题目：Insulin-like growth factor signaling regulates zebrafish lymphatic-vessel development

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41691624/

期刊：Cell Reports

研究亮点

l 舌骨软骨对于下颌面淋巴丛（MFL）的生长是必需的

l IGF信号通路对发育中的颌面部淋巴管（MFL）的迁移是必需的

l IGF信号通路促进斑马鱼和人淋巴管内皮细胞的迁移

摘要

淋巴管内皮细胞（LECs）的协同迁移对于淋巴管网络的形成至关重要。本研究揭示了胰岛素样生长因子（IGF）信号通路在斑马鱼淋巴管发育中的作用。研究证实，面内侧淋巴管（MFL）的形成需要舌弓软骨的参与，并确定妊娠相关血浆蛋白A2（pappa2）可能是介导软骨-淋巴管相互作用的候选因子。Pappa2编码一种分泌型金属蛋白酶，可切割同样在舌弓软骨附近表达的胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs；Igfbp3和Igfbp5b）。IGF的过表达和IGFBP的抑制能促进MFL的生长，而pappa2敲低、Igfbp3/Igfbp5b过表达或IGF1R抑制则会抑制MFL的生长。研究表明，IGF信号在斑马鱼淋巴管发育中具有细胞自主性作用，且诱导多能干细胞（iPSC）来源的人LECs表达IGF1R，并能在IGF2的刺激下迁移。本研究数据凸显了IGF信号通路在淋巴管发育中的重要性。

图形摘要

引言

淋巴系统是一个复杂的血管网络，它介导体液稳态，促进免疫细胞的运输以及膳食脂质的吸收。受损或发育不全的淋巴管会引发淋巴水肿，这是一种病理液体的病理性积聚，而异常淋巴生长是慢性炎症、肿瘤转移的特征，且器官排斥。揭示影响淋巴管发育的信号通路是开发治疗这些疾病的疗法的关键。

斑马鱼幼鱼拥有具有功能的淋巴网络，其结构与哺乳动物的淋巴系统相似，且发育通路也与之共享10-14。斑马鱼胚胎的光学透明度为淋巴管生成的实时体内研究提供了便利12。在躯干部位，淋巴内皮细胞（LECs）在受精后36小时（hpf）从后主静脉（PCV）出芽，并向水平肌隔迁移，于受精后50小时形成副脊淋巴母细胞（PLs）。随后，副脊淋巴母细胞内的淋巴内皮细胞沿节间动脉血管（aISVs）迁移，并在受精后5-6天建立起包括胸导管（TD）在内的躯干淋巴网络。在头部，静脉来源的淋巴内皮细胞在受精后36小时出芽，随后向前迁移，并与非静脉来源的淋巴内皮细胞簇融合填充面部外侧淋巴管（LFL）。耳石淋巴管（OLV）和面部内侧淋巴管（MFL）分别在受精后3天和4天从LFL出芽，于受精后5-6天形成功能性颅面淋巴管网络。

斑马鱼躯干淋巴管通过与邻近的非淋巴结构相互作用形成典型模式。这些组织产生的信号塑造了淋巴管网络。例如，脊索鞘细胞分泌的2a型细胞外基质胶原蛋白、动脉壁细胞分泌的趋化因子配体Cxcl12a/Cxcl12b，以及神经元和成纤维细胞分泌的Vegfc，都是淋巴管内皮细胞非细胞自主性吸引所必需的。相反，3型信号素配体从体节分泌的物质是防止淋巴内皮细胞异常生长脱离主动脉间血管的关键排斥信号。这些研究阐明了调控躯干淋巴系统发育的分子通路；然而，调控斑马鱼颅面淋巴管发育的机制仍不明确。本研究表明，斑马鱼颅面骨骼中的舌骨软骨通过胰岛素样生长因子信号调控中颌面部淋巴管的发育。

与其他脊椎动物类似，斑马鱼颅面软骨的发育涉及颅神经嵴细胞向咽区的迁移，以及随后七个咽弓的模式形成。同源框基因（hox 基因）是一类同源盒基因家族对于颅面软骨的分节发育是必需的。发育为下颌弓的最前咽弓（第一咽弓）不表达hox基因，而形成舌骨弓的第二咽弓则表达hox2基因。颅神经嵴细胞内的hox基因表达谱受上游因子调控；组蛋白乙酰转移酶K（赖氨酸）乙酰转移酶6A（kat6a）和转录因子AP-2α（tfap2a）均是促进第二咽弓前体细胞中hox2表达所必需的，这些基因的突变会破坏舌骨软骨

胰岛素样生长因子1（IGF1）和胰岛素样生长因子2（IGF2）对胚胎发育和出生后生长至关重要。 IGF1和IGF2通过激活胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）促进细胞增殖、迁移和存活。胰岛素样生长因子信号通路由六种胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP1-6）家族调控，这些蛋白可控制胰岛素样生长因子的生物利用度，在某些情况下还能抑制IGF1R的激活。妊娠相关血浆A蛋白（PAPP-A和PAPP-A2）是金属蛋白酶，能够特异性切割胰岛素样生长因子结合蛋白，释放游离的胰岛素样生长因子，并激活胰岛素样生长因子信号通路。缺失人类体内的PAPP-A2功能会降低游离胰岛素样生长因子（IGF）水平并导致生长缺陷。斑马鱼的pappa2作为PAPP-A2的同源物，已被证实对斑马鱼的胰岛素样生长因子结合蛋白3（Igfbp3）、胰岛素样生长因子结合蛋白5b（Igfbp5b）以及它们对应的人类同源物胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）、胰岛素样生长因子结合蛋白5（IGFBP5）具有特异性蛋白水解活性。尽管胰岛素样生长因子（IGF）信号通路已被证实与淋巴管内皮细胞（LECs）的体外迁移及淋巴管的病理性生长相关，但其在淋巴管发育中的作用仍有待研究。发育过程中的作用尚不清楚。

在此，我们证明舌骨软骨对于MFL的发育是必需的。我们鉴定出pappa2是在舌骨中表达的基因，其对于MFL的发育必不可少。过表达斑马鱼igf2b基因、注射人源重组IGF2蛋白以及化学抑制Igfbp均能部分挽救kat6a突变体中的MFL缺陷。相反，过表达Igfbp3/Igfbp5b任一基因或化学抑制Igfr均会抑制MFL的生长。我们的研究数据表明，舌骨软骨是MFL生长的必要条件，并揭示了胰岛素样生长因子（Igf）信号通路在淋巴管发育中的作用。

结果

舌骨软骨对于颌面部淋巴组织的发育至关重要

MFL 不会在血管附近发育，这表明该血管的发育涉及一种新型的引导组织¹⁶。颅面软骨是一个明显的候选对象，因为它在 MFL 发育之前就已形成，且尾侧舌骨软骨的解剖位置与 MFL 相似。为了研究 MFL 与软骨之间的空间关系，研究人员将淋巴和静脉标记转基因系 yvelb:dsRed与软骨标记转基因系进行了杂交sox10:EGFP.43 受精后6天的共聚焦成像显示，颌下淋巴囊与舌骨软骨的尾侧表面紧密贴合，其近端紧邻舌颌软骨，血管的内侧端和远端端分别与舌间软骨及角舌软骨对齐（图1A、图1B，视频S1）。颌下淋巴囊与舌骨软骨之间显著的一致性表明，舌骨软骨对颌下淋巴囊的发育具有影响。

为确定下颌面淋巴丛（MFL）是否沿颅面舌骨软骨发育，我们使用lyve1b:dsRed；sox10:EGFP双转基因品系，通过延时共聚焦显微镜从受精后4.3天（dpf）开始追踪MFL的生长情况（参见视频S2）。MFL最初从侧淋巴丛（LFL）出芽，随后迁移至舌颌软骨、间舌骨软骨和角舌骨软骨的尾侧表面附近（图1C）。当到达角舌骨软骨腹侧表面时，MFL又出芽形成另一个分支。该分支沿角舌骨软骨腹侧面向前延伸（图1C）。我们对4条fli1a:nEGFP；lyve1b:dsRed斑马鱼幼鱼进行了受精后4至5天的延时成像，以观察发育中的MFL内淋巴内皮细胞（LEC）的行为（参见视频S3）。最初，1-2个来自LFL的淋巴内皮细胞向腹侧迁移，形成初始的MFL出芽结构。6-8小时后，这些MFL细胞抵达第一个转折点，并与舌颌软骨平行迁移。8-14小时期间，另一个来自LFL的淋巴内皮细胞加入MFL；14-17小时时，MFL顶端细胞到达第二个转折点，通常在此处进行细胞分裂。分裂产生的子细胞或另一个MFL淋巴内皮细胞随后继续与角舌骨软骨平行迁移。24小时时，MFL通常已迁移至与角舌骨软骨腹侧表面平齐的位置。在1/4的实验中，观察到非顶端细胞中发生一次额外的细胞分裂；因此，24小时时MFL内包含4-5个淋巴内皮细胞。这些数据表明，MFL的初始发育主要由LFL的淋巴内皮细胞迁移驱动，且MFL淋巴内皮细胞沿舌骨软骨的尾侧和腹侧边缘迁移，提示软骨可能对MFL的生长起到调控作用。

为验证这些软骨在颌面部淋巴前体（MFL）发育中的必要性，我们采用硝基还原酶介导的组织消融技术杀伤软骨细胞。我们构建了稳定的双转基因品系lyve1b:dsRed; sox10:EGFP-epNTR，其中sox10启动子驱动软骨细胞内表位硝基还原酶前体（epNTR）的表达。经甲硝唑（MTZ）处理的sox10:EGFP-epNTR组斑马鱼，其间舌骨软骨和角舌骨软骨发生移位，且舌骨软骨内的EGFP阳性软骨细胞出现部分缺失。MTZ处理组的颌面部淋巴前体平均长度为38微米，显著短于二甲基亚砜（DMSO）处理的对照组（104微米）。仅表达lyve1b:dsRed; sox10:EGFP的对照组斑马鱼未出现软骨或淋巴缺陷。软骨消融未影响胸导管（TD）的发育，这表明特异性地干扰了胸鳍褶膜（MFL）的发育。与此一致的是，在受精后3天（3 dpf）对舌骨软骨进行激光消融也抑制了胸鳍褶膜（MFL）的发育（图S1A–S1E）。综合来看，这些数据表明舌骨软骨是胸鳍褶膜（MFL）发育所必需的。

图1. 舌骨软骨对MFL的发育至关重要。（A和B）在lyve1b:dsRed（绿色）和sox10:EGFP（品红色）标记的斑马鱼幼虫中，6天胚胎期（dpf）头部侧面（A）和腹侧（B）的共聚焦图像。中淋巴丛（MFL，黄色箭头）与匙骨间软骨（ih）、舌颌软骨（hs）和角舌骨软骨（ch）对齐。（A‴–B‴）为从（A″–B″）中黄色虚线框区域拍摄的三维图像。（A⁗）为从（A″）中虚线处获取的XZ视图，显示了中淋巴丛在匙骨间软骨附近的排列情况。（C）为对lyve1b:dsRed（绿色）和sox10:EGFP（品红色）标记的斑马鱼幼虫中淋巴丛发育过程进行共聚焦延时成像得到的静态图像，拍摄时间为4.3至5天胚胎期（16.37小时）（视频S2）。黄色箭头指向发育中的中淋巴丛尖端。（D–F）为5天胚胎期斑马鱼头部的共聚焦图像，对比了3.5天胚胎期经二甲基亚砜（DMSO）处理（D）或5毫摩尔浓度甲硝唑（MTZ）处理（E）的lyve1b:dsRed; sox10:EGFP-epNTR幼虫，以及3.5天胚胎期经5毫摩尔浓度甲硝唑（MTZ）处理的对照组lyve1b:dsRed; sox10:EGFP幼虫的软骨（品红色，D–F）和淋巴（绿色，D′–F′）表型。 

kat6a 对胸鳍淋巴前体（MFL）的发育至关重要

为进一步检测舌骨软骨在下颌骨淋巴鳍（MFL）发育中的作用，我们采用遗传方法干扰舌骨的发育。(kat6a ^{b 719}) 突变体缺失 hox2 表达，导致舌骨软骨发生同源转化，呈现下颌弓的身份特征。我们将 (kat6a ^{b 719}) 突变体分别与 lyve1b:dsRed; sox10:EGFP 或 fli1a:nEGFP; lyve1b:dsRed 复合转基因品系杂交，以表征该突变背景下的淋巴和软骨表型。与已报道的表型一致，与野生型（WT）同窝仔鱼相比，(kat6a ^{b 719}) 突变体的舌颌软骨出现部分缺失，间舌软骨和角舌软骨位置异常（图2A-2D）。(kat6a ^{b 719}) 突变体幼鱼在受精后6天（dpf）的下颌骨淋巴鳍（MFL）发育受到严重干扰，其平均MFL长度为6微米，仅含3个MFL-淋巴内皮细胞（LECs）；而野生型同窝仔鱼的MFL长度为109微米，含11个MFL-LECs。相比之下，侧腹淋巴管（OLV）和胸导管（TD）的发育基本未受影响（图2A-2I）。我们对 fli1a:nEGFP; lyve1b:dsRed 幼鱼从受精后4天（dpf）开始进行延时成像对比。平均而言，在最初16-24小时内，野生型幼鱼的MFL尖端细胞以3.2微米/小时的速度迁移（((n=4))），并发生1-2次细胞分裂（((n=3))）；而在(t6a ^{b 719}) 突变体中，6/6的延时实验均未观察到从下唇淋巴鳍（LFL）的迁移，也未从母血管形成MFL出芽（图2J、2K，视频S3、S4）。

(kat6a a^{b 719}) 突变体斑马鱼幼虫在受精后第6天（6 dpf）缺乏鱼鳔，但在其他方面发育正常（图S2A和S2B）。此外，(kat6a ^{b 719}) 突变体幼虫的血管发育基本正常；(kat6a a^{b 719}) kdrl:EGFP; sox10:EGFP 双荧光标记幼虫在受精后第3天（3 dpf），下颌弓动脉（AA1）、鳃盖动脉（ORA）和第一鳃弓动脉（AA3）的形成存在轻微缺陷，但其他所有血管均发育正常（图S2C–S2I）。到3 dpf时，鳃盖动脉（ORA）与下颌弓动脉（AA1）会在舌骨软骨附近形成环状结构，并与腹主动脉（VA）相连。e70bb268-1242-473d-b9e5-8594e83d839a 突变体幼虫的ORA-AA1-VA环状结构尺寸更小（307微米），而野生型同窝幼虫为455微米；且在20只突变体幼虫中有8只，其AA3发育不全，到3 dpf时未能与背侧主动脉相连（图S2C–S2I）。综上，这些数据表明舌骨软骨可能对ORA-AA1-VA血管的发育起到支撑作用。

为进一步测试舌骨软骨在MFL生长中的相关需求，我们向靶向kat6a和tfap2a的吗啉代寡核苷酸（MOs）注射lyve1b:dsRed; sox10:EGFP转基因斑马鱼幼体。与kat6a类似，tfap2a的缺失会降低hox2的表达，导致舌骨软骨特性丧失^{27,28}。kat6a吗啉代寡核苷酸处理的胚胎表现出中度舌骨缺陷，严重程度低于(kat6a ^{b 719})突变体，且抑制了MFL的发育（图S2J–S2R）。tfap2a吗啉代寡核苷酸处理的胚胎则表现出更严重的舌骨软骨缺陷，以及相应的MFL特异性淋巴缺陷（图S2P）。综上，这些数据支持MFL发育需要舌骨软骨这一假说。

为了探究 kat6a 是否在淋巴管内皮细胞（LECs）中以细胞自主性方式调控主淋巴导管（MFL）的生长，我们在 (kat6a a^{b 719}) ; lyve1b:dsRed 供体与 lyve1b:EGFP 野生型（WT）宿主胚胎之间进行了细胞移植（图2L）。将受精后3小时（3 hpf）供体的囊胚细胞移植到年龄匹配的宿主中，随后对其进行PCR基因分型。研究人员通过个体供体区分(kat6a ^{b 719})突变体与野生型同胞。野生型-野生型（44%）和kat6a-野生型（45%）组合中，宿主脉管系统中至少有一个供体细胞嵌合的嵌合胚胎百分比相当，且两种组合在颌下淋巴滤泡（MFL）内的淋巴内皮细胞（LEC）嵌合率也相似（图2M-2P）。综上，这些数据表明kat6a以非细胞自主方式调控颌下淋巴滤泡的发育，其机制很可能与舌骨软骨祖细胞的特化有关。

图2. kat6a 对下颌面部淋巴管（MFL）的发育是非细胞自主性必需的。（A和B）头部侧面的共聚焦图像，对比了野生型同窝幼鱼（A）与(kat6a ^{b719 })（B）品系的lyve1b:dsRed（绿色）sox10:EGFP（品红色）斑马鱼幼鱼在6天胚胎期的软骨和淋巴表型。（A′和B′）放大图像区域为（A）中黄色虚线框标注的部分。黄色箭头头标注出了颌面部淋巴管。（C和D）对应（A）和（B）的腹侧视图。注意到(kat6a ^{b719 })幼虫（B′和D）中舌颌软骨发育不全。（C′和D′）为示意图，展示了（C）和（D）中舌颌软骨及淋巴管（绿色）的表型特征。(E–G) 对6天龄胚胎（dpf）时中鳍韧带（MFL）的长度（E）、卵黄囊静脉（OLV）的长度（F）以及导水管（TD）的形成（G）进行定量分析，对比 (kat6a ^{b 719}(n=24)) 与 ((n=33)) （H和I）在受精后6天对MFL-LECs（H）和OLV-LECs（I）的定量分析，对比了kat6ab719 ((n=22))型野生型同窝仔鱼（((n=23))型）（J 和 K）MFL 迁移速度的量化结果（J）以及从受精后第4天到第5天MFL-LEC的分裂数量（K）。数据取自从受精后第4天开始的16至24小时延时成像实验，对比了野生型（((n=3-4))、(kat6a ^{b 719}) 以及 ((n=6))）(L) 展示细胞移植实验工作流程的示意图（m）血管植入率表。（N和O）侧头6 dpf共聚焦图像显示面部淋巴植入lyve1b：dsRed表达WT（N）或(kat6a ^{b719 })（O）（绿色）供体细胞进入lyve1b：EGFP WT宿主（品红色）。黄色箭头突出MFL。(P) 图表显示至少有一个供体细胞在指定血管中定植的嫁接胚胎比例。野生型到野生型（ (in = 109) (kat6a ^{b719 }) 到野生型（ ((n=40)) 数据表示为平均值±标准差；*** (^{* *} p<0.001) (p<0.05) (rho>0.05) 校正。CCV，总主静脉；DLLV，背侧纵行淋巴管；ISLV，节间淋巴管；LFL，面外侧淋巴管；MFL，面内侧淋巴管；OLV，耳石淋巴管；PCV，后主静脉；TD，胸导管。比例尺：50 微米。

pappa2 在 kat6a 突变体软骨细胞中的表达下调

鉴于MFL的发育需要舌骨软骨和kat6a，我们推断(kat6a ^{b 719})软骨细胞缺乏驱动淋巴管发育的潜力。因此，我们对(kat6a ^{b 719})软骨细胞与野生型（WT）软骨细胞进行了RNA测序（RNA-seq）对比分析，并提出(kat6a ^{b 719})细胞中的淋巴管生长因子应呈下调表达的假设。

为分离软骨细胞，我们使用了sox10:EGFP；col2a1a:mCherry复合转基因品系，该品系中sox10与col2a1a的共表达可通过荧光激活细胞分选术（FACS）实现软骨细胞的分选43,47（图3A）。我们在受精后4天（4 dpf）分离了软骨细胞RNA，此时下颌舌骨肌纤维（MFL）正沿舌骨软骨延伸。为验证分选所得软骨细胞群的纯度，我们通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）比较了组织特异性标志物的表达情况；双阳性细胞表达荧光标记物mCherry以及软骨特异性基因col2a1a，却不表达髓系富集基因溶菌酶（lyz）（图3B）。

对四个生物学重复进行RNA测序分析发现，与野生型软骨细胞相比，(kat6a ^{b 719}) 软骨细胞中存在174个差异表达基因（DEGs），其中53个基因上调、121个基因下调（((p<0.01)) 图3C）。正如预期的那样，我们在(kat6a a^{b 719}) 突变体中观察到颅面发育相关基因的下调，包括hoxb2a和tfap2b。随后，我们参考Ensembl基因注释信息，鉴定出16个编码分泌蛋白的差异表达基因（图3C；表S1）。该分析筛选出一个候选基因pappa2，其在(kat6a ^{b 719}) 软骨细胞中的表达量较野生型下调1.3倍。pappa2编码一种分泌型金属蛋白酶，可通过胰岛素样生长因子（IGF）信号通路发挥调控作用Igfbp3 和 Igfbp5b 的蛋白水解切割。39,50 我们通过qPCR验证了pappa2的下调（图3D）。对sox10:EGFP转基因斑马鱼幼鱼的pappa2和egfp进行全胚原位杂交结果显示，在受精后3天（3 dpf）颌面部淋巴丛（MFL）发育之前，pappa2在表达sox10的舌骨软骨内部及邻近区域表达（图S3A、S3E和S3H），但在躯干中未检测到其表达，这表明其不太可能在淋巴系统发育中发挥广泛作用。在3 dpf、颌面部淋巴丛生长之前，igfbp3和igfbp5b也在舌骨软骨内部或其附近区域表达（图S3B–S3D、S3F和S3G）。pappa2及其底物在正在发育的颌面部淋巴丛附近的表达区域重叠，这表明它们可能在该血管的发育中发挥作用。

图3. pappa2在(kat6a ^{b719 })软骨细胞中表达下调。（A）展示RNA测序实验工作流程的示意图。双阳性软骨细胞表达mCherry、col2a1a以及持家基因ef1α（eef1a1l1），但不表达中性粒细胞标记物lyz。相比之下，mCherry/EGFP双阴性非软骨细胞表达ef1α和lyz。标准差（((n=3) 次实验）（B）RT-PCR产物的凝胶电泳结果，验证了从col2a1a:mCherry; sox10:EGFP幼虫中经荧光激活细胞分选分离的软骨细胞的纯度。mCherry/EGFP（C）火山图展示了差异表达基因以及那些编码分泌蛋白的差异表达基因。红色和蓝色圆点分别代表显著下调和上调的基因。D）hoxb2a和pappa2表达的RT-qPCR分析，证实了kat6ab719突变体软骨细胞中pappa2的表达下调。柱状图数据代表基因的平均值±（((p<0.01))）。绿色圆点代表候选基因pappa2

pappa2 对主淋巴前管的发育至关重要

为了研究pappa2在MFL发育中的作用，我们首先向lyve1b:dsRed；sox10:EGFP胚胎中注射了两种先前已发表的pappa2剪接阻断MO中的一种。39 我们验证了通过4天龄（dpf）时的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析，探究pappa2吗啉代寡核苷酸（MOs）的剪接阻断效应（图S4A和S4B）。两种pappa2吗啉代敲低胚胎中，中鳍韧带（MFL）的发育均受到抑制（对照组吗啉代胚胎中MFL长度为129微米，而MO1处理组为59微米，MO2处理组为58微米）（图4A、4B和4F）。相比之下，pappa2吗啉代敲低胚胎中，肝静脉窦（OLV）和主静脉（TD）的发育基本正常（图4G和4H）。为验证pappa2吗啉代寡核苷酸的特异性，我们采用了两种方法。第一种方法是共注射亚有效剂量的MO1和MO2，该处理方式在注射单一吗啉代寡核苷酸的胚胎中重现了中鳍韧带的发育缺陷（图4F-4H）。第二种方法是在4天龄时给予100微摩尔NBI-31772（以下简称NBI），成功挽救了吗啉代敲低胚胎的中鳍韧带表型（图4F-4H）。NBI是一种胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）抑制剂，可从胰岛素样生长因子受体（IGF-）上置换胰岛素样生长因子（IGF）配体结合蛋白。

对于F0代CRISPR-Cas9介导的pappa2基因敲除，我们遵循了已建立的实验方案。我们设计了三种靶向pappa2不同外显子的向导RNA（gRNA），并通过T7核酸内切酶I消化验证了每种gRNA诱导的突变效率（图S4C-S4F）。向lyve1b:dsRed；sox10:EGFP胚胎中注射这三种gRNA和Cas9蛋白，以诱导F0代pappa2基因敲除，即获得“crispant”（基因编辑嵌合体）。利用分解插入缺失追踪（TIDE）算法通过扩增子测序分析确定了编辑效率（图S4G和S4H）。对照组则从同一批胚胎中选取，注射酪氨酸酶（tyr）gRNA。以及 Cas9 蛋白。正如预期的那样，pappa2 基因crispant斑马鱼中的主淋巴鳍管（MFL）发育受到抑制，在受精后6天（6 dpf），其平均血管长度为84微米，而对照组为121微米（图4C、4D和4I）。pappa2 基因crispant斑马鱼的后主淋巴静脉（OLV）和主导管（TD）基本保持正常，且加入NBI后可挽救主淋巴鳍管（MFL）的表型（图4E、4I-K）。延时成像显示，pappa2 基因crispant斑马鱼的主淋巴鳍管（MFL）表型是由迁移缺陷导致的；其主淋巴鳍管（MFL）的迁移方向与对照组动物一致，但速度显著更慢（pappa2 组为0.81微米/小时，对照组为3.1微米/小时），而两组中主淋巴鳍管-淋巴内皮细胞（MFL-LEC）的分裂数量保持不变（图4L、4M，视频S5）。综上，这些数据表明pappa2促进主淋巴鳍管（MFL）的迁移。

最后，我们通过在3天龄（3 dpf）的kdrl:EGFP转基因斑马鱼幼虫中对pappa2基因敲除型（crispant）进行成像，测试了pappa2在血管发育中的作用。与(kat6a a^{b 719})突变体类似，其唯一的血管缺陷出现在ORA-AA1-VA环的长度上，pappa2基因敲除型中该环长度为429微米，相较于对照组的480微米略短（图S4I-S4O）。

图4. pappa2基因的遗传破坏抑制MFL的发育。(A–E) 6天龄斑马鱼头部的共聚焦图像，其中lyve1b:dsRed（绿色）和sox10:EGFP（品红色）被标记。这些斑马鱼在单细胞阶段分别注射了1皮摩尔对照吗啉代寡核苷酸（A）、0.75皮摩尔pappa2吗啉代寡核苷酸1（B）、带有对照（酪氨酸）向导RNA的Cas9蛋白（C）、带有pappa2向导RNA的Cas9蛋白（D）以及带有pappa2向导RNA和100微摩尔NBI的Cas9蛋白（E）。黄色箭头标记了中额面淋巴丛。(F–H) 对6天龄斑马鱼的中额面淋巴丛长度（F）、后主淋巴静脉长度（G）和胸导管形成（H）进行定量分析，比较了对照吗啉代敲低组、注射0.75皮摩尔pappa2吗啉代寡核苷酸1的吗啉代敲低组、共注射0.38皮摩尔pappa2吗啉代寡核苷酸1和0.5皮摩尔pappa2吗啉代寡核苷酸2的吗啉代敲低组，以及在4天龄时用NBI处理的共注射吗啉代敲低组。(I–K) 对6天龄斑马鱼的中额面淋巴丛长度（I）、后主淋巴静脉长度（J）和胸导管形成（K）进行定量分析，比较了对照crispant组、pappa2 crispant组以及在4天龄时用NBI处理的pappa2 crispant组。 

抑制胰岛素样生长因子信号可抑制淋巴管生成

我们推测Pappa2会从Igfbp3/Igfbp5b中释放Igf配体，在局部激活Igf信号通路以助力MFL的发育。如果这一推测成立，那么抑制Igf信号通路野生型动物中的通路应能重现kat6a和pappa2缺陷胚胎中观察到的MFL缺陷，而增强Igf通路则应能挽救kat6a突变体中的MFL表型。

为抑制胰岛素样生长因子信号通路，我们首先使用了胰岛素样生长因子1受体抑制剂BMS-754807（以下简称 BMS）57,58 对其进行处理在4至6天龄（dpf）的lyve1b:dsRed; sox10:EGFP幼虫中，这是颌面部淋巴丛（MFL）的活跃生长期（图5A）。BMS处理导致颌面部淋巴丛长度呈剂量依赖性减少，在2.5微摩尔浓度下这种减少更为显著（BMS处理组颌面部淋巴丛长度为28微米，对照组为125微米）（图5B-5F），同时颌面部淋巴丛淋巴管内皮细胞（MFL-LECs）的平均数量也显著减少（图S5A-S5E）。我们进一步研究了胰岛素样生长因子1受体（Igf1r）信号通路在其他淋巴管发育中的作用。我们在颌下淋巴囊（OLV）或后主淋巴管（PLs）的活跃生长期（分别为3天龄和30小时龄），用2.5微摩尔BMS处理fli1a:nEGFP; lyve1b:dsRed幼虫。BMS处理导致颌下淋巴囊长度显著减少（BMS处理组为81微米，对照组为142微米）（图S5F-S5K）。此外，后主淋巴管的数量也显著减少（图S5L-S5P）。综上，这些数据表明，面部和躯干淋巴网络均对胰岛素样生长因子（Igf）受体信号通路的抑制敏感，且该通路在淋巴管生长中具有更广泛的作用。

接下来，我们过表达了胰岛素样生长因子结合蛋白（Igfbps）。首先，我们构建了共表达 col2a1a:Gal4-ERT2；UAS:igfbp5b；lyve1b:dsRed 的转基因品系，该品系可通过表达软骨的 col2a1a 启动子实现他莫昔芬诱导的 Igfbp5b 表达⁴⁷（图5G）。作为另一种方法，我们向 lyve1b:dsRed 胚胎中注射 hsp70l:igfbp3 tol2 载体，并在受精后4天对嵌合体进行热休克处理（图5H）。与赋形剂处理组（126微米）和4-羟基他莫昔芬（4-OHT）对照组（141微米）相比，Igfbp5b 过表达使平均MFL长度显著缩短（90微米）；而与注射 hsp70l:EGFP 的对照组（111微米）相比，Igfbp3 过表达也使MFL长度显著缩短（79微米）（图5I-5P）。综上，这些数据表明 Igfbp5b 和 Igfbp3 可抑制MFL的发育。

图5. 抑制胰岛素样生长因子信号通路可抑制肌纤维母细胞样细胞的发育。（A）展示二甲基亚砜（DMSO）和胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）抑制剂BMS-754807处理方案的示意图。（B–E）6天胚胎期（dpf）头部侧面的共聚焦图像，对比了4天胚胎期（dpf）用二甲基亚砜（DMSO）（B）、0.61微摩尔（μM）（C）、1.25微摩尔（μM）（D）或2.5微摩尔（μM）BMS处理的、表达lyve1b:dsRed（绿色）和sox10:EGFP（品红色）的斑马鱼幼体的软骨和淋巴表型。黄色箭头标记突出显示中面部淋巴管（MFL）。（F）对二甲基亚砜对照组（((n=16))）与0.61微摩尔（μM）处理组（((n=16))）、1.25微摩尔（μM）BMS处理组（((n=16))）、2.5微摩尔（μM）BMS处理组（((n=21))）的中面部淋巴管长度进行定量分析。（G和H）展示胰岛素样生长因子结合蛋白5b（igfbp5b）过表达（G）和胰岛素样生长因子结合蛋白3（igfbp3）过表达的实验流程示意图。（I–K）6天胚胎期（dpf）头部侧面的共聚焦图像，对比了3天胚胎期（dpf）用赋形剂（I）或他莫昔芬（J）处理的、表达lyve1b:dsRed; col2a1a:Gal4-ERT; UAS:igfbp5b的斑马鱼幼体，以及3天胚胎期（dpf）用他莫昔芬处理的、作为对照的lyve1b:dsRed; col2a1a:Gal4-ERT斑马鱼幼体（K）的淋巴表型。（L和M）6天胚胎期（dpf）头部侧面的共聚焦图像，对比了单细胞阶段注射hsp70l:EGFP（L）或hsp70l:igfbp3（M）的lyve1b:dsRed胚胎，在4天胚胎期（dpf）经37℃热激处理2小时后的淋巴表型。黄色箭头标记突出显示中面部淋巴管（MFL）。（N和O）4天胚胎期（dpf）时胰岛素样生长因子结合蛋白5b（igfbp5b）（N）或胰岛素样生长因子结合蛋白3（igfbp3）（O）表达的实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析。（P）6天胚胎期（dpf）时中面部淋巴管长度的定量分析，对比了他莫昔芬处理的igfbp5b过表达组（((n=21))）与赋形剂对照组（((n=13))）、他莫昔芬处理的对照组（((n=11))），以及hsp70:EGFP对照组（((n=13))）与hsp70:igfbp3组（((n=24))）。MFL，中面部淋巴管；OLV，耳石淋巴管。比例尺：50微米。数据表示为平均值±标准差；***（(^{+++} p<0.001)）、**（("p<0.01)）、*（(p<0.05)）表示显著性差异；ns（(rho>0.05)）表示无显著性差异，显著性评估采用邓尼特多重比较检验的单因素方差分析（igfbp5b）或经韦尔奇校正的非配对t检验（igfbp3）。

增强Igf信号通路可挽救kat6a突变体中的MFL缺陷

如果 pappa2 的下调导致了 ka-(t6a a^{b 719}) 突变体出现主淋巴导管（MFL）缺陷，那么抑制胰岛素样生长因子结合蛋白（Igfbps）应能恢复主淋巴导管的生长。为验证这一点，我们用 100 微摩尔 NBI 处理 4 天龄（dpf）的 kat6ab719; lyve1b:dsRed; sox10: EGFP 斑马鱼幼虫。与 DMSO 处理的 (kat6a a^{b 719}) 突变体（10 微米）相比，NBI 处理的 (kat6a ^{b 719}) 幼虫的主淋巴导管长度显著更长（78 微米），表明 NBI 可部分恢复主淋巴导管缺陷（图 6A–6F）。我们还观察到，用 NBI 处理的野生型同窝幼虫的平均主淋巴导管长度（NBI 处理组为 177 微米，DMSO 对照组为 119 微米）和平均主淋巴导管淋巴内皮细胞（MFL-LECs）数量（NBI 处理组为 17 个，DMSO 对照组为 14 个）均显著增加。（图6B-D、6F及图S5A-E），这支持了Igfbps抑制MFL生长的假设。

为确定 NBI 对 MFL 生长影响的特异性，我们在 OLV 和 PLs（分别为受精后3天和受精后30小时）的活跃生长期，用100微摩尔的 NBI 处理 fli1a:nEGFP; lyve1b:dsRed 幼虫。与 BMS 检测法不同，OLV 和躯干淋巴管均未表现出任何反应（图 S5F–S5K）。这些数据表明，内源性表达的 IGFBPs 特异性调控 MFL 的生长。接下来，我们通过向 (kat6a ^{b 719}) 品系的 lyve1b:dsRed; sox10:EGFP 胚胎注射 hsp70l:igf2b tol2 构建体来过表达 Igf2b（图6G）。对嵌合斑马鱼幼虫的RT-qPCR分析证实，与对照组相比，注射后的幼虫中 igf2b 转录本表达上调（图6H）。正如预期的那样，在 Igf2b 过表达的 (kat6a ^{b 719}) 突变体中，主淋巴管（MFL）的生长得到了部分挽救（对照组MFL长度为11微米，Igf2b过表达组为49微米）（图6I、6J和6M）。作为 Igf 挽救的另一种方法，我们在受精后4天（4 dpf）向 (kat6a a^{b 719}) 品系的 lyve1b:dsRed; sox10:EGFP 幼虫的血腔中注射重组人IGF2（hIGF2）（图6G）⁵⁹，这也部分挽救了MFL缺陷（载体注射组MFL长度为24微米，hIGF2注射组为61微米）（图6K-6M）。我们在野生型（WT）幼虫中重复了hIGF2注射实验，结果显示受精后6天（6 dpf），主淋巴管内的淋巴管内皮细胞（LECs）数量出现小幅但显著的增加（hIGF2注射组为13个，载体对照组为11个），而MFL的长度未发生改变（图S5Q和S5R）。综上，我们的数据表明Igf信号通路能够促进主淋巴管的生长。

图6. IGF信号通路的增强可挽救(kat6a ^{b 719})突变体中的肌纤维长度缺陷。(A)示意图展示二甲基亚砜（DMSO）和胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）抑制剂NBI-31772的处理方案。(B–E) 6天龄（dpf）斑马鱼幼虫侧头部的共聚焦图像，采用lyve1b:dsRed（绿色）和sox10:EGFP（品红色）标记，对比4天龄（dpf）经二甲基亚砜（DMSO）处理的野生型（WT）同窝幼虫(B) 或 (kat6a ^{b719 })突变体(C)，以及4天龄（dpf）经100微摩尔（μM）NBI处理的野生型（WT）同窝幼虫(D) 或 (kat6a ^{b 719})突变体(E) 的软骨和淋巴表型。黄色箭头头突出中面部淋巴管（MFL）。(F) 6天龄（dpf）中面部淋巴管（MFL）长度的定量分析，对比二甲基亚砜（DMSO）处理的野生型（WT）( ((n=20))、((n=18))、((n=21)) 处理的 (kat6a ^{b 719})、((n=20))) (G) 示意图展示胰岛素样生长因子2b（Igf2b）过表达诱导及重组人胰岛素样生长因子2（hIGF2）注射的实验流程。(H) 热休克处理2小时后胰岛素样生长因子2b（igf2b）表达的实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析( (= 4) 实验)，证实igf2b过表达成功。(I–L) 6天龄（dpf）斑马鱼幼虫侧头部的共聚焦图像，采用lyve1b:dsRed（绿色）和sox10:EGFP（品红色）标记，对比单细胞阶段注射hsp70l:EGFP载体(I) 或 hsp70l:igf2b载体(J) 并在4天龄（dpf）经37℃热休克处理2小时的 (kat6a a^{b 719})突变体幼虫，以及4天龄（dpf）注射溶剂(K) 或 人胰岛素样生长因子2（hIGF2）(L) 的 (kat6a a^{b 719})突变体幼虫的软骨和淋巴表型。黄色箭头头突出中面部淋巴管（MFL）。(M) 6天龄（dpf）中面部淋巴管（MFL）长度的定量分析，对比注射hsp70l:EGFP的 kat6ab719( ((n=19)))、注射hsp70l:igf2b的 ((n=20))、注射hIGF2的 ((n=22)) 幼虫( ((n=35)))。MFL，中面部淋巴管。数据表示为平均值±标准差；*** (^{* * *} p<0.001)、(^{*} p<0.01)、(p<0.05)：无显著性差异（ns），(p>0.05) 结果来自经Welch校正的非配对t检验。

IGF信号传导在淋巴管发育中具有细胞自主性的必要性

尽管我们已发现胰岛素样生长因子（Igf）信号通路在淋巴管发育中发挥作用，但目前尚不清楚Igf信号通路是否是淋巴管内皮细胞（LECs）内淋巴管生长所必需的细胞自主信号。我们首先检测了斑马鱼淋巴管内皮细胞中是否表达Igf受体。我们通过荧光激活细胞分选术（FACs）从受精后4天（4 dpf）的fli1a:EGFP；lyve1b:dsRed双转基因斑马鱼中分离出绿色荧光蛋白/红色荧光蛋白双阳性（EGFP/dsRed+）的淋巴管内皮细胞，并通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）证实斑马鱼淋巴管内皮细胞表达全部五种Igf受体（图7A），这表明它们有可能直接对Igf配体产生反应。在斑马鱼中，igf1ra和igf1rb是哺乳动物胰岛素样生长因子1型受体（IGF1R）的直向同源物60。随后，我们使用先前验证过的剪接阻断型吗啉代寡核苷酸（MOs），在野生型（WT）斑马鱼中敲低igf1ra或igf1rb的表达1。逆转录聚合酶链式反应验证了igf1ra或igf1rb吗啉代寡核苷酸注射的有效性（图S6A）。正如预期的那样，单独注射igf1ra或igf1rb吗啉代寡核苷酸会导致斑马鱼幼鱼在受精后3天（3 dpf）的眼径和体长轻微减小，而同时注射两种吗啉代寡核苷酸则会导致严重的发育缺陷（图S6B–S6D）。

为了检测igf1ra和igf1rb的细胞自主性，我们开展了细胞移植实验：将共注射了igf1ra和igf1rb吗啉代寡核苷酸（MOs）或对照吗啉代寡核苷酸（MO）的lyve1b:dsRed供体胚胎的细胞，移植到lyve1b:EGFP宿主胚胎中。与对照组（移植率27%）相比，igf1ra-igf1rb形态发生突变细胞在血管中的定植能力更低（移植率9%）（图7B），且与对照组吗啉代寡核苷酸组（每个移植物8个细胞）相比，igf1ra- igf1rb 吗啉代寡核苷酸处理组的淋巴移植物平均细胞数量显著减少（每个移植物3个细胞）（图7C）。这些数据表明，淋巴管内皮细胞中存在的igf1ra和igf1rb是淋巴管发育所必需的。

我们接下来测试了IGF信号通路是否能不依赖VEGFR信号通路来刺激淋巴管生成，而VEGFR信号通路是面部淋巴管发育所必需的关键通路。63-65 VEGFR抑在受精后4天（4 dpf）斑马鱼主淋巴导管（MFL）生长前，分别加入3 μM的舒尼替尼（sunitinib）和3.5 nM的替沃扎尼（tivozanib），这两种药物的剂量已知可抑制斑马鱼淋巴系统发育。66,67 受精后6天（6 dpf）时，与二甲基亚砜（DMSO）处理的幼虫相比，VEGFR抑制剂处理的幼虫主淋巴导管（MFL）长度显著更短（DMSO组为120微米，舒尼替尼组和替沃扎尼组均为46微米和45微米），且淋巴内皮细胞（LEC）数量更少（DMSO组为12个，舒尼替尼组和替沃扎尼组均为4个），这证实了Vegfr信号通路在主淋巴导管（MFL）生长中的作用。63,64（图S6E–S6K）向经任一VEGFR抑制剂处理的幼虫共同施用2.5微摩尔BMS，能够进一步减少MFL的生成；而向经舒尼替尼或替沃扎尼处理的胚胎添加100微摩尔NBI-31772，则可使MFL淋巴管内皮细胞的长度和数量恢复至对照组水平（图S6J和S6K）。综上，这些数据表明IGF信号通路在MFL生成过程中可独立于Vegfr信号通路发挥作用。

最后，我们采用体外淋巴管生成实验验证了IGF信号通路在淋巴管生长中的作用。诱导多能干细胞来源的人淋巴管内皮细胞（iPSC-hLECs）通过已发表的方案制备。既往研究已证实，该方案获得的iPSC-hLECs可表达淋巴管内皮细胞经典标志物PROX1、VEGFR3、平足蛋白和LYVE1，以及泛内皮标志物CD31和血管内皮钙黏蛋白。IGF1R经典活性的主要效应是激活下游磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）以及Ras/MAPK通路。我们证实了诱导多能干细胞衍生的人淋巴内皮细胞表达胰岛素样生长因子1受体，并且发现给予人胰岛素样生长因子2可激活蛋白激酶B（图7D和图7E）。综合来看，这些数据表明诱导多能干细胞衍生的人淋巴内皮细胞能够对胰岛素样生长因子配体做出反应。

最后，我们通过体外3D微流体出芽实验检测了IGF信号通路在淋巴管内皮细胞迁移中的作用采用3D体外微流体出芽实验进行研究。诱导多能干细胞来源的人淋巴管内皮细胞系hLEC 细胞系在暴露于人 IGF2 时表现出出芽现象增加；然而，其对 IGF2 的生长反应不如诱导多能干细胞来源的 hLEC 暴露于由 VEGFC、血管生成素 1 和肝细胞生长因子（HGF）组成的对照淋巴管生成混合物时强烈（图 7F 和 7G）。我们的数据证实了此前在原代小鼠和人 LEC 中开展的研究，该研究表明 LEC 表达 IGFR1，且可响应 IGF 配体激活 AKT 信号通路并发生迁移。综合来看，这些数据凸显了 IGFR 信号通路在淋巴管生成中的保守作用。

图7. 胰岛素样生长因子信号在淋巴管生长中具有细胞自主性需求。(A)RT-PCR产物的凝胶电泳结果，展示了4天post-fertilization（dpf）时淋巴内皮细胞（LECs）中igfr家族成员的表达。(B) 血管植入率表格。(C) 对照吗啉代寡核苷酸（MO）注射供体（((n=46))）与igf1ra/igf1rb吗啉代寡核苷酸共注射供体（((n=41)）之间，每个dsRed+淋巴移植物内平均细胞数的比较。(D) 免疫印迹实验证实诱导多能干细胞来源的人淋巴内皮细胞（iPSC-hLECs）中IGF1R的表达（iPSC1 = ATCC-BYS0112，iPSC2 = ATCC-BXS0116）。小鼠前脂肪细胞IGF1R敲除（KO）细胞裂解物和一条对照细胞系分别作为阴性和阳性对照。(E) 免疫印迹实验展示诱导多能干细胞来源的人淋巴内皮细胞（iPSC-hLECs）与135纳摩尔人胰岛素样生长因子2（hIGF2）孵育5分钟后，AKT（丝氨酸472位点）的激活情况（iPSC1 = ATCC-BYS0112，iPSC3 = (PSC3 =) KOLF2.1J）。(F) 微流控芽生实验中诱导多能干细胞来源的人淋巴内皮细胞（iPSC-hLECs）迁移的定量分析；来自两条不同诱导多能干细胞系的(n=4)次独立分化（每条系两次分化）。(G) 体外微流控芽生实验的共聚焦图像。黄色虚线代表含有溶剂对照或生长因子的通道；白色虚线代表接种诱导多能干细胞来源的人淋巴内皮细胞（iPSC-hLECs）的通道。比例尺：200微米。数据以平均值±标准差表示；**(^{*} p<0.01)：(^{*} p<0.05)：无显著性差异（ns），(p>0.05)通过单因素方差分析（ANOVA）结合Dunnett多重比较检验进行显著性评估。

讨论

基于研究结果，我们提出了一种舌骨软骨依赖型下颌韧带生长的分子机制。在该模型中，Pappa2 及其底物胰岛素样生长因子结合蛋白 3（Igfbp3）和胰岛素样生长因子结合蛋白 5b（Igfbp5b）在舌骨软骨附近或内部表达。Pappa2 切割 Igfbp3 和 Igfbp5b，使胰岛素样生长因子配体在局部释放。在发育中的下颌韧带中表达胰岛素样生长因子 1 受体 a（Igf1ra）和胰岛素样生长因子 1 受体 b（Igf1rb）的淋巴管内皮细胞（LECs）会出现迁移增强的反应（见图形摘要）。相比之下，kat6ab719 突变体缺乏 Pappa2 的表达，导致胰岛素样生长因子结合蛋白的局部蛋白水解作用不足；胰岛素样生长因子配体仍被胰岛素样生长因子结合蛋白束缚，无法参与下颌韧带的发育。

IGF信号通路在发育过程的生长促进中发挥关键作用。Igf1r纯合突变小鼠体型更小，并且表现出骨骼发育延迟和肌肉发育不全的现象。在斑马鱼中，通过igf1r或igf2吗啉代寡核苷酸敲低IGF信号，或是通过显性负效IGF1R的表达来抑制该信号，均会导致斑马鱼体长缩短，同时其眼睛、心脏、神经元以及血管出现发育缺陷。多项研究表明IGF信号参与了血管的发育过程。Igf1基因敲除小鼠的视网膜血管生长存在缺陷，而体外实验显示血细胞和淋巴管内皮细胞表达IGFR1，并且能够在IGF配体的刺激下发生迁移。然而，在本研究开展之前，相关研究还十分有限有证据表明胰岛素样生长因子（IGF）信号通路在体内调控淋巴管的发育。此前研究已证实IGF信号通路参与淋巴管的病理性生长，且其与结直肠癌的肿瘤淋巴管生长相关6。本研究证实，IGF信号通路可调控胚胎发育过程中的淋巴管生长。

在良性淋巴血管生成（OLV）或躯干淋巴管形成之前应用胰岛素样生长因子受体（IGFR）抑制剂（BMS）产生了一定程度的生长抑制作用。这表明IGFR信号传导可能在淋巴管的发育过程中发挥更广泛的作用。为支持这一观点，我们证实斑马鱼淋巴管内皮细胞（LECs）中表达胰岛素样生长因子（Igf）受体，且与野生型（WT）细胞相比，敲低胰岛素样生长因子1受体a/b（igf1ra/b）的供体细胞对淋巴管网络的形成贡献能力更弱。此外，我们的体外实验数据显示，诱导多能干细胞来源的人淋巴管内皮细胞（iPSC-hLECs）表达胰岛素样生长因子1受体（IGF1R），并通过下游蛋白激酶B（AKT）信号通路的激活以及迁移能力的增强对胰岛素样生长因子2（IGF2）产生响应，这一数据与原代哺乳动物淋巴管内皮细胞的相关实验结果一致。综合来看，这些研究结果表明IGF1R信号传导在淋巴管生长中具有保守的、细胞自主性的作用。

值得注意的是，IGFBP抑制剂（NBI）仅能促进MFL的生长；当在OLV或躯干LEC生长前施加该药物时，未观察到任何效应。这可能反映了Pappa2和Igfbps的空间表达受限。已有充分证据表明，IGF信号通路在发育过程中可产生局部效应。例如，IGF1基因敲除会导致大脑、肺、骨骼和肌肉出现严重的发育缺陷，但通过肝脏特异性Cre/LoxP敲除导致循环IGF1缺失，却不会引发显著缺陷。在小鼠体内，研究已证实成骨细胞内PAPPA2的局部表达可调控出生后骨骼的生长。在斑马鱼中，我们已证明pappa2及其底物igfbp3和igfbp5b的表达在舌骨软骨内或其附近（紧邻正在发育的MFL）高度富集，而在躯干或耳泡中几乎无重叠表达。这可以解释pappa2敲低后出现的特异性MFL表型，以及IGFBP抑制剂对MFL生长的促进作用。

发育过程中淋巴管生长的一个关键特征是受邻近非淋巴管相关因子的调控结构。 淋巴管的典型模式形成血管的形成是对邻近结构所表达的吸引和排斥信号的响应。与这一范式一致，我们的研究表明下颌舌骨软骨的发育需要舌骨软骨。我们进一步确定Pappa2是在舌骨软骨细胞内表达的一种“促淋巴管生成”分子，并通过全局敲除实验证实，Pappa2是乳房淋巴束-淋巴管内皮细胞迁移所必需的。

本研究揭示了Pappa2-Igfbp-Igf轴在调控淋巴管发育中的作用。胰岛素样生长因子（IGF）信号通路在体外也能促进人淋巴管内皮细胞（LECs）的淋巴管生成，表明该功能具有保守性。IGF信号通路可作为治疗靶点，与其他已知通路协同增强或调控淋巴管生成。

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