标题：Transformation of an early-established motor circuit during maturation in zebrafish

期刊：Cell Reports

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.110654

摘要

运动由脊髓回路介导，这些回路能以精准的协调度和力度产生运动。这些回路的构建在发育早期就已确定；然而，其结构和功能在整个发育过程中是否保持恒定尚不明确。本研究发现，在成年斑马鱼体内，两种背侧V2a中间神经元与四种主要运动神经元之间最初形成的快速回路，与此前在幼体中报道的情况相比发生了显著转变。该回路不仅出现了原有连接的消失和新连接的建立，还伴随突触传递方式、可塑性及强度的改变。此外，本研究表明，这一回路不再作为游泳节律发生器发挥作用，其组成部分反而整合到脊髓逃逸回路中，在初始逃逸转弯后控制推进动作。因此，本研究结果揭示了动物发育至成年过程中，运动回路在结构和功能上的显著变化。

图形摘要

引言

运动的执行依赖于运动神经元在时间上的精准激活，以实现计划中的动作（格里德纳，2003；格里德纳与埃尔·米拉，2020；胡珀与布施格斯，2017；奥尔洛夫斯基等，1999；维亚尔，2018）。在脊髓中，功能性神经环路以精准的时间、时长和幅度产生运动，以适应环境的变化（阿伯，2017；布朗斯通与布依，2010；布施格斯等，2011；费乔与麦克莱恩，2010；古尔丁，2009；格里德纳与杰塞尔，2009；林等，2018；基恩，2016；罗伯茨等，2010）。这些神经环路的组装在发育早期就通过确定组成神经元的身份和连接性的过程得以确立（布兰肯希普与费勒，2010；德拉波等，2002；古尔丁与普法夫，2005；拉德等，2007；孟与赫克舍，2021；圣-阿芒与德拉波，2000；万等，2019）。最近两项针对秀丽隐杆线虫和果蝇的研究表明，在成熟过程中，决策相关神经环路保持不变，而感觉和运动通路则出现年龄依赖性的结构变化（李与多伊，2021；威特利特等，2021）。在脊椎动物中，我们对神经环路组装背后的分子机制，以及发育过程中这些环路的运动输出和调控如何重构，已有了广泛的认识（康布斯等，2004；哈舒米与西拉尔，2020；胡施等，2015；兰德梅瑟，2018；马德与雷姆，2005；圣-阿芒与德拉波，2000）。然而，成熟过程中运动环路连接性的变化本质一直是一个持续的难题。解决这一问题需要对同一神经环路进行研究在不同发育阶段，单个神经元和突触层面的回路组成部分。

斑马鱼是为数不多的可用于对比幼体和成体阶段运动回路组织与功能的脊椎动物模型系统之一（Ahrens 等人，2012；Arrenberg 等人，2009；Berg 等人，2018；Buss & Drapeau，2001；Chow 等人，2020；Dunn 等人，2016；Fetcho 等人，2008；Knafo & Wyart，2018；McLean 等人，2008；Satou 等人，2013）。对驱动运动的脊髓回路的分析显示，其组织和功能连接会在斑马鱼获得成体特征的时期发生变化（Budick & O’Malley，2000；Buss & Drapeau，2001，2002；Devoto 等人，2006；Gabriel 等人，2008；Hale，2014；Jackson & Ingham，2013；Kyriakatos 等人，2011；Masino & Fetcho，2005；Müller 等人，2000；Picton 等人，2021；Saint-Amant & Drapeau，1998；van Raamsdonk 等人，1982）。在幼体阶段，间歇性游泳运动主要由激活快肌的快速回路驱动（Kimura 等人，2006；McLean 等人，2007，2008；McLean & Fetcho，2009；Menelaou & McLean，2012；Myers，1985；Pujala & Koyama，2019；Svara 等人，2018）。在成体阶段，游泳网络包含三个速度回路模块，这些模块会随着运动速度和强度的增加被依次激活（Ausborn 等人，2012；Gabriel 等人，2011；Song 等人，2018，2020）。

斑马鱼中首个已确定的运动回路包括两种早期出生的V2a中间神经元（INs；I型和II型）以及初级运动神经元（pMNs）（Eisen等人，1986；Kimura等人，2006；McLean和Fetcho，2009；McLean等人，2008；Menelaou和McLean，2012，2019；Myers，1985；Myers等人，1986；Svara等人，2018；Westerfield等人，1986）。针对幼体的近期研究斑马鱼在该回路内表现出独特的突触连接模式（Bagnall和McLean，2014；McLean等人，2007；McLean和Fetcho，2009；Menelaou和McLean，2019）。两种V2a中间神经元类型构成了一个相互兴奋性回路，作为游泳节律发生器，并与运动神经元（pMNs）形成差异性连接。I型V2a中间神经元广泛连接所有运动神经元，而II型V2a中间神经元似乎选择性地连接支配上轴或下轴快肌的两种运动神经元（Menelaou和McLean，2019）。这一早期形成的回路的神经元组成、其连接方式以及在游泳中的作用是否在成体阶段得以保留，目前尚不清楚。

本研究在斑马鱼中揭示，动物生命早期建立并具备功能的运动回路，到成年后会发生连接与功能的重塑。我们首先证实，成年斑马鱼体内的两种V2a中间神经元类型以及pMN细胞均可被单独识别，且保留其幼体特征。其次，通过体外连续配对记录与体内行为分析，我们发现该回路的内部连接及其功能相较于生命早期发生了显著变化。I型V2a中间神经元仅与所谓的尾侧pMN细胞建立连接，通过易化化学突触支配轴下肌的最腹侧象限；而II型V2a中间神经元则通过非易化的混合电-化学突触，广泛连接多个体节内的所有pMN细胞，且不依赖其支配的肌肉象限。此外，我们发现该回路不再作为游泳的节律发生器，其组成部分转而整合至脊髓逃逸回路中。因此，本研究结果表明，斑马鱼中最早建立的快速运动回路，在向成年发育的过程中，其组织结构与功能均发生了改变。

结果

成年斑马鱼早期形成的快速运动回路的神经组成部分

为确定成年斑马鱼中运动神经元前体细胞（pMNs）的组织分布与神经支配模式，并将其与以往在幼鱼及成年斑马鱼中的研究报道进行对比（Eisen 等人，1986、1990；Menelaou 和 McLean，2012；Myers，1985；Myers 等人，1986；Westerfield 等人，1986），我们向快速轴突中注射了逆行染料肌肉组织（图1A）。多个快运动神经元被标记，包括每个半体节的四个前运动神经元（pMNs，图1B）。为了确定这些前运动神经元中哪些支配轴下或轴上快肌，我们向这些肌肉注射了两种不同的逆行染料。我们在每个半体节中均稳定地发现两个轴下和两个轴上前运动神经元（图1B、1C和图S1A），与在幼体中报道的结果一致（Eisen等人，1986，1990；Menelaou和McLean，2012；Myers，1985）。其中一个轴下前运动神经元始终占据该体节的最尾端位置，而另一个轴下及两个轴上前运动神经元的胞体位置则具有可变性（图1C，(n=85)个体节，11只动物）。这个最尾端的轴下前运动神经元支配同侧快轴肌的腹侧象限（图S1B；(n=57)个体节，5只动物），与此前在幼体和成体中的研究结果一致（Eisen等人，1986；Menelaou和McLean，2012；Myers等人，1986；Westerfield等人，1986）。

在斑马鱼幼鱼（受精后4-5天，体长3-4毫米）中，两种早期出生的V2a抑制性中间神经元类型（I型和II型）位于背侧，它们是根据转录因子Chx10的表达水平（通过绿色荧光蛋白表达水平推断）、输入电阻和放电模式得以鉴定的（Menelaou和McLean，2019）。I型V2a抑制性中间神经元的Chx10表达水平高、输入电阻高，放电规律且适应性弱，轴突呈单向投射（Menelaou和McLean，2019）。II型V2a抑制性中间神经元的Chx10表达水平较低，位置相对更靠腹侧，输入电阻低，表现出强烈的放电适应性，且轴突呈双向投射（Menelaou和McLean，2019）。为确定这两种V2a抑制性中间神经元类型在成年斑马鱼中是否仍可被鉴定，我们聚焦于转基因品系（Tg(Chx10:GFP)）中最靠背侧的神经元。基于Chx10的表达水平，我们在脊髓背侧鉴定出了两种V2a抑制性中间神经元类型。每个半体节中每种类型有1-2个神经元（图1D）。其中一种V2a抑制性中间神经元的Chx10表达水平最高，在所有V2a抑制性中间神经元中位置最背侧且更内侧，可对应幼鱼I型（图1D；箭头头）。另一种V2a抑制性中间神经元的Chx10表达水平低，表现为较弱的绿色荧光蛋白信号强度，位置更靠腹侧，与运动神经元前体细胞（pMNs）处于同一水平。该类型可对应幼鱼II型V2a抑制性中间神经元（图1D；箭头）。

为了确定这些推定的I型和II型V2a中间神经元是否与幼体中的同类神经元表现出相似的生理和形态特征，我们使用成年斑马鱼脊髓的离体标本进行了全细胞膜片钳记录（Ausborn等人，2012；Gabriel等人，2008；Kyriakatos等人，2011）。Chx10高表达的背内侧V2a中间神经元在去极化电流注射刺激下表现出规则的放电且适应性极弱（图1E；(n=50)神经元，36条斑马鱼），具有较低的放电阈值和较高的输入电阻（图1G和1H；(n=12)神经元，9条斑马鱼），与幼体中已报道的I型V2a中间神经元特征高度相似。相比之下，Chx10低表达的腹外侧V2a中间神经元以高频放电且具有强适应性（图1F；(n=52)神经元，44条斑马鱼），并具有较高的放电阈值和较低的输入电阻（图1G和1H；(n=12)神经元，12条斑马鱼），与幼体的II型V2a中间神经元特征相似。

形态学分析显示，Chx10高表达的V2a中间神经元具有直径较小的轴突，且可见侧支（图1I和图S1D；(n=6)个神经元，6只动物）；而Chx10低表达的V2a中间神经元则具有直径较大的轴突，在头侧和尾侧区域均有大量侧支（图1J和图S1D；(n=7)个神经元，7只动物）。对胞体和轴突分支的细致分析发现，Chx10高表达的V2a中间神经元胞体较小（图S1C），树突广泛分支并向背侧延伸，轴突起始段较粗，且在胞体所在节段发生分叉（图1K，上图）。相比之下，Chx10低表达的V2a中间神经元胞体较大（图S1C），树突分支范围较小，沿头尾轴延伸（图1K，下图）。这类神经元具有一条直径较大的主下行投射，并发出一条上行侧支（图1K，下图）。两种V2a中间神经元类型的轴突投射均向两侧延伸多个节段，但仅有Chx10低表达的V2a中间神经元（II型）其轴突沿脊髓全长延伸，到达脑干和脊髓尾端（图1L和图S1E）。

最后，为了确认幼虫中描述的I型和II型V2a中间神经元（INs）与我们在成年斑马鱼中鉴定出的神经元相对应，我们对幼虫（4-5日龄，(n=6)个体；图S2A-S2C）的4至9个脊髓节段中的这两种V2a神经元进行了消融处理，并在这些个体发育至成年阶段后进行检测。在未消融节段的成年脊髓背侧，可检测到高表达和低表达Chx10的V2a中间神经元，而在幼虫阶段被消融的节段中则完全不存在这些神经元（图S2D）。这些结果，结合我们对分子、生理和形态学特性的分析，以及与幼虫时期神经元特征的对比，支持高Chx10表达和低Chx10表达的V2a中间神经元分别对应I型和II型V2a中间神经元的观点。

图1. 成年斑马鱼早期形成的快速运动回路的组成部分

V2a 中间神经元亚型与 pMN 细胞的突触连接

为了确定成年斑马鱼中两种V2a中间神经元是否像幼鱼那样与运动神经元（pMNs）建立连接，我们进行了双细胞膜片钳记录。I型V2a中间神经元仅通过化学突触与运动神经元建立连接，由此产生的缓慢兴奋性突触后电位/电流（EPSP/Cs）可被AMPA受体拮抗剂NBQX消除（图2A；(n=32 type I)，18条斑马鱼）。II型V2a中间神经元同样与运动神经元存在连接，但通过混合的电突触和化学突触实现（图2B，左图；(n=85) 为II型样本，42条斑马鱼）。其化学突触成兴奋性突触后电位/电流（EPSP/C）的慢成分（cEPSP/C）被谷氨酸受体拮抗剂NBQX和AP5阻断，而剩余的快速电成分（eEPSP/C）即使在镉存在的情况下也持续存在（图2B，右图；(n=3) Ⅱ型，3只动物）。此外，即使在高频放电期间，Ⅱ型V2a中间神经元的单个动作电位也能在运动神经元（pMNs）中诱发大且稳定的兴奋性突触后电位（EPSPs）（图2C）。

形态学分析显示，IV2a型中间神经元的轴突始终比运动前体细胞胞体更偏外侧走行，背腹侧位置不固定，并发出稀疏的轴突侧支，与运动前体细胞胞体未形成可检测的紧密接触（图2D-2F；(n=12) 为I型，共12只动物）。相比之下，II型V2a中间神经元的轴突投射高度一致，更偏内侧投射，且有大量侧支包裹运动前体细胞胞体（图2G-2I；(n=14) 为II型，共14只动物）。

这些结果共同表明，成年斑马鱼中的pMNs以及I型和II型V2a中间神经元保留了与幼体相似的若干特征。该神经网络为研究幼体阶段观察到的选择性靶向是否会随着神经系统的成熟而保持提供了一个研究体系。

图2. I型或II型V2a IN和pMN之间的突触连接。（A）I型V2a IN刺激在pMN中引发化学EPSP/C（左），被NBQX（右）废除。灰色痕迹，20次单独扫描；黑色和品红色痕迹，平均50次扫描。箭头表示V2a IN动作电位((n = 32 type)I，18只动物）（B）l型V2a IN刺激在pMN中引发化学和电混合EPSP/C（左，(n=85)ll型，42只动物）。化学成分被NBQX和AP5废除，只留下一个电成分，也存在镉（(Cd2+)，右，(n=3)ll型，3只动物）。灰色痕迹，20次单独扫描，黑色品红色和粉红色痕迹，平均80次扫描。箭头表示V2a IN动作电位。（C）II型V2a IN中的重复动作电位在pMN中引发了大量混合EPSP。（d）I型V2a IN神经生物素填充的侧视图((n=12 type ))，12只动物）。（e）I型V2a IN的尾部轴突投影。（f）I型V2a IN的头侧轴突投影。（g）lI型V2a IN神经生物素覆盖的背侧视图(= 14 type II)，14只动物）。（h）来自II型V2a IN下行轴突和pMN躯体的侧支之间的紧密接近（用星号表示）。右图：左侧虚线框所示部分的高倍放大。（i）来自II型V2a IN上行轴突的短侧支靠近pMN躯体（用星号表示）。

I型V2a中间神经元-运动神经元突触的选择性与短时程可塑性

接下来，我们希望确定连接模式是否会维持到成年期，首先通过检测I型V2a中间神经元是否像在幼体中那样，与所有轴下和轴上运动神经元前体细胞建立均匀的突触连接（Menelaou和McLean，2019）。为此，我们对单个V2a中间神经元与四个运动神经元前体细胞之间的连接进行了连续采样（图3A；(n=13) 型I V2a中间神经元，13只动物）。I型V2a中间神经元在每个节段中均选择性地与最尾端的运动神经元前体细胞建立连接（图3B和3D；(n=11) 配对，7只动物）。在反复的高频刺激下，这种连接表现出强烈的时间依赖性和使用依赖性易化（图3E和3G；(n=8) 配对，7只动物）。相比之下，I型V2a中间神经元的单个动作电位几乎无法在其余三个运动神经元前体细胞中诱发兴奋性突触后电位或兴奋性突触后电流（图3C和3D；(n=10) 配对，8只动物）。然而，在对该类型V2a中间神经元进行反复高频刺激时，能够在其余运动神经元前体细胞中检测到微弱的兴奋性突触后电位/电流（图3F和3H；(n=) 8对，8只动物）。另一方面，I型V2a中间神经元未与位于头侧节段的任何运动神经元前体细胞形成突触连接（图S3；(n=5 c-pMN)、(n=3) 其他运动神经元前体细胞，6只动物）。这些结果表明，I型V2a中间神经元主要与最尾端运动神经元前体细胞形成强且具有选择性的易化化学突触。

图3. I型V2a中间神经元与运动前神经元之间的选择性突触连接。(A) 连续配对记录的实验装置，显示I型V2a中间神经元的重建（橙色）以及半体节中的四个运动神经元前体细胞（蓝色，轴上肌；品红色，轴下肌）。虚线指示脊髓节段边界 ([n=13) 型I V2a中间神经元，13只动物）。(B) 对I型V2a中间神经元的刺激在半体节中最尾侧的运动神经元前体细胞中诱发了兴奋性突触后电位/电流。灰色轨迹为20次单个扫描；黑色轨迹为100次扫描的平均值。箭头指示V2a中间神经元的动作电位。(C) 对I型V2a中间神经元的刺激未在其他三个运动神经元前体细胞中诱发任何兴奋性突触后电位/电流。灰色轨迹为20次单个扫描；黑色轨迹为100次扫描的平均值。箭头指示V2a中间神经元的动作电位。(D) 运动神经元前体细胞中兴奋性突触后电位幅度的箱线图（****p (^{* * *} p ≤0.0001)，非参数Mann-Whitney检验，I型V2a中间神经元至尾侧运动神经元前体细胞 (n=11 pairs)，7只动物，I型V2a中间神经元至其他运动神经元前体细胞 (n=10 pairs)，8只动物）。(E) 示例轨迹显示，在对I型V2a中间神经元进行40赫兹刺激时，尾侧运动神经元前体细胞中诱发的兴奋性突触后电位/电流出现短时程易化。灰色轨迹为1-10次扫描（0-20秒）的平均值；黑色轨迹为71-80次扫描（140-160秒）的平均值。箭头指示V2a中间神经元的动作电位。(F) 示例轨迹显示，在对I型V2a中间神经元进行40赫兹刺激时，其他三个运动神经元前体细胞中诱发了兴奋性突触后电位/电流。(G) 经40赫兹刺激I型V2a中间神经元后，尾侧运动神经元前体细胞中诱发的兴奋性突触后电位幅度 ((n=8 pairs)，7只动物）。(H) 40赫兹刺激I型V2a中间神经元对其他运动神经元诱发的兴奋性突触后电位幅度，涉及7对样本、8只动物；图G和图H中的数据以平均值±标准误表示，0.0001；前10个扫描采用单因素重复测量方差分析，后10个扫描采用双因素重复测量方差分析。

II型V2a中间神经元与pMN细胞间的广泛突触连接

温研究团队检测了II型V2a中间神经元与支配下轴/上轴快肌的运动神经元（pMNs）之间的选择性连接是否在成鱼中得以保留。我们依次对单个II型V2a中间神经元与位于该神经元尾侧节段内的全部四个运动神经元（pMNs）之间的连接进行了取样（图4A；(n=29 ~V 2 a) 中间神经元，26条斑马鱼）。在每次实验前，我们通过向各自的肌肉逆行注射染料，预先标记了下轴和上轴运动神经元（pMN (PMN) 和 (pMN)）。单个II型V2a中间神经元产生的动作电位，在下轴和上轴运动神经元中均能诱发强烈且稳定的兴奋性突触后电位/电流（EPSP/Cs）（图4A，(n=86 pairs)；图4B，35个下轴运动神经元和12个上轴运动神经元）。II型V2a中间神经元与运动神经元之间的突触，始终比……之间的突触更强I型V2a抑制性中间神经元（图S4 (n=13) 为I型，63个为II型V2a抑制性中间神经元），但在重复高频刺激过程中未表现出时间或使用依赖性易化（图S4A和S4B；(n=6) 配对，6只动物）。兴奋性突触后电流与抑制性突触后电流的幅度之间存在强相关性（图4C；(n=88 pairs)），这表明电学和化学成分的强度以突触依赖性的方式共同变化。

为了检查不同类型的II V2a IN是否会聚在单个过氧或外延pMN上，我们依次采样了不同节段中的II V2a IN与单个尾部节段中的pMN的连接（图4D）。在所有实验中，过氧和外延pMN都从所有采样的II型V2a IN接收会聚的混合电和化学EPSP/Cs（图4D；(n=6 pMNs)，6只动物）。突触连接的选择性也在II型V2a INs和位于口段的pMNs之间进行了测试（图S4D）。在所有情况下，II型V2a INs中的单个动作电位在过氧和外延pMNs中引起EPSP/Cs（图S4D-S4F；(n=19 ~V 2 a)INs，18只动物）。然而，与位于尾部节段的pMNs相比，这些pMNs中电和化学EPSP/Cs的振幅明显较小（图4E和4F；(n=35 pMNs)口，(n=58 pMNs)尾，34只动物）。无论其肌肉神经支配模式和节段距离如何。

图4. Ⅱ型V2a中间神经元与运动神经元之间的广泛突触连接。(A) 上图：序列配对记录的实验装置，显示了II型V2a中间神经元（绿色）以及轴上（((pMN)，蓝色）和轴下（((pMN)，品红色）运动神经元前体细胞的重建图。虚线指示脊髓节段边界。下图：通过刺激同一个II型V2a中间神经元，在四个运动神经元前体细胞中诱发的兴奋性突触后电位/电流（EPSP/Cs）示例。灰色轨迹为20次单个扫描；黑色轨迹为50次扫描的平均值。箭头指示V2a中间神经元的动作电位（((n = 29 V2a) 中间神经元，86对，26只动物） (B) 通过刺激同一个II型V2a中间神经元，在运动神经元前体细胞中诱发的化学性和电性兴奋性突触后电流（EPSCs）的幅度（ns，无显著差异；配对t检验，12个轴下和12个轴上运动神经元前体细胞，(n=12)） (C) 化学性兴奋性突触后电流（cEPSC）与电性兴奋性突触后电流（eEPSC）幅度的相关性（(R^{2}=0.55)、(p<0.0001)、(n=88)） (D) 上图：带有两个重建II型V2a中间神经元（绿色）的序列配对记录实验装置。在记录两个II型V2a中间神经元的同时，分别夹持一个(DMN)或(a PMN_{H})运动神经元前体细胞。下图：通过刺激两个不同的II型V2a中间神经元，在同一个(pMN_{H} or pMN_{E})运动神经元前体细胞中诱发的兴奋性突触后电位/电流（EPSP/Cs）示例轨迹（((n=6pMNs)，6只动物） (E和F) 相对于受刺激的II型V2a中间神经元，在尾侧或头侧节段记录的运动神经元前体细胞中，电性兴奋性突触后电位（eEPSP，E）或化学性兴奋性突触后电流（cEPSC，F）的幅度图（*(p ≤0.05)、(^{* *} p ≤0.001)、(cdots p ≤0.0001)，P<0.0001；ns，无显著差异；单因素方差分析结合Tukey多重比较检验，头侧和尾侧节段运动神经元前体细胞中EPSP的比较采用未配对t检验；(n=35)个头侧运动神经元前体细胞、(n=58)个尾侧运动神经元前体细胞，34只动物）。参见图S4。

II型V2a中间神经元-运动前神经元突触处的间隙连接组成

在斑马鱼幼体的逃逸脊髓回路中，已证实马氏细胞轴突（M-轴突）与连合局部中间神经元（CoLo INs）之间的间隙连接具有分子不对称性，其突触前和突触后连接蛋白具有独特性。连接蛋白35.5定位于轴突区的突触前部位，而连接蛋白34.1则存在于树突体区的突触后部位（Miller等人，2017）。为验证这些连接蛋白是否存在于II型V2a中间神经元与运动前神经元（pMNs）之间的间隙连接中，我们使用了此前被证实对每种蛋白具有特异性的相同抗体（Miller等人，2017）。本免疫组织化学分析在神经生物素标记的II型V2a中间神经元标本中开展（图5A；II型样本(n=6)，共6只动物）。在多个脊髓节段中，II型V2a中间神经元的轴突侧支包裹着运动前神经元胞体，其整个表面均广泛分布着连接蛋白35.5（图5A、5B及图S5A）。运动前神经元未显示出连接蛋白34.1染色的明显突触模式（图5A、5B），而其他未鉴定的脊髓神经元胞体上则呈现出Cx34.1/Cx35.5共定位的清晰点状模式（图S5B）。II型V2a中间神经元的轴突侧支形成膨体，与运动前神经元胞体紧密接触，且紧邻连接蛋白35.5的点状结构（图5B及图S5C）。这些结果表明，连接蛋白35.5参与了II型V2a中间神经元与运动前神经元之间的间隙连接。

通过阈下超极化电流注射发现，II型V2a中间神经元与运动神经元之间的缝隙连接介导了电耦合（图S5D；(n=48) 配对样本，25只动物）。从运动神经元到V2a中间神经元的耦合系数始终更大（图S5D和S5E），且随两个神经元之间距离的增加而降低（图S5E）。两个方向上耦合系数的差异表明，这些电突触是由整流型缝隙连接介导的。

缝隙连接所提供的这种强电耦合作用，可使运动神经元前体细胞（pMN）膜电位的变化逆向传导至II型V2a中间神经元（INs）的突触前末梢，并影响突触传递（Song等人，2016）。为验证这一点，我们对这些神经元进行了双记录，同时将运动神经元前体细胞（pMN）钳制在超极化或去极化膜电位状态下（图5C；(n=44 pairs)，25只动物）。运动神经元前体细胞（pMN）的去极化会使复合兴奋性突触后电位（cEPSP）的幅度增大（图5C和5D），而运动神经元前体细胞（pMN）的去极化和超极化均会影响失败率（图5E）。此外，运动神经元前体细胞（pMN）与V2a中间神经元（INs）之间的耦合系数，与运动神经元前体细胞（pMN）在稳态去极化下复合兴奋性突触后电位（cEPSP）幅度的增加量之间存在显著相关性（图5F；(n=17)对，14只动物）。兴奋性突触后电位（eEPSP）的幅度变化方向与复合兴奋性突触后电位（cEPSP）相反，即会因运动神经元前体细胞（pMN）的超极化而增大，因去极化而减小。（图5C和图5G）。这些结果表明，间隙连接使运动神经元（pMNs）能对突触前的II型V2a中间神经元（INs）产生逆向影响。

图5. 运动神经元前体细胞通过间隙连接逆行影响II型V2a中间神经元的突触传递。(A) 神经生物素标记的II型V2a中间神经元轴突侧支环绕表达连接蛋白35.5（Cx35.5）而非Cx34.1的少突胶质前运动神经元胞体（n=(= 6) 为II型，6只动物）。(B) 为(A)中虚线框区域在单焦平面下的高倍放大图，显示II型V2a中间神经元侧支与少突胶质前运动神经元胞体间的紧密接触。突触前侧支不表达Cx35.5，该蛋白似乎仅局限于突触后少突胶质前运动神经元。(C) 来自II型V2a中间神经元和少突胶质前运动神经元的代表性记录，显示兴奋性突触后电位幅度受少突胶质前运动神经元膜电位的强烈影响。灰色轨迹为20次单次扫描；黑色和绿色轨迹为50次扫描的平均值。(D) 复合兴奋性突触后电位幅度随少突胶质前运动神经元膜电位的变化（数据以平均值±(p ≤0.05)、(^{*} p ≤0.01)、(^{* *} p ≤0.001)、(^{* * *} p ≤0.0001) 表示，经Tukey多重比较检验校正的单因素重复测量方差分析，(n=44 pairs)，25只动物）(E) 复合兴奋性突触后电位失败率随少突胶质前运动神经元膜电位的变化（统计检验和重复次数同[D]）。(F) 复合兴奋性突触后电位幅度与耦合系数的相关性（((R^{2}=0.63)、(p<0.001)、(n=17 pairs)，14只动物）。(G) 外源性兴奋性突触后电位幅度随少突胶质前运动神经元膜电位的变化（统计检验和重复次数同[D]）。另参见图S5和图S6。

通过间隙连接实现pMNs放电的同步化

初级运动神经元之间也表现出强烈的电耦合。向单个前运动神经元（pMN）内注射神经生物素，总会导致同一节段内另外三个前运动神经元发生染料耦合（图S6A和S6B；4只动物，填充了(n=5)对应的前运动神经元）。通过双细胞膜片钳记录证实了电耦合的存在，该记录显示所有四个前运动神经元之间均存在双向电流流动，且耦合系数较大（图S6C和S6E；7只动物，共(n=14)对神经元）。当电耦合的前运动神经元同时去极化至放电阈值时，它们的动作电位呈现高度同步性（图S6F和S6H；4只动物，共(n=6)对神经元）。相比之下，支配慢肌和中间肌的次级运动神经元（sMNs）耦合性较弱（图S6D和S6E；35只动物，共(n=56 pairs)个神经元），且未表现出同步放电（图S6G和S6I；2只动物，共(n=3)对神经元）。

I型和II型V2a中间神经元功能与连接的重组

在幼体阶段，I型和II型V2a中间神经元通过兴奋性相互连接形成正反馈回路，在快速游泳过程中驱动运动神经元的活动（Menelaou和McLean，2019）。鉴于幼体和成体阶段V2a中间神经元与运动神经元的形态和连接方式发生了变化，我们首先探究了这三种神经元组分在成年斑马鱼快速游泳时是否会被募集。我们对I型或II型V2a中间神经元、运动神经元进行膜片钳记录，同时通过光遗传刺激脑干中下行谷氨酸能神经元来诱导虚拟游泳。两种V2a中间神经元亚型和运动神经元均表现出阈下膜电位振荡，该振荡与外周运动神经记录到的游泳活动相关，但在任何频率下均未被可靠地募集（图6A；每种类型5条鱼，(n=3)）。I型V2a中间神经元偶尔能产生动作电位，但即便在最高频率下，也并非每个游泳周期都能稳定出现（图6A）。

我们接下来通过双膜片钳记录检测了两种V2a中间神经元类型是否存在相互连接（图6B）。I型V2a中间神经元的单个动作电位可在同一段尾侧或头侧的II型V2a中间神经元中可靠诱发兴奋性突触后电位/电流（EPSP/Cs）（图6C；(n=16 pairs)）。AMPA受体拮抗剂NBQX可消除这些EPSP/Cs（图6D；(n=5)配对），表明其仅通过化学突触介导。在对II型V2a中间神经元进行高频重复刺激期间，这些化学突触介导的EPSP/Cs幅度表现出显著的时间和使用依赖性易化（图6F；(n=16 pairs)）。相反，刺激II型V2a中间神经元并未在I型V2a中间神经元中诱导任何EPSP/Cs（图6E；(n=16 pairs)）。这些结果表明，I型和II型V2a中间神经元并未形成相互连接的环路；相反，它们仅通过易化谷氨酸能突触进行单向连接。

由于两种V2a抑制性中间神经元类型不参与游泳活动的产生，我们检测了它们是否被整合到驱动逃逸行为的神经环路中。成年斑马鱼的该神经环路包含下行指令神经元（包括M细胞；Lee和Eaton, 1991；Mauthner, 1859；Zottoli, 1977）以及一种新近鉴定的脊髓胆碱能V2a抑制性中间神经元亚型（esV2a抑制性中间神经元）（Guan等人, 2021）。因此，我们通过连续双记录技术探究了这两种V2a抑制性中间神经元是否接受来自esV2a抑制性中间神经元的兴奋性输入（图6G、图S7A和图S7B）。单个esV2a抑制性中间神经元的动作电位并未在I型V2a抑制性中间神经元中引发任何兴奋性突触后电位/电流（图6H；(n=7)对细胞，6条斑马鱼），但却在II型V2a抑制性中间神经元中诱发了大振幅的兴奋性突触后电位/电流，且该电位/电流通常能达到动作电位的阈值（图6I；(n=5)对细胞，5条斑马鱼）。II型V2a抑制性中间神经元还接收来自M细胞的突触输入，该输入表现为具有多个成分的大振幅兴奋性突触后电位/电流（图6J；(n=3)对细胞，3条斑马鱼），这证实该亚型V2a抑制性中间神经元被整合到了成年斑马鱼的逃逸神经环路中。为检测这两种V2a抑制性中间神经元在逃逸行为中是否被募集，我们采用了离体脑干-脊髓标本，通过刺激M细胞区域可诱导出逃逸运动模式，该模式表现为大振幅的运动爆发（图S7C；Song等人, 2015）。I型V2a抑制性中间神经元未被募集在模拟逃逸过程中，I型V2a中间神经元仅表现出阈下去极化（图S7D；(n=5 type I)，共3只动物）。相比之下，II型V2a中间神经元在模拟逃逸过程中始终被募集，并发放多个动作电位（图S7E；(n=5)，II型，共3只动物）。最后，为了检测这两种V2a中间神经元是否接受感觉输入，我们在对这些中间神经元进行全细胞记录的同时刺激背根神经节（DRG）（图S7F和S7G）。背根神经节的刺激在I型V2a中间神经元中诱导出了大的复合兴奋性突触后电位/电流（EPSP/C）（图S7H和S7J；(n=4)，I型，共3只动物），但在II型V2a中间神经元中未诱导出（图S7I和S7J；(n=3)，II型，共3只动物）。

图6. I型和II型V2a INs的活动和连通性

II型V2a中间神经元参与控制逃逸过程中的推进阶段

研究人员通过行为分析结合双光子激光消融的方法，在活体状态下探究了I型和II型V2a中间神经元对快速游泳和逃逸行为的贡献（编号(in)）。研究人员对I型和II型V2a中间神经元、或仅对I型或仅对II型V2a中间神经元进行了双侧选择性激光消融，消融范围覆盖17至20个脊髓节段（图7A和7B；其中88只动物消融了I型和II型V2a中间神经元，5只动物消融了I型V2a中间神经元，5只动物消融了II型V2a中间神经元，另有6只作为对照的动物）。研究人员首先分析了这些V2a中间神经元的消融对尾部皮肤触碰诱导的快速游泳行为的影响。消融这两类V2a中间神经元，或仅消融其中一类，均未影响快速游泳，因为与对照组相比，平均行进距离、平均速度或最大速度没有差异（图7C-7F）。

然后，我们检查了两种V2a IN类型的消融对声音诱导逃逸的影响。高加速度逃逸反应被描述为发生在三个阶段：阶段1，“准备”阶段，身体快速弯曲（C-弯曲），质心平移最小；阶段2，“推进”行程，当鱼加速离开其初始位置时；和阶段3，其中鱼eithercontinuesswimming或开始滑翔（多梅尼西和黑尔，2019年；威尔斯，1973年）。I型和II型V2a INs的消融不影响逃逸阶段1的任何评估参数（C-弯曲；图7G-7J）。然而，在I型和II型V2a INs都被烧蚀的动物中，随后的逃生阶段2和3明显较慢（图7K-7M），尽管它们的幅度与对照相似（图7N）。这导致逃生效率较低，推进力较弱，因此逃生过程中行进的距离较短（图7L）。II型V2a INs的选择性烧蚀也显著降低了声音诱导的逃生阶段2和3的速度（图7M），而不影响它们的幅度（图7N）。相比之下，仅I型V2a INs的选择性烧蚀并没有显著影响逃生阶段2和3的速度（图7M），尽管在这些被烧蚀的动物中可以看到阶段2的幅度显着增加（图7N）。

同时，这些结果表明两种类型的V2a INs和pMNs之间的早期建立的回路经历了幼虫和成虫阶段之间的组织和功能变化。虽然它的任何组件都不有助于产生离岸游泳，但asubsetoftheseneuronsbecomeincorporated逃逸回路内并有助于推进效率。

图7. 消融I型和II型V2a中间神经元对游泳和逃逸行为的影响

讨论

脊髓运动回路在发育早期建立，使动物能够在胚胎和新生儿阶段就已经产生运动（Brandchereau等人，2000年；Clarac等人，2004年；Falgairolle等人，2017年；Hamburger 1963年；Saint-Amant和Drapeau，1998年；Ton和McDearmid，2012年）。在发育和生长过程中，所有动物都会改变大小和形状。许多研究表明，在发育过程中，运动回路的活性会发生变化（Combes等人，2004年；Hachoumi和Sillar，2020年；Marder和Rehm，2005年；Vinay等人，2005年），建立突触连接（HA和Dougherty，2018年；LandMesser，2018年；Marin-Burgin等人，2008年），以及调节组成神经元的活动（Abbinanti等人，2012年；Husch等人，2015年；Smith和Brownstone，2020年）。在这项研究中，斑马鱼的实验可及性允许直接比较幼体和成体阶段神经元回路的连通性和功能。我们之前关于成年斑马鱼游泳网络组织的工作仅限于晚出生的腹侧V2a INs和次级MNs（Ampatzis等人，2013年，2014年；Ausborn等人，2012年；Gabriel等人，2011年；Song等人，2018年）。因此，在本研究之前，还没有关于成年斑马鱼早期出生的V2a IN和pMNs连接性的信息。我们的结果现在揭示，与幼体阶段相比，成年斑马鱼中两种早期出生的V2a IN类型（I型和II型）和pMNs形成的电路存在年龄依赖性发育重组。

在幼虫中，I型和II型V2a INs被建议形成一个单一的相互连接的电路层，控制快速游泳活动的时间和幅度（Menelaou和McLean，2019）。这两种中间神经元类型相互之间进行兴奋性互惠连接。此外，I型V2a INs与支配外轴和过氧pMNs的所有pMNs建立广泛而均匀的连接，但II型V2a INs却只连接到外轴或过氧pMNs（Bagnall和McLean，2014；Menelaou和McLean，2019）。这种V2a IN-pMN电路仅在快速游泳时招募，但已经表明多巴胺能调制可以将pMNs的招募转向较慢的游泳频率（Jha和蒂鲁马莱，2020）。

这种早期建立的回路在成熟过程中经历了connectivityandfunction的几个关键变化。在成年斑马鱼体内，两种V2a IN类型不形成相互兴奋性回路；相反，只有通过化学谷氨酸能传递从I型到II型V2a INs的单向连接。这两种V2a IN类型在游泳过程中没有被招募，它们的消融对体内游泳行为没有影响。II型V2a INs的消融显着损害了听觉刺激反应中逃逸行为的效率，而I型V2a INs整合了感觉反馈。此外，I型V2a INs失去了与所有pMN的统一连接，转而支持与所谓的尾部pMN的强而选择性的突触连接，该pMN支配缺氧轴心肌肉组织的腹肌近象限（Eisen等人，1986；Menelaou和McLean，2012；Westerfield等人，1986）。这种突触连接仅通过化学传递介导，在重复刺激过程中表现出强烈的使用依赖性易化和短时程增强。由I型V2a中间神经元和尾部腹侧pMN细胞构成的成年斑马鱼选择性回路似乎参与感觉整合，并可能在快速逃逸运动中起到转向作用。

另一方面，II型V2a中间神经元建立新的连接，使其能够向所有运动神经元前体（pMNs）提供广泛且均匀的兴奋性信号。这些连接通过混合的电突触和化学突触传递介导，未表现出任何显著的使用依赖性增强或短期可塑性。反过来，在成年斑马鱼中，II型V2a中间神经元从最近发现的局部胆碱能逃逸V2a中间神经元获得强烈的兴奋性驱动（Guan等人，2021）。目前尚不清楚这些胆碱能逃逸V2a中间神经元是否存在于斑马鱼幼体中。在成体中，这些逃逸V2a中间神经元作为来自大脑的逃逸指令的局部中继，控制C型弯曲（第一阶段）的启动和方向性，而II型V2a中间神经元可能通过其与整个脊髓中所有运动神经元前体（pMNs）的广泛突触接触，在传递局部兴奋性信号中发挥互补作用。事实上，在逃逸行为的第一阶段，消融II型V2a中间神经元并不会影响C型弯曲的幅度或持续时间，但会显著降低逃逸第二和第三阶段中后续反向弯曲的速度。我们的研究结果表明，脊髓运动网络将与游泳相关的幼体环路元件整合到成体中另一种与逃逸相关的环路组织中。II型V2a中间神经元向所有运动神经元前体（pMNs）提供的广泛兴奋性驱动可能与体型增大有关，因为体型增大需要逃逸过程中更高效、更有力的运动。

本研究的另一项重要发现是，V2a中间神经元与运动前神经元之间的电耦合，以及运动前神经元之间的电耦合发挥着互补的功能作用。间隙连接可充当低通滤波器，相较于较慢的膜电位变化，它会减弱动作电位的传递（Li等人，2009）。此外，间隙连接使运动前神经元的膜电位变化能够逆向传递至II型V2a中间神经元的突触前末梢，进而改变神经递质释放的概率以及运动前神经元中由此产生的兴奋性突触后电位。此前，我们发现晚出生的次级运动神经元与驱动游泳活动的V2a中间神经元之间存在类似的逆向影响（Song等人，2016）。另一方面，运动前神经元之间存在强烈的相互耦合，这介导了它们放电的同步化。因此，电耦合使运动前神经元能够以整体形式接收来自II型V2a中间神经元的共同兴奋性驱动，一旦被募集，它们就会同步放电，同时通过对II型V2a中间神经元突触前末梢的逆向影响进一步增强其突触驱动。这种由突触后pMN神经元之间以及与突触前II型V2a中间神经元通过间隙连接构成的环路结构，在协调所有pMN神经元的同步放电活动、实现快速肌肉收缩以及产生逃逸行为所需的力量方面将发挥重要作用。

从出生到成年稳定的行为输出，要求神经系统持续适应新行为的习得，同时随着与外部环境的经验和互动不断调整神经网络（Bucher 等人，2005；Dominici 等人，2011；Gerhard 等人，2017；Kämper 和 Murphey，1994）。我们对这些适应背后的突触和神经环路机制的理解仍不完整。本研究发现，斑马鱼向成年发育的过程中，最早建立的运动神经环路之一会发生重大重构。因此，斑马鱼不同发育阶段相同环路组件的实验可及性，不仅为运动神经环路的组织方式提供了见解，如今也开始揭示发育成熟过程中的适应机制。综上，本研究揭示的环路重组表明，在发育成熟过程中，机体既保留并重新利用现有网络组件，又通过重构其连接方式，以适应动物成年过程中身体生长与形态变化带来的新需求。

本研究的局限性

我们希望强调一些具体的局限性。首先，两种V2a中间神经元与pMN神经元之间突触连接的分布和位置还需进一步分析。其次，尽管电生理数据显示II型V2a中间神经元与pMN神经元之间存在整流性缝隙连接，但其分子组成尚未完全明确。这需要针对其他连接蛋白的特异性抗体，而目前尚无此类抗体。第三，我们通过电刺激背根神经节神经元检测了I型V2a中间神经元在感觉整合中的作用，但感觉传入神经元的身份及其在自然行为中的作用仍有待阐明。

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