标题： Germline Stem Cells Drive Ovary Regeneration in Zebrafish

期刊：Cell Reports

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.01.061

摘要

生殖系干细胞（GSCs）在生物体的生命周期中维持着配子发生过程。尽管有证据表明生殖系干细胞持续存在于斑马鱼卵巢中并支持卵子发生，但生殖系干细胞是否参与斑马鱼卵巢再生的相关机制仍知之甚少。本研究发现，脊椎动物生殖系干细胞的保守标记基因nanos2是维持斑马鱼生殖系干细胞所必需的。我们通过遗传消融和组织切除技术，明确了生殖系干细胞在斑马鱼卵巢再生中的功能。生殖系干细胞被消融后，卵巢无法再生并转化为不育的精巢。残留生殖系干细胞的增殖使被切除的卵巢组织完全再生，而由于缺乏生殖系干细胞，nanos2突变体的卵巢在切除后无法再生。Wnt信号通路的抑制会导致生殖系干细胞数量减少以及卵巢再生延迟。本研究结果揭示了生殖系干细胞在驱动卵巢再生过程中的关键作用。

图形摘要

引言

干细胞是一类能够自我更新并产生分化子代细胞的细胞群，在胚胎发育、组织稳态和再生过程中发挥重要作用。生殖系干细胞是一种单能干细胞类型，因为它仅能分化为两种终末细胞类型，即精子或卵母细胞（Yuan 和 Yamashita，2010）。在哺乳动物卵巢中，卵子发生在出生后完成。学界普遍认为，出生后卵巢的卵母细胞数量固定且无法更新（Smith 等人，2014）。有少数研究表明，哺乳动物出生后卵巢中存在类胚生殖干细胞和有丝分裂卵原细胞，但这一观点仍存在争议（Eggan 等人，2006；Johnson 等人，2004；Zou 等人，2009）。不过，一些低等脊椎动物一生都能保持高繁殖力，这表明其成熟卵巢中存在生殖系干细胞。在成年青鳉鱼的卵巢中，研究人员通过谱系追踪实验鉴定出了生殖系干细胞，这些细胞由 nanos2 特异性标记，周围环绕着表达 sox9b 的体细胞（Nakamura 等人，2010）。有研究表明，斑马鱼卵巢中存在生殖系干细胞，其存在对斑马鱼的繁殖能力维持具有重要作用。卵母细胞的产生（Beer 和 Draper，2013；Draper，2017；Draper 等人，2007；Wong 等人，2011）。但这一过程中涉及的关键因素仍有待阐明。

斑马鱼具有强大的再生能力，成为研究器官再生细胞和分子机制的重要脊椎动物模型（Gemberling 等人，2013）。常用的技术包括甲硝唑（MTZ）和细菌硝基还原酶（NTR）介导的特定细胞类型消融（Curado 等人，2007；He 等人，2014）以及组织切除或损伤（Poss 等人，2002）。低等脊椎动物（如鱼类）的生殖器官具备强大的再生能力。例如，在 Tg(zpc:G4VP16/UAS:NfsB-mCherry) 转基因背景下，成年斑马鱼的卵母细胞经 MTZ 消融后可实现恢复（White 等人，2011）。尽管已有研究提出卵巢再生源于残留生殖细胞增殖的观点，但生殖干细胞（GSCs）在卵巢再生中的作用及功能机制却鲜有报道。

已有研究表明信号通路可调控组织再生（川上等人，2006；威尔斯等人，2008；赵等人，2014）。然而，参与性腺再生的信号通路目前尚不清楚。Wnt 信号通路调控脊椎动物的卵巢发育和性别决定（沙索等人，2011；奈拉特等人，2010；斯里尼瓦桑等人，2014；瓦伊诺等人，1999）。因此，Wnt 信号通路是否在生殖干细胞行为和卵巢再生中发挥调控作用值得进一步研究。

本研究发现，nanos2 基因突变会导致生殖干细胞（GSCs）缺失并引发雌性向雄性的性逆转，揭示了 nanos2 在斑马鱼生殖干细胞维持中的作用。此外，本研究借助 Tg(vasa:Dendra2-NTR-vasa (3'UTR) ^{c 41})) 转基因品系，构建了遗传消融和组织切除两种斑马鱼卵巢再生模型。研究数据表明，卵巢再生主要由生殖干细胞（GSCs）驱动，而 Wnt 信号通路在此过程中发挥调控作用。

结果

Nanos2 对生殖干细胞的维持是必需的

与青鳉鱼（中村等人，2010）类似，斑马鱼nanos2基因仅在雌性和雄性性腺中具有生殖干细胞特征的细胞中特异性表达（比尔和德雷珀，2013；德雷珀，2017）。为了研究nanos2基因的功能，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了两个斑马鱼nanos2基因突变等位基因（张等人，2013；赫鲁沙等人，2013），在该基因座中，nanos2基因的两个和七个碱基对（bps）发生了分别被删除。这些缺失导致开放阅读框发生移码，并在 Nanos2 锌指-nanos RNA 结合结构域中产生了提前终止密码子（图1A和1B）。nanos2 在两性双潜能性腺中的表达始于受精后21天（dpf）（Beer 和 Draper, 2013）；因此，突变性腺的分析均在该时间点之后进行。在受精后21天、25天和28天，突变性腺与野生型（WT）相比未观察到差异（图1C–1E''），这表明生殖干细胞（GSCs）的建立不依赖于 nanos2。然而，在性别已确定的受精后32天，被 nanos2 特异性标记的生殖干细胞在 nanos2 突变体中消失（图1F–1F''）。受精后35天，与野生型相比，nanos2 突变体卵巢中的早期生殖细胞（包括有丝分裂分裂的卵原细胞和活跃进入减数分裂的细胞（IA期卵母细胞））消失（图1G–1G''）。nanos2 突变体精巢在受精后35天无生殖细胞存在（图S1A和S1B）。从受精后60天到75天，根据突变性腺、泄殖腔和鳍部色素的表型转化，雌性 nanos2 突变体发生性逆转成为雄性，且无可检测到的生殖细胞（图S1C–S1K''）。最终，由于缺乏生殖干细胞，nanos2 突变体全部发育为不育的雄性个体（图1H–1J''）。这些结果表明，斑马鱼 nanos2 是维持生殖干细胞所必需的，这与小鼠睾丸中 nanos2 维持生殖干细胞的需求相似（Sada 等人, 2009）。

为进一步验证 nanos2 在卵巢维持中的作用，我们构建了 Tg(hsp70l:nanos2-nanos2 30UTR)cq42 转基因品系（简称为 Tg(hsp70l:nanos2)cq42），以在 nanos2 突变体中补充 Nanos2。从受精后第21天（21 dpf）开始，每天进行一次热激处理，并在受精后第40天（40 dpf）对卵巢进行分析。结果显示，补充 Nanos2 后，突变体卵巢中确实出现了早期生殖细胞，与野生型相似（图1L-1N），这表明补充 nanos2 能够挽救卵巢维持的缺陷。

图1. nanos2 对维持生殖干细胞至关重要。（A）nanos2 基因组结构及突变基因型的示意图。（B）野生型（WT）及两种突变体（锌指-nanos，Zf-nanos）的 nanos2 蛋白功能域示意图。（C–G）野生型（WT）和 nanos2 纯合突变体在受精后21（C）、25（D）、28（E）、32（F）和35（G）天的体长。（C0–G00）野生型和 nanos2 纯合突变体在受精后21、25、28、32和35天卵巢中 nanos2 荧光原位杂交（FISH-nanos2）、Vasa 抗体免疫染色与4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色的三重荧光标记结果。可见突变体从受精后32天开始出现生殖干细胞（GSCs）缺失（箭头指示）。（H–J）成年野生型雌性（H）、nanos2 突变体（I）和野生型雄性（J）。（H0–J0）性腺侧视图。（H00–J00）性腺切片的苏木精-伊红（H&E）染色结果显示，所有 nanos2 突变体均发育为不育雄性。（K–M）热激处理后40天，携带（L）或不携带（K）Tg(hsp701:nanos2) 转基因背景的 nanos2 突变体，以及野生型（M）经 Vasa 抗体免疫染色与 DAPI 双染色结果，表明过表达 nanos2 可挽救 nanos2 突变体的表型。箭头指示早期生殖细胞。Oo，卵原细胞；IAz，偶线期IA期；IB，IB期卵母细胞。比例尺：500 微米（C–G）、50 微米（C0–G00）、1 毫米（H0–J0）、200 微米（H00–J00）、50 微米（K–M）。另见图S1。

生殖干细胞的基因消融导致卵巢再生失败

为研究生殖干细胞（GSCs）在斑马鱼卵巢再生中的作用，我们构建了Tg(vasa: Dendra2-NTR-vasa (3'UTR) ^{eq41 }))转基因品系，简称为Tg(vasa:DenNTR)cq41，该品系中荧光蛋白Dendra2与硝基还原酶（NTR）融合，并由生殖细胞特异性启动子vasa驱动。有研究报道Tg(vasa:egfp)仅在卵母细胞中表达，而在减数分裂前细胞中不表达（Leu和Draper, 2010）。在我们的转基因品系中，Dendra2与Tg(vasa:DenNTR)cq41雌性生殖细胞中的Vasa完全共定位（图2A），表明Dendra2能够标记所有生殖细胞。

三个月大的成年 Tg(vasa:DenNTR)cq41 雌性斑马鱼（图2B和图2B'）经8毫摩尔甲硝咪唑（Mtz）处理一周，以消融生殖细胞。处理后第5天（dpt），卵巢体积大幅减小（图2C和图2C'）。此外，与对照组相比，除I、II期卵母细胞外，其余所有生殖细胞均被消融（图2B''和图2C''）。处理后第30天，尽管卵巢体积有所增大（图2D），但绿色荧光蛋白（Dendra2）的表观荧光（图2D'）以及早期生殖细胞均已无法检测到（图2D''）。处理后第60天，卵巢中仅存V期成熟细胞（图2E至图2E''）。尽管雌性斑马鱼在 （注：原文末尾未完整，译文保留对应截断状态；专业术语如Tg品系、Mtz、Dendra2、dpt等按领域惯例保留原文缩写，ovary译为卵巢，oocytes译为卵母细胞，stage I/II/V按生殖发育阶段译为I/II/V期）这一阶段仍能产卵，但大部分卵子均无法受精（表S1）。最后，在处理后第90天，经甲硝咪唑（Mtz）处理的Tg(vasa:DenNTR)cq41雌性个体逆转为可育雄性（图2F–2F00及图S2A–S2H）。

为进一步确认生殖干细胞（GSCs）是否被甲硝唑（Mtz）完全清除，研究人员进行了瓦萨（Vasa）抗体染色实验，结果显示处理后第5天（5 dpt）的卵巢中不存在早期生殖细胞（图S2I、S2I）。此外，处理后第5天的卵巢不表达nanos2基因（图S2K、S2L）以及减数分裂起始标记基因sycp3（Lammers等人，1994）（图S2M、S2N），这表明生殖干细胞和减数分裂起始细胞已被完全清除。去除甲硝唑后，卵巢中未出现早期生殖细胞，且由于缺乏生殖干细胞，雌性个体无法持续产生卵母细胞。卵巢中的卵母细胞数量有限，这与哺乳动物产后卵巢的情况类似。由于生殖细胞对维持斑马鱼卵巢功能至关重要（Dranow等人，2013；Siegfried和Nüsslein-Volhard，2008；Tzung等人，2015），经甲硝唑处理的雌性斑马鱼会排出所有成熟卵母细胞，并最终转变为不育的雄性个体（图S2A–S2H）。此前有研究表明，从成年斑马鱼卵巢中分离的减数分裂前生殖细胞移植到不育斑马鱼体内后，可恢复生殖细胞的产生和生育能力（Wong等人，2011），而本研究结果也证实，缺乏生殖干细胞时斑马鱼卵巢无法完成再生。

图2. GSC基因消融后卵巢再生有缺陷，最终发生性别逆转。（A）Vasa蛋白和vasa的比较：卵巢中的DenNTR表达显示Dendra2与Vasa完全重叠，表明vasa：DenNTR能够标记所有的生殖细胞。检测到（D00）。（C-C00）在5 dpt时，卵巢大小大大减小（C和C0），除了I期和II期卵母细胞外，生殖细胞被Mtz（C00）消融。（D-D00）卵巢变大，在30 dpt时有成熟的卵母细胞（D），但观察到少量绿色荧光（D0），早期生殖细胞不是细胞（B00）。（E-E00）到60 dpt时，鱼卵巢只有V期细胞。（F-F00）缺乏生殖细胞的睾丸（箭头）出现在90 dpt时，显示用Mtz治疗的雌性恢复为不育雄性。Oo，卵母细胞；IAz，偶线期-IA；IA，IA期卵母细胞；IB，IB期卵母细胞；II，II期卵母细胞；III，III期卵母细胞；IV，IV期卵母细胞；V，V期卵母细胞。比例尺：50毫米（A）、1毫米（B-F0）、200毫米（B00-F00）。另见图S2。（B-B00）大约3个月大的Tg（vasa： DenNTR）cq41雌性有明亮的卵巢（BF）（B）、强烈的绿色荧光（B0）和不同阶段的胚芽

GSCs 增殖并推动卵巢再生

为探究生殖干细胞（GSCs）在卵巢再生中的作用，本研究采用卵巢组织切除术作为另一种再生模型。在受精后50天（50 dpf），约95%的左侧卵巢组织被切除（图3A、3B和3F）。卵巢在切除后5天（5 dpa）几乎未发生再生（图3C和3F）。然而，在切除后15天（15 dpa），剩余的卵巢组织出现了约十倍的扩增（图3D和3F）。到切除后30天（30 dpa），卵巢再生至与切除前相当的大小（图3E和3F）。在受精后约50天，接受卵巢切除的雌性鱼能够产生可受精的卵子，表明其生殖功能已完全恢复。相比之下，当左侧卵巢被完全切除时，卵巢未发生再生（图3A0–3F0），这说明剩余的卵巢组织是卵巢再生的关键。此外，在4月龄成鱼中切除大部分左侧卵巢组织后，卵巢在20 dpa时完成再生（图S3A）。这些结果证实了斑马鱼卵巢具有强大的再生能力。

为确定再生是否由剩余卵巢组织中的生殖干细胞（GSCs）介导，我们通过 nanos2 荧光原位杂交（FISH）和 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）标记实验评估了生殖干细胞的数量与增殖情况。与 50 天胚胎期（dpf）、65 天胚胎期和 80 天胚胎期等不同阶段的对照组相比，截肢后第 15 天（dpa，相当于 65 天胚胎期）卵巢中增殖的生殖干细胞数量显著增加（图 3G-3L）。定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）结果显示，与对照组相比，15 天截肢/65 天胚胎期阶段 nanos2 的表达水平上调（图 3M），提示损伤信号激活了生殖干细胞的增殖。成年卵巢再生过程中也获得了类似结果（图 S3B-S3D）。上述数据表明，卵巢损伤可激活残留生殖干细胞的增殖。

为探究生殖干细胞（GSCs）在卵巢再生中的功能意义，本研究分析了在生殖干细胞维持方面存在缺陷的 nanos2 突变体。由于 nanos2 突变体中生殖干细胞的完全缺失最初出现在受精后32天（图1F00），因此在该阶段对卵巢进行了切除操作。与野生型卵巢在一周内逐渐再生的情况不同（图4A-4E），nanos2 突变体在切除后4天和7天观察到卵巢再生存在缺陷（图4A0-4D0和4E）。然而，在 Tg(hsp70l:nanos2) 背景下，从受精后21天开始通过持续热休克补充 Nanos2，能够挽救 nanos2 突变体中卵巢再生的缺陷（图4A00-4D00和4E）。此外，在切除后4天，nanos2 突变体中表达 nanos2 的生殖干细胞已不存在（图4F和4G）。这一点通过 ziwi 的荧光原位杂交（FISH）得到了证实，ziwi 通常在生殖干细胞（GSCs）和其他生殖细胞（如 vasa 阳性细胞）中均有表达（图4H、4I）。由于 nanos2 突变体在受精后35天（35 dpf）既缺失生殖干细胞（GSCs）也缺失其他生殖细胞（图1G、4G、4I），我们进一步探究了卵巢再生主要是由生殖干细胞（GSCs）驱动，还是由现有生殖细胞的增殖驱动。研究人员从受精后21天（21 dpf）开始持续进行热休克处理，直至受精后34天（2 dpa，即热休克处理后2天）停止。在热休克处理结束后的第2天（受精后36天，4 dpa），再生卵巢中除了 nanos2 阳性的生殖干细胞（GSCs）外，其余所有生殖细胞均未消失（图4J）。因此，从受精后36天（4 dpa）到受精后39天（7 dpa），热休克处理的终止导致卵巢再生停止（图4A、4D、4E）。这些结果表明，生殖干细胞（GSCs）是卵巢再生所必需的。

图3.卵巢再生过程中残留的GSC高度增殖。（A-E）左卵巢大部分切除，1个月可完全恢复斑马鱼卵巢在50 dpf/截肢前（A）、0（B）、5（C）、15（D）、30（E）dpa箭头表示剩余或再生的卵巢组织（((n=5))（A0-E0）左卵巢完全截肢导致再生失败（((n=5))（F和F0）0、5、15、30 dpa处卵巢表面积的量化值表示最大左卵巢表面积的大小（n=5，mea((n = 5)，平均值±SEM，(^{* *} p<0.001)，双尾t检验，误差条表示SEM）。（G-J）用FISH-nanos2、抗Vasa抗体和EdU在不同阶段对卵巢进行三重荧光标记，包括50（G）、65（I）和80（J）dpf未截肢，以及截肢后15 dpf/65 dpf（H）。注意15 dpa时nanos2阳性细胞（箭头）的数量和增殖增加。（K）截肢前和15 dpa、65 dpf和80 dpf时每个左卵巢的nanos2阳性细胞的定量（n=7，mea((n=7)，平均值±SEM，(^{* * *} p<0.001)，双尾t测试，误差条表示SEM）。（L）截肢前和15 dpa、65 dpf和80 dpf时每个左卵巢的nanos2+EdU+双阳性细胞的定量。（n=7，mea((n=7)，平均值+SEM，(^{*} p<0.01)(p 0.05)*p<0.05，双尾t测试，误差条表示SEM）。（M）nanos2表达水平通过qRT-PCR测量((n=7)，平均值+SEM，(^{* *} p<0.001)，双尾t检验，误差条表示SEM）比例尺：1 mm（A-E0），50 mm（G-J）另见图S3。

图4. nanos2突变体的卵巢无法再生。（A–D0）对携带Tg(vasa:DenNTR)cq41转基因背景的野生型幼鱼，分别在截肢前/32天胚胎期（dpf）（A）、截肢后0天（dpa）（B）、4天（C）和7天（D）对其卵巢进行成像。对nanos2突变体在相同阶段（A0–D0）进行成像，结果显示其卵巢再生情况远不及野生型（A–D）。（A0–D0）携带Tg(vasa:DenNTRcq41; hsp70l:nanos2cq42)遗传背景的nanos2突变体幼鱼，从21天胚胎期开始进行热休克处理，并在32天胚胎期对卵巢进行截肢。（A00–D00）热休克处理从21天胚胎期持续至截肢后7天/39天胚胎期。（A000–D000）热休克处理从21天胚胎期持续至截肢后2天/34天胚胎期。（E）对野生型和nanos2突变体在截肢后0、4、7天的卵巢表面积进行定量分析。(= 5)，均值±标准误（SEM），(^{* * *} p<0.001)，(^{*} p<0.01)，NS表示无显著性差异，双尾t检验，误差棒代表标准误。（F和G）对截肢后4天野生型（F）和nanos2突变体（G）的卵巢，采用FISH-nanos2、抗Vasa抗体和DAPI染色进行三重荧光标记。（H和I）对截肢后4天野生型（H）和nanos2突变体（I）的卵巢，采用FISH-ziwi和DAPI染色进行双重标记。（J）对nanos2纯合突变体卵巢，从21天胚胎期至截肢后2天进行热休克处理，在截肢后4天采用nanos2 RNA探针、Vasa抗体和DAPI染色进行三重荧光标记。比例尺：500微米（A–D000），50微米（F–J）。

抑制Wnt信号通路会损害卵巢再生

Wnt信号通路在斑马鱼性别决定和卵巢发育的调控中发挥重要作用（Sreenivasan 等人，2014）。为探究Wnt信号通路在再生过程中的参与机制，我们首先检测了淋巴细胞增强因子的表达结合因子1（lef1）是一种Wnt靶基因（川上等人，2006年）。与术后0天相比，术后2天lef1的表达上调（图5A和图5B），这表明损伤后Wnt信号通路被激活，且其可能参与卵巢再生过程。

为进一步研究 Wnt 信号通路在卵巢再生中的功能意义，构建了 Tg(hsp70l:dkk1b-GFP) 转基因品系结合诱导型Dickkopf（一种Wnt信号通路的分泌型抑制剂）进行处理。对(Tg(vasa:DenNTR ^{c q 41}) ; hsp70l:dkk1b-GFP双转基因幼鱼进行卵巢切除术后，每日热休克2小时。术后5天，Dkk1b-GFP的异位表达导致卵巢再生延迟（图5C-5E），同时生殖干细胞（GSCs）数量显著减少，nanos2的表达水平也有所降低（图5F-5H）。为验证上述结果，研究人员使用了Wnt信号通路的化学抑制剂XAV939。XAV939处理后，卵巢再生同样出现延迟（图S4A-S4C），生殖干细胞数量及nanos2的表达均出现下降（图S4D-S4F）。这些结果表明，抑制Wnt信号通路会抑制生殖干细胞的增殖和卵巢的再生。

为了进一步探讨成纤维细胞生长因子（FGF）和骨形态发生蛋白（Bmp）信号通路是否参与卵巢再生，使用Tg（hsp70l： dnfgfr1-EGFP）和Tg（hsp70l：dnbmpr1-GFP）转基因背景或化学抑制剂BGJ-398和DMH1的遗传抑制分别用于抑制FGF和Bmp信号转导。既不异位表达dnFgfr1-EGFP/dnBmpr1-GFP（图S5A-S5C）也不BGJ-398/DMH1（图S5D-S5F）影响卵巢再生，表明FGF和Bmp信号不参与卵巢再生。

图5. Wnt信号被激活并调节卵巢再生。（A）lef1的RNA荧光原位杂交显示lef1在2 dpa（H）nanos2表达水平上的表达上调，通过qRT测量，与0 dpa相比。（B）lef1表达水平通过qRT-PCR测量((^{++*} p<0.001)，双尾t测试，误差条表示SEM）。（C）与热休克野生型（hsWT）相比，dkk1b-overexpressing鱼的卵巢再生在5 dpa时被阻断。红线表示截肢后两个剩余卵巢组织之间的距离。（D）hsWT红线长度的量化同一组((n=7))（E）hsWT和hsDkk1b再生比率的量化在5dpa((n=7)，平均SEM，(^{++*} p<0.001)，双尾t测试，误差条表示SEM）。（F）在hsWT和hsDkk1b鱼中使用nanos2 RNA探针、Vasa抗体和DAPI染色进行三重荧光标记，在5 dpa。箭头指向GSCs。（g）在5 dpa（((n=7)平均值±SEM，(^{*} p<0.01)，双尾t测试，误差条表示SEM）下定量每个左卵巢残余卵巢中的GSC数量。hsDkk1b在0 dpa和5 dpa下PCR(= 7).平均值±SEM，(^{* *} p<0.001).双尾t测试，误差条表示SEM）。比例尺：100 mm（A）、1 mm（C）、50 mm（F）。另见图S4和S5。

讨论

（A）lef1的RNA荧光原位杂交显示lef1在2 dpa（H）nanos2表达水平上的表达上调，通过qRT测量，与0 dpa相比。（B）lef1表达水平通过qRT-PCR测量((^{++*} p<0.001)，双尾t测试，误差条表示SEM）。（C）与热休克野生型（hsWT）相比，dkk1b-overexpressing鱼的卵巢再生在5 dpa时被阻断。红线表示截肢后两个剩余卵巢组织之间的距离。（D）hsWT红线长度的量化同一组((n=7))（E）hsWT和hsDkk1b再生比率的量化在5dpa((n=7)，平均SEM，(^{++*} p<0.001)，双尾t测试，误差条表示SEM）。（F）在hsWT和hsDkk1b鱼中使用nanos2 RNA探针、Vasa抗体和DAPI染色进行三重荧光标记，在5 dpa。箭头指向GSCs。（g）在5 dpa（((n=7)平均值±SEM，(^{*} p<0.01)，双尾t测试，误差条表示SEM）下定量每个左卵巢残余卵巢中的GSC数量。hsDkk1b在0 dpa和5 dpa下PCR(= 7).平均值±SEM，(^{* *} p<0.001).双尾t测试，误差条表示SEM）。比例尺：100 mm（A）、1 mm（C）、50 mm（F）。另见图S4和S5。

先前的研究表明，nanos2的表达仅限于次和小鼠的GSC（Nakamura等人，2010年；Sada等人，2009年）。尽管迄今为止，仅在小鼠睾丸中报告了显示nanos2在维持GSC中的作用的突变分析（Sada等人，2009年），但这种功能在脊椎动物中可能是保守的。这项研究中斑马鱼nanos2突变体的卵巢表型与先前描述的nanos3突变体相似（Beer和Draper，2013年；Draper等人，2007年），表明部分冗余的作用然而，nanos3仅在女性中表达（Draper等人，2007年），而nanos2在卵巢和睾丸的GSC中都可以检测到（Beer和Draper，2013年），因此能够维持女性和男性的GSC。

已经生成了三个NTR-Mtz模型来消融生殖细胞。其中两个是使用zp启动子建立的（Huu et al.，2010； White et al.，2011），剩下的一个是基于ziwi启动子的（Dranow et al.，2013）。因为zp只在卵母细胞中表达（Liu et al.，2006；Onichtchouk et al.，2003），所以这些模型不能消融GSC。ziwi，类似于vasa，在所有生殖细胞中都可以检测到（Houwing et al.，2007；Leu和Draper，2010）。但是温和的Mtz处理条件并没有完全消融GSC。因此，用Mtz处理的Tg（ziwi：CFP-NTR）雌性最终恢复为可生育的雄性（Dranow et al.，2013）。我们的模型在5 dpt退出Mtz后的卵巢表型与35 dpf的nanos2突变体的卵巢表型相似，其中GSC缺失。需要最少数量的卵母细胞来维持斑马鱼中稳定的雌性表型（Dranow et al.，2013；齐格弗里德和N欧元usslein-Volhard，2008； Tzung et al.，2015），类似于产后哺乳动物卵巢，由有限的卵子数量赋予。用Mtz治疗的雌性中的性别逆转表明GSC对于维持雌性斑马鱼的多产生殖能力和性表型至关重要。

卵巢截肢实验展示了斑马鱼卵巢的再生能力，可用于卵巢再生的细胞和分子机制的进一步研究。两个月大的卵巢一般只含有少量的GSC，主要定位在卵巢GSC生态位中（Beer和Draper，2013；谢，2008）。当一侧的大部分卵巢组织被移除时，损伤微环境刺激剩余卵巢GSC的增殖。Nanos2突变体中Nanos2从21 dpf到2 dpa/34 dpf的补给在4 dpa时恢复除nanos2+GSCs之外的所有类型的生殖细胞，这导致4 dpa后卵巢再生停止。这些结果突出了GSCs在卵巢再生中的基本作用，但不排除现有生殖细胞通过转化为nanos2+GSCs来支持再生的可能性。需要进一步的谱系追踪或移植实验来解决这个问题。

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苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。