2048的分辨率采集，对每颗心脏进行拼图扫描（Tile scan）和Z轴堆叠（z stack）成像。使用Imaris 8.2软件（BITPLANE公司）评估mCherry+/MHC+心肌细胞在全部MHC+心肌细胞中的占比。通过距离转换算法（Imaris 8.2软件）分析mCherry+/MHC+心肌细胞与损伤区域或心尖区域的距离。图S2E和S2F中展示的成年斑马鱼心脏为表达胚胎期sox10来源心肌细胞的样本。将.lsm原始数据文件通过Imaris 8.2软件（BITPLANE公司）转换为.ims格式（Imaris文件后缀）。将Imaris图像保存为TIFF格式，其视野范围大于原始文件，与图中展示的图像一致。

幼虫活体成像

将双转基因幼虫 Tg(sox10:CreERT2;ubb:Switch) 转移至含有 0.2 毫克/毫升三卡因和 0.0033% 对苯二酚（PTU）的 E3 培养基中，使用 0.7% 琼脂糖（伯乐低熔点琼脂糖，货号 161-3111）将其固定在玻底微孔培养皿（MatTek 公司）中。使用徕卡 SP5 共聚焦显微镜，搭配 20 倍甘油物镜，以双向采集模式扫描斑马鱼心脏。小心将幼虫从琼脂糖包埋中取出，与卡斯珀鱼一同置于鱼缸中培养至成体。收集成年斑马鱼心脏，用 2% 多聚甲醛（PFA）固定过夜，再使用蔡司 LSM 700 共聚焦显微镜，搭配 20 倍干物镜进行扫描。利用 Imaris 8.2 软件完成三维重建与分析。

RNAscope 2.5HD 检测试剂（红色）-免疫荧光法

所有样本均在10%中性福尔马林缓冲液（NFB）中于室温（RT）固定24小时。固定后，样本在1×磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤3次，每次10分钟。随后采用标准乙醇梯度进行脱水处理（每次10分钟），接着用二甲苯洗涤2次（每次5分钟），并完成组织包埋操作。

使用切片机（Microm）将石蜡块切成每片6微米的厚度，将切片收集于带有SuperFrost载玻片的水浴中，随后将载玻片置于干燥箱中60℃烘烤1小时。之后，将载玻片置于二甲苯中孵育2次、每次5分钟进行脱蜡，再置于100%乙醇中2次、每次2分钟处理，接着放入干燥箱中60℃干燥5分钟。随后，用过氧化氢（ACD#322381）在室温下通透处理10分钟，再用蒸馏水洗涤2次、每次1分钟。

在100摄氏度下进行了15分钟的靶标 retrieval（ACD，货号#322000）处理。随后，玻片在蒸馏水中洗涤15秒，再在100%乙醇中洗涤3分钟，并于60摄氏度下干燥5分钟。之后，使用PAP笔（Vector，货号#H-4000）为每个切片制作疏水屏障。完成后，将玻片与蛋白酶Plus（ACD，货号#322381）在40摄氏度下孵育5分钟，再用蒸馏水洗涤两次。

为该实验设计了两种探针（Dr-Sox10 探针和阴性对照探针-DapB）。杂交过程为：将切片与探针在 40 摄氏度下孵育 2 小时，随后在洗涤缓冲液（ACD，货号 310091）中洗涤 2 次，每次 2 分钟。

最后，使用 RNAscope 2.5 HD 红色检测试剂（ACD，货号322360）进行信号检测，步骤如下：在40℃下与AMP1孵育30分钟；在40℃下用洗涤缓冲液AMP2洗涤15分钟、洗涤缓冲液AMP3洗涤30分钟、洗涤缓冲液AMP4洗涤15分钟、洗涤缓冲液AMP5洗涤30分钟、洗涤缓冲液AMP6洗涤15分钟，在室温下用红色工作液洗涤10分钟，最后用蒸馏水洗涤两次，每次5分钟。

斑马鱼心脏解离、心肌细胞分选及RNA-Seq文库构建

在最后一次4-羟基他莫昔芬（4-OHT）处理后12天或损伤后7天（dpi），分别收集未损伤和损伤的重组成年斑马鱼sox10:CreERT2;vmhcl:loxP-tagBFP-loxP-mCherry-NTR心脏，并按照先前的方案进行处理（Sánchez-Iranzo等人，2018；Tessadori等人，2012）。去除心房和动脉球，仅保留心室。共使用15个未损伤心脏和18个损伤心脏，为未损伤心脏建立5个混合样本（每个含3个心脏），为损伤心脏建立6个混合样本（每个同样含3个心脏）。从每个混合样本中通过荧光激活细胞分选（FACS）分离出20个心肌细胞（CMs）。

使用 Synergy 4L 细胞分选仪在 0.2 毫升管的裂解缓冲液中对 mCherry+、mCherry;BFP+ 和 BFP- 心肌细胞进行分选，随后立即在 -80℃ 下冷冻。按照先前的方案（Picelli 等人，2014 年）执行 Smart-Seq2 文库制备。使用 Agilent 生物分析仪检测文库制备的质量。通过 Qubit 荧光计（赛默飞世尔科技）测定文库浓度。最终文库浓度为 10 纳摩尔。使用 Illumina NextSeq 500 对文库进行测序。

生物信息学分析

使用 bcl2fastq2（v2.20.0.422 – 因美纳公司）将 BCL 文件转换为 FastQ 文件。使用 2.1.0 版本的 Hisat2（Kim 等人，2015）将读段比对至参考基因组（Ensembl 版本 11，第 94 版），并使用 1.6.0 版本的 featureCounts（Liao 等人，2014）进行计数。通过 0.11.5 版本的 FastQC（Andrews，2010）和 2.6.4 版本的 RseQC（Wang 等人，2012）对多项质量控制指标进行检测与分析。44 个测序样本中有 18 个因未通过质量控制而被剔除。生物信息学分析中，我们将 mCherry+（mCherry+、mCherry+BFP+）样本池与 mCherry-（BFP+）样本池进行对比，该对比针对从未受伤和 7 天感染期（dpi）的心脏组织中提取的样本展开。后续分析在 3.5.1 版本的 R 语言（R 核心团队，2018）中进行。

对计数进行了标准化处理，并使用 DESeq2 软件包 v.1.20.00 测试设计组之间的差异表达，未进行对数2倍变化收缩（该工具最新版本的默认 betaPrior 选项）。主成分分析（PCA）图、火山图和热图均使用 ggplot2 软件包（3.0.0 版；H. Wickham 著，《ggplot2：数据分析的优雅图形》，纽约：施普林格出版社，2016 年）生成。

研究人员基于DESeq2的分析结果开展了进一步分析。在富集分析环节，研究人员选取了所有基因稳定标识符，并将其转换为小家鼠基因稳定标识符，随后借助biomaRt包获取了对应的ENTREZ标识符与基因符号（Durinck等人，2005年）。完成基因转换后，研究人员利用clusterProfiler包（Yu等人，2012年）对通过FDR <0.05筛选的差异表达基因进行了基因本体论（GO）过代表分析（ORA），从而筛选出排名靠前的差异表达基因（Ashburner等人，2000年）。

随后，我们通过基因集富集分析（GSEA）对整体基因表达进行了更深入的分析。将DESeq2得到的差异基因表达结果按Log2倍变化值（Log2FoldChange）进行排序。我们利用京都基因与基因组百科全书（KEGG）（Kanehisa和Goto，2000）以及分子特征数据库（MsigDB）（Liberzon等人，2015）的特征集（Hallmarks collection）来挖掘生物学意义。在GSEA分析中，分别使用clusterProfiler和FGSEA软件包（Sergushichev，2016）结合KEGG和MsigDB特征集基因集进行分析。对于数据呈现，仅将经校正后P值为1e-6的结果视为显著。使用Ingenuity通路分析核心分析（IPA，QIAGEN公司，https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuitypathway-analysis）来识别未损伤和损伤状态下与我们差异表达基因相关的经典通路、功能和疾病。

定量与统计分析

使用GraphPad进行统计分析。所有图表中均展示均值，误差棒代表标准差。具体使用的检验方法、样本量的精确数值、样本量的含义说明、集中趋势、离散程度和精密度指标的定义均在各图注或正文中的引用处标注。通过正态性检验确定需采用参数检验还是非参数检验。

数据与代码可获取性

RNA测序数据已存放在基因综合数据库：参考编号为GSE 133571的基因综合数据库。图像原始数据及统计分析结果已上传至Mendeley数据库：https://doi.org/10.17632/5h7z68ck98.2 

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。