标题：Brainstem circuits encoding start, speed, and duration of swimming in adult zebrafish

期刊：Neuron

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.10.034

摘要

运动行为的灵活性需要对其起始、持续时间和速度进行精准控制。脑干回路如何编码并传递这些运动参数目前仍不明确。本研究结合成年斑马鱼的体内钙成像、电生理、解剖学和行为学方法来解答这些问题。我们发现，运动行为的详细参数由内侧纵束核内两个在分子、拓扑和功能上均相互分离的谷氨酸能神经元亚群所编码。vGlut2+ 神经元编码运动起始、持续时间及速度变化，而 vGlut1+ 神经元编码向高速/高幅度运动的突然转变。消融 vGlut2+ 神经元会损害慢速探索性游泳行为，消融 vGlut1+ 神经元则会破坏快速游泳行为。本研究结果为不同的脑干亚群如何实现灵活的运动指令提供了机制层面的见解。这两个脑干指令亚群的组织形式使其能够整合环境信号，进而产生灵活的游泳运动，以匹配动物的行为需求。

图形摘要

引言

运动是一种普遍的运动行为，对整个动物界多种行为模式的表达至关重要。运动行为并非刻板不变，而是需要高度的灵活性，以依情境匹配行为需求。动物始终会面临需要精准控制运动过程时长、方向、速度和力度的情境。因此，必然存在编码运动行为不同参数的机制，但这些机制的本质及参数的调控方式一直难以阐明。  参与运动控制与表征的关键皮层下区域在整个脊椎动物谱系中高度保守。这些区域会先整合多种感官信号与整体内部状态，再激活脑干中的不同神经核团，随后脑干将相应的运动指令传递至脊髓的运动神经环路。 研究逐渐揭示了脑干中不同的亚核如何启动并控制不同形式的运动。例如，中脑运动区（MLR）可驱动向前运动并调控其速度，且其内部存在对运动行为有独立贡献的亚群。光遗传学激活小鼠楔状核（CnF）中的谷氨酸能神经元，可引发与逃逸相关的高速运动，而不同脚桥核（PPN）中的神经元已被赋予多种功能，包括探索或运动停止。

这些研究开始将特定的神经元亚群与运动和身体运动不同特征的控制联系起来。然而，目前尚不清楚最终的脑干指令是否以及如何以精确且恰当的方式构建并传递至脊髓回路。事实上，大多数中脑运动区神经元并不直接投射到脊髓回路，而是其轴突活性通过下行网状脊髓神经元传递。运动控制的另一个方面是，在没有外部线索的情况下，运动参数的复杂调控是否在特定的大脑回路中存在内部表征。因此，为了更好地理解特定神经元群如何编码运动动作的持续时间、方向和速度，获取运动动作前后脑干下行神经元精确的时间激活信息是十分必要的。

在哺乳动物中，解析单个神经元在持续行为过程中的活动模式一直是一项挑战。斑马鱼是一种脊椎动物模型系统，它使得在持续行为过程中对特定神经元进行记录成为可能，并且其脊髓运动网络的组织在神经元和环路层面都极为清晰。与哺乳动物类似，逃逸运动和探索运动由不同的脑干区域驱动。毛特纳细胞及其同源细胞的激活会引发逃逸行为，而后脑内一类谷氨酸能神经元已被证实可引发游泳行为。然而，最终启动并控制运动行为特性的高级下行指令通路，其具体机制仍有待明确，尤其是在成年斑马鱼中。内侧纵束核（nMLF）具备多项关键特征，表明该区域参与运动的高级调控。该核团包含神经元，其轴突构成内侧纵束，直接投射至后脑和脊髓，并接收包括视觉与前庭信息在内的汇聚性感觉输入。nMLF 内的神经元是否具有内在活性并编码运动的复杂参数，这一问题尚未完全阐明。对幼体斑马鱼开展的钙成像和神经元消融研究，已为 nMLF 赋予了不同功能，但这些功能尚无法完全统一，有研究支持其在驱动视觉诱导的游泳行为中发挥作用，也有研究表明其参与尾部姿势调控。 这些相互矛盾的研究结果凸显了深入了解 nMLF 内神经元的功能多样性及其在行为过程中活性变化的必要性。

本研究利用成年斑马鱼对构成nMLF的神经元亚群进行了鉴定与功能解析。研究人员根据谷氨酸能神经元在nMLF中的位置、特定囊泡转运蛋白的表达情况，以及其在不同运动形式下的独特募集模式，对其进行了特征分析。结果显示，尽管广泛的nMLF群体均表达转录因子Pitx2c，但它们在分子层面可分为两个不同的亚群，分别优先表达囊泡谷氨酸转运体1或2（分别为vGlut1和vGlut2）。这两个亚群具有地形组织特异性：vGlut2+神经元位于内侧，而vGlut1+神经元占据nMLF的外侧区域。这种分子与地形的分离特性也延伸至两个亚群的功能活动模式。vGlut2+ nMLF神经元的活动可编码运动事件的起始与持续时间，且其放电频率随运动速度升高而增加；而vGlut1+ nMLF神经元的活动则编码运动向高游速、大幅值运动模式的转变。对这两类神经元群体的选择性消融实验表明，vGlut2+神经元参与运动的启动过程，而vGlut1+神经元则在快速运动时调控运动速度与幅值的提升。综上，本研究揭示了脑干下行神经元存在两个独立的亚群，各自编码运动行为的特定参数，证明运动指令在传递至脊髓神经网络前，会经过精细的加工与构建。

结果

下行脑干回路的组织

本研究采用生物素化葡聚糖逆行标记法，对成年斑马鱼中直接投射至脊髓的脑干神经元组织方式进行了检测（图1A）。从脊髓吻侧进行逆行标记后，共标记出四个主要脑干区域。不同胞体大小的神经元沿延脑的吻尾轴分布，其中许多小型神经元位于尾侧的下网状结构（IRF；图图1A）。在中间网状结构（IMRF）中，标记出了大量大型神经元，包括控制逃逸行为的毛特纳细胞及其两个系列同源物MiD50px和MiD75px17（图1A）。位于峡部和三叉神经被盖神经纤维区域的上网状结构（SRF）包含中型神经元，此前研究已证实这些神经元在前向运动过程中会被激活38,39。最后，直接向脊髓投射的最吻侧脑干神经元位于中脑的nMLF（图1A）。

在背侧中脑核（nMLF）中，每侧平均有27±7个逆行标记的神经元，其中包括四种典型的大型神经元，可通过其位置和较大的胞体大小进行识别，分别为两个内侧神经元（MeM和MeLm）和两个外侧神经元（MeLr和MeLc）（图1B）。背侧中脑核中的神经元通过转录因子Pitx2c的表达得以标记，这一表达情况在转基因品系Tg(pitx2c:GFP)40中以绿色荧光蛋白（GFP）的表达形式呈现（图1C）。通过对Tg(pitx2c:GFP)斑马鱼进行脊髓逆行标记，证实了Pitx2c在投射至脊髓的背侧中脑核神经元中的表达。绝大多数逆行标记的投射神经元（79%±4%；(N=5)：(n=266)）表达Pitx2c，而Pitx2c也在小型背侧中核局部神经元中表达（图1C）。由此可见，背侧中脑核主要由下行神经元构成，同时还包含小型局部神经元。

在斑马鱼幼体中，部分已明确识别的大型nMLF神经元已被证实能对脊髓中的运动神经元提供兴奋性作用⁴¹。为确定成年斑马鱼nMLF神经元的神经递质表型，我们分析了囊状谷氨酸转运体1和2（分别为vGlut1和vGlut2）在nMLF中的表达情况。向脊髓中注射神经生物素，以在vGlut1-GFP和vGlut2-GFP转基因斑马鱼中逆行标记nMLF投射神经元。vGlut1的表达仅限于位于nMLF外侧区域的投射神经元，包括大型的MeLr和MeLc神经元（图1D-1F）。实际上，nMLF内侧区域的所有投射神经元（包括MeLm神经元及若干小型神经元）均不表达vGlut1（图1E、1F、图S1A和图S1B）。这些内侧投射神经元则强烈表达vGlut2（图1G、1H、图S1C和图S1D），而部分外侧nMLF投射神经元中也存在vGlut2的弱表达（图1I、图S1C和图S1D）。

这些研究结果表明，nMLF 投射神经元是与脊髓相连的最前端中脑核团，并表达转录因子 Pitx2c。nMLF 投射神经元是一类异质性群体，可依据其形态、在 nMLF 中的位置以及囊状谷氨酸转运体的表达情况进行细分。该群体包含两个具有拓扑结构的亚群，可通过囊状谷氨酸转运体的差异表达加以区分，分别为内侧 vGlut2+ 亚群和外侧 vGlut1+ 亚群。

图1.分离的分子和解剖nMLF神经元群。（A）共聚焦图像的正交投影显示通过生物素化葡聚糖注射在脊髓中逆行标记的网状脊髓神经元（IRF，下网状结构；IMRF，中间网状结构；SRF，上网状结构）。背腹侧位置是彩色编码的（v，腹侧红色和d，背侧蓝色）。（B）nMLF的放大图像（A中的虚线框）显示在动物中单独识别的四个细胞（MeM、MeLm、MeLr和MeLc）。（C）顶部面板显示nMLF神经元表达转录因子Pitx2c。中间面板显示神经生物素（NB）逆行标记的来自脊髓的nMLF神经元（红色）。底部面板是Pitx2c表达和神经生物素的合并，显示双标记的nMLF神经元。（D）共聚焦图像的正交投影显示nMLF神经元中vGlut1的差异表达。（E）（D）中虚线框“medial”表示的内侧nMLF神经元中vGlut1的表达不足（箭头表示神经生物素[NB]标记神经元的位置）。（F）（D）中虚线框“横向”表示的外侧nMLF神经元中vGlut1的表达不足（箭头表示神经生物素[NB]标记神经元的位置）。（G）共聚焦图像的正交投影显示nMLF神经元中vGlut2的差异表达。（H）（G）中虚线框“medial”表示的内侧nMLF神经元中vGlut2的强表达（箭头表示神经生物素[NB]标记神经元的位置）。（I）（G）中虚线框“横向”表示的外侧nMLF神经元中vGlut2的弱表达（箭头表示神经生物素[NB]标记神经元的位置）。

活体游泳过程中nMLF亚群的激活

为了探究两种nMLF神经元在游泳过程中是否被激活以及如何被激活，我们在头部固定的幼鱼/成体斑马鱼中使用了双光子钙成像技术（图2A）。头部固定的斑马鱼可自发产生游泳活动，我们通过尾部的视频记录对其进行监测运动模式（图2A）。自主游泳包含由小幅度或大幅度尾部弯曲构成的片段，分别对应慢速或快速游泳（图2A）。在尾部弯曲幅度小的慢速游泳片段中，仅内侧vGlut2+脑干中缝大核神经元被募集，且在游泳过程中双侧均保持活跃。它们的活动起始与游泳片段的开始同步，并在整个游泳过程中持续激活（图2B，紫色）。然而，外侧vGlut1+脑干中缝大核神经元在慢速游泳时未被募集（图2B，蓝色），仅在包含与快速游泳相关的大幅度尾部弯曲片段时被双侧募集（图2C，蓝色）。在这些片段中，内侧vGlut2+脑干中缝大核神经元持续保持活跃，且在不同弯曲幅度下活动水平稳定（图2C-2F）。相比之下，外侧vGlut1+脑干中缝大核神经元的活动水平与尾部运动幅度高度相关（图2G）。

这些结果表明，两个群体的nMLF神经元在游泳过程中具有不同的激活模式。内侧vGlut2+神经元在慢速探索游泳过程中被招募，其活动与发作的开始和持续时间有关。另一方面，侧向vGlut1+神经元在尾巴运动的速度和幅度变化期间被招募，其活动与游泳速度的突然变化相关。

图2. 两种nMLF神经元群体的速度相关募集。(A) 上图展示了头部固定的成年斑马鱼实验装置，通过摄像机监测其尾部运动，同时使用双光子共聚焦显微镜检测nMLF神经元的钙活性。下方两个图分别展示了慢速/低幅度（蓝色）和快速/高幅度（橙色）的自主游泳行为。(B) 在慢速游泳过程中（上图中蓝色线标注的尾部运动轨迹），内侧vGlut2+ nMLF神经元被双侧激活，而外侧vGlut1+神经元未被募集（第二个图）。黑色虚线表示在(C)中快速/高幅度游泳时达到的最大幅度。第三个图显示内侧vGlut2+神经元的钙活性升高，而外侧vGlut1+ nMLF神经元无钙活性。最后一个图展示了上图中白色虚线标注的两个时间点（1和2）的钙活性。(C) 在伴随小幅度尾部运动的慢速游泳过程中（上图中蓝色线标注的尾部运动轨迹），仅内侧vGlut2+ nMLF神经元被双侧激活。在快慢混合的游泳过程中，外侧(vGlut1+)神经元仅在伴随大尾部运动的快速游泳阶段被募集（上图中橙色线标注）。第三个图展示了左右侧内侧vGlut2+和外侧vGlut1+ nMLF神经元的钙水平变化。最后一个图展示了上图中白色虚线标注的两个时间点（1和2）的钙活性。(D) 慢速游泳时仅募集内侧nMLF神经元。(E) 快速游泳时内侧和外侧nMLF均被募集。(F) 内侧vGlut2+ nMLF神经元的活性不会随游泳运动幅度的增加而升高。(G) 游泳时外侧vGlut1+ nMLF神经元的活性随尾部运动幅度的增加而升高。

内侧vGlut2+和外侧vGlut1+nMLF亚群编码自发运动参数

我们的钙成像数据提供了头固定鱼体内游泳期间内侧和外侧nMLF亚群差异激活的广泛概述然而，钙成像在精确的时间分辨率下解决活动和在游泳期间逐周期评估nMLF神经元放电模式的能力有限因此，我们接下来使用单个nMLF神经元的electrophysiological记录来更精确地检查vGlut1+和vGlut2+nMLF投射神经元种群的招募和放电模式之间的关系以及频率和幅度的变化

内侧vGlut2+和外侧vGlut1+nMLF亚群编码自发运动参数

我们的钙成像数据提供了头固定鱼体内游泳期间内侧和外侧nMLF亚群差异激活的广泛概述然而，钙成像在精确的时间分辨率下解决活动和在游泳期间逐周期评估nMLF神经元放电模式的能力有限因此，我们接下来使用单个nMLF神经元的electrophysiological记录来更精确地检查vGlut1+和vGlut2+nMLF投射神经元种群的招募和放电模式之间的关系以及频率和幅度的变化关于游泳运动。为此，我们采用了离体脑干-脊髓标本，通过全细胞膜片钳技术对单个已鉴定的nMLF神经元进行记录（图3A）。首先，我们确定该标本在没有任何感觉反馈的情况下，是否能产生频率和幅度各异的自发性游泳活动。事实上，我们从左右两侧的肌肉中记录到了具有游泳行为特征的自发性交替运动爆发离体制备的两侧（图3B）。在较低的游泳速度下（尾拍频率最高为5赫兹），大多是小肌肉单位处于激活状态，这很可能对应慢肌纤维的激活（图3C和3D）。随着游泳速度提高，在最高8赫兹的游泳频率下，更多振幅更大的肌肉单位被募集，这可能对应中间肌纤维。最大的肌肉单位在游泳频率超过8赫兹时被募集，很可能代表快肌单位的激活（图3C和3D）。在不同的游泳频率下，三种肌单位从慢肌到中间肌再到快肌被依次募集（图3E和3F）。三种肌单位中，慢肌单位的最低募集频率(was <3.5 ~Hz)低于3.5赫兹，中间肌单位为4.1至8.0赫兹，快肌单位(and >7.3 ~Hz)的最低募集频率也在此区间内（图3E）。

图3. 成年斑马鱼在无感觉输入情况下的自发游泳活动。(A) 自发游泳活动期间对nMLF神经元进行离体记录的实验装置。(B) 以左右体侧肌电活动记录的一次典型自发游泳事件示例。放大部分显示了左右体侧肌肉交替活动的协调游泳模式。(C) 肌电活动幅度随游泳频率的增加而增大。慢速游泳时募集小的慢肌单位（红色）（上图，游泳频率4.5赫兹）。中速游泳时同时募集慢肌单位（红色）和中间肌单位（绿色）（中图，游泳频率6赫兹）。快速游泳时则全部募集慢肌单位（红色）、中间肌单位（绿色）和大快肌单位（蓝色）（下图，游泳频率7–12赫兹）。(D) 慢肌单位（红色）、中间肌单位（绿色）和快肌单位（蓝色）的募集情况随游泳频率的变化。每个点代表从单条鱼的多次游泳事件中汇总的一个游泳周期。(E) 在5条鱼的29次游泳事件中观察到的慢肌单位（红色）、中间肌单位（绿色）和快肌单位（蓝色）的最小募集频率。(F) 不同肌单位（慢肌，红色；中间肌，绿色；快肌，蓝色）的活动范围。每个点代表相应肌单位处于活动状态的一个游泳周期（数据来自fb42bcd9-017c-4320-a978-81c826e55b1中(n=15)次游泳事件）

我们通过靶向单细胞记录，进一步探究了内侧vGlut2+和外侧vGlut1+ nMLF投射神经元的活动与游泳运动输出之间的关系。在自发的游泳活动过程中，内侧vGlut2+神经元被稳定募集（图4A、4C和4D）。它们在整个游泳过程中持续发放动作电位（图4A）。此外，内侧vGlut2+神经元的放电频率与游泳运动爆发的频率和幅度相关（图4A）。当大型肌单位被募集时，快速游泳状态下其放电频率升高；而仅小型肌单位被激活的慢速游泳状态下，放电频率则降低（图4A）。相比之下，仅激活小型肌单位的慢速游泳过程中，外侧vGlut1+神经元未被募集（图4B-4D）。这类vGlut1+神经元仅在以高爆发频率激活大型肌单位为特征的快速游泳过程中被募集（图4B）。

所有内侧vGlut2+神经元在所有游泳速度（频率）下均被募集，且当与高游泳速度相关的大运动单位被激活时，其放电频率会增加（图4A和图4C-4E）。然而，外侧vGlut1+神经元在仅小运动单位处于激活状态的慢速游泳过程中从未被募集（图4B-4E）。相反，当活动从低速切换至以快速游泳频率和大运动单位激活为特征的高速时，它们会被依次募集（图4A-4D）。当游泳频率超过6赫兹时，外侧vGlut1+神经元被募集（图4C和图4D）。还有极少数投射神经元在任何游泳速度下都从未被募集（图4C和图4E）。这些神经元可能在本感觉剥夺的离体标本无法模拟的条件下被募集。

这些研究结果在单细胞水平上对nMLF中两类神经元群进行了功能鉴定。这两类神经元群代表了两种功能截然不同的脑干神经元类型，其特征为优先表达vGlut1或vGlut2，具有拓扑结构分布，并在不同的游泳速度和强度下被募集激活。

图4. 编码游泳起始、持续时间和速度的nMLF神经元亚群的活性频率（黑色圆点，每个圆点代表一个游泳周期）、神经元瞬时放电频率（蓝色圆点，单位为赫兹的瞬时放电频率）以及相应的肌肉爆发（A）对内侧vGlut2+ nMLF神经元（紫色轨迹）的记录，该神经元在整个游泳过程中被募集，通过记录肌肉活动（黑色轨迹）进行监测。上图：图表显示瞬时游泳频率（黑色圆点，每个圆点代表一个游泳周期）、神经元瞬时放电频率（紫色圆点，单位为赫兹的瞬时放电频率）以及肌肉爆发幅度（灰色圆点）。下图：虚线指示的放大轨迹显示，所记录的内侧nMLF神经元在慢速与快速游泳活动时的放电频率存在差异。（B）对外侧vGlut1+ nMLF神经元（蓝色轨迹）的记录，该神经元仅在高游泳速度下被募集（黑色轨迹）。上图：图表显示瞬时游泳幅度（灰色圆点，每个圆点代表一个游泳周期）。下图：虚线指示的放大轨迹显示，所记录的外侧nMLF神经元仅在快速游泳时被募集，而在慢速游泳时不被募集。（C）内侧和外侧nMLF神经元的募集与游泳频率的关系。每条线代表一个神经元的募集情况；每个圆点代表一个游泳周期；灰色圆点代表神经元未被募集的游泳周期，紫色和蓝色圆点分别代表神经元被募集的游泳周期。（D）内侧和外侧nMLF神经元的募集概率与游泳频率的关系。阴影区域表示95%置信区间。内侧vGlut2*神经元在低游泳频率下即被募集；外侧神经元则随游泳频率升高被依次募集。（E）所记录神经元在nMLF中的位置。每个神经元的位置用圆点表示，根据其在游泳过程中的活动情况，按（A）和（B）中的颜色编码着色。神经元位置相对于中线和MeLr进行测量，并针对鱼体大小差异进行标准化，以中线至MeLr的距离为参照（MeLr用带有多种颜色的大圆圈表示）。

游泳速度变化过程中内侧vGlut2+神经元与外侧vGlut1+神经元的募集

为了更好地理解所有记录神经元中这两个亚群的活动，我们接下来分析了内侧vGlut2+神经元和外侧vGlut1+神经元的活动与自发游泳过程中运动爆发的频率和幅度之间的关系。我们分别在仅出现低频小肌单位爆发的慢速游泳状态（图5A）、伴随频率升高且小肌单位爆发向大肌单位爆发转变的混合速度状态（图5B），以及出现大肌单位爆发的快速游泳状态下，对这两个神经元亚群的募集情况进行了分析以高频放电（图5C）。在慢速游泳期间，仅内侧vGlut2+神经元被募集。它们的放电频率在小肌单位爆发开始前就开始升高，并在整个游泳过程中保持活跃（图5A）。外侧vGlut1+神经元在慢速游泳期间未被募集（图5A）。在混合速度游泳期间，随着从慢速向快速过渡以及大肌单位爆发的出现，内侧vGlut2+神经元的活性增强（图5B）。外侧vGlut1+神经元在从慢速向快速游泳过渡时被募集，而当游泳从快速转回慢速时则被解除募集（图5B）。最后，当自发性游泳片段直接以高速启动时，内侧vGlut2+和外侧vGlut1+神经元均在游泳开始和结束时同时被募集和解除募集（图5C）。同样，这些神经元的放电频率在高速游泳活动开始前就已趋于升高（图5C）。

这些结果揭示了两个nMLF亚群的活性与自发游泳活动速度之间存在紧密且具有选择性的关系。自发游泳事件的开始、持续时间以及其速度的变化强度通过内侧vGlut2+神经元的活性变化来体现以及外侧vGlut1+神经元。

图5. nMLF 中对游泳起始、速度和持续时间的编码。(A) 慢速游泳过程中nMLF神经元的活动。上图：包含小肌肉单位的慢速游泳过程的肌电图记录。中图：内侧vGlut2+神经元在游泳过程开始前被募集，并在整个过程中持续保持募集状态（刺激时间直方图[PSTHs]，(bin width =0.01 ~s)）。下图：外侧(vGlut1+)神经元在慢速游泳过程中未被募集。(B) 慢速与快速游泳速度间的转换。上图：从慢速游泳切换为快速游泳的过程的肌电图记录。中图：当游泳从慢速切换为快速时，内侧vGlut2+神经元的活动增强。下图：外侧vGlut1+神经元仅在以大肌肉单位出现为特征的快速游泳速度下被募集。(C) 快速游泳过程的开始与结束。上图：高游泳频率下大肌肉单位活跃的快速游泳过程的肌电图记录。中图：内侧vGlut2+神经元在快速游泳过程开始前就已处于活跃状态，并在快速游泳过程开始时出现显著的活动增强。下图：外侧vGlut1+神经元在以大肌肉单位出现为特征的快速游泳过程开始前不久被激活。

nMLF神经元的放电特性

我们接下来检测了游泳过程中内侧vGlut2+神经元与外侧vGlut1+神经元不同的募集模式是否与其内在特性差异相关。通过去极化电流注射，在不同的nMLF神经元中观察到三种不同的放电模式。部分神经元表现出适应特性，初始放电频率较高，随后随时间逐渐降低（图S2A）。另一部分神经元在小幅度电流刺激下呈现不规则放电模式，而在大幅度电流注射下，其放电变得持续且规律，放电频率无明显变化（图S2B）。最后，其余神经元表现出放电延迟起始且频率逐渐加快的特性（图S2C）。表现出延迟放电模式的神经元主要分布在nMLF外侧的vGlut1+神经元群中，而表现出适应或持续放电频率特性的神经元主要分布在nMLF内侧的vGlut2+神经元群中（图S2D）。无法根据放电阈值、输入电阻或静息膜电位区分nMLF投射神经元的内侧与外侧群（图S2E-S2G）。这些结果表明，nMLF神经元群具有相似的内在特性，但外侧vGlut1+神经元的延迟放电特性可能使其在更快的游泳速度下被选择性募集。

nMLF 的传入输入

我们之前的研究结果表明，在没有感觉输入的情况下，nMLF 神经元在自发游泳过程中会被可靠地激活。然而，除了受 nMLF 神经元之间局部相互作用的影响外，nMLF 的活动也可能受到感觉输入的调节。因此通过逆行追踪技术检测了nMLF的输入核团（图S3）。向nMLF中注射神经生物素后，对位于大脑多个区域的输入神经元进行了逆行标记。对侧nMLF中也有神经元被标记，其在中线处形成连合轴突以连接两侧（图S3A）。此外，也有神经元从后连合核（npc）发出投射，靶向对侧的nMLF（图S3A）。向 nMLF 的投射也源自处理视觉和前庭感觉信息的脑区。nMLF 接受来自位于树突野（AF7 和 AF9）视网膜接收区水平的顶盖前神经元的投射（图 S3B）。此外，向 nMLF 的同侧上行投射源自同侧前庭上核和对侧切线核（图 S3C）。这些结果表明，nMLF 神经元接收来自大脑两侧的、携带不同感觉模式的输入（图 S3D）。最后，左侧和右侧 nMLF 中的神经元之间存在双向通信（图 S3D）。这些双向投射可能是左右 nMLF 神经元相互兴奋的基础，并解释了它们在向前游动时的双侧对称激活。然而，在向 nMLF 注射染料后，脊髓中未发现逆行标记的神经元。

nMLF神经元的轴突投射及其与运动神经元的接触

为了探究哪些运动神经元亚型接收来自nMLF神经元的输入，以及nMLF的投射是否也靶向后脑，我们对nMLF的输出进行了形态学评估。将内侧/vGlut2+和外侧/vGlut1+ nMLF神经元填充以神经生物素，并在完成电生理特征鉴定后对其进行三维重建。重建的神经元在nMLF区域呈现广泛的树突分支，并向尾侧发出轴突投射至脊髓（图6）。此外，所有重建的nMLF神经元均产生广泛的轴突侧支在菱脑尾部扩散。表达内侧vGlut2和外侧vGlut1的神经元发出的侧支在菱脑中占据重叠区域（图6A–6C），且大多投射至内侧纵束核（图S4A–S4C）。一个特定的内侧内侧纵束核神经元并未一直投射到脊髓，而是其轴突折返并以花束状广泛分支（图6A，右侧面板）。

在脊髓层面，下行的 nMLF 神经元展现出广泛的轴突侧支，且这些侧支主要分布于脊髓的吻端和中段（图6D、图S4D及图S4E）。我们接下来探究了这些侧支是否与支配慢肌、中间肌和快肌的运动神经元形成接触。通过向对应肌肉类型注射逆行染料，可对三个运动神经元群分别进行特异性标记；同时，通过细胞内记录电极，将神经生物素填充至下行的 nMLF 神经元中。源自下行 nMLF 神经元的轴突侧支与所有运动神经元群（慢肌、中间肌和快肌相关）均形成紧密接触，且尤其接触这些神经元的胞体（图6E）。这类接触存在于所有类型的运动神经元上，且大多分布于脊髓的吻端和中段（图S4D及图S4E）。这些结果表明，内侧 vGlut2+ 与外侧 vGlut1+ 的 nMLF 神经元均向脑干发出投射并延伸侧支；其轴突继续向脊髓延伸，与所有在慢游和快游中均处于激活状态的运动神经元类型形成广泛且紧密的接触。总体而言，这一推测的连接通路使 nMLF 神经元具备在以下层面调控运动的潜力以及在运动神经元输出层面的脑干下行神经元。

图6. nMLF神经元的投影模式。（A）四个内侧vGlut2+nMLF神经元的后脑形态和侧支投射。对于每种神经元类型，左侧面板显示单个神经元的重建，右侧面板显示所有记录的神经元的侧支的热图。（B）三个外侧vGlut1+nMLF神经元的后脑形态和侧支投射。对于每种神经元类型，左侧面板显示单个神经元的重建，右侧面板显示所有记录的神经元的侧支的热图。（C）nMLF中分析的神经元的位置，显示四个大神经元（1，MeLm；2，大内侧神经元；3，MeLr；4，MeLc）的索玛位置。（D）共聚焦图像和重建nMLF神经元的轴突投射在脊髓的头侧。（E）nMLF神经元的轴突侧支与慢、中、快模块的运动神经元之间的密切接触。

nMLF 神经元的不同行为学作用

对内侧vGlut2+和外侧vGlut1+ nMLF神经元活动的分析表明，它们分别优先在慢速和快速游泳速度下被激活。为了确定这些nMLF神经元群的活动是否是驱动体内慢速探索性与快速游泳行为所必需的，我们结合双光子消融内侧或外侧nMLF神经元亚群进行了行为学分析。双侧内侧vGlut2+ nMLF神经元的消融显著损害了慢速探索性游泳行为（图7A）。这些神经元的消融降低了探索性游泳的速度和次数，且与游泳行为的速度下降相关（图7A、7B、7D和7E）。相比之下，双侧外侧vGlut1+ nMLF神经元的消融并未影响慢速探索性游泳行为（图7A）。这些神经元的消融对慢速探索性游泳过程中的速度、次数和行进距离均无显著影响（图7A和7C-7E）。

接下来，我们探究了两个nMLF神经元亚群的消融如何影响快速游泳行为。为此，我们分析了声音诱导逃逸后的快速游泳阶段（图7F和7I）。内侧vGlut2+ nMLF神经元的消融会影响低速和高速两种游泳模式（图7F-7H），而外侧vGlut1+神经元的消融则主要影响高速游泳（图7I-7K），并降低了所能达到的最大速度。这些结果表明，外侧vGlut1+ nMLF神经元是快速游泳行为表达所必需的，而内侧vGlut2+神经元则有助于缓慢的探索性游泳，同时也是快速游泳行为表达的必要条件。因此，行为分析的结果揭示了内侧vGlut2+和外侧vGlut1+ nMLF神经元对行为的不同影响，进而证实了这两个神经元群在自发游泳过程中的活动模式。

图7. 内侧和外侧nMLF神经元消融的选择性行为结果。(A) 追踪对照组斑马鱼体内自发探索性慢速游动的序列，以及内侧(vGlut2+)或外侧(vGlut1+) nMLF神经元被消融后的序列。下图：对照组斑马鱼（黑色）以及内侧vGlut2+（紫色）或外侧vGlut1+（蓝色）nMLF神经元被消融的实验斑马鱼的瞬时游动速度。(B) 对照组（黑色）和内侧神经元被消融的斑马鱼([**p <0.001)的游动速度累积分布；柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验。(C) 对照组（黑色）和外侧神经元被消融的斑马鱼（蓝色）的游动速度累积分布（ns: (p 0.05)；柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验）。(D) 图表显示对照组((N=10 fish))、内侧神经元被消融的((N=9 fish))和外侧神经元被消融的((N = 10 fish))斑马鱼的自发游动次数（箱体由第25和第75百分位数界定，须线从最小值延伸至最大值；(p 0.05)；重复测量单因素方差分析；效应量科恩d (d = 1.85)）(E) 图表显示对照组((N=10fish))、内侧神经元被消融的((N=9fish))和外侧神经元被消融的((N=10 fish))斑马鱼的游动距离（箱体由第25和第75百分位数界定，须线从最小值延伸至最大值；(^{* *} p<0.01)；重复测量单因素方差分析；效应量科恩d (d = 2.04))）(F) 追踪对照组斑马鱼以及内侧vGlut2+ nMLF神经元被消融后，体内声音诱导的逃逸行为后快速游动的序列。(G) 对照组和内侧神经元被消融的斑马鱼的游动速度与频率关系图（黑点：对照组，来自(N=5)斑马鱼的n = 119个周期；紫点：消融组，来自(N=6 fish))斑马鱼的n = 58个周期）(H) 对照组和内侧神经元被消融的斑马鱼(Gamma^{++*} p<0.001)的游动速度累积分布；柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验(I) 追踪对照组斑马鱼以及外侧(vGlut1+) nMLF神经元被消融后，体内声音诱导的逃逸行为后快速游动的序列。(J) 对照组和外侧神经元被消融的斑马鱼的游动速度与频率关系图（黑点：对照组，来自(N=5)斑马鱼的(n=119)个周期；紫点：消融组，来自(N=6 fish)斑马鱼的(n=) 118个周期）。(K) 对照组和外侧神经元被消融的斑马鱼(p < 0.001)的游动速度累积分布；柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验。

讨论

运动行为的灵活性对动物的生存至关重要。精准控制运动发作的起始与持续时间，结合快速改变运动速度和强度的能力，是决定运动灵活性的关键特征。脊髓回路具备必要的神经元群，这些神经元群可通过自身特性以及精准且有序的连接来产生运动并控制其速度。然而，为所产生的运动行为的起始、持续时间和速度提供必要信号的指令，最终源自大脑的下行回路。解析下行指令如何组织以控制运动灵活性，一直是一项持续的挑战。本研究在成年斑马鱼的nMLF中鉴定出两个神经元亚群，它们在分子层面相互分离、功能上存在差异，且在nMLF内具有拓扑组织分布。这代表了投射至后脑和脊髓的最前端投射神经元。内侧vGlut2+神经元群编码游泳事件的起始与持续时间。这些神经元的募集及放电频率会随游泳速度的提升而增加。第二类神经元群由外侧vGlut1+神经元构成，这类神经元仅在游泳速度提升前被募集。因此，内侧vGlut2+神经元群的损毁会损害缓慢的探索性游泳行为，而外侧vGlut1+神经元群的损毁仅影响快速游泳行为，对缓慢的探索性游泳则无影响。我们的研究结果表明，存在两类直接投射至脊髓的下行神经元群，它们编码了游泳的起始、持续时间与速度。这些神经元或许还会接收携带不同感觉模态的输入信号，从而能够整合环境线索，以情境依赖的方式整合运动指令，进而产生灵活的游泳动作。

我们的解剖学分析表明，内侧和外侧nMLF轴突均与慢、中间和快运动神经元存在接触。这些运动神经元亚型及其所支配的肌肉会随游泳速度的变化被依次募集，且它们与特定的V2a中间神经元亚群相连类型以形成三个速度模块。一种可能性是两个nMLF亚群也与所有模块的V2a中间神经元存在连接。即便这些下行亚群以相同强度提供输入，三个模块的固有特性也足以让这种无差别输入驱动它们按顺序被募集。事实上，我们此前的研究已表明，慢模块的V2a中间神经元和运动神经元具有最低的募集阈值，而快模块的募集阈值最高。另一种可能性是，突触强度经过调控，使得内侧vGlut2+ nMLF神经元向慢/中间模块提供强输入，而外侧vGlut1+神经元则更强烈地靶向更快的模块。此外，这两个nMLF亚群的下行输入还可在其存在广泛侧支的延脑水平进一步进行精细调控。要评估这些可能性，需要在单细胞水平进行详细的突触连接图谱绘制。

控制运动的脑干区域的结构在脊椎动物物种中被认为是保守的。中脑运动区（MLR）是驱动向前运动并控制身体不同部位运动的关键指挥中心，已在多种脊椎动物中通过生理学方法得到确认物种。受到刺激时，中脑运动区（MLR）会引发运动哺乳动物中速度和步态变化的运动。最近对啮齿类动物的研究表明，中脑运动区是一个复杂的结构，混杂着不同的神经元群不同的投射模式与行为功能。中脑腿侧区由不同的核团（楔状核和脚桥核）组成，这些核团包含具有不同神经递质表型、靶标以及行为学作用。这些延髓外侧核通过延髓尾侧中间中枢对运动发挥作用，这些神经元直接投射到脊髓，并提供了与本研究中 nMLF 所展示的类似的控制作用。

在七鳃鳗中，MLR和DLR（间脑运动区）均通过激活______诱导游泳运动网状脊髓下行神经元。4,8,59-61 中脑运动区的存在已在金鱼中得到证实。52,62,63 最近的一项研究斑马鱼幼体的研究已在蓝斑附近发现一个能激活持久游泳行为的功能区域，并推测该区域对应于中脑运动区（MLR）。因此，在斑马鱼体内，中脑运动区（MLR）和中脑大细胞核（nMLF）共存，且二者在运动控制中可能执行独特但又相互关联的功能。在所有被研究的脊椎动物中，从中脑运动区（MLR）发出的指令并非直接与脊髓运动环路相关，而是通过网状脊髓神经元传递。如今我们的研究结果表明，运动行为的启动以及对其持续时间、速度和强度的控制，同样由中脑大细胞核（nMLF）中具有选择性的下行神经元编码。这些中脑大细胞核（nMLF）神经元或许还能整合来自中脑运动区（MLR）神经元的输入与感觉输入，进而塑造最终传递至脊髓运动环路的指令。

在斑马鱼幼鱼中，nMLF 主要被视为感觉运动协调中枢，参与处理游泳过程中与运动相关的感觉输入。针对斑马鱼幼鱼的研究通过钙成像和消融实验，为 nMLF 赋予了不同且相互矛盾的功能。对大型 nMLF 神经元（MeLr、MeLc、MeLm 和 MeM）进行消融后，斑马鱼在响应视觉刺激时难以达到高速游泳状态。 单侧消融 nMLF 神经元并未证实这种对游泳速度的影响。29 相反，单侧消融使得斑马鱼在视觉诱发的游泳过程中，尾部位置更偏向未被消融的一侧，且这种操作并未影响游泳运动的启动、持续时间或速度控制。尽管这些研究表明 nMLF 在整合视觉信息并控制转向时的头尾位置方面发挥作用，但并未阐明其在调控游泳行为中的具体功能。本研究以成年斑马鱼为对象，首次直接证实 nMLF 神经元的活动与自发游泳行为相关，并揭示了两类不同神经元群体如何协同作用，编码游泳行为的关键特征。通过结合钙成像与这两类神经元的细胞内记录，我们将其活动的时序和模式与游泳行为关联起来。腹侧 vGlut2+ nMLF 神经元在游泳开始前便被激活，且放电频率随游泳速度升高而增加，消融这类神经元会影响斑马鱼缓慢的探索性游泳。背侧 vGlut1+ nMLF 神经元的活动与高速游泳直接相关，消融这类神经元则会选择性地影响高速游泳行为的表现。

刺激脑干的多个区域可诱发运动行为；然而，极少有研究能够阐明运动行为的特定参数是如何在单个神经元水平上被编码的。一个关键问题是，脊髓运动回路的最终指令是否已经经过塑造，以编码灵活游动所需的复杂参数。通过利用成年斑马鱼的易操作性，并结合多种技术，我们现在揭示了在运动过程中，脑干核团中不同神经元亚群的活动情况，以及它们如何编码运动输出的各类参数。我们此前对详细的连接模式和功能进行的分析在脊髓回路中，其模块化的组织结构揭示了下行指令转化为节律性输出的机制。本研究中发现的脑干亚群构成了指令链的起始环节，该亚群对运动的启动、持续时间和速度具备精细的编码功能。这些研究结果正逐步填补脊髓运动回路组织与最终驱动这些回路的脑干指令之间的认知空白。本文揭示的两条指令流及其对脊髓回路的直接调控作用，使动物能够通过调节运动的速度和强度来适应所处环境。

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苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。