题目：A Neural Representation of Naturalistic MotionGuided Behavior in the Zebrafish Brain

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32386533/

期刊：Current Biology

研究亮点

l 高阶滑翔运动刺激在斑马鱼幼体中引发视动反应

l 滑翔刺激引发全脑活动，且该活动随诱导转向方向呈现侧化特征

l 方向选择性视网膜神经节细胞对滑翔器刺激具有方向特异性反应

l 行为模式可精准预测顶盖前区的神经元反应强度

摘要

所有动物都必须将模糊的感官数据转化为有效的行为。这需要感官表征能够准确反映自然刺激和行为的统计特征。多项研究表明，视觉运动处理在自然条件下会为准确性而优化，但提取这些信号并实现运动引导行为的感觉运动回路仍不明确。本研究发现，斑马鱼幼体视网膜能提取多种自然运动信号，而接受视网膜输入的顶盖则会围绕行为要素对这些信号进行组织。研究发现，高阶运动刺激（滑翔运动）能诱导出与自然场景分析预期相符的视动行为。随后，研究人员对视网膜神经节细胞轴突终末和顶盖神经元的活动进行了成像。视网膜在各类滑翔运动刺激下均表现出方向选择性反应，且解剖学上呈簇状分布的顶盖神经元的响应幅度与行为表现相匹配。因此，外周计算反映了自然输入的统计特征，而中枢大脑活动则精准编码行为所需的信息。这一通用原则可能是跨物种感觉运动转换的组织基础。

引言

所有动物都需要对环境变化做出反应。许多变化涉及动物与其周围环境之间的相对运动，这使得视觉运动检测成为一项关键的感知任务。空间局部化的运动信号可能指示视觉环境中显著的物体，例如捕食者或猎物，这可能触发专门的逃避或捕猎行为。空间连贯的整体运动通常表明动物正在其环境中移动，因此动物会对全场运动表现出多种稳定反应。为了对视觉运动刺激做出恰当的反应，动物必须从光信号中准确估计运动线索，并将这些运动信号通过中枢大脑传递到产生相应行为反应所需的运动回路。然而，连接感知与行为的神经回路和计算机制在很大程度上仍不为人知。例如，尽管对人类和非人灵长类动物的研究揭示了大脑从嘈杂的感官输入中推断整体运动所使用的多种计算线索，但这些运动感知依赖于不同神经回路还是共同神经回路的程度仍存在争议。

有趣的是，我们对视觉运动处理的原理、算法和神经环路的认知，在脊椎动物和无脊椎动物的大脑中都惊人地保守。一个能解释这些现象的颇具吸引力的假设是，每种动物物种都各自调整了其运动处理策略，以反映行为相关的自然感官环境中普遍共有的统计特征。视觉信息处理适配自然场景统计这一核心思想，为各类视觉现象提供了定量和概念层面的见解。在运动处理领域，这一假设针对一类名为“滑翔体”的复杂运动刺激得到了最充分的发展。在探讨其计算逻辑之前，有必要先介绍几项关于滑翔体的关键研究结果。首先，滑翔体至少对灵长类动物和昆虫具有感知相关性。其次，在自然环境中经过性能优化的全视野速度估计模型中，能够复现果蝇对滑翔体的选择性方向模式。最后，果蝇在视觉系统的早期阶段就能提取滑翔体信号，而灵长类动物的滑翔体处理则涉及视觉皮。这引出了一个有趣的可能性：不同动物的大脑针对共同的需求，已经趋同演化出了实用的算法解决方案。尽管在神经回路层面的实现方式存在差异，但仍能达成相同的计算目标。

视觉运动估计的算法描述必须明确大脑在何时以及如何将光的时空模式解读为运动。这一目标难以实现，原因在于可能的刺激空间过于庞大，无法进行全面采样，且仅有一小部分刺激会引发运动感知。此外，自然图像和电影因其复杂的统计特征，难以进行参数化描述。滑翔子刺激通过在时空相关性的数学完备基中表征运动估计算法，解决了这一难题。每种滑翔子刺激的设计都考虑到了运动会在整个视野中引发多种不同时空相关性的事实。通过人为分离真实运动中同时出现的相关性，滑翔子能够灵活地揭示各类计算线索对运动感知的作用。例如，奇阶滑翔子刺激可测量相对于ON/OFF刺激明显不对称的基元，这一特性已被用于证明ON/OFF不对称的神经处理与果蝇的行为高度相关。类似的刺激和相关性计算也适用于深度感知和纹理感知。

本文介绍斑马鱼幼鱼作为一种硬骨鱼模型，用于解析脊椎动物大脑中滑翔子诱导行为的神经机制。已知斑马鱼幼鱼对φ运动、反向φ运动和非傅里叶运动刺激存在行为学反应，而这些刺激是滑翔子刺激的经典前体。研究首先证实斑马鱼对三阶滑翔子刺激同样具有方向反应，由此表明斑马鱼行为中存在光暗不对称的视觉运动处理机制。值得注意的是，斑马鱼幼鱼体型小巧且身体半透明，这使得研究人员能够以单细胞分辨率实现全脑功能成像。近期研究发现，多种运动引导的稳定行为会募集大脑中央一个名为顶盖前区的区域。该区域会整合来自多种视网膜神经节细胞类型的视觉信号，并与多条视觉和运动通路形成神经连接。这种功能上的多重性体现在其显著的反应异质性上，但视网膜输入对顶盖前区的贡献、以及顶盖前区内部的计算过程如何塑造单个顶盖前神经元的反应，目前仍不明确。本研究结合视网膜和顶盖前区的成像技术，证实存在对滑翔子刺激具有方向选择性的视网膜神经节细胞，且顶盖前神经元会对该信号进行精细调控，使其与行为学观察到的模式精准匹配。这些研究结果表明，视网膜的运动处理机制是为自然刺激的需求量身定制的，而顶盖前区则为那些驱动稳定行为的视觉运动刺激提供了一套灵活的编码体系。

结果

斑马鱼的视动转向可调节移动光栅的时间频率

视动反应是一种先天行为，可抵消动物与其环境之间的相对运动，例如向左的运动会导致持续的向左转向偏向（图1A）。经典的哈森施泰因-赖因霍尔德相关器（HRC）通过时空相关性检测视觉运动该刺激能准确预测许多动物对移动正弦光栅的转向幅度。这种漂移正弦光栅的时空结构可通过其空间波长和速度直观表征（图1B，正面）。然而，HRC模型预测，与视动转向行为相关的光栅速度概念是运动的时间频率（图1B，右侧面），该频率结合了光栅的波长和速度，以编码刺激的时间振荡规律。例如，图1B中的两个移动光栅尽管速度和空间波长不同，但其时间频率却相同。

我们首先检测了斑马鱼对侧向漂移光栅的视动反应是否具有时间频率调谐特性。我们对自由游动的斑马鱼施加闭环全视野运动刺激进行视动反应测量，该刺激的方向与斑马鱼的体轴保持一致（图1A；STAR实验方法）。正如预期的那样，斑马鱼会通过一系列连续的游动动作，始终向刺激运动的方向转向（图1C）。这些转向反应的幅度与运动速度的调谐关系并不稳定（图1D左图）。例如，当光栅的波长更长时，斑马鱼会对更快的刺激速度产生反应。然而，当我们将最大归一化反应幅度作为时间频率的函数进行绘制时，发现其呈现出一致的时间频率调谐曲线（图1D右图），这与此前在果蝇中的研究报道结果相似。因此，幼体斑马鱼的转向反应验证了高阶视网膜对比（HRC）模型的一个核心预测，也支持了斑马鱼通过利用刺激中的局部时空相关性来检测运动这一观点。

图1. 斑马鱼幼体的视动转向反应符合视觉运动经典模型的预测。(A)自由游动闭环实验示意图，其中刺激与鱼的体轴锁定。红色部分描绘了90度的转向。在本图及所有后续图中，正角度表示向左转向。(B) 二维正弦光栅向右运动的时空表示。正弦光栅的空间结构显示在立方体的顶面。描述正弦光栅运动只需两个量，例如速度(n)和波长(l)，且可从时空相关性中推断出运动的方向和速度。该模型预测运动感知与运动光栅的时间频率调谐相关（侧面）。值得注意的是，正弦光栅的速度与波长之间的相互作用使得相同的时间结构可在不同的速度和波长参数下出现（对比顶部和底部立方体）。(C) 量化了转向累积角度随时间的变化((full trial =12 ~s ))。单个向左运动刺激的单次试次以浅灰色显示，试次平均值以黑色显示，插图突出展示了一次包含向左转向的单次试次（上方）。(D) 鱼在12秒内的平均总转向角度((N=40 fish ))（左图）。同一数据在求平均前进行了峰值归一化，并根据时间频率绘制（右图），该时间频率由波长和速度的每种组合计算得出。误差棒表示均值的标准误。(E) 左图：与(B)类似。选自van Hateren自然图像数据集的一张示例自然图像（图像编号：598）[35]（顶面）。我们使用经亮度校准的图像模拟向右的匀速运动（正面）。仅为演示目的，我们对所显示的图像进行了均衡化处理，将每个像素的亮度替换为其在图像中的强度等级。需注意，该运动包含明暗边缘的移动。中左图：为简化运动信号模式，我们将自然图像的对比度在均值附近进行了二值化处理。中右图：我们通过将时空像素对相乘来计算二阶运动信号，这些像素对的时空偏移与运动速度（每时间步1像素）相匹配。通过从向右方向信号中减去向左方向信号，我们得到了一个方向性运动信号，该信号在每个边缘位置均指示向右运动。尤其值得注意的是，该信号在所有位置均为正值或零。右图：我们还通过将三个时空像素相乘来计算三阶运动信号，这些像素的时空偏移同样与运动速度匹配，且呈时间收敛的三角形模式（见图2A最右列）。此时的方向性运动信号取决于移动边缘是亮边还是暗边，向右移动的亮边会产生正信号，而向右移动的暗边则产生负信号。

自然图像运动包含高阶相关性

自然图像极为复杂（图1E，顶部图像），其运动包含高阶时空相关性，这超出了HRC检测到的二阶线索。我们通过模拟二值化自然图像的向右运动来展示这些高阶相关性（图1E，左侧、中左侧）。正向的二阶运动线索可靠地指示了图像内每个垂直边缘的向右运动（图1E，中右侧）。三阶运动线索也出现在每个边缘，但亮边和暗边的响应符号相反（图1E，右侧）。综上，二阶和三阶运动线索共同编码了每个运动边缘的方向和对比度极。有趣的是，无脊椎动物和脊椎动物的大脑均以边缘类型选择性的方式编码运动，而对三阶运动线索的敏感性是果蝇实现这种选择性的原因之一。这种编码方式可直接用于区分自然环境中运动的亮物体和暗物体。此外，视觉运动估计器可借助三阶运动线索带来的边缘类型特异性，更准确地估计亮暗不对称自然环境中全场运动的速度。因此，多种动物对三阶相关性表现出行为学上的运动反应，我们接下来探究斑马鱼幼体是否也属于这类动物。

滑翔器刺激诱导斑马鱼幼体的视动反应

我们使用了一组刺激集，该刺激集由一对横向漂移的正弦光栅组成（图2A，第一列），二者为不相关的非方向性噪声（图2A，第二列），以及时空相关的滑翔机刺激，这些刺激旨在分离出能预测自然环境中向左或向右运动的视觉线索（图2A，其余列）。但需注意，滑翔机刺激的时空朝向（图2A，上排与下排）不必与运动线索的方向一致。每种滑翔机刺激均被设定为在空间和时间上形成特定的二阶或三阶相关性（STAR方法；图S1A）。例如，正二阶相关性仅将二元空间图案按每个像素平移一时间步（图2A，第三列），而负二阶相关性也会反转平移模式的对比度（图2A，第四列）。这两种刺激类型是φ运动和反φ运动的例子，它们为建立视觉运动估计的几种经典模型奠定了基础。三阶滑翔机刺激在时空中构建三角形（图2A，第五至第八列），并消除了经典模型可检测到的所有二阶线索。尽管这些刺激看起来可能不自然，但它们具有实验上有用的特性。首先，它们能产生性能优化的模型以及此前在果蝇中测得的模型（图S1C）均与之一致。这些方向性特征也与蜻蜓和猕猴的神经元记录结果相符。因此，滑翔器刺激是一种运动错觉，可用于探究整个动物界中自然运动的计算机制。

斑马鱼幼鱼以一系列离散的游动周期进行游动，而光运动刺激会调节行为的多个要素，这些要素共同作用以产生总转向角度。因此，我们将行为进一步拆解为与向前游动、向右转向和向左转向相关的游动周期频率（图2D；图S1D）。与无相关噪声相比，每种刺激都会在诱导的转向方向上增加游动周期频率，且许多刺激还会降低相反方向的转向频率。尽管侧向运动刺激对向前游动周期的调节作用较弱，但正相关的三点滑翔运动通常会提高向前游动的频率，并诱发相对较弱的转向行为。

图2. 斑马鱼幼体将滑翔器刺激感知为运动正弦光栅刺激的向右运动。根据（A）我们实验中呈现的15种刺激的示例时空图，方向性刺激分为左取向（第一行）和右取向（第二行）两类。球棍图展示了相关时空图内的相关结构，空集符号（B）表示时空无相关刺激，箭头图标表示标准向左或组成点的位移方向（STAR 方法）。（B）以((N=120 fish))的累计转向角度量化的鱼平均平均转向反应。阴影误差棒代表平均值的标准误差。鱼对无相关刺激的反应微弱，且会朝着漂移正弦光栅的运动方向转向（上图）。正向左取向两点滑翔机诱导出与向左光栅运动相似的转向反应，而负向左取向两点滑翔机诱导出与刺激取向相反的转向（下图）。（C）每种无方向性或左取向刺激在完整12秒试次内的总转向角度。包括三点滑翔机在内的每种滑翔机刺激的反应均与无相关刺激的反应存在显著差异（所有(p<10^{-5})，威尔科克森检验）。需注意，左取向滑翔机反应的方向取决于滑翔机的模式和奇偶性（相关符号）。误差棒为平均值的标准误差。（D）15种刺激下斑马鱼的单次游动行为，以12秒试次内鱼平均的向前游动、向左转向和向右转向频率量化(N=120 fish) STAR 方法）。误差棒为平均值的标准误差。星号表示与无相关刺激反应相比存在显著差异（(p 0.05)，威尔科克森检验）。另见图S1。

神经元对滑翔刺激的反应随转向方向呈现侧偏化特征

接下来，我们旨在表征全脑神经元对滑翔器刺激的反应。我们通过在双光子显微镜下，对泛神经元表达基因编码钙指示剂的转基因斑马鱼（Tg:elavl3:GCaMP6f）[70]在头部固定、尾部自由的制备状态下测量荧光钙反应来实现这一目标（图3A-3B；STAR方法）。这使我们能够同时监测神经元活动和游泳行为，这一点至关重要，因为头部固定状态下的行为频率可能与自由游动的幼鱼不同。我们采用已发表的方法自动检测神经元感兴趣区域（ROIs）[58]（STAR方法）。斑马鱼神经元对漂移正弦光栅的方向选择性具有高度的侧偏性，左/右脑主要对向左/向右运动做。在此，我们重现了这一发现（图3C；图S2A），并进一步观察到正向两点滑翔器刺激也呈现出类似模式（图3D；图S2A）。有趣的是，后脑（Hb）和小脑（Ce）的神经元反应在两点滑翔器刺激和漂移光栅刺激之间视觉上无法区分，这与以下观点一致：这些区域产生的运动输出由两种刺激以相似的方式诱发（图2D）。然而，两点滑翔器刺激在视顶盖（OT）中募集了漂移光栅刺激无法诱发的反应（图3A、3C和3D；图S2A）。重要的是，两种刺激类型在前顶盖引发的视觉反应相似，这与前顶盖是斑马鱼视动反应关键视觉区域的假说相符]。

因此，我们重点研究了顶盖前核如何以视觉方式呈现滑翔刺激。顶盖前核的两侧均对负两点滑翔刺激产生反应（图3E；图S2B）。靠后/腹侧的亚区对负向和正向两点滑翔刺激表现出相反的朝向偏好，而靠前/背侧的亚区则表现出一致的朝向偏好。靠后/腹侧亚区的反应模式与左/右侧顶盖前核神经元偏好能引发向左/向右转向的刺激这一假设相符。事实上，当我们定义一个方向指数来量化单个感兴趣区（ROIs）对能引发向左转向与向右转向的刺激的偏好程度时，我们发现左/右侧顶盖前核强烈偏好能驱动向左/向右转向的刺激（图3F；图S2B）。顶盖前核的方向选择性模式在后脑的反应中也同样明显（图S2C），且三点滑翔刺激图同样显示出与转向行为方向性相关的偏侧化现象（图S2D和S2E）。需注意，向左/向右取向的负向两点滑翔刺激包含长程正向两点相关性，若单独呈现这类相关性，会驱动向左/向右转向[50]。结合这一事实与上述结果，我们推测顶盖前核的前侧/背侧亚区存在偏好长程运动信号的神经元。通过对左侧和右侧顶盖前核中视觉激活的感兴趣区（ROI）反应进行平均分析，我们发现每一种滑翔刺激都能观察到这种方向选择性（图3G）。该偏侧化模式在视顶盖中未出现，在小脑和后脑神经元中的表现也相对少见（图S2F）。不过，在解剖和功能上位于顶盖前核下游的小脑和后脑亚区，可能仍保留了对滑翔刺激的类顶盖前核调谐特性。

图3. 顶盖前区的神经元反应具有解剖学侧偏性且对滑翔刺激具有方向选择性。(A)参考大脑的全脑解剖图谱（由 Tg(elavl3:GCaMP6f) 7 天龄幼体共聚焦堆栈构建而成），所有后续 ROI 选择性图谱均叠加于此图谱上。文中提及的脑结构已高亮标注（大致位置）。OT：视顶盖；Pt：顶盖前区；Ce：小脑；Hb：后脑。(B) 双光子成像装置示意图，幼体头部包埋在琼脂糖中但尾部可自由活动。我们从下方呈现视觉运动刺激，并可在记录神经活动的同时追踪其行为。(C) 移动正弦光栅刺激下的全脑方向选择性图谱，揭示了左侧偏好（绿色）和右侧偏好（品红色）区域（来自 11 条幼体的 30,778 个 ROI）。(D) 两点滑翔刺激下的全脑方向选择性图谱。(E) 负向两点滑翔刺激下的顶盖前区方向选择性图谱。腹侧（背侧）顶盖前区的方向选择性与正向两点滑翔刺激的方向相反（匹配）（来自 11 条幼体的 559 个 ROI）。(F) 比较所有驱动向左转向（绿色）与向右转向（红色）刺激的顶盖前区方向选择性图谱。顶盖前区的方向选择性以与转向行为方向匹配的方式呈现侧偏性。对于每组图谱，我们展示了冠状面（三联图中心）、横断面（三联图顶部）和右侧矢状面投影（三联图右侧）。A 代表前后轴，V 代表腹背轴，L 代表左右轴。比例尺在 (C)、(D) 和 (B) 中代表 0.1 毫米，在 (E) 和 (F) 中代表 0.05 毫米。(G) 左侧 ((N=840 ROls )) 与右侧顶盖前区 (( N=991 ROls)) 中 ROI 的平均 z 评分荧光反应。每个平均值对每对方向刺激均表现出方向选择性，且方向偏好与行为转向方向一致。阴影误差棒代表均值标准误。绿色和红色圆点分别代表驱动向左转向和向右转向的视觉刺激。水平虚线标记了无相关刺激呈现期间的峰值平均反应。星号表示所有比较在 (p=0.01) 水平上均显著（威尔科克森检验）。另见图 S2。

AF5和AF6包含方向选择性视网膜信号

顶盖接收来自视网膜的方向选择性和非方向性输入，因此我们接下来旨在确定滑翔器刺激的方向选择性是否已存在于视网膜输出中。在斑马鱼中，视网膜神经节细胞（RGC）的轴突在十个不同的树突野（AF）中分支，每个树突野都传递来自一个视网膜神经节细胞亚群的信息。为了精确测量视网膜反应，我们对转基因SyGCaMP6s斑马鱼进行了成像，该鱼在islet-2b启动子调控下的视网膜神经节细胞突触中选择性表达荧光钙指示剂GCaMP6s（图4A；STAR方法），并改进了分割程序以检测突触体尺度的感兴趣区域（ROIs）（图4B；STAR方法）。已有研究表明AF5、AF6和AF10均包含方向选择性信号，但神经纤维层消融实验发现，仅AF5和AF6附近的神经突起会影响视动行为。因此，我们对不包含AF10的视野进行成像，以对远小于AF10的其余树突野实现高分辨率成像。借助该技术，我们得以在大多数树突野中检测到对视觉有反应的荧光信号（图4B），但在我们的实验装置中，AF1、AF2和AF3位置过于腹侧，无法进行高保真成像。此外，实验期间AF7中的荧光信号未受视觉调制。因此，我们将后续所有分析聚焦于AF4、AF5、AF6、AF8和AF9。另外，我们在分析中将AF5和AF6合并，因为仅在AF5中检测到少量感兴趣区域，且这些区域的反应特性与邻近的AF6相似（图S3A），同时方向选择性视网膜信号似乎并不遵循AF5/6的。

视觉运动刺激会使一些感兴趣区域的荧光增强，而使另一些感兴趣区域的荧光减弱（图4C），因此我们首先将感兴趣区域分为三类：被正向两点运动刺激显著激活的激活群、被显著抑制的抑制群，以及无反应的零反应群（STAR 方法）。所有听觉特征区域中均同时存在激活群和抑制群（图4D），我们分别评估了每个听觉特征区域中激活群和抑制群的方向选择性。我们发现，大多数感兴趣区域在任意一个听觉特征区域中均未表现出强烈的选择性，但听觉特征5和6的感兴趣区域表现出显著更强的方向选择性对漂移光栅的反应高于随机预期水平（图4E；STAR 方法），与之前的结果一致。我们还发现，仅在激活状态下，对正两点滑翔刺激、负两点滑翔刺激和三点滑翔刺激的方向选择性反应才会增强AF5和AF6感兴趣区域（图S3B–S3D）。我们决定仅基于对侧向漂移光栅的反应来聚焦被识别为方向选择性的感兴趣区域。这一选择使我们能够评估经典的方向选择性视网膜神经节细胞是否也对滑行运动表现出方向选择性。

图4 视网膜计算方向选择性滑翔器反应。(A)视网膜轴突在斑马鱼中枢脑中分支的几何结构。本图展示了使用视网膜标记的 Tg:Islt2b:SyGCAMP6s 斑马鱼（受精后7天）对左侧半球分支区域（AFs）进行3D重建的投影视图。每种颜色标记一个独立的分支区域。本视角下AF8位于AF7后方。由于AF5和AF6难以区分且功能相似（图S3A），我们在大多数图版中将二者合并为AF5&6。在进行其他数据分析前，已对眼部自发荧光伪影进行了掩膜处理（STAR 方法）。P 代表前后轴，V 代表腹背轴，M 代表内外轴。比例尺为50微米。(B) 示例成像平面，显示通过本研究成像和分割算法识别出的感兴趣区域（ROIs）。我们从大多数分支区域中提取了大量ROI，但未在AF7中观察到功能性反应。A 和 L 分别代表前后轴和左右轴。比例尺为20微米。(C) 在不同刺激条件下，单个视网膜ROI对视觉刺激的激活或抑制反应具有一致性。图中展示了从270,596个ROI中随机选取的2,500个ROI的荧光反应。根据所有刺激下ROI对刺激开启与刺激关闭时期的选择性显著性（Wilcoxon 检验）对这些ROI进行排序。黄色实线和虚线分别代表刺激呈现的开始和结束时间。蓝线标记用于定义激活和抑制ROI群体的p值阈值((p = 0.05))。(D) 被激活和抑制的视网膜ROI数量显著高于随机水平，且不同分支区域中被激活或抑制的ROI占比存在差异。误差棒代表平均值的标准误，置信区间通过计数统计中的泊松变异性假设估算（((N=AF 4: 62,173)；AF5&6：59,450个；AF8：5,676个；AF9：73,722个ROI）。(E) 通过洗牌检验评估（STAR 方法），仅在AF5&6中，对漂移光栅具有方向选择性的视网膜ROI数量显著高于随机水平。具体而言，误差棒代表估算的95%置信区间，且仅在AF5&6中排除了0的随机水平。(F) 上图：最左侧列展示两个示例成像平面，包含AF5和AF6区域。偏好向左（向右）漂移光栅的ROI分别用青色（红色）标记。中间/最右侧列的图分别来自脑的左侧/右侧。最左侧图中的绿色框标记了子区域，其经旋转后在右侧以更高分辨率展示。A 代表前后轴，L 代表左右轴。比例尺：最左侧列30微米，其余列5微米。下图：上图中三个黄色圆圈标记的示例ROI的Z评分荧光轨迹。每个ROI均通过其对漂移光栅刺激的方向选择性识别，但它们对两点和三点滑行刺激也表现出方向选择性反应。(G) 左侧或右侧AF5&6中所有对向左或向右漂移光栅具有方向选择性的ROI的平均Z评分荧光轨迹。带星号的方向性刺激对在(p=0.01)水平上存在显著差异（单尾Wilcoxon检验）。其余所有方向配对刺激均未表现出统计学上的显著差异。(N=240 ROls)（左上）、330（左下）、234（右上）、449（右下）。另见图S3。

视网膜方向选择性包含滑翔器刺激

我们发现被激活的方向选择性感兴趣区域（ROIs）稀疏分布在AF5&6区域内及AF5/6边界附近（图4F，上图）。有趣的是，许多单个感兴趣区域对漂移光栅的方向选择性，还可泛化为赋予正向两点滑翔刺激、负向两点滑翔刺激（反向相位）以及每种三点滑翔刺激配置以方向选择性（图4F，下图）。此外，偏好向右运动光栅的感兴趣区域示例，也偏好与向右转向相关的滑翔刺激（图4F，下图，第1、3行）；而偏好向左运动光栅的感兴趣区域，则偏好驱动向左转向的滑翔刺激（图4F，下图，第2行）。

然而，并非所有被激活的方向选择性感兴趣区域都表现出有模式的滑翔刺激响应。例如，左侧AF5&6区域中所有向左选择性感兴趣区域的平均响应呈现出前述的选择性模式（图4G，左上），但右侧AF5&6区域中向左选择性的平均响应则表现出较弱的滑翔刺激调制，且对大多数三点滑翔刺激未表现出显著的方向选择性（图4G，右上）。向右选择性感兴趣区域也呈现出类似模式（图4G，下图），此时右侧AF5&6区域表现出更强的滑翔刺激选择性。

相比之下，在被抑制的AF5&6感兴趣区域中观察到的对光栅的较弱方向选择性（图4E），并未泛化到其他刺激对（图S3E）；且两个半球中均包含非方向选择性的感兴趣区域（图S3F）。这些结果表明，斑马鱼幼体视网膜能提取高阶运动刺激的方向选择性信号，且提示利用滑翔刺激可区分出多种方向选择性神经元群体。

尽管如此，视网膜感兴趣区域的响应幅度与刺激的运动强度和行为相关性并非完全匹配。例如，AF5&6区域中绝大多数（95%）被激活的方向选择性感兴趣区域，对无方向的不相关噪声均表现出显著响应。因此，我们推测顶盖前区的处理会对视网膜输入进行优化，以构建更适合驱动视动行为的视觉表征。

将顶盖前神经元建模为行为结果的阈值-线性整合

为了确定单个顶盖前神经元是否编码由滑翔刺激诱导的行为结果，我们将每个感兴趣区域的激活建模为几种行为预测因子的阈值线性组合（图5A；STAR方法）。具体而言，三个预测因子源自向左转向、向右转向和向前游动的平均行为频率，第四个预测因子代表非特异性刺激驱动（图2D和图5A）。这些模型通常能解释顶盖前区大部分神经元反应的方差，但无法解释AF5&6区的（图5B）。我们可以通过考虑AF5&6区精确的反应动力学来改善该区域的模型拟合度（图S4A和S4B），但这种改进后的模型形式仍能更好地拟合顶盖前区的感兴趣区域（图S4B）。我们发现准确的模型拟合贯穿整个顶盖前区（图5C），且模型轨迹成功捕捉了顶盖前区对经典运动和三阶滑翔刺激的反应（图5D；图S4D）。模型拟合完美揭示了许多方向选择性神经元，它们能精确追踪各种刺激相关性使向左或向右转向频率增加的幅度（图5D，轨迹1和轨迹2）。其他神经元表现出的反应模式类似于转向行为与向前游动行为的结合（图5D，轨迹3和轨迹4）。

正如图3D所预期的那样，顶盖前区的神经元根据其行为相关性在解剖学上进行了组织排列（图5E）。最明显的是，受向左和向右转动模式强烈影响的神经元分别定位于左侧和右侧顶盖前区（图5E，下图；图S4C）。我们还发现了沿前后轴的清晰组织分布，与转动相关的神经元位于更靠后的位置（图5E；下图，图S4C），而与向前游动或非特异性刺激驱动正相关的神经元则位于更靠前的位置（图5E，上图；图S4C）。这些系数图让人联想到图3中的方向选择性图，且只有当感兴趣区域（ROI）同时具有高方向选择性时，单个感兴趣区域的模型拟合才会出现较大的正向转动权重（数据未展示）。尽管顶盖前区神经元活动与平均行为结果之间存在这些强相关性，但顶盖前区的活动并不具有指导性，且在无行为输出的情况下也可能发生。例如，在5秒的刺激呈现期间，头部固定的斑马鱼幼体通常会对漂移光栅和正两点滑翔器产生定向反应（图S4E），但不会对反相位或三点滑翔器刺激产生反应（图S4F）。因此，顶盖前区对反相位和三点滑翔器刺激的反应必须由顶盖前区下游的机制进行门控，这可能是通过后脑或小脑中的竞争性处理实现的。总体而言，我们据此提出假设：顶盖前区整合具有方向选择性的视网膜输入（图S5），以构建一种可被下游运动中枢轻松读取的、具备行为就绪状态的编码。

图5. 单个顶盖前区神经元根据其对视动行为的影响来表征视觉运动刺激。(A) 模型架构示意图（STAR 方法学）。首先将行为回归子与模拟钙成像实验中可测量反应的时间核进行卷积。随后将回归子以加权和的形式组合，最终的阈值化步骤捕捉了所测得顶盖前区反应的非负性。我们用 N、F、L、R 分别表示非特异性刺激开启回归子、向前游动频率回归子以及左/右转频率回归子（STAR 方法学）。为简洁起见，我们仅展示前三种刺激的处理流程。(B) 所有被激活的感兴趣区域（ROI）的决定系数（R²，即模型解释的变异数比例）分布。需注意，当对 AF5&6 神经元的反应进行类似拟合时，与顶盖前区的情况相比，模型解释的变异数比例向更小的数值偏移。(C) 决定系数分布图，显示模型拟合质量在整个顶盖前区均较为一致。与图3一致，我们在解剖图（灰度）上叠加了冠状面（中心）、横断面（上方）、左矢状面（左侧）和右矢状面投影（右侧）。A 代表前后轴，V 代表腹背轴，L 代表左右轴。比例尺为 0.05 毫米。(D) 四个顶盖前区感兴趣区域（ROI）的示例轨迹，以及对应的模型拟合结果和决定系数值。前两个示例ROI显示的顶盖前区神经元对滑翔刺激有反应，其反应幅度与该刺激诱导的行为转向频率高度匹配。最后两个ROI显示其他顶盖前区神经元对滑翔刺激的反应相对无选择性。(E) 模型中使用的四种回归子的权重系数分布图。使用L或R回归子的感兴趣区域（ROI）分别定位于左侧或右侧顶盖前区。从N或F回归子获得正向驱动的感兴趣区域（ROI）定位于顶盖前区前部。所有图形约定均与图(C)一致。另见图S4和图S5。

讨论

视觉运动影响着多种行为学行为，因此进化要求视觉系统能够从自然的输入模式中准确估计运动。果蝇和灵长类动物的视觉运动估计经典模型均认为，光信号之间的成对相关性是基本运动检测的核心线索，而本研究中我们在斑马鱼行为中发现的时间频率调谐特性与模型预测及果蝇行为一致。尽管如此，对于复杂的自然刺激，成对运动估计的准确性有限。幸运的是，自然运动丰富的统计特性意味着多种高阶时空线索能够提供帮助。本研究中，我们发现三阶线索能在斑马鱼幼体中稳定引发运动引导行为，其模式与果蝇的相关特征惊人一致。值得注意的是，自然视觉场景的基本统计特征在多种视觉环境中普遍存在[，而包括果蝇、蜻蜓、斑马鱼幼体、猕猴和人类在内的多个物种的视觉系统，均已找到将二阶、三阶及更高阶相关性整合到运动处理算法中的方法。斑马鱼和果蝇转向行为的这种方向性特征，与先前理论研究的假设相符——该研究计算了果蝇应如何结合低阶相关线索，以最佳估计全视野运动的速度。因此，视觉运动估计的算法在动物界呈现出显著的趋同性王国，而自然感官统计数据为理解这些算法提供了宝贵的指导。由于先前的模型是基于自然陆地环境的统计数据构建的，因此确定斑马鱼所处的水下环境是否会改变任何预测将是一件有趣的事。

了解这些算法在视觉系统中的实现方式，能够为神经元计算的逻辑和机制提供更多见解。方向选择性出现在包括兔子、小鼠和斑马鱼在内的许多脊椎动物的视网膜中。然而，并非所有运动线索都存在于最早的方向选择性细胞中，而关于运动信号是在视网膜还是在中枢大脑中进行计算的问题目前尚不明]。本研究通过对视网膜神经节细胞轴突末梢进行功能性钙成像，证实斑马鱼视网膜能够为反向φ刺激和三点滑翔刺激计算出方向选择性运动信号。方向选择性的模式与视运动转向行为的方向性完全匹配。有趣的是，果蝇最早的方向选择性神经元也会对反向φ刺激产生反应，其方向性与行为相匹配。果蝇研究人员已发现，这种反应模式与霍恩-赖希特特单元（HRC）乘法运算的简单神经元实现方式相矛盾]，但它可以从运动能量模型、霍恩-赖希特特单元的空间分布式实现方式或具有生物物理真实性的神经元模型中产生。另一方面，针对三阶滑翔刺激的正确方向偏好仅在果蝇中，当单独的ON边缘和OFF边缘运动信号结合后便会出现这种现象。这表明AF5和AF6同时编码ON边缘和OFF边缘运动。我们的研究结果总体上支持斑马鱼视动反应所需的基本运动信号在视网膜中计算的假说。由于滑翔行为的方向性可根据自然场景下精确运动估计的需求来预测，这意味着视网膜的运动处理算法是针对自然感官环境的结构而定制的。此外，与全场运动相关的方向选择性特征特异性地靶向AF5和AF6，而此前已有研究证实这两个区域会对漂移光栅刺激引发的视动反应产生因果影响。因此，我们得以通过中枢大脑中特定的视网膜投射模式，将自然主义的视网膜计算与行为联系起来。

视网膜信号并不会直接投射到产生行为的后脑运动中枢，我们的数据支持一种逐渐形成的观点，即顶盖前区是一个中脑视觉区域，它会整合并优化视觉运动信号，以支持多种稳定行为。例如，已有研究表明，顶盖前区会以复现视动行为的幅度和潜伏期的方式，对多个方向的视觉运动信息进行双眼整合。本文进一步拓展了这一观点，指出顶盖前区还会整合方向选择性视网膜信号，以表征更复杂的运动信号，包括反向相位和滑翔刺激中的运动信号，其信号幅度能够为行为提供支撑。我们还进一步假设，这种功能架构将构成对二阶运动刺激产生视动反应的基础，而这些特性通常使顶盖前区能够很好地处理需要对局部运动信号进行长距离非线性整合的高阶运动信号。总体而言，这形成了一种与多种视觉运动刺激所引发的行为结果高度相关的表征[。这种表征在解剖结构上由具有相似方向调谐特性的偏侧化神经元群体构成，这可能使得顶盖前区能够向与转向行为相关的偏侧化后脑核团发出同侧长距离连接。更广泛地说，顶盖前区的传入和传出纤维种类繁多、数量丰富，这或许使其能够灵活地影响多种行为活动。

我们的研究数据支持这一观点：视网膜会提取自然视觉刺激的多种特征，而大脑中枢区域会根据这些特征与特定行为的相关性对其进行整合和优化。这一观点很可能适用于不同物种以及各类视觉引导的行为。小鼠拥有数十种功能各异的视网膜神经节细胞（RGC）类型。在斑马鱼幼体中，许多解剖结构不同的RGC会向对侧的十个听觉纤维（AF）发出投射。这些投射的不均匀性很容易将视觉特征传递至相应的靶区。例如，听觉纤维7（AF7）中的RGC会对天然和人工猎物刺激产生特异性反应，而这些反应又能驱动视顶盖中与猎物捕获相关的神经环路。此外，听觉纤维6（AF6）、听觉纤维8（AF8）和听觉纤维9（AF9）会处理暗 looming和暗变刺激，其中听觉纤维9（AF9）对亮 looming和亮度增加的反应更为强烈，而这些视网膜反应可通过视顶盖的视觉处理驱动逃逸行为。最后，视动反应和视动反应结合了多种行为模式，而AF4、AF5、AF6、AF9以及顶盖前区均与它们的某些方面存在关联。未来仍需开展研究，以更全面地明确视网膜特征与特定听觉特征（AFs）、下游脑区及最终行为之间的功能对应关系。

视觉运动估计是所有动物都需要完成的一项计算任务。通过对比进化对这一问题的解决方案，我们能更好地理解神经回路之间的异同。相似性指向进化趋同。例如，明暗不对称是滑翔体处理的基础，而果蝇和灵长类动物中滑翔体处理的神经实现都涉及将信号分离为边缘激活通道和边缘抑制通道。我们目前的研究结果表明，脊椎动物视网膜内的开/关分离机制或许可用于在斑马鱼中生成对滑翔体刺激的反应。差异同样具有重要意义，因为它们可能揭示了同一计算算法的多种实现方式。例如，多种回路架构都可能提取滑翔体信号。此外，已有研究表明灵长类动物的皮层参与了滑翔体的处理，但我们目前的数据显示，在斑马鱼体内，这些信号在视网膜中就已存在。这表明脊椎动物的大脑已经探索出了视觉处理的多种策略。例如，部分物种的视网膜中可能拥有高度特化的特征检测器，而另一些物种则可能依赖更通用的视网膜表征。类似地，引导注意力的显著图可能出现在不同脊椎动物物种的可变脑区。这种物种层面的差异或许能为探究细微的进化和行为学因素如何影响神经计算提供线索。本研究为将斑马鱼幼鱼确立为研究视觉运动处理背后神经计算的比较研究强大模型迈出了重要一步。我们预计，在这种可活动的脊椎动物中开展全脑成像所带来的独特优势，将在针对运动引导行为和决策复杂方面的比较研究中发挥关键作用。

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苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。