题目：SLAMseq resolves the kinetics of maternal and zygotic gene expression during early zebrafish embryogenesis

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36757845/

期刊：Cell Reports

研究亮点

l 30 mRNA SLAMseq技术可在母源合子转换期间区分合子转录本与母源转录本

l 在二细胞阶段就已有多达数百个短内含子少的基因开始转录

l 合子基因组激活后，大多数转录本来自数千个MZ基因

l MZ转录本的快速替换维持核心基因表达机制

摘要

母体向合子过渡（MZT）是后生动物胚胎中的一个关键发育过程，涉及合子转录激活（ZGA）和母体转录本的降解。我们采用代谢型mRNA测序技术（SLAMseq）对斑马鱼复杂的胚胎转录组进行解析。尽管在母体向合子过渡（MZT）之前线粒体合子转录本占主导，但我们发现早在2细胞阶段就有数百个短且内含子少的基因存在虚假转录。在合子基因组激活（ZGA）后，大多数合子转录本源自数千个母源-合子（MZ）基因，这些基因的转录速率与数百个纯粹合子基因相当，并在不同的时间尺度上补充母体mRNA。母源-合子（MZ）转录本的快速替换涉及与主要母体降解途径无关的转录本降解特征，并通过增加poly(A)尾长度和翻译效率促进核心基因表达机制的从头合成。因此，SLAMseq技术为揭示斑马鱼胚胎发育过程中母体向合子过渡（MZT）的时间尺度、分子特征及调控机制提供了重要见解。

图形摘要

引言

受精卵向发育胚胎的转变由母体遗传（母体）和合子产生（合子）因子共同驱动。受精后，合子基因组最初处于转录失活状态，母体沉积的RNA和蛋白质是执行所有细胞功能的关键。随着发育进程，细胞过程的调控权逐渐移交至合子基因组产生的转录本和蛋白质。这一移交过程被称为母体-合子转变（MZT），在果蝇、秀丽隐杆线虫、非洲爪蟾和斑马鱼等生物中该过程可持续数小时，而在小鼠和人类中则可持续数天。因此，胚胎发生的进展需要转录组的全面重排：母体转录本需及时清除，同时核转录的启动会在合子基因组激活（ZGA）期间产生新的mRNA。由此，在母体-合子转变过程中，转录组由三类基因产物构成：仅由母体提供的（母体型[M]）、仅由合子表达的（合子型[Z]），以及由母体提供并在合子中重新表达的（母体-合子型[MZ]）。

在斑马鱼胚胎中，合子基因组激活的主要波峰出现在受精后约3小时，即前十个快速卵裂周期之后与细胞核不同，线粒体基因组在受精后会立即进行转录⁴。此外，有研究报道斑马鱼在合子基因组激活（ZGA）之前，会因染色质局部开放而出现低水平的随机转录，同时还会从特定位点（如多拷贝的miR-430位点）进行选择性转录。

关于合子基因组激活（ZGA）发生时间及动态的研究，主要集中在占比相对较小的纯合子转录本上（估计占比低于25%）。这类转录本缺乏母体mRNA的对应序列，因此可以直接进行定量分析。来自RNA测序实验。然而，大多数tran编码管家蛋白的脚本（包括转录、翻译、代谢和稳态等关键细胞过程所需的组分）在卵子发生阶段便已合成，由母体遗传，因此最初可作为胚胎中蛋白质产物从头合成的模板，之后才会被胚胎中新合成的mRNA所替代。在一个过渡期内，这类所谓的母源合子基因（MZ基因）在胚胎中同时存在母源和合子转录本。由于在早期胚胎发生过程中转录和转录后调控方面的研究尚处于起步阶段，MZ基因在其中可能占比不小，但目前在很大程度上仍未被鉴定和研究这一特定基因类别在区分母体贡献和合子体贡献方面存在技术难题。

关于母源-合子转换（MZ）基因表达的相对丰度及动态变化，相关认知的缺口主要源于难以以全基因组且能识别合成时间的方式对转录本进行定量评估。尽管已知部分基因在母源与合子启动子和/或3'非翻译区（3' UTR）的使用上存在差异，但这并非所有MZ基因的普遍特征。 以往在斑马鱼中全局表征从头合成转录本的研究采用了基于测序的技术， 包括对含内含子的前体mRNA进行定量，7,18 抑制合子转录的干扰实验，利用不同亲本斑马鱼品系对父本基因组转录的mRNA进行单核苷酸多态性（SNP）定位，以及对胚胎中新合成的RNA进行代谢标记后再通过生物化学方法富集标记RNA。然而，这些方法均无法以兼顾MZ的方式对未受干扰的胚胎转录组进行足够灵敏且全面的分析。鉴于母源转录本在胚胎发育初期大量存在，未标记的母源污染物对于ZGA期间从头合成转录本的定量评估尤为关键。因此，目前仍不清楚MZ转录本在从头合成转录本总量中的占比究竟有多大。此外，MZ基因的转录时间以及母源转录本被合子同源转录本取代的动态过程，也尚未得到定量且全面的解析。

在此，我们采用SLAMseq技术，以MZaware的方式对斑马鱼胚胎转录组进行分类和表征。 SLAMseq通过以下两点克服了以往实验策略的挑战：(1) 用尿苷类似物4-硫尿苷（4sU）标记新合成的RNA；(2) 在逆转录步骤中，将体外掺入的4sU基团定量转化为T-to-C（T>C）错配，通过结合核苷酸转换感知生物信息学工具的下一代测序（NGS）即可轻松对其进行检测和定量分析。 结合3' mRNA测序，我们优化并扩展了斑马鱼胚胎发育过程中当前的mRNA 3'注释，并表征了母源-合子转换（MZT）期间转录输出的时间、动态变化和程度。本研究为数百种基因的虚假转录提供了证据在合子基因组激活主要浪潮之前的基因，并揭示早期胚胎发生过程中大部分转录输出源自母源合子基因，而这一点此前在很大程度上被忽视了。最后，我们发现对于具有稳定基因表达模式的特定母源合子基因亚类，转录本替换的动力学特征存在差异，其中编码核心基因表达程序因子的转录本表现出尤为快速的合子补充动力学特征。

结果

体内SLAMseq技术区分斑马鱼胚胎中的合子转录本与母源转录本

为研究母源-合子转换（MZT）过程中的基因表达动态，我们在斑马鱼中建立了一种体内代谢RNA测序方法（30 mRNA SLAMseq）（图1A）：我们在不干扰胚胎发育（图S1A、S1B）或基因表达（图S1C）的条件下，于1细胞期向斑马鱼胚胎注射4sU（1.5 mM）。在受精后5.5小时（hpf）内的不同发育时间点提取总RNA后，我们进行了巯基连接烷基化反应，以在cDNA文库中检测新合成的转录本，具体表现为4sU掺入位点处出现特异性T>C转换（SLAMseq）。我们将SLAMseq与30 mRNA测序相结合，此前研究已证实，该方法可快速、规模化地实现对RNA聚合酶II依赖型基因表达的细胞动力学的转录本30异构体的实验检测形式敏感的方式。 为了克服所施加的限制由于现有斑马鱼基因组版本（GRCz11）中mRNA 3'端注释存在缺陷， 我们利用3' GAmES技术重新注释了阶段特异性多聚腺苷酸化位点（图S1D、S1E；表S1）。人工核查发现，3' GAmES生成的计数窗口与常规RNA测序（RNA-seq）所定义的基因单位3'端（基因主体）及CAGE-seq所定义的5'端相重叠（图1B）。对常规RNA-seq与3' mRNA末端测序进行全转录组水平的对比分析测序显示3'端的mRNA表达召回率更为均匀GAmES 注释与 Ensembl 注释的对比（图 S1F 和 S1G）。与富集 poly(A) 样本的常规 RNA-seq 不同，30 mRNA 测序采用短锚定寡聚(dT)引物进行 cDNA 文库制备，这可减少不同 poly(A) 尾长度的 mRNA 定量偏差（图 S1H–S1L）。斑马鱼胚胎发生过程中，因为多聚(A)尾长度变异体通常源自细胞质mRNA的降解与重新加尾腺苷酸化。

为验证30 mRNA SLAMseq技术能否区分新合成的合子转录本与母源转录本，我们检测了斑马鱼胚胎在受精后5.5小时（hpf）构建的文库——这一时间点已发生强烈的合子基因组激活（ZGA）。正如预期，我们在匹配已知合子基因vox的读段中观察到T>C转换的显著积累，而在母源转录本cldnd中则无此现象（图1B）。为评估SLAMseq的特异性与灵敏度，我们检测了更广泛的预定义合子基因（即由Harvey等人、Heyn等人或Lee等人检测到，并经进一步筛选；见STAR方法(n=47)；n=47）、高可信度母源基因（即参与卵子发生和减数分裂，且在成年体细胞组织中不表达的基因；(n=25)）以及疑似母源转录本（即先前由Lee等人定义并经进一步筛选的转录本；见STAR方法(n=226)）。在受精后5.5小时，合子基因的从头转录与表达水平显著相关（皮尔逊相关系数(R_{P}=0.92)与(p<10^{-18})），而高可信度母源基因（(R_{P}=-0.11)与(p=0.59)）或疑似母源基因（(R_{P}=0.1)与(p=0.12)，图1C）则无此关联。值得注意的是，疑似母源基因呈现双分布特征，其中许多基因（((n=133))）表现出从头表达的信号，而另一些基因（((n=93))）则无标记信号，与高可信度母源基因相似（图1C右侧图、S1n、S1o）。为评估合子转录对母源到合子转换（MZT）过程中整体转录本丰度的贡献，我们在校正基因型特异性单核苷酸多态性（SNP）和测序误差后，计算了每个基因的T>C转换率（见STAR方法）。我们发现，对于合子基因，一旦合子基因组激活启动（即受精后3.5小时），每个基因的T>C转换率立即达到7.9%的中位数（即每13个尿苷中就有1个被4sU替换），且在实验期间该转换率保持稳定，消除了对4sU稀释效应可能带来的担忧（图1D左侧图）。需注意，未注射样品中未出现T>C转换的积累（图S1P）。高可信度母源转录本通常表现出极低至检测不到的T>C转换率，且在整个时间进程中无显著升高，表明这些基因组位点缺乏转录活动（图1D中间图）。相比之下，疑似母源转录本仅在受精后4.5小时出现显著且持续的T>C转换率上升（图1D右侧图），这说明尽管基因表达整体呈下降趋势，但母源转录本仍逐渐被合子转录本取代（图S1M）。因此，仅通过基因表达下降来对母源转录本进行分类是不够的，先前被归类为母源的大量基因实际上可能在母源到合子转换过程中重新表达。

为了评估30 mRNA SLAMseq是否能可重复地区分母源合子转换（MZT）前后的阶段，我们对整个时间序列中的基因表达进行了主成分分析。该分析显示，4sU注射的重复样本与相应的对照样本聚类效果良好，其中76%的变异可由第一主成分解释，该主成分反映了发育时间（图1E，左图）。对未过滤的T>C读长进行类似分析后，发现基于4sU标记的分离效果更显著（第一主成分涵盖84%的变异），其中4sU注射的重复样本在母源合子转换前与对照样本聚在一起，但在转换后重新在母源合子转换（MZT）后，这些样本与各自的未标记对照组相比存在显著差异（图1E，右侧图表）。此外，重复数据显示，在所有时间点，基因表达的重复数据均存在强烈且显著的相关性（皮尔逊相关系数 (R_{P}>0.92)、(p<10^{-15})，图S1Q，左侧图表）；早在受精后2.5小时（2.5 hpf），从头转录（通过每条读段存在多个T>C转换进行保守评估）也呈现出显著相关性（(R_{P}>0.89)、(p<10^{-12})；图S1Q，右侧图表）。综上，我们认为SLAMseq技术能够可重复地区分母源合子转换（MZT）前后的阶段。

图1. 斑马鱼胚胎中的3'端mRNA SLAMseq技术可区分合子来源与母源沉积的mRNA。(A) 将 4硫尿苷（4sU）注射至 1细胞期斑马鱼胚胎，胚胎发育指定时长（Δt）后，提取总 RNA，采用 3' 端 mRNA 测序的 SLAMseq 技术开展实验。通过 SLAMDUNK 识别 4sU 掺入位点上的 T→C 转换，即可将新合成转录本与母源 mRNA 区分开。(B) 基因组浏览器截图示例：左侧为合子基因ventral homeobox（vox），右侧为母源基因claudin d（cldnd）。图中展示不同数据轨道：上方为 poly (A) 富集 RNAseq；中间为 CAGE（帽分析基因表达，数据重映射自 Haberle 等人的文献 ¹⁴）；下方为 3' 端 mRNASLAMseq；样本取自标注的发育阶段（受精后小时数 hpf）。放大视图显示 3' mRNASLAMseq 数据集比对到对应 3'UTR 计数窗口的各条读段。星号代表 T→C 转换（红色，T>C）或其他类型碱基转换（黑色，V>N）。(C) 5.5 hpf 条件下，对预先划分的合子基因（n=47）、高置信度母源基因（h.-c.；n=25）、疑似母源基因（susp.；n=226），比较从头转录水平（T>C 读段，单位：每百万读段 rpm）与基因表达量（rpm）。图中标出皮尔逊相关系数 (Rₚ) 及对应的 p 值 (p)。(D) 卵母细胞合子转换期（MZT，时间单位 hpf），统计 (C) 中各类转录本的 T→C 转换率。展示可由两组独立生物学重复计算得到可靠平均转换率的基因（红色，n 为基因数量），四分位距用灰色区域表示。标注了 KruskalWallis 检验 + Dunn 多重比较检验的 p 值；nd：未检测到。(E) 未过滤对照组（无标记，黑色）与两组独立 3' mRNASLAMseq（+4sU；R1 浅红、R2 深红）实验样本，在各发育时间点（hpf）的主成分分析。左图：基因表达；右图：从头转录（T>C 读段）。各主成分的方差贡献率以百分比标出。n：分析所用基因数目。

早期胚胎转录组以预先存在的母体mRNA为主

为评估合子基因组激活（ZGA）主要波次前后的转录活性，我们对比未标记样本（-4sU；图2A）或样本内背景转换（即T>A；图S2A），统计了30个mRNA SLAMseq数据集里的T>C读取数（T>C读取；+4sU）。早在最早时间点（即受精后0.75小时），以及后续更显著的时间点（即受精后5.5小时），从注射4sU（+4sU）的斑马鱼胚胎制备的30个mRNA SLAMseq数据集里，我们检测到的T>C读取数显著高于未标记样本（-4sU）或样本内对照转换（T>A，Whitney Mann (p<10^{-15})）（图2A和图S2A）。为确定整个时间进程中的转录输出量，我们统计了映射至线粒体或核基因组的含1个、2个或≥3个T>C转换的读取数（图2B）。值得注意的是，通过对合子及母体转录本的评估证实，多个T>C转换是从头转录的可靠指标（图S2B）。尽管早在受精后0.75小时，我们就在线粒体转录本中检测到持续的高转录信号，但核基因组编码的基因在受精后3.5小时前几乎没有强转录的迹象，此后所有后续时间点的转录活性均显著增强（图2B）。我们得出结论，与核基因组不同，线粒体在受精后立即启动强转录。

为估算整个胚胎发生过程中合子基因组对整体转录组的贡献，我们通过测定T>C读取的总数，相对于基因的绝对表达量，对转录输出进行了定量分析（图2C）。我们将此分析限定在稳定表达的基因范围内，这类基因的T>C转换特征相较于未标记的对照样本显著更高（见STAR方法）。我们发现，在最早的时间点，仅有0.01%的转录组由新合成的基因产物构成，在合子基因组激活（ZGA）的主要波次之前，这一比例仅有小幅上升。值得注意的是，即便在受精后5.5小时（hpf），也仅有9.33%的转录组可归属于合子基因组（图2C）。这表明即便是在原肠胚形成开始时，转录组仍主要由预先存在的母体基因产物主导。在合子基因组激活（ZGA）之前观察到的低水平合子转录本，绝大部分源自线粒体基因组（占新生转录组的((≥85%)），而核基因组仅在受精后3.5小时（hpf）后才成为合子转录组的主导部分（图2D）。

图2. 斑马鱼胚胎发生中的转录组全景。(A) 对比注射4sU的斑马鱼胚胎（+4sU，红色）与未处理的对照胚胎（无4sU，黑色）在指定发育时间点（小时受精后，hpf）的从头转录（即每百万读段中T>C读段数，rpm）与基因表达量（rpm）。箱线图通过比较T>C读段数对从头转录信号进行定量分析，标注了p值（威尔科克森检验），n为检测的基因数量。(B) 气泡图展示了包含1个、2个及3个以上T>C转换的读段数（rpm），这些转换分别定位在线粒体基因组（左）和核基因组（右）上。(C) 展示合子转录本（红色，顶部标注百分比）和母源转录本（黑色）在对应时间点（小时受精后，hpf）对基因表达的贡献占比。(D) 展示线粒体基因组（浅红色）与核基因组（深红色）的相对转录活性，标注了每类对应的基因数量。

在主要的合子基因组激活浪潮之前，数百个基因位点存在虚假转录的证据

随机基因表达是早期合子基因组激活的一个特征。事实上，近期的成像研究揭示了虚假表达在512细胞阶段的8个基因（apoeb、aldob、slc25a22、mex3b、lrwd1、sox19a、zic2b和tbx16）以及早在64细胞阶段的多拷贝miR-430基因座。鉴于30 mRNA SLAM-seq的灵敏度和特异性，我们重新探究了2细胞阶段（0.75小时受精当量）和64细胞阶段（2小时受精当量）下虚假核转录的发生时间和范围。为此，我们应用了一个基于T>C转换率（T>C置信得分百分比[PTC]）的过滤参数，用于报告转录本中单个4SU掺入事件的发生情况（详见STAR方法学）。我们基于5.5小时受精当量时检测到大多数预先定义的合子基因但未检测到母源h.-c.基因，确定了重复特异性的PTC临界值（图S3A）。通过应用该过滤方案，我们在两个重复中的任意一个中鉴定出总计501个（0.75小时受精当量）和554个（2小时受精当量）PTC临界值以上的基因，包括9个先前报道的早期表达基因中的8个（图3A；表S2）。在5.5小时受精当量时，PTC临界值以上的基因数量大幅增加至3328个（图3B、3C和S3B）。值得注意的是，在2细胞和64细胞阶段，重复之间重叠的基因比例仅分别为4.2%（0.75小时受精当量）和7.6%（2小时受精当量）（图3B），这可能反映了一种虚假和/或随机的表达模式。与此一致，仅检测到20.2%和18.9%的基因分别在受精后0.75小时和2小时的至少一个重复样本中也检测到了（图3C和图S3C）。相比之下，在受精后5小时和5.5小时，超过40%的基因可重复地检测到表达量高于临界值，这证明了母源-合子转换后基因组的高效激活（图3B）。

在斑马鱼和果蝇中，最早检测到的合子转录本很短且内含子很少。为了确定这些特征是我们最早检测到的基因产物的标志，我们根据这些基因在受精后0.75小时或2小时的无义介导的mRNA衰变分级，对其内含子数量和编码序列长度进行了比较。实际上，与所有已注释的基因相比，具有高T>C置信分数的基因的内含子数量和编码序列长度显著更低（Wilcoxon检验；图3D和图S3D）。我们还查阅了已发表的染色质特征，例如256细胞阶段通过转座酶可及性染色质测序技术（ATAC-seq）测定的整体染色质可及性，以及在启动子区域（已注释区域的±1千碱基对）在圆顶阶段通过染色质免疫沉淀测序技术测定的H3K27乙酰化水平。检测到的PTC临界值以上基因的转录起始位点）事实上，我们发现PTC值最高的基因在开放染色质和H3K27乙酰化方面显著富集（超几何检验，(p<0.05) 图3E和图S3E）。综合来看，我们的数据表明，在斑马鱼胚胎发育过程中，数百个缺乏内含子的短基因最早会在二细胞阶段被错误地表达。

图3. 母源合子转换前数百个基因位点存在虚假转录的证据。（A）T>C 置信度分数（PTC）报告每4sU标记转录本中T>C转换的百分比。仅展示对应真阳性率>74.4%且假阳性率为0%的PTC分数的基因（参见图S3A）。先前报道的早期转录基因以红色高亮显示。n为基因数量。另见表S2。(B) 维恩图展示了在指定时间点（以小时受精后数计），两个独立生物学重复中检测到的PTC临界值以上基因的重叠情况。标注了p值（费希尔精确检验，(****p<10)）。(C) 0.75小时受精后（2细胞阶段；(n=501)）所有PTC临界值以上检测到的基因的热图，展示了在后续指定时间点（以小时受精后数计），两个独立实验中均无（白色）、仅有一个（灰色）或两个都有（黑色）T>C读取（高于PTC临界值）的情况。两个重复中至少一个具有连续信号（红色）或不连续信号（蓝色）的基因以左侧形式高亮显示。(D) 0.75小时受精后按PTC最高（实心圆）或最低（空心圆）排序的指定数量基因的内含子中位数（左图）或编码序列（CDS）长度（以千碱基[kb]计，右图）。标注了与数据集中所有基因的中位数（虚线）和四分位距（灰色区域）存在统计学显著偏差的结果（威尔科克森检验；****p < 10 (cdots cdot p<10^{-4})）。(E) 0.75小时受精后按PTC最高（红色）或最低（蓝色）排序的指定数量基因的ATAC-seq（左图；源自Pa´ lfy等人9）和H3K27乙酰化染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）（右图；源自Bogdanovic等人25）的标准化富集分数（NES）。以不透明颜色标注显著富集结果（超几何检验结合本雅明尼-霍赫伯格校正；(p<0.05)）。

MZT转录组的分类揭示了大多数母源基因的合子重新表达

在母源到合子转换（MZT）期间，转录组由严格由母源提供的基因产物（M）、仅由合子表达的基因产物（Z），或母源提供且在____中重新表达的基因产物组成合子（MZ）。为了探究母源基因重新表达的程度，我们基于（1）基因表达水平和（2）随时间推移的基因特异性T>C转化率，对通过30个mRNA SLAMseq测序测得的转录组进行了分类（图S4A；表S3）。仅考虑稳定表达的基因（即任意时间点每百万读长[(>5.) reads per million, rpm]），我们将转录组分为四类：（1）母源不稳定型（((n =) 1,416个基因），在母源-合子转换（MZT）过程中基因表达下降，且未检测到T>C转换；（2）母源稳定型（((n=1,569))个基因），在整个实验时间进程中基因表达保持稳定且未检测到T>C转化；（3）MZ基因MZ ((n=6,923))，在2细胞期和64细胞期呈现表达下降、稳定或上升的趋势，且检测到T>C转化；（4）合子基因zygotic ((n=434))，在2细胞期和64细胞期基因表达呈上升趋势，且检测到T>C转化（图4A）。值得注意的是，绝大多数（即70%）母源基因在5.5小时的时间进程中通过合子途径重新表达。为独立验证这一分类，我们比较了受精卵母细胞和2细胞期胚胎中各组的基因表达。正如预期的那样，我们观察到母源稳定、母源不稳定和MZ基因在卵母细胞和2细胞胚胎中具有统计学上显著的高相关性（皮尔逊相关系数(R_{P}>0.87)：(p<10^{-15})），而合子基因在卵母细胞中未被检测到，在2细胞期胚胎中表达也极低（即便有表达）（图S4B）。基因本体论（GO）术语分析显示，母源不稳定基因与生殖过程显著相关，母源稳定基因与代谢及其他持家活动相关，合子基因则与发育和分化功能相关（图4B）。值得注意的是，MZ基因与基因表达相关过程——包括RNA代谢、加工和生物合成——显著相关（图4B）。

为了对我们的分类进行基准测试，我们将30个mRNA SLAMseq技术在受精卵中鉴定出的表达基因（合子型和母源合子型）与三种先前的专用方法进行了对比合子转录本的注释（图S4C）。除了与以往研究高度一致之外与以往研究总体高度一致，30 项 mRNA SLAMseq 技术揭示了 4398 个此前未被报道的合子表达新基因（其中 4188 个为母源合子基因、210 个为合子基因）（图 4C）。在这些新分类的基因中，母源合子基因与合子基因均表现出与预先定义的合子基因、母源合子基因一致的代谢测序特征（图 S4D、1D 及 S1O），进一步证实了本分类方法的有效性。

最后，我们比较了母源合子转换（MZT）期间母源合子基因（MZ）和合子基因对整体转录负荷的贡献程度（图4D）。3小时受精后（hpf），首个合子基因——miR-430基因座的稳定表达早于最早的母源合子基因（3.5 hpf时检测到），但母源合子基因的整体表达量最高可达合子基因的6.3倍。同时，母源合子基因分布在多达6.6倍更多的基因上（即5.5 hpf时，母源合子基因有2173个，合子基因仅329个；图4D），其整体转录负荷更高，这使得母源合子基因与合子基因在每个基因座上的中位转录输出量相近（图S4E）。综上，我们证实30个信使核糖核酸（mRNA）测序技术（SLAMseq）可解析斑马鱼胚胎母源合子转换过程中转录本的母源和合子来源，并揭示了大量未预期的母源基因重新表达。事实上，我们的研究证据表明，大多数合子转录组源自数千个母源合子基因，这些基因的平均转录速率与合子基因相当。

图4. 母源-合子转换期间斑马鱼转录组的分类揭示了大多数母源基因的合子重新表达。（A）通过k-中心点聚类对转录组进行分类（见图S4A），是基于指定发育时间点（单位：小时胚胎形成，hpf）的基因表达（上图）和T>C转换率（下图）进行的。仅纳入在任意时间点表达量超过临界值（5 reads per million，rpm）的基因。基因数量（n）被分为母源不稳定型（M unstable；黑色）、母源稳定型（M stable；蓝色）、母源-合子型（MZ；黄色）和合子型（Z；红色）。各基因的表达量均以其观测到的最大表达量为参照进行计算。另见表S3。（B）在（A）所述的各类基因中显著富集的前五项基因本体论（GO）术语。（C）桑基图展示了本研究中基于30种mRNA SLAMseq技术的基因分类与先前报道的合子型（即合子型或母源-合子型）基因注释之间的对比。4,7,19 （D）在指定时间点（单位：hpf），合子型（红色）或母源-合子型（黄色）基因的整体合子型表达量化结果（即T>C读取数，单位rpm）。图中标注了每个时间点纳入分析的基因数量。相对整体转录输出量指的是所有合子型（红色）或母源-合子型（黄色）基因所产生的T>C读取数的相对丰度。

MZT过程中母体基因产物的替换以不同速率发生

鉴于MZT期间母源基因重新表达的广泛范围（图4），我们探究新合成的转录本在多大程度上scripts 对单个基因的基因表达有促进作用。为此，我们聚焦于在本时间进程中丰度未发生变化的母源合子过渡（MZ）基因子集——该子集占母源合子过渡基因的大多数（即6923个母源合子过渡基因中的4249个；图S5A），并基于合子基因组激活（ZGA）主要阶段（即受精后3.5至5.5小时）T>C测序读段的贡献进行了k-中心点聚类分析（图5）。以dhx15、nono、pou5f3和sox11b这些代表性基因为例，我们鉴定出了四个聚类，这些聚类在合子转录本替代预先存在的母源基因产物的速率上存在差异（图5A；表S4）。定量评估显示，聚类1（2268个基因）的平均合子贡献仅为5.29%，占比极低。聚类2（1022个基因；最高达15.1%）和聚类3（642个基因；最高达30.53%）基因的补充程度更高。聚类4（317个基因）的基因被替代的效率最高，平均合子贡献高达59.8%，这表明对于这些基因而言，转录组会迅速被合子基因产物主导（图5B和S5B）。需注意的是，尽管所有聚类的基因表达均处于中位数水平(levels >10 rpm)（图S5C），但聚类3和4基因的表达水平显著低于聚类1和2。由于替代动力学增强意味着转录本稳定性下降，我们检测了低转录本稳定性是否是这些基因（尤其是聚类4基因）固有的保守特征。与该假设一致，对小鼠胚胎干细胞（mESCs）中基因聚类直系同源物的mRNA半衰期进行比较后发现，mRNA中位数半衰期呈逐渐降低的趋势，且聚类4基因的mRNA半衰期显著更低（威尔科克森检验，(p<10^{-2})；图S5D）。

GO 术语分析显示，四个具有不同替换动力学的母源-合子（MZ）簇基因存在差异富集：缓慢更新的母源-合子基因与持家功能（簇 1）或 mRNA 加工及代谢（簇 2）显著相关。相比之下，簇 3 和 4 中的基因则富集于基因调控功能，包括蛋白质生物合成、mRNA 剪接和蛋白酶体的基因网络，这表明在母源-合子转换（MZT）过程中，持续且快速的 mRNA 周转通过活跃的转录得到了补偿（图 5C）。值得注意的是，簇 3 和 4 还包含合子基因组激活（ZGA）所需的关键转录因子，包括 pou5f3 和 nanog。我们得出的结论是，母源-合子转录本的恒定水平源于合成与降解速率的平衡，而不同基因的合成与降解速率差异显著。

MZ转换动力学影响母源-合子转换期间转录后调控的特征

合子转录本替换MZ基因产物的不同速率，意味着母体mRNA清除机制参与了动力学转变的建立。为了深入了解可能有助于斑马鱼MZT期间MZ mRNA不同清除速率的机制，我们探究了与转录本不稳定相关的已知特征，包括密码子适应指数（CAI）、(3')非翻译区（UTR）长度，以及母体和MZ转录本中miR-430靶位点的存在情况（图S5E）。 正如预期的那样，母体不稳定转录本显著富集于低CAI和短3'非翻译区（(p<10^{-11})，单侧费希尔精确检验），且miR-430靶位点缺失（((p<10^{-3}))），这与先前报道的母体快速清除转录本的特征一致此外，母体稳定的转录本对和平号空间站430目标((p<0.01))((p<10^{-3}))和富集的CAl明显更高，UTR更长，这也符合它们在我们整个时间过程中的稳定性质和和平号空间站430介导的衰变随后进行（图S5E）在母亲稳定的成绩单中观察到的Tes，即长30UTRs、高CAI和miR-430目标的富集，没有一个已知的特征可以解释MZ簇2至4（图S5E）观察到的越来越快的替换动力学，这意味着仍有待确定的RNA翻转机制的参与。

为了进一步解决已知的mRNA命运和功能的分子决定因素如何与观察到的MZ置换率相关，我们在MZT.26,27期间检查了poly（A）-尾长度、30 mRNA uridylation（由Chang et al.26分析）和核糖体关联（由Chew et al.27分析）的变化。如前所述，母体沉积的mRNA的poly（A）-尾在受精后很短，在MZT.26,33期间逐渐增加。虽然在我们的分析中，所有类别的基因（母体稳定、母体不稳定和MZ）都普遍观察到这一点，但在最初的4小时内，与母体不稳定的mRNA相比，母体稳定的转录本显示了poly（A）-尾长度显着增加（图S5F）。这与细胞质多腺苷酸化信号一致，这些信号在母体稳定的转录本中显着丰富，但在母体不稳定的转录本中耗尽（图S5G）。随着这种增加，4 hpf后poly（A）-尾长度再次下降，大概是由于母体mRNA清除的开始（图S5F）。有趣的是，MZ簇的转录本显示，在ZGA之前，poly（A）-尾长度的增加与母体稳定的mRNA一样快，但此后保留扩展的poly（A）-尾的时间更长，导致MZ簇基因的poly（A）-尾长度明显高于母体不稳定或母体稳定的基因（(p<0.01)，Kolmogorov-Smirnov检验）（图5D）。这种效应在MZ簇4中最为明显，并与快速MZ替换动力学相关（图5B和5D）。虽然MZ簇1可能由于细胞质多聚腺苷酸化信号的显著富集（甚至比母体稳定的更丰富）而积累更长的poly（A）尾，但对于MZ簇2至4（图S5G）没有观察到这一点，这与更长的poly（A）尾起源于de-novo合成转录物的概念相一致。与多聚腺苷酸化相反，mRNA 30 uridylation出现在MZT开始时，并且在我们对母体稳定和母体不稳定mRNA的整个时间过程中不断增加（图S5H）。相比之下，MZ簇的基因似乎在此转变开始时抵抗mRNA uridylation，导致与母体基因相比，ZGA后30 uridylation的渗透率显着降低（图5E）。虽然MZ簇1最不明显，但MZ簇2至4显示出显著的（(p<0.003)，Kolmogorov-Smirnov测试）和逐渐增强的弹性，这表明更快的MZ置换动力学赋予uridylation-mediatedmRNA衰变越来越大的抵抗力（图5E）。对此的一个可能解释是，去新生合成转录本上更长的聚（A）尾使它们不太容易尿酰化。最后，我们调查了MZ转化动力学对翻译效率（TE）的影响。如前所述，对于母体稳定的，TE保持不变整个MZT的mRNA，而母体不稳定的转录本在受精后TE中迅速下降，此后保持低水平（图S5I）。有趣的是，MZ群集转录本在ZGA之前的TE谱中类似于母体稳定的转录本，但此后TE迅速显着增加（(p<10^{-3})，Kolmogorov-Smirnov测试）（图S5I）。同样，对于MZ群集2、3和4 mRNA，这种影响逐渐增强（图5F和S5I）。总之，我们的分析显示，MZT期间的MZ过渡动力学影响了转录后控制的特征，这些特征对核糖体参与和蛋白质输出有直接影响。

图5. MZ转录本的替换以不同的速率发生，影响转录后控制的签名。（A）具有恒定丰度但合子补充率不同的MZ基因的代表性基因组浏览器截图。放大到基因的30末端显示在指定时间点（以hpf为单位）确定的总基因表达（全部，灰色）和合子表达（T>C，红色）。（B）热图（顶部）显示了合子转录本与总丰度（Z/[M+Z]）相比的贡献，用于通过k-medoid聚类分类为四个组（簇1-4）的指定数量的基因（n）。合子表达对转录本丰度的平均贡献（底部）和在5.5 hpf时的最大置换。另见表S4。（C）（B）中描述的每个基因簇中显着富集的前五个GO项。（D和E）poly（A）-尾长（D）和mRNA 30末端尿酰化（E）变化的累积分布在ZGA之后vs.之前（6 vs.2 hpf），由Chang et al.26测量的基因（n）的指示数量分为母体稳定（黑色）、母体不稳定（灰色）和MZ簇（1-4，红色阴影；见图4）显示。p值（Komogorov-Smirnov测试）用于与所有其他转录本类别进行母体不稳定的比较。（F）翻译效率变化的累积分布post-（屏蔽期，6 hpf）vs. pre-MZT（256细胞期，2.5 hpf）。翻译效率由Chew等人确定。27显示了划分为母体稳定（黑色）、母体不稳定（灰色）和MZ簇（1-4，红色阴影；见图4）的基因（n）的指示数量。

讨论

在这里，我们在斑马鱼胚胎中使用代谢RNA-seq来解决MZT期间的化合物（即母体和合子）基因表达。为此，我们解决了几个问题突出的技术限制：首先，我们展示了30mRNA测序减少了不同poly（A）尾长度的mRNA定量偏差（图S1H-S1L），这是一个关键特征，因为poly（A）尾长度变异经常出现在细胞质mRNA去腺苷酸和再腺苷酸中斑马鱼胚胎发生过程中的作用通过系统地重新注释mRNA 30端（使用30 GAmES）（图S1D），可以提高30 mRNA测序量化基因表达的适用性（图S1F和S1G）。最后，我们建立了斑马鱼胚胎体内SLAMseq的实验和计算框架，该框架以高灵敏度和准确性（图1B-1E、S1N和S1O）区分合子和母体转录本，而不会干扰胚胎发育（图S1A和S1B）或基因表达（图S1C）。我们因此扩展了时空图技术的先前应用基因表达的ping

通过对斑马鱼胚胎应用30 mRNA SLAMseq技术，我们对斑马鱼早期胚胎发生（直至受精后5.5小时）的检测结果，从定量角度揭示了合子基因组激活（ZGA）的整体范围、模式及其对转录组的贡献。与先前报道一致⁴，受精后即刻的绝大部分（>85%）稳定转录活性可归因于线粒体基因组。相比之下，核基因表达仅在受精后3.5小时后才主导新生转录组，由此界定了合子基因组激活的主要波峰（图2B-2D). 值得注意的是，我们检测到了 hun 的合子表达信号数百个核基因在主要的合子基因组激活（ZGA）浪潮之前就已开始转录，最早可追溯至2细胞期（即受精后0.75小时，hpf）（图3A）。这些潜在基因展现出早期转录合子基因的标志性特征，包括内含子少、编码区（CDSs）短，以及染色质高可及性、H3K27乙酰化等活性染色质特征（图3D、3E、补充图3D和补充图3E）。在早期时间点（0.75和2小时后受精），大多数这些转录本只能不连续地被检测到((>79%))，且仅在两个重复样本中的一个中检测到((>92%))（图3B、3C、补充图S3B和S3C），这表明存在假阳性和/或随机性表达。因此，我们的数据显著提前并扩展了此前在部分细胞和胚胎中观察到的核基因转录随机起始时间。对于数量少得多的纯合子基因。给定据报道，RNA 聚合酶 II 在多拷贝位点的活性miR-430位点早在64细胞期，我们认为在胚胎发生的最初阶段广泛存在的假转录可能是快速细胞的综合结果缺乏G2期的细胞分裂、染色质的随机开放以及转录因子的有限浓度。

在胚胎发生的后期时间点（即>3小时受精后），核基因转录受到强烈激活，这种激活是逐渐增强的，而非以两个不同的波峰形式出现（图2B、图2C及补充图3B），这与之前在果蝇中的观察结果一致以及斑马鱼。有趣的是，在囊胚期（即5.5在合子基因组激活（ZGA）的主要浪潮过去很久之后，母体mRNA仍占转录组的(>90%)，这一数值远高于此前的估计。尽管母体转录组整体占主导地位，且与非洲爪蟾的一项近期研究一致，我们发现大多数母体基因（70%）在原肠胚形成前于合子中重新表达，只是表达程度各不相同（图4A）。35 事实上，基于30种mRNA的SLAM测序系统分类显示，在10342个基因中，14%被归为母体不稳定型((n=1,416))，15%为母体稳定型((n=1,569))，67%为母体-合子混合型（MZ）((n=6,923))，仅有4%为纯粹的合子型((n=434))（图4A及图S4A–S4D）。值得注意的是，大多数合子转录组（即囊胚期的(>84%)）源自数千个MZ基因，其平均表达水平与合子基因相当（图4D及图S4E）。这是一项重要发现，因为迄今为止关于ZGA的研究几乎都集中在数量相对较少的合子基因上，这在很大程度上是由于技术限制无法检测MZ基因的表达。从生物学角度来看，观察到的这些基因类别可能具有不同的功能：母体不稳定型基因可能在生殖过程中发挥作用，母体稳定型基因与代谢及其他持家活动相关，而合子基因则在发育和分化中承担角色（图4B）。有趣的是，MZ基因与基因表达相关过程显著相关，包括RNA代谢、加工和生物合成（图4B）——这或许表明需要重新表达此类基因以维持ZGA的主要浪潮。或者，这也可能是为了补充在卵子发生过程中或卵子长期休眠期间可能受损的母体转录本，例如由活性氧引发的氧化损伤所导致的损伤物种，这可能对胚胎存活有益，因为这会最大限度减少由截短或错误转录本的翻译所引发的潜在核糖体碰撞或细胞应激

MZT过程中母源基因活性的意外广泛范围，为胚胎中MZ基因的调控及动态变化提出了重要的未解问题。事实上，有四组不同的MZ基因在MZT过程中表达水平保持恒定，但母源转录本被合子基因产物替代的速率存在显著差异（图4A和图S4A），导致合子贡献的中位数逐渐上升，从第一组的5.3%增至第四组的59.8%。补充速度较慢的MZ基因与持家功能（第一组）或mRNA加工及代谢（第二组）显著相关，这或许反映了基因表达动力学对能量限制的进化适应，这一观点此前已被提出。相比之下，第三组和第四组的基因则富集于基因调控功能，包括蛋白质的基因网络生物合成、mRNA剪接以及蛋白酶体相关过程，这表明持续且高速的mRNA更新（在母源到合子转换期间通过转录激活得到补偿）或许能让生物体快速适应不断变化的发育和/或环境变化（图5C）。有趣的是，斑马鱼母源mRNA在母源到合子转换期间的已知清除相关特征（即密码子适应指数、3'非翻译区长度以及miR-430结合位点的存在）均无法解释这一快速的母源到合子转换动力学特征（图S5E），这为未来研究确定其潜在机制指明了方向。无论其具体作用模式如何，这种不同的动力学特征可能是基因固有且保守的特征所导致的（图S5D），这也直接关系到由编码蛋白的特定功能及其调控所引发的遗传信息的持久性。

在分子水平上，母源合子转换（MZ）替换会影响转录后调控的特征以及蛋白质的产出。我们发现，替换速度最快的基因簇（基因簇4）呈现出与胚胎中此类转录本高效翻译需求相符的特征：多聚腺苷酸（poly(A)）尾长度显著增加、U尾修饰程度低且翻译效率（TE）高（图5D-5F及补充图S5）。因此，我们的研究证实，这些转录本的快速补充有助于胚胎中高效的从头蛋白质合成，从而保障胚胎发育过程的稳健推进。这一观点也得到了佐证：合子基因组激活（ZGA）所需的关键转录因子（包括Pou5f3和Nanog）均由快速更新的母源合子转换（MZ）基因编码。

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