标题：The preoptic area and dorsal habenula jointly support homeostatic navigation in larval zebrafish

期刊：Current Biology

原文链接： https://doi.org/10.1016/j.cub.2023.12.030

摘要

尽管环境发生了变化，动物必须将生理过程保持在最佳温度范围内。通过行为检测、全脑功能成像和神经消融，我们发现斑马鱼幼体是一种外温性脊椎动物，通过恒定导航实现体温调节——向最接近其生理设定点的温度进行非定向和定向运动。包含多个大脑区域的全脑回路使这种行为成为可能。我们确定下丘脑的视前区（PoA）是在热条件恶化时触发非定向重新定向的关键大脑结构。这一结果表明PoA在外温性中也作为大脑的主要温度调节器的进化保守作用。我们进一步表明，即使在没有连续感觉线索的情况下，habenula（Hb）-脚间核（IPN）回路也保留了感觉历史的短期记忆，以支持连贯定向运动的产生。我们最终提供的证据表明，这种电路可能不是温度独有的，但可能传达更抽象的生理意义刺激的相对价表示，而不管其特定身份，以实现恒定导航。

图形摘要

引言

为了应对环境扰动，动物重新定位以保持其生理过程在健康范围内（即体内平衡）。不管涉及的具体策略和环境因素如何，神经系统在体内平衡期间发挥着至关重要的作用，方法是跟踪环境和内部信号，并将其与过去和正在进行的感官诱发体验和生理状态进行比较。温度是环境因素如何严重影响所有组织的生理过程的典型例子。未能评估其绝对水平、变化率和派生效价可能会产生各种后果，从组织损伤到整个系统失效。吸热动物，如哺乳动物，可以将意志行为策略（例如，温暖或寻求寒冷的行为）与自主措施（如颤抖/出汗或血管收缩/血管舒张）结合起来，以应对热应激。相反，诸如鱼、两栖动物和爬行动物等外生动物缺乏自主恒定机制来调节它们的体温。这些动物需要移动才能导航到外部温度与其恒定定点相匹配的地方。因此，对于外星动物来说，体温调节主要是通过导航来实现的。我们将这种现象称为恒定导航。

尽管对导航或稳态所涉及的行为策略和大脑区域进行了广泛的研究，但这两个过程的相互作用方式以及神经系统如何支持稳态导航尚不清楚。值得注意的是，像下丘脑视前区（PoA）这样的大脑区域是否是一个悬而未决的问题，PoA调节恒温动物的温度稳态，并在行为发热中发挥作用以及变温动物的温度感知，也可能参与稳态导航。

本研究结合空间、时间和虚拟温度梯度，解析了斑马鱼幼鱼稳态导航的特征及神经机制。研究发现，斑马鱼会根据感官环境和过往运动选择，调整自身的重定向概率与转向方向。具体而言，当环境恶化（即偏离生理温度设定值）时，其重定向概率会显著上升，且斑马鱼更倾向于做出连贯的转向反转动作，而非随机转向或保持静止。

结合全脑钙成像、神经环路扰动和行为表型分析等方法，我们发现了两个进化保守的大脑结构——视前区（PoA）和背侧缰核（dHb，哺乳动物内侧缰核的同源物），它们是稳态导航的关键组成部分。一方面，视前区的损毁会削弱温度恶化时非定向转向概率的上升，而这一过程是鱼类对温度梯度产生所有相关行为反应的主要驱动力。相比之下，背侧缰核损毁的斑马鱼在感官条件恶化时仍保留了重新定向的驱动力，但在朝着远离不利温度的方向连贯移动时出现了选择性损伤。此外，我们还发现右侧背侧缰核一小区域的神经元对温度和盐度变化均以相似的动态模式做出反应。因此，这些神经元可能向下游脑区传递多模态输入，并在稳态导航中发挥不依赖于特定模态的作用。

基于我们的实验数据，我们提出了一个模型，其中视前区（PoA）和背侧缰核（dHb）均参与稳态导航并支持斑马鱼幼体的体温调节。视前区（PoA）是检测触发重定向和迁移行为的稳态应激所必需的，而背侧缰核（dHb）将感官体验的记忆与先前的运动选择相耦合，以驱动朝着适宜温度的连贯运动轨迹。最后，背侧缰核-脚间核（dHb-IPN）通路似乎也是一个用于更抽象表征环境背景的通用神经回路，可支持稳态导航。

结果

斑马鱼通过调节转向概率和方向来完成稳态导航

我们首先询问幼体斑马鱼，当被放置在温度梯度较浅的竞技场中并且在没有任何其他感官提示的情况下，是否可以导航并保持接近特定温度，或者它们是否会在腔室中均匀分布。为此，我们设计了一个20厘米3 4厘米的矩形竞技场（图S1A），我们在其中选择性地将一端4厘米3 4厘米的区域加热到33C，同时将竞技场的另一端保持在24C，有效地沿着竞技场的长边建立了0.04C/mm的线性热梯度（参见STAR方法和图S1B）（图S1C）。在这种环境中，鱼身体长度上的温差最多为0.2C。我们监测个体5-7天受精后（dpf）斑马鱼15分钟（见STAR方法），发现到实验结束时，鱼有力地避开了竞技场的热侧（图1A）。给定竞技场内鱼的x坐标，我们可以识别它经历的温度（使用图1A中的红色曲线，见STAR方法）。我们观察到，在大约260秒的初始探索阶段后，鱼很快出现更喜欢25.3摄氏度的温度，我们认为这是它们的恒定设定点（图1B和S1D-S1F）。

当前经历的温度和动物偏好的温度之间的差异是稳态导航的基本驱动力。然而，仅靠这个标量并不能提供一个显著的方向线索来指示方向行为，空间搬迁所需的在我们的实验中观察到。我们推断，与趋化、趋光性和变流性类似，最简单的方向提示是由动物自我重新定位引起的温度时间变化给出的（图1C）。在这种情况下，以前经历的温度可以将当前的温度置于上下文中，并提供恶化或改善上下文的基本概念，分别驱动当前行为输出的变化或延续，例如与绝对温度无关的转弯与前进运动的增加。恶化的上下文应该增加重新定向的概率，以改变鱼的行进方向。另一方面，改善的上下文，即更接近稳态设定点，应该导致转弯抑制保持当前方向（图1D）。因为幼体斑马鱼以离散的回合游泳，持续300毫秒，以大约1赫兹的速率诱发，上下文评估可能发生在每个游泳事件结束时，如前文所述的类固醇运动学上非常不同。

通过考虑鱼在最后一次运动动作中经历的温度变化（参见STAR方法），我们能够定义三种场景。当温度变化接近鱼的设定点时，与所经历的绝对温度无关，这是一个改善的上下文（ICxt），当鱼离开设定点时，这是一个恶化的上下文（WCxt），而等温运动没有上下文（NCxt）。图1E显示了一个示例鱼在竞技场中移动，以及我们从轨迹中提取的所有相关刺激和行为变量。在行为序列的特写中（图1E右），我们分析了动物经历相同温度但在两种不同上下文中的几个时期（WCxt的橙色箭头和ICxt的蓝色箭头）。在WCxt（橙色箭头）中，重新概率方向被高度调制，转弯频率增加。此外，如底部面板所示，鱼倾向于向同一方向连接转弯，这样一个右转随后是右转反之亦然。通过这种方式，可以为幼体的每一次游动行为分配一个行为类别，对应左转、右转或向前游动，并根据该游动行为是让鱼远离生理设定值、接近生理设定值，还是无影响，为其分配一个情境变化WCxt、ICxt或NCxt。

图1.斑马鱼幼体在线性浅热梯度中保持体内平衡

通过绘制WCxt和ICxt条件下所有鱼的绝对转向角度的相对分布（图2A），我们证实了之前的观察结果，即温度背景会影响鱼的重新定向行为。体验温度的升高会导致重新定向的概率增加。在允许鱼在没有温度梯度的水族箱内游动的对照组中，这种转向角度分布的差异并不存在（参见图S2A，参见STAR方法）。为简化起见，我们还生成了一个指标，以便在未来的分析中量化由感官背景驱动的重新定向程度。具体而言，我们计算了WCxt期间的转向比例与ICxt期间的转向比例之间的差值。同样，该指标表现出存在显著差异（图2B）。值得注意的是，当我们对其他游泳运动学参数（如游动距离（图S2B）、游泳时长（图S2C）以及游间（泳间）间隔（图S2D））进行类似分析时，未观察到显著的情境依赖性调节。此外，我们发现每次运动过程中转向方向并非随机决定。实际上，在WCxt情境下，当我们结合前一次转向事件对游泳方向进行量化时，发现了高度相关性，这表明鱼类会利用某种记忆来维持在先前选择的方向上（图2C）。尽管在无温度梯度的情况下以及ICxt和NCxt两种条件下，这种相关性已可被观察到，但其在WCxt条件下的强度有所增加（图S2E）。这些数据表明，鱼类不仅在环境条件恶化时会增加转向次数（WCxt，即非定向策略），还会以相同方向进行连续转向（即定向策略）。

为了验证重定向概率增加和不同时间尺度下方向持续性的稳健性，我们在另一组实验中通过从24摄氏度到30摄氏度的阶梯式升温梯度对斑马鱼进行测试。具体而言，整个实验区域的温度每2分钟变化2摄氏度（图2D，详见STAR方法）。本实验采用了方形的小型实验区域，确保温度能在整个区域内均匀变化（图2D左）。与之前的实验一样，斑马鱼可自由游动。与前一实验结果一致，对转向比例的分析（图2D、2E、S3A和S3B，详见STAR方法）显示，当温度偏离偏好设定值时，感官背景确实上调了转向行为，使斑马鱼产生更多的重定向动作。此外，对WCxt阶段连续转向的分析也证实了转向方向具有较高的时间相关性（图2F），而在ICxt阶段这种相关性会减弱（图S3C）。这一结果既体现了斑马鱼行为策略在不同实验装置和条件下的稳健性与可重复性，也证明了仅时间结构就能引发策略层面的这些变化。

与之前的实验不同，本实验中，感官环境在较长一段时间内保持相对恒定，且鱼类无法控制所经历的温度——因为温度每2分钟就会变化一次。因此，鱼类在两次经历温度变化的游动事件之间所间隔的时间，可能比在空间梯度实验中显著更长。我们探究了这一特征是否会影响之前发现的水温情境下转向方向的相关性。我们提出的假设是：两次转向及其感官后果之间的时间间隔越长，这些转向的方向呈现相关性的可能性就越小。当我们重复上述分析、但现在考虑两次转向之间的游动间隔时，我们证实了这一假设（图S3D左图和S3D右图为每个时间区间内考虑的平均事件数）。

在大型矩形竞技场中，我们注意到，由于温度梯度的形状（图S1B和S1C），鱼类不太可能在一次游动中从水上下文（WCxt）移动到中间上下文（ICxt），游动过程中经历的温度差的整体分布（图S3E）以及不同感官环境间的转移矩阵（图2G）也证实了这一点。此类环境转换通常需要多次游动事件，其中这些运动中的许多并未提供任何关于温度变化（NCxt）的有用信息。我们假设，尽管如此，鱼类仍可利用过去的温度变化，并结合以往的运动选择，维持其行为程序。我们证实，即便鱼类在最后一次运动中未经历温度变化（NCxt），它们在源自WCxt时也更倾向于重新定向（图S3F、S3G）。这一结论不依赖于定义NCxt所采用的阈值，因此不太可能是分析伪影导致的结果（图S3H）。事实上，重新定向的序列形成了U形轨迹（U型机动），通常以鱼类朝向与起始方向相反的位置结束，即朝向偏好的温度方向（图2H）。为量化这些观察结果，我们提取了所有在WCxt中开始的U型机动，并计算了动物执行这些行为序列过程中经历的平均温差（详见STAR方法）。与我们之前的观察一致，即使没有新的感官线索，定向游动仍会持续在WCxt中确定的方向上（图2I，黑色箭头标注的游动3和游动4）。

为总结我们的行为观察结果（图1和图2），我们发现斑马鱼幼鱼会根据游泳时所经历的感官环境调节重定向概率，从而实现稳态导航。偏离稳态设定点会引发转向行为增加。此外，此类重定向动作的方向往往具有一致性，正如观察到的U型转向动作。我们最终还发现，即便在没有即时感官方向线索（NCxt）的情况下，这些动作依然会持续，因此可将其解读为斑马鱼处于运动状态并执行定向策略。

图2. 稳态导航通过结合无方向策略和有方向策略来实现。(A) 鱼类经历WCxt或ICxt时绝对转向角度的相对分布（平均值±标准误，采用Mann-Whitney非参数检验并通过Bonferroni校正进行多重比较）。(B) 转向比例的标准化增幅随感官环境的变化（中位数±中位数标准误，Mann-Whitney非参数检验）。(C) WCxt期间的游泳方向与前一次游泳方向的关系（平均值±标准误，Mann-Whitney非参数检验）。正值表示本次游泳倾向于与前一次方向一致。右侧菱形为通过随机为每个值分配符号得到的随机置换结果。(D) 左图：实验装置。右上：时间梯度实验的刺激方案。右下：(n=40 fish)的平均标准化转向率（红色）和向前游泳率（蓝色）(E) 实验2中转向比例随感官环境的增幅，与(B)类似（中位数±中位数标准误，Mann-Whitney非参数检验）。(F) 实验2中WCxt下的转向相关性，与(C)类似（平均值±标准误，Mann-Whitney非参数检验）。(G) 鱼类群体感官环境的平均转移矩阵。(H) 上图：实验1中执行的典型U型机动动作。下图：U型机动动作示意图。(I) 鱼类在WCxt条件下执行U型机动动作时所经历的温度差异（平均值±标准误）。另见图S2和图S3。

全脑功能筛选可识别受感觉背景调控的脑区

我们的行为实验表明，斑马鱼幼鱼通过结合感官情境、过往经历以及依赖运动的行为策略来调节体温。随后，我们利用斑马鱼幼鱼的光学透明性，借助光片显微镜开展了全脑功能筛选实验。我们使用在大部分神经元中表达核定位型 GCaMP6s 的转基因动物（(n=5)，6-8 日龄，Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s)，视频S1）来识别对温度有反应的脑区，这些脑区推测参与了稳态导航过程。

为了控制斑马鱼在嵌入状态和成像过程中所经历的温度，我们在鱼的头部附近放置了一根小针。这通过多阀系统提供了恒定的水流，该系统还可通过珀尔帖元件在管道上游对水流进行加热或冷却（详见STAR方法，图3A）。在对斑马鱼幼虫进行成像的同时，我们使用高速相机追踪其尾部的行为运动。我们首先采用与图2D相同的刺激方案（图3A右上角），并在一小部分斑马鱼（((n=2))）上进行了光片全脑成像。在行为层面上，我们再次观察到，针对WCxt的感觉背景和方向，重定向概率会发生调节，这与我们自由游动斑马鱼的实验数据一致（图3A右下角，图S4A–S4E）。当我们提取出对三次试验均有可靠反应的神经元时（见采用STAR方法，我们在多个区域观察到了反应，例如嗅球（OB）、大脑皮层（Pa）、右缰核（rHb）、视前区（PoA）、脚间核（IPN）和上中缝核（RN）（图S3H）。

图3：全脑筛选中编码感觉背景的神经元的鉴定

尽管该方案引发了强烈且明确的行为调节，但单次试验相对较长的持续时间（约20分钟）对于成像实验而言并非最优选择，而成像实验中更多的重复次数是有益的。此外，在该检测中，观察到的神经元反应可能源于温度感知或运动行为：因为刺激方案（升温梯度与降温梯度）与动物的行为（转向与前进）之间存在强相关性。因此，我们设计了一种方案，将较短的刺激模块重复五次。在每个模块中，鱼群先经历偏离其偏好温度（26℃）的+0.25℃升温，随后温度恢复至基线水平（单脉冲）。接着再次进行升温，但此次温度后续会进一步升至26.5℃（双脉冲）（图3B及图3B右侧）。该方案的设计原理是让鱼群处于一种情境中：要么先变差再好转（单脉冲，改善情境），要么持续变差（双脉冲，恶化情境），以此模拟鱼群自由游动时自然遭遇的场景。我们随后采用该方案获取了主要的全脑数据集。

温度并非唯一会构成稳态威胁的环境因素，当动物偏离其稳态设定值时，该因素会引发不对称行为。我们探究了鱼类大脑是否会对刺激历史进行编码，形成一种可泛化于不同感官模态、且不依赖刺激本身属性的表征。因此，我们在盐度短暂升高（盐度刺激实验）的过程中记录了大脑活动，该过程可对动物的生理机能也同样构成威胁。重要的是，我们能够定性地将盐刺激组与温度刺激组的刺激特征进行匹配（图S4F和S4G，详见STAR方法），以准确比较大脑反应。此外，我们匹配了两次实验中单个神经元的身份（图3C，详见STAR方法），并提取了它们全程的荧光信号（见图3C右侧展示的一条斑马鱼的部分感兴趣区域活动情况）。对于每条斑马鱼((n=5))，我们提取到44,772±7,090（平均值±标准差）个可能对应单个神经元的感兴趣区域，这些区域覆盖了前脑、中脑以及后脑直至菱形脑节II的部分区域。

我们首先将分析聚焦于温度相关实验阶段。针对每个神经元，我们计算了五次实验中的平均相关性（可靠性指数），并借助实验触发的平均响应（TTA）来识别个体间一致的TTA（见图S3G及STAR方法）。该方法旨在筛选出对温度刺激能产生稳定响应、且在不同斑马鱼个体间响应模式具有一致性的神经元。我们为所有神经元设定了统一的标准阈值，仅筛选出“可靠神经元”。  随后，我们采用无监督方法（主成分分析[PCA]）对时间维度进行降维，以探究哪些刺激特征对神经活动的影响最为显著。观察前两个主成分（累计方差解释率70.2%，图3D）时，我们发现神经元群体轨迹在时间主成分1（t-PC1）上可区分水上下文（WCxt）和离子上下文（ICxt），同时在时间主成分2（t-PC2）上可区分刺激强度。  为了更深入理解哪种神经元响应是上下文依赖型神经活动的基础，我们从另一维度开展主成分分析：图3E中前两个主成分构成的空间内，每个点代表刺激呈现期间单个神经元的平均响应（累计方差解释率65%，图S5A）。由于该空间中可清晰观察到3个聚类，我们结合主成分空间的坐标进行k均值聚类((k=3))，以刻画神经元的共性响应模式。我们还通过戴维斯-布尔丁指数进一步验证了聚类数量的合理性（详见STAR方法及图S5B）。

这三个神经元簇对应三类神经元群体：一类遵循刺激特征（I型），一类在温度升高时活性增强，且上升常数更长（II型），还有一类在温度升高时基线荧光降低（WCxt）、温度降低时荧光增强（ICxt）（III型）（图3F）。如图3G中的原始轨迹所示，感觉反应并非源于平均伪影或运动活动。在单条试验水平上，单个斑马鱼体内就已能观察到这些反应，且它们与纯运动相关活动相分离。通过比较感觉神经元与推定运动神经元之间与运动活动的相关性，这一观察结果得到了进一步量化（图S5C和S5D）。III型神经元非常适合向斑马鱼告知温度环境是在恶化还是改善（环境神经元）。此外，当我们计算平均荧光变化率（ΔF/F）的差值时在刺激模块内的单脉冲与双脉冲之间，我们发现I型和II型神经元的活动受温度绝对变化的调控。另一方面，背景神经元的活动仅表现出轻微的调制，这表明该神经元集群的反应不会随刺激强度变化而改变（图3H，另见图3G中的原始轨迹，黑色和橙色箭头）。最后，我们绘制了图3B右侧定义的WCxt和ICxt条件下的(AF/F) /F值，分别对应单脉冲期（图3I，左）和双脉冲期（图3I，右）。在该图中，若神经元位于第一和第三象限，说明其在不同背景下的反应一致；若位于第二或第四象限，则表现出不对称反应。在本研究中，I型神经元位于第一象限，双脉冲期间DF/F值升高，表明其可编码刺激强度且对背景呈对称反应。II型神经元对两种脉冲表现出非线性反应。最后，III型神经元位于第二象限，其DF/F值在单脉冲与双脉冲之间未出现调制，这表明在水笼刺激（WCxt）期间，感觉背景存在一种编码方式，表现为基线荧光降低；而在离子笼刺激（ICxt）期间，基线荧光则出现升高。

重要的是，当我们观察这三个神经元集群的解剖分布时（图3J，左），发现I型和II型神经元富集于吻侧区域，如内侧嗅球（mOB）、室旁核（Pa）和右缰核（rHb），而情境神经元则分布于其他区域，如视前区（PoA）、前菱脑（aHb）、脚间核（IPN）和红核（RN）。上述大多数区域已知存在强连接（图3K）。实际上，我们在沿内侧嗅球-室旁核-缰核-脚间核-红核通路中观察到了功能梯度，上游区域主要对绝对温度做出反应，而下游区域与视前区一同主要追踪刺激情境（图3L）。

在确定了几个富集于情境神经元的脑区后，我们接下来希望找到可能的运动前区，这些区域可以利用这些信息来影响行为。因此，我们寻找了能被向前、向左或向右游动可靠激活的细胞（图4A、图S5E及STAR方法）。与其他研究一致在报告的第29至33页中，我们观察到在内侧纵束核（nMLF）和后脑区域周围存在运动活动的神经相关特征。我们还检查了运动相关信号在先前被确定为追踪刺激特征关键区域（I、II、III型神经元）的定位情况。我们注意到，背景神经元数量更多的区域往往也具有更多的运动相关特征（图4B），尽管在神经元群体上与感觉神经元存在差异（图S5C）。

最后，我们在盐度和温度实验中寻找具有相似刺激-反应特征的多模态神经元。我们对两次实验中可靠神经元的时间调谐曲线（TTAs）进行了互相关分析，然后基于这些轨迹的循环移位洗牌版本计算了p值（详见STAR方法）。我们筛选出满足(p value <0.025)条件的神经元（图4C和图S5F），并为可视化目的将其聚为两类（图4D）。该分析揭示了在温度和盐度变化时具有相似动态变化的神经元（图4E）。尽管所有先前鉴定的感觉区域在两次实验中均有神经元响应（图S5G），但仅右侧背侧缰核内侧核（mr-Hb）、主嗅球（mOB）以及下丘脑室旁核（Pa）的一个小区域存在多模态神经元（图4F）。

总之，我们的全脑分析证实，温度是由嗅觉系统中的神经元感知的⁷，可能还涉及本研究中未成像的其他区域，例如三叉神经节³⁴。随后，该信息会被传递至下丘脑区域（如视前区）以及背侧缰核-脚间核-红核系统。视前区中富含温度特异性的情境细胞²²，这表明该区域在体温调节中发挥着作用。（即作为恒温器），与哺乳动物的情况一致。7,35-39 关于dHb-IPN-RN系统的情况更为复杂。尽管背侧缰核（dHb）的反应主要是感觉性的，但作为背侧缰核（dHb）主要靶区的脚间核（IPN），其反应中与情境相关的细胞和运动调节型细胞占比更高。已知缰核（Hb）还会接收直接输入通过终纹床核核团（Pa）从嗅球（OB）接收直接输入，并从视前区（PoA）接收少量输入。最后，Hb 中还特别富含能够跨模态泛化的神经元跨模态进行泛化。40,41 总体而言，我们的成像结果这表明视前区（PoA）和缰核（Hb）均参与了稳态导航过程。

图4. 一小部分背侧缰核、内侧嗅球和大脑皮层神经元对温度和盐度变化的反应相似。(A) 运动触发感兴趣区的解剖密度分布。选定的细胞可分别对向前、向左或向右游动产生调谐反应。(B) 每个感官识别区域中运动触发感兴趣区的占比。(C) 温度实验（左）和盐度实验（右）期间所有多模态神经元的试次触发平均值。(D) 多模态神经元簇 (k=2) 的平均值（均值±标准误）。(E) 两个示例多模态神经元（一个来自嗅球，一个来自缰核）在温度和盐度实验中的原始活动轨迹，以黑色线条呈现。(F) 三种投射路径下多模态神经元的解剖密度分布。mOB：内侧嗅球；mPa：内侧大脑皮层；mr-dHb：右侧背侧缰核内侧核。另见图S5。

视前区和背侧缰核的损毁会影响稳态导航的不同方面

在全脑功能筛选中，我们确定了视前区（PoA）以及背侧缰核-脚间核-红核（dHb-IPN-RN）系统作为提供刺激背景信息的候选通路。考虑到视前区在哺乳动物体温调节中的作用，以及背侧缰核在斑马鱼幼鱼其他感官驱动的导航实验中的参与情况，我们假设这两个区域都可能参与稳态导航。为验证这一假设，我们消融了视前区或背侧缰核，并分析了斑马鱼在空间梯度竞技场中的行为表现。

在我们之前的光片实验中功能鉴定出的 PoA ((n = 20 fish)) 双侧消融，是在受精后5天使用钛蓝宝石激光进行的（图5A和图S6A）。作为对照，我们靶向了视顶盖内侧（OT）的部分区域，因为该区域几乎不被温度刺激激活（n = (= 20) 条鱼，详见STAR方法）。消融操作完成后，让鱼恢复40至48小时，并在受精后7天进行测试。与对照组相比，PoA 消融组在实验结束时的温度梯度中产生了更高的离散系数对照，这表明其在维持稳态设定点附近的能力受损（图S6B、S6C，参见STAR方法）。为验证这一假设，我们计算了与图2B中野生型斑马鱼相同的转向比例变化。遵循前视区（PoA）消融方案，与对照组相比，斑马鱼在根据感觉历史（交叉交互情境[ICxt]与水化学情境[WCxt]）调节重定向概率方面表现出显著受损（图5B）。与对照组相比，整个实验过程中转向比例的降低也反映了这种调节的缺失（图S6D），但斑马鱼的游动速率显示未观察到普遍的运动损伤（图S6E）。值得注意的是，当斑马鱼经历水化学情境（WCxt）时，其通过U型转向改变方向的方向持续性也受到损害（图5C）。这些结果表明，前视区（PoA）参与驱动稳态导航中观察到的转向行为。

接下来，我们使用转基因品系 Tg(Gal4:16715; UAS:NtrmCherry)，通过化学遗传学方法在5日龄（5 dpf）时背侧缰核（dHb）进行消融（详见STAR方法学）。该品系将硝基还原酶的表达限定于背侧缰核（图5D、图S6F和图S6G）。作为对照组，我们设置了遗传对照组和处理对照组（遗传对照组、处理对照组和消融组的样本量分别为25、23和14，对应标识(n = 25)）。与前顶盖核（PoA）消融的结果不同，尽管背侧缰核消融鱼的群体离散系数高于对照组（图S6I），但背侧缰核消融鱼仍能基于感官背景调整其重定向概率（图5E）。然而，当我们检测最后一次即时动作前的感官经历是否会导致转向方向出现偏差时，发现与对照组相比，缰核消融鱼的游动方向相关性（对应U型动作）出现受损（图5F）。此外，当鱼能够接收到间歇性感官线索（例如，水刺激背景/无刺激背景或间歇刺激背景/无刺激背景）时，消融组在水刺激背景下重定向概率的提升现象消失（图S6J）。最后，我们观察到消融组的重定向动作整体上调（图S6K），但游动速率与对照组相比无显著变化（图S6L）。

这些结果证实了我们在钙成像实验中的发现，并表明视前区（PoA）和背侧缰核（dHb）均参与稳态导航，且二者共同对这一过程起到支撑作用。

总而言之，我们已证明，PoA 可通过在状况恶化时触发重新定向动作，来支持稳态导航，尤其是体温调节。

另一方面，血红蛋白（Hb）似乎主要影响协调转向轨迹的生成，这有助于动物在温度梯度较浅的环境中定位其适宜温度——在这类环境中，个体的移动并非总能改变所处环境条件。因此，在每次移动后缺乏持续新信息的情况下，背侧血红蛋白（dHb）能为鱼类的定向导航提供支持。

图5. 前视区和背侧缰核的消融会损害稳态导航的不同方面。（A）靶向前视区（PoA，以绿色标注）的双光子消融示意图。星号为选定的消融位点。对照消融位于视顶盖（OT）（见正文）。（B）转向比例随感觉背景的变化。左：视顶盖对照消融，右：前视区消融。（中位数±中位数标准误，曼-惠特尼非参数检验。）（C）对照组与消融组在水迷宫情境（WCxt）下的转向相关性（平均值±平均值标准误，曼-惠特尼非参数检验）。（D）靶向背侧缰核（dHb，以橙色标注）的化学遗传学消融示意图。（E）转向比例随感觉背景的变化。左：遗传对照，中：处理对照，右：背侧缰核消融（中位数±中位数标准误，曼-惠特尼非参数检验）。（F）两个对照组与消融组在水迷宫情境（WCxt）下的转向相关性（平均值±平均值标准误，曼-惠特尼非参数检验）。另见图S6。

图6. 稳态导航。（A）本研究揭示了斑马鱼幼鱼体内稳态导航背后的行为原理。斑马鱼采用两种互补策略：在经历稳态偏离状态（被推离稳态设定点，左图）时增加转向（重定向概率），同时在该稳态偏离状态下以持续的方向转向（右图）。第一种策略依赖于前脑前区，而第二种策略则同时依赖于前脑前区和背侧缰核。（B）参与稳态导航的神经回路。代表三种主要不同刺激特征的神经元以不同颜色标注，解剖学阴影显示了每个区域内反应类型的占比。

讨论

在本研究中，我们证实了斑马鱼幼鱼作为变温动物，能够在浅热梯度中导航以找到其偏好的环境温度，从而实现体温稳态。这与哺乳动物等恒温动物形成对比，后者除了行为调节外，还依赖自主神经反应。6 重要的是，我们的数据表明，变温动物的体温稳态仍依赖于视前区，哺乳动物大脑的内部恒温器。此外，我们的研究结果表明，背侧缰核（dHb）能够通过简单的工作记忆，在温度变化缓慢或轻微的环境中实现精准的温度稳态调节。

更具体地说，斑马鱼幼体采用的策略是对比一次游动行为发生前后的温度，并根据新温度是接近其偏好设定点（ICxt）还是远离该设定点（WCxt），来调整后续的行动。在前一种情况下，斑马鱼会做出更多向前游动的反应，而在后一种情况下，它们会调整身体朝向以改变行进方向（图6A左）。这种非定向策略在动物界中被广泛采用。在应对多种不同的感觉梯度时会出现这种情况，这一现象被称为行为滞后。

有趣的是，某一类型或类别的游泳行为（转身游泳与向前游泳）的发生概率是唯一受情境（水情境或笼情境）调节的行为学参数。游泳类别的运动学参数，如游泳距离、游泳时长和游泳间隔，仅受绝对温度的影响。基于这一证据，我们认为，除游泳类别外，所有其他行为变化很可能反映了由不可逃避的稳态威胁引发的类应激状态，而非导航策略。这一观点得到进一步佐证：尽管转向比例、游动距离、游动时长和方向一致性的调节幅度随绝对温度升高呈线性变化，但鱼类仍会避开低温环境，且在偏离适宜温度时，会通过上调重定向行为来确定其稳态设定值。因此，我们认为行为滞后是稳态导航的主要构成基础。

在我们的实验中，我们还观察到鱼倾向于连接重新定向事件，其中一个转弯很可能随后在同一方向上发生另一个转弯。同样，这一观察与绝对温度的影响形成对比在高温下，相干性强烈降低。最后，我们发现，当游泳既没有改善（ICxt）也没有恶化（WCxt）时，鱼仍然能够利用它们对最后一次运动前感觉历史的记忆，并将其与先前运动方向的知识相结合，以产生连贯的U型动作（图6A，右）。

我们发现一个有趣的现象，即类似的感觉运动策略也在不同类型的时间和空间场景中被描述过趋化性实验。这表明鱼类也可能拥有一种 </response>对环境的抽象表征，且独立于感官模态。事实上，我们发现了一些独立于感觉模态传递情境信息的单个神经元。此后，鱼类便可借助情境，通过不同的感觉模态构建一套独特的导航系统，而非依赖独立的平行单模态回路。

总体而言，我们的行为学数据表明，稳态导航比简单的反射性刺激-反应行为更为复杂，尽管生理压力仍是其主要的触发. 涉及这一过程的行为机制过程超越了针对稳态设定点对感官输入进行逐时刻估算。我们提出，即便没有新的感官信息，鱼类仍可借助其过往的运动选择来指导内部生成的运动程序。该程序包含定向成分，会影响后续的数次游动行为。由此，鱼类即便在温度变化缓慢或变化极小的环境中，也能实现精准的温度调节。

实现稳态导航的神经回路

借助全脑功能成像技术，我们在开环虚拟梯度检测实验中识别出了对温度变化有响应的脑区（图6B）。温度响应主要分为三种功能类型。I型和II型神经元对刺激模式有响应，但动力学特征不同，而III型神经元则追踪刺激变化（情境神经元）。情境神经元的活动呈双向调节：在水迷宫情境（WCxt）中活动较基线水平下降，在情境转换（ICxt）中活动增强。其活动不受刺激强度的影响。我们还观察到沿吻尾解剖轴存在功能梯度。I型和II型神经元主要定位于斑马鱼的前脑。内侧嗅球（mOB）和大脑皮层（Pa）几乎仅存在I型和II型细胞，而右侧缰核（重组血红蛋白）显示出I型、II型和背景神经元的混合存在。对于为何在传统上与嗅觉相关的区域能检测到神经活动，一种可能的解释是：在水环境中，温度和化学物质（如气味）往往具有相似的时空特征；因此，利用同一套感觉回路来感知二者具有优势。有趣的是，其他动物的嗅觉回路中也发现了温度感知现象。有研究报道，斑马鱼幼体嗅觉区域在接触盐类12、pH值变化22以及二氧化碳53时会被激活，这一发现也支持了上述解释。

另一方面，除视前区（PoA，见下文）这一显著例外，情境相关神经元主要分布在鱼类的中脑和后脑区域，例如后脑前部（aHb）、脚间核（IPN）以及红核（RN）。值得注意的是，近期在一项基于视动反射（OMR）的决策范式研究中也发现，菱形肌I区神经元活动的双向调节同样与向左和向右的视觉运动刺激相关。这一共同性表明，这些区域的神经元可能并非直接参与感觉处理本身，而是基于感觉情境来选择两种相反的行为策略。

上述提到的大多数区域也被证实具有强连接性。具体而言，主嗅球（mOB）的神经元既投射至终纹床核（Pa），也投射至红核（rHb），且通常通过同一神经元的侧支实现这一投射。前视前区（PoA）的次要投射也被证实以背侧红核（dHb）为靶标。随后，红核（Hb）会向……发送谷氨酸能输入IPN 通过后屈束连接。具体而言，神经元rHb 中的神经元选择性地向缰核腹侧部分投射，其轴突环绕该结构。最后，缰核是一个向红核投射并接收来自____的输入的γ-氨基丁酸能核团。背侧缰核。值得注意的是，红核向更尾侧的区域发出轴突菱体节，以及返回至嗅球和下丘脑室旁核等前脑区域的反馈投射。 因此，我们认为这些区域是支持稳态导航的全脑网络的一部分。

视前区——变温动物体内的稳态调节器

我们研究了视前区（PoA）在斑马鱼幼鱼体温调节中的潜在作用，因为该结构在哺乳动物中具有关键功能。为维持稳定的体温，此前的研究认为热相关的神经元，在我们的实验中，该区域在背景神经元中尤其富集。在对该区域进行双侧切除后，我们发现实验组在达到热稳态方面存在缺陷。与对照组相比，鱼无法根据感官背景调整其重新定向的概率。

与背侧缰核通路（主嗅球-背侧缰核-脚间核-网状核）不同，斑马鱼幼鱼中视前区的解剖结构研究得较少。由于嗅球的主要靶区是背侧缰核、前顶盖核、后结节区以及端脑腹侧核，25 目前尚不清楚视前区是从嗅球、前顶盖核还是其他结构（如终神经、24 三叉神经或背根神经）接收温度信息的。

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