标题：Cerebrovascular Injuries Induce Lymphatic Invasion into Brain Parenchyma to Guide Vascular Regeneration in Zebrafish

期刊：Developmental Cell

原文链接： https://doi.org/10.1016/j.devcel.2019.03.022

摘要

急性脑血管疾病（如缺血性中风）发作时，会对区域脑血管网络和神经元组织造成损伤。促进血管再生是最具前景的治疗方法。为探究脑血管再生背后的细胞和分子机制，我们利用基因消融和光化学血栓形成两种方法构建了斑马鱼脑血管损伤模型。尽管脑实质在生理上不存在淋巴管，但我们发现脑血管损伤会诱导脑膜淋巴管快速长入受损的脑实质。长入的淋巴管一方面形成管腔，引流组织液以缓解脑水肿；另一方面则作为新生血管的“生长轨道”发挥作用。脑血管再生完成后，长入的淋巴管会发生凋亡并被清除。本研究揭示了脑膜淋巴管的一种病理功能——其会以此前未被发现的方式长入脑实质，同时也明确了淋巴管作为血管“生长轨道”的全新功能。

图形摘要

引言

缺血性中风是导致死亡和成人残疾的主要原因，由脑血管闭塞以及由此引发的局部血管和神经组织损伤所致（Krupinski 等人，1993；Liu 和 Levine，2008）。促进脑血管再生，包括新生血管（血管新生）生长至缺血后梗死区域，是为受损的脑实质重新提供营养的前提，因此成为最具前景的治疗方法（Shen 等人，2008；Thored 等人，2007）。已有研究表明，血管生成信号（包括血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）等因子以及基质金属蛋白酶等蛋白酶）源自受损神经元、反应性星形胶质细胞和血管（Greenberg 和 Jin，2013；Su 等人，2008；Heissig 等人，2003）。然而，相关研究目前尚未开展相关研究来阐明受损脑实质血运重建背后的细胞和分子机制。

淋巴管在体液稳态、脂肪吸收以及淋巴水肿、肿瘤转移等多种病理过程中发挥关键作用（Alitalo 等人, 2005）。淋巴管在发育过程中起源于原始静脉（Srinivasan 等人, 2007; Nicenboim 等人, 2015; Yaniv 等人, 2006; K€uchler 等人, 2006）。其特征为引流组织间隙液而非血液，且表达 Prox1、Vegfr3/Flt4 及 Lyve1 等分子标志物（Flores 等人, 2010; Wigle 和 Oliver, 1999; Okuda 等人, 2012）。淋巴管生成依赖 Vegfc（Karkkainen 等人, 2004; Villefranc 等人, 2013）和 Ccbe1（Hogan 等人, 2009），而后者是 Vegfc 加工与成熟所必需的（Le Guen 等人, 2014; Roukens 等人, 2015）。中枢神经系统（CNS）缺乏淋巴管是长期以来的认知。近期研究在小鼠体内发现了脑膜淋巴管，这类淋巴管可作为真正的淋巴管，将脑脊液中的液体引流并携带免疫细胞至外周（Aspelund 等人, 2015; Louveau 等人, 2015），并与血管协同清除毒性代谢废物（Da Mesquita 等人, 2018）。在斑马鱼中，脑膜壁淋巴管内皮细胞（muLECs），也被称为脑淋巴管内皮细胞（BLECs）或荧光颗粒周皮细胞（FGPs），可在发育过程中调控脑膜血管生成，并介导大分子物质的内吞作用（Bower 等人, 2017; Venero Galanternik 等人, 2017; van Lessen 等人, 2017）。尽管 muLECs-BLECs-FGPs 不形成管状结构，但它们表达所有淋巴管标志物，且对 Ccbe1/Vegfc/Vegfr3 的缺失敏感，因此被认定为斑马鱼脑膜淋巴管。在生理状态下，哺乳动物和斑马鱼的脑实质均无淋巴管分布。目前尚不清楚淋巴管是否能够侵入脑实质，以及脑膜淋巴管在病理状态下是否发挥作用。

斑马鱼模型系统凭借其强大的再生能力，为理解器官再生背后的细胞和分子机制做出了重要贡献，尤其是在哺乳动物再生能力有限的器官（如心脏）方面（乔普林等人，2010；菊地等人，2010；张等人，2013）。细菌硝基还原酶（NTR）及其底物甲硝唑（Mtz）已成功用于诱导条件性靶向细胞消融，以开展斑马鱼的再生研究（张等人，2013；崔等人，2014年；何等人，2014年）。然而，该系统尚未应用于脑血管系统。光化学诱导血栓技术已被报道可在小鼠、大鼠脑部以及斑马鱼背主动脉（DA）中有效诱导光血栓性缺血并造成局部血管损伤（马克斯韦尔与戴克，2005年；库恩泽等人，2006年；李等人，2007年、2017年；黑岩等人，2009年），但该技术尚未应用于斑马鱼脑血管系统。

在本研究中，我们运用NTR-Mtz系统结合光化学血栓形成技术，对斑马鱼的脑血管系统造成损伤。体内延时成像结果显示，在脑血管损伤后，黏膜淋巴内皮细胞（muLECs）、背侧淋巴内皮细胞（BLECs）和纤维蛋白原阳性细胞（FGP）会快速侵入受损的脑实质，形成具有管腔的淋巴管。这些侵入的淋巴管一方面可引流组织液以缓解脑水肿，另一方面则充当“生长轨道”，为新生血管的生长提供引导和支持。脑血管再生完成后，侵入的淋巴管会发生凋亡，脑实质由此恢复无淋巴管的生理状态。这种由暂时性侵入的淋巴管介导的脑血管再生过程，在斑马鱼光化学血栓形成模型中同样存在。本研究的结果揭示，在病理性血管损伤的情况下，脑膜淋巴管会意外地侵入脑实质。这一暂时性的淋巴管系统能够清除水肿，并为脑血管再生提供生长轨道。

结果

斑马鱼NTR-Mtz脑血管损伤模型的建立

为深入研究脑血管再生，我们利用NTR-Mtz系统在斑马鱼中构建了脑血管损伤模型。我们构建了Tg(kdrl:DenNTR)cq10转基因品系，该品系中Dendra2（Den）与NTR融合，并由血管特异性启动子kdrl驱动。斑马鱼脑血管的基本连接模式和解剖结构在受精后3天已明确（图1A）（Isogai等人，2001年）。以DMSO处理的Tg(kdrl:DenNTR)幼虫（图1B）和Mtz处理的Tg(kdrl:GFP)幼虫（图1C）为对照，将3天龄的Tg(kdrl:DenNTR)幼虫与Mtz共同孵育，结果显示处理后1天（1 dpt，相当于受精后4天）脑血管内皮细胞大量缺失。例如，中脑中央动脉（MMCtAs）、小脑中央动脉（CCtA）和中央动脉（CtAs）均出现损伤。但脉络丛（CVP）、后脑动脉（MtA）和中脑原始通道（PHBC）等较大血管则保持完整（图1D，箭头）头部）。由于大脑中的血管内皮细胞（BECs）对甲硝唑（Mtz）的敏感性高于躯干血管内皮细胞，因此使用低浓度（1毫摩尔/升）的甲硝唑可实现对脑血管的特异性损伤，且不会影响躯干血管系统或引发机体表型异常（图S1A-S1C）。甲硝唑处理后，在大脑中检测到广泛的凋亡信号，包括内皮组织和神经元组织，但在躯干血管中未检测到（图S1D-S1F）。大脑内出现局部出血现象（图S1G和S1H），模拟了大面积缺血性中风的症状。研究观察到巨噬细胞浸润以及对死亡细胞的吞噬过程（图S1I和S1J）。甲硝唑处理破坏了局部脑血管网络，并在脑实质中造成损伤。在损伤后2天（2 dpt），观察到损伤周围区域向损伤区新生血管生成的现象，例如新生的脑大动脉吻合支（MMCtAs）、基底动脉（BA）和脑动脉（CtAs）（图1D，箭头所示）。这一再生过程在损伤后3天（3 dpt）持续进行，损伤后6天（6 dpt）表现明显，损伤后8-9天（8-9 dpt）完成（图1B-1E）。在Tg(gata1:DsRed; kdrl:DenNTR)转基因背景下，如图S1K所示，从损伤后4天（4 dpt）起即可检测到新生血管的灌注情况。再生后的动物与未受伤的对照组相比，寿命和生育能力无显著差异，表明脑血管再生实现了完全的功能恢复。

图1. 脑血管损伤后脑实质出现淋巴管。(A) 3 dpf 时斑马鱼的脑血管解剖结构。红框表示相应面板的图像区域。背面观，前面向上。 (B-E) 斑马鱼 NTR-Mtz 脑血管再生模型。与用 DMSO (B) (n = 40/40) 处理的 Tg(kdrl:DenNTR) 幼虫和用 Mtz (C) (n = 49/49) 处理的 Tg(kdrl:GFP) 幼虫相比，Tg(kdrl:DenNTR) 幼虫的脑血管在与 1 mM Mtz (D) 孵育后受到特别损伤（1 dpt，n = 39/39）。显示了从 BT 到 8-9 dpt 的再生时间过程。新血管生成的速度表示为血管的总长度 (E) (n = 10)。 Dunnett 多重比较测试的双向方差分析。所有 p < 0.0001）。箭头表示剩余的相对较大的船只 CVP、MtA 和 PHBC。箭头表示新生血管 MMCtA、BA 和 CtA。 ***p < 0.001。数据表示为平均值±SEM。比例尺，50 μm。另请参见图 S1 和 S5。(F–H) 在对照中，lyve1b+ LEC 在脑实质中不存在，仅在 1 至 3 dpt 中存在于视顶盖 (F) (n = 24/24)。 Mtz 治疗 (G) (n = 20/24) 后，lyve1b+ 淋巴管的生长在 2 dpt 时快速且活跃，但在 3 dpt 时明显减慢。定量显示 1-3 dpt (H) 时大脑中 kdrl+ 和 lyve1b+ 血管的总长度 (n = 10)。 Dunnett 多重比较测试的双向方差分析。所有 p < 0.0001）。 ***p<0.001。数据表示为平均值±SEM。比例尺，50 μm。另请参见图 S2。(I) 在额叶横截面中，在对照幼虫 (#1) (n = 6/6) 中，lyve1b+ 淋巴管主要位于脑表面的脑膜中，而在 Mtz 治疗后 2 dpt 时，lyve1b+ 淋巴管在脑实质中变得丰富 (#1') (n = 6/6)。比例尺，50 μm。另请参见图 S2。 AMCtA，前（头侧）中脑中央动脉； BA，基底动脉； CCtA，小脑中央动脉； CtA，中央动脉； CVP，脉络膜血管丛； Fb，前脑； Hb，后脑； iLV，内生淋巴管； Mb，中脑； MMCtA，中脑中央动脉； MsV，中脑静脉； MtA，后脑动脉； muLECs，脑膜壁淋巴内皮细胞； PHBC，原始后脑通道； PMCtA，后（尾）中脑中央动脉。

脑血管损伤诱导血管内皮生长因子C依赖性脑膜淋巴管向损伤实质内生长

我们使用由lyve1b或prox1a启动子驱动的转基因标记淋巴管内皮细胞（LECs）（Flores等人，2010；van Impel等人，2014），发现在甲硝唑（Mtz）处理后的第二天，淋巴管迅速且活跃地长入损伤区域，但到第三天这种长入明显放缓（图1F-1H和图S2；视频S1）。大脑的额状切面显示，在生理条件下，淋巴管（lyve1b+）仅存在于大脑表面的脑膜中（图1I1），但在损伤后第2天，大量出现在脑实质中（图1I10）。脑膜淋巴管和muLECs是斑马鱼颅骨内仅有的已知淋巴管内皮细胞（Bower等人，2017；Venero Galanternik等人，2017；van Lessen等人，2017）。因此，我们探究了损伤后脑实质中的淋巴管是否实际是长入的脑膜淋巴管。延时活细胞成像显示，在损伤后1-2天，脑膜淋巴管快速长入受损的脑实质（图2A；视频S1）。三维重建展示了损伤早期淋巴管长入和分支的起始过程（图2B；视频S2）。我们利用Tg(lyve1b:CreERT2; β-actin:loxP-RFPloxP-GFP; lyve1b:DsRed; kdrl:DenNTR)品系进行了基于Cre/loxP的谱系追踪（图2C）。以甲硝唑（Mtz）联合乙醇处理作为阴性对照（图2D），以在由二甲基亚砜（DMSO）联合4-羟基他莫昔芬（4-OHT）调控的条件下（图2E），当施加甲硝咪唑（Mtz）联合4-OHT时，大多数向内生长的淋巴管均为绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（DsRed）双阳性（图2F、图2G）。为进一步证实向内生长的淋巴管源自表达溶酶体相关膜蛋白1b（lyve1b）的脑膜淋巴内皮细胞（muLECs），研究人员利用Tg(lyve1b:Kaedecq63; kdrl:CFP-NTRcq62)转基因品系，在甲硝咪唑（Mtz）处理前对单个脑膜淋巴内皮细胞环进行了光转化。在移植后2天（2 dpt），向内生长的血管中仍保留有光转化后的红色荧光蛋白（Kaede-red）荧光（图2H、图2I），这表明光转化后的脑膜淋巴内皮细胞是这些向内生长血管的来源。上述所有结果均证明，脑膜淋巴管会对脑血管损伤做出响应，并快速向内生长至受损的脑实质中。

图2. 脑膜淋巴管响应脑血管损伤快速长入受损实质

图3. 脑膜淋巴管的向内生长依赖于局部激活的Vegfc。(A–D) 脑中下层血管网络示意图显示了血管在(B) 中表达vegfc ((n = 30/34))的位置。约68%和22%的FISH-vegfc信号分别分布在脑内皮细胞（BECs）和nkx2.2+神经元中（箭头）(C) ((n = 10))。双尾非配对t检验，(p<0.0001)。对解剖的脑组织进行RT-qPCR分析，显示2-6天移植后（dpt）脑中vegfc的相对表达水平(D) ((n=5))。采用Dunnett多重比较检验的双因素方差分析（ANOVA）。二甲基亚砜（DMSO）组2 dpt与甲硝唑（Mtz）组2 dpt相比，(p<0.0001) 1；DMSO组3 dpt与Mtz组3 dpt相比，(p<0.0001)；DMSO组4 dpt与Mtz组4 dpt相比，(p=0.0119)）。背侧视图，前方朝上。比例尺50毫米。参见图S3。(E-G) 与对照组(E) (= 18/20))中vegfr3的缺失相反，2 dpt时vegfr3仅在fli1 +kdrl-淋巴内皮细胞（LECs）中表达(F) ((n=17 / 22))。展示了框选区域（脑血管动脉，CtAs，箭头）的高倍放大图像。统计数据显示了vegfr3阳性血管的比例((n=15))。双尾非配对t检验，(p<0.0001)。腹侧视图，前方朝上。比例尺50微米。参见图S3。(H-M) 与野生型（WT）(H) ((n = 22/22))相比，ccbe1突变体() ((n=14 / 14))的脑血管发育未受影响。甲硝唑处理后，与野生型(J) ((n=36/40))相比，ccbe1突变体(K) ((n=23/27))中未出现脑膜淋巴向内生长（fli1+kdrf-）和新血管生成（kdr+）。(J)和(K)中的红色斑点代表巨噬细胞内吞的kdrl:mCherry红色荧光。定量分析显示了向内生长的总长度2 dpt 时的淋巴管（L）((n=60))。双尾未配对t检验。(p<0.0001) 以及 4 dpt 时的新生血管（BV）((n=6))。双尾未配对t检验，野生型、二甲基亚砜组 vs ccbe1/-、二甲基亚砜组，(p=0.8383)；野生型、甲硝唑组 vs (ccbe1-1-)、甲硝唑组，(p<0.0001)）。背侧视角，前方朝上。比例尺，50 微米。（N–S）内生淋巴管的缺失会导致严重的脑水肿。图中为斑马鱼头部在4天移植后（dpt）背侧和外侧视图的明场图像（N–Q）。与经二甲基亚砜（DMSO）处理的野生型（N）((n = 32/32))相比，ccbe1突变体表现出轻微的脑水肿（O）((n=24 / 24))，表现为眼间距增大（红线所示）。在甲硝咪唑（Mtz）处理4天后，与野生型（P）((n = 18/18))相比，ccbe1突变体的眼间距显著增大（Q）((n=18/18))，提示存在严重脑水肿，这一结果经统计分析得到证实（R）((n = 9))。采用双尾非配对t检验，野生型DMSO处理组对比(ccbe1 ^{-1-}) DMSO处理组，(p=0.0209)；野生型Mtz处理组对比(ccbe1 ^{-1-}) Mtz处理组，(p<0.0001)。图（S）((n=10))展示了ccbe1突变体在0至8天移植期内，经Mtz处理和未处理的存活率。数据以平均值±标准误（SEM）表示。(^{* * *} p<0.001)。(p 0.05)，NS表示无显著差异。比例尺为50微米。AMCtA：前（嘴侧）中脑中央动脉；BCA：基底交通动脉；CtA：中央动脉；CVP：脉络膜血管丛；iLV：向内生长的淋巴管；MMCtA：中中脑中央动脉；MtA：后脑动脉；PCS：后（尾侧）交通段；PHBC：原始后脑通道。

活跃的淋巴管生成需要淋巴管生成因子。荧光原位杂交（FISH）结果显示，在损伤后2天（dpt），损伤区域内部及边缘的剩余脑内皮细胞（BECs）中，经典的促淋巴管生成标记物vegfc被激活（图3A-3C、图S3A、图S3B；STAR方法），例如基底交通动脉（BCA）和中脑前中央动脉（AMCtA）。一部分nkx2.2阳性神经元也表达vegfc（图3A-3C）。vegfc的表达激活在损伤后4天显著降低，并在损伤后5-6天降至最低水平（图3D）。随后，我们使用Tg(kdrl:DenNTR; fli1:GFP)双转基因品系分析Vegfc受体Vegfr3的表达。fli1启动子在脑内皮细胞（BECs）和淋巴管内皮细胞（LECs）中均有活性（Yaniv等人, 2006; K€uchler等人, 2006），因此fli1+kdrl+血管代表淋巴管。损伤后2天，vegfr3仅在向内生长的淋巴管内皮细胞（fli1+kdrl+）中表达，在脑内皮细胞（kdrl+）中不表达（图3E-3G、图S3C-S3E；STAR方法）。这些表达模式表明，残留的脑内皮细胞和神经元分泌促淋巴管生成因子Vegfc，作用于淋巴管内皮细胞，从而促进脑膜淋巴管的向内生长。为了验证Vegfc对脑膜淋巴管向内生长的功能重要性，我们采用了ccbe1突变体。Ccbe1是Vegfc加工和成熟所必需的，因此其突变会导致淋巴管生成缺陷（Hogan等人, 2009; Le Guen等人, 2014; Roukens等人, 2015; van Lessen等人, 2017）。在Tg(kdrl:DenNTR; kdrl:mCherry; fli1:GFP)三转基因背景下，尽管ccbe1突变体表现出淋巴管发育缺陷，且眼间距显示存在轻微脑水肿，但其脑血管仍保持正常（图3H、图3I、图3L-3O、图3R）。损伤后，该突变体中脑膜淋巴管（fli1+kdrl+）的向内生长和脑血管再生（kdrl+）均未发生（图3J-3M）。该突变体在损伤后4至7天因严重脑水肿死亡（图3P-3S）。这些结果一方面证明了Vegfc是脑膜淋巴管向内生长的必需因子，另一方面也暗示了向内生长的淋巴管在水肿消退和脑血管修复中发挥作用。血管再生。研究的其余部分将集中在向内生长淋巴管的功能上。

内陷淋巴管腔化以引流脑间质液

严重的脑血管损伤通常会导致脑水肿（格林伯格与金，2013）。ccbe1 突变体中出现的致死性水肿（图3P-3S）表明，向内生长的淋巴管会从受损脑组织中引流组织间隙液，以消除水肿。由于斑马鱼脑膜淋巴管在生理状态下无管腔结构（鲍尔等人，2017；韦内罗·加兰特尼克等人，2017；范莱森等人，2017），我们探究向内生长的淋巴管是否会形成管腔并获得液体引流功能。向背主动脉（DA）注射 Alexa647-葡聚糖可标记血管管腔，而脑室内（ICV）注射则可标记脑组织间隙液（图4A）（亚尼夫等人，2006；范莱森等人，2017）。在背主动脉注射后，Alexa647 在血管内分布的调控下，脑室内注射后即刻可在 lyve1+ 淋巴管的管腔中观察到 Alexa647 的引流现象（图4B-4D）。这些数据证明，损伤后4天（4 dpt）已形成有管腔的淋巴管，且其具备了组织间隙液引流功能。  此后，我们在损伤后2天（2 dpt）和3天（3 dpt）通过脑室内注射 Alexa647-免疫球蛋白G（150 kDa），以确定管腔形成的大致时间。与对照组（图4E）（范莱森等人，2017）一致，损伤后2天时向内生长的淋巴管仍无管腔，淋巴管内皮细胞（LECs）内吞了 Alexa647-免疫球蛋白G 大分子（图4G）。注射后30分钟内，细胞内吞的 Alexa647-免疫球蛋白G 水平保持稳定，且可观察到其在淋巴管内皮细胞中的累积（图4F、4H）。  甲硝唑（Mtz）处理后损伤后3天（3 dpt），向内生长的淋巴管出现管腔（图4I，箭头所示）。脑室内注射后，Alexa647-免疫球蛋白G 即刻填充管腔（图4I，黄色箭头），30分钟后被引流排出（图4J）。注射后2小时，在受损斑马鱼幼虫的后主静脉（PCV）中检测到了 Alexa647-免疫球蛋白G 的分布（图4L，箭头所示），而未损伤的对照组中未检测到（图4K），这表明染料通过循环从向内生长的脑膜淋巴管引流至血管中（屈希勒等人，2006；坎贝尔等人，2018）。  后续聚焦离子束扫描电子显微镜（FIBSEM）分析进一步证实，损伤后3天（3 dpt）向内生长的淋巴管已形成管腔（图5I）。所有这些数据表明，向内生长的淋巴管在损伤后2至3天（2-3 dpt）期间经历管腔形成过程，从而获得液体引流功能，以消除脑水肿。

管腔形成是一个复杂的形态发生过程，涉及索状中空和细胞中空。索状当血管融合至顶膜时，细胞接触表面会发生管腔形成。在血管腔形成过程中，管腔扩张伴随着细胞的高度增殖。细胞腔形成发生在细胞质内，形成一个大的细胞内腔，该腔室会扩张并融合至细胞膜（Charpentier and Conlon, 2014; Elsen et al., 2008; Herwig et al., 2011; Kamei et al., 2006; Lubarsky and Krasnow, 2003; Sigurbjo¨ rnsdo´ ttir et al., 2014; Yu et al., 2015）。使用Tg(lyve1b:DsRed; fli1:nEGFP; kdrl:DenNTR)转基因品系对向内生长的淋巴内皮细胞核进行标记后，观察到了单细胞腔和多细胞腔（图4M和4N），这表明血管腔形成和细胞腔形成均参与了向内生长淋巴管的管腔化过程。通过向Tg(lyve1b:DsRed; kdrl:CFP-NTR)背景中注射淋巴细胞膜GFP（memGFP）质粒lyve1b:GFP-Farnesyl以构建嵌合动物，验证了这一推论。memGFP的落射荧光显示单细胞腔的存在（图4O）（Gebala et al., 2016），而memGFP+DsRed+和memGFPDsRed+嵌合血管则呈现多细胞腔（图4P）。此外，EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）标记显示，淋巴内皮细胞在向内生长至脑实质的过程中处于增殖状态（图4Q和4R），这与血管腔形成过程中的高增殖特征相符。这些数据表明，向内生长的淋巴管通过包含细胞腔形成和血管腔形成的复杂机制完成管腔化。

图4.内生淋巴管经历流明以排出脑间质液

向内生长的淋巴管作为新生血管的“生长轨道”

基于ccbe1突变体的表型（图3K），我们接下来探究向内生长的淋巴管在脑血管再生中的作用。在Tg(kdrl:DenNTR; kdrl:mCherry; fli1:GFP)三重转基因品系中，通过延时成像观察到新生血管（kdrl+）沿着预先形成的向内生长的淋巴管（fli1+kdrl-）生长（图5A、图5B；视频S3）。若通过高能多光子激光的聚焦照射特异性消融向内生长的淋巴管，其旁侧新生的血管会出现生长停滞与退化。相比之下，对淋巴管邻近的实质组织进行消融，并不会影响新生血管血管（图5C和5D；视频S4；STAR方法）。这些数据表明，向内生长的淋巴管作为新生血管的“生长轨道”，这一过程极有可能通过直接的物理黏附实现。在移植后3天，淋巴管-血管界面处表面黏附分子紧密连接蛋白5b和血管内皮钙粘蛋白的富集现象，为这种物理黏附提供了支持（图5E、5F及图S4A-S4C），这提示了血管内皮细胞与淋巴管内皮细胞之间存在细胞旁相互作用。相关光镜-电镜联合技术以及聚焦离子束扫描电镜的三维重建结果证实，移植后3天向内生长的淋巴管和新生血管是两种具有管腔的黏附血管结构（图5G-5I；视频S5；STAR方法）。在单张切片平面上，放大两个血管的边界时可观察到紧密连接（图5J，箭头）。所有这些结果均表明，向内生长的淋巴管充当“生长轨道”，支持并引导新生血管的生长。

活跃的血管新生过程需要促血管生成因子。斑马鱼脑膜微淋巴内皮细胞可在发育过程中产生血管内皮生长因子A（Vegfa）以调节脑膜血管新生（Bower等人，2017），这表明其作为产生促血管生成因子的细胞，在脑血管再生中具有进一步的功能。在损伤后2天，向内生长的淋巴内皮细胞中血管内皮生长因子A（vegfa）呈高表达（图S4D-S4H），其表达水平约为对照组脑膜微淋巴内皮细胞的3倍（图S4H）。这些结果表明，向内生长的淋巴内皮细胞可表达血管内皮生长因子A（Vegfa）等促血管生成信号，以促进脑血管生长。

为探究新生血管的来源，我们在损伤后1天通过对Dendra2进行光转化，标记了部分残留的大血管（如共同静脉主脉或垂体静脉主血管）。损伤后5天，Dendra2红色荧光保留在新生的中后脑中央动脉（Figure S5A）和脑中央动脉（Figure S5B）中，表明新生血管源自残留血管。活体成像显示，新生的中后脑中央动脉和脑中央动脉分别通过血管从共同静脉主脉迁移至后脑动脉、从垂体静脉主血管迁移至基底动脉形成（Figure S5C、S5D）。此外，损伤后3天，许多新生血管呈现EdU标记阳性（Figure S5E–S5G）。所有这些数据表明，残留血管是新生血管的来源，血管内皮细胞的增殖和迁移均参与其中。

图5。通过直接物理粘附，新生淋巴管作为新生血管的“生长轨迹”。（A）中脑和后脑血管网络的插图显示面板中的图像区域（红色框）。所有面板都是背向视图，向前向上。（B）延时成像显示新生血管（kdrl+，MMCtA，箭头）沿着预先形成的淋巴管（fl1+kdrl，箭头）生长。明亮的区域表示这两种血管结构。经过的时间以h： min表示。比例尺，10毫米。另见视频S3。（C和D）消融向内生长的淋巴血管（D）(= 20/20)10只幼虫的血管，每只幼虫2条血管），但不消融邻近的薄壁组织（C）(= 20/20)10只幼虫的位置，每只幼虫2个位置），导致粘附新生血管的生长停止和消退。箭头表示激光照射部位。经过的时间以h：min表示。比例尺，20毫米。另见视频S4。（E和F）抗Claudin5b抗体，TagRFP和Dendra2在3 dpt的三重标记。与DMSO处理（E）（n=21/22）相反，Claudin5b((n = 21/22))。Claudin5b在Mtz处理（F）后在向内生长的淋巴（prox 1a+）和新生血管（kdrl+）之间的界面富集((n=18/21))。标尺条，20 m。另见图S4。（G-J）6 dpf/3 dpt的脑血管的相关光和电子显微镜（CLEM）。共聚焦图像（G）内的FIB-SEM目标区域用框架表示。标尺条，10毫米。FIB-SEM单一计划的3D重建将向内生长的脑膜淋巴管（mLV）和新生血管（BV）识别为两个粘附的血管结构（H）((n=3 / 3))。（G）中的框架区域显示在（H）中。单个FIB-SEM图像平面表示mLV和BV（l）((n=3 / 3))管腔。浅绿色和浅红色分别标记淋巴管和血管的横截面。（J）中的虚线框表示淋巴管和血管的边界区域，该区域被放大以显示紧密连接（J）（箭头）。比例尺，1毫米。另见视频S5。BA，基底动脉；CtA，中央动脉；CVP，脉络膜血管丛；iLV，向内生长的淋巴管；MMCtA，中脑中央动脉；PHBC，原始后脑通道；PMCtA，后（尾）中脑中央动脉。

脑血管再生完成后，向内生长的淋巴管发生凋亡并被清除

综合上述数据可知，脑膜淋巴管会响应脑血管损伤而快速长入脑实质。一方面，它们通过引流组织液来缓解脑水肿；另一方面，它们充当“生长轨道”，引导新生血管的生成。然而，这种淋巴管介导的脑血管再生机制会导致脑实质内出现淋巴管，这与脑实质在生理状态下无淋巴管的特征相矛盾。因此，我们探究了脑血管再生完成后长入的淋巴管的命运。利用lyve1b或prox1启动子驱动的转基因进行的时间进程研究表明，长入的淋巴管在损伤后6至8天逐渐消失（图6A、图6B及补充图S2）。从损伤后5天起，部分长入的淋巴管内皮细胞（fli1+kdrl）中可检测到凋亡信号（补充图S6A-S6D），该信号在损伤后7天变得显著且强烈，但在后续时间点几乎无法检测到。

图6 向内生长的淋巴管在脑血管再生完成后发生凋亡。(A) 脑血管示意图标注了各图中的图像区域（红色方框）。所有图像均为背侧视图，前方朝上。(B) 向内生长的淋巴管在7至8天移植后（((n=23/26))）消失。箭头头和箭头分别指示黏附的淋巴管和血管。注意8天移植后淋巴管的消失（虚线箭头头）。比例尺，20毫米。(C-E) 与对照组（C，((n=33/35))）相比，约70%的向内生长的淋巴管（fli1+kdrl-）（D，((n=30 / 33))）检测到TUNEL信号，而血管（kdrl+）中检测到的信号不足5%（E，((n=8))）。双尾非配对t检验（((p<0.0001))）。比例尺，20毫米。数据以平均值±标准误表示（(^{*} p<0.001)）。另见图S6。中枢动脉（CtA）、向内生长的淋巴管（iLV）、中脑中央动脉（MMCtA）、原始后脑通道（PHBC）。

斑马鱼光化学血栓模型中淋巴管介导的再生机制具有保守性

为探究脑膜淋巴管的向内生长是否也存在于其他脑血管损伤模型中，我们构建了斑马鱼光化学血栓形成模型，该模型能高度模拟人类脑血栓形成（图7A）。剂量滴定实验表明，在注射玫瑰红后经冷光照射600秒，可在斑马鱼脑部照射区域诱导血栓形成并造成血管损伤（图S7A–S7C；视频S6；STAR方法）。研究中频繁观察到出血现象（图S7D和S7E，箭头所示）。与注射若丹明的对照组幼鱼（图7B、7C）相比，光照后2天，脑膜淋巴管（lyve1+）已侵入损伤区域（图7D，虚线圆圈）。新生血管（kdrl+）（图7D，箭头所示）沿向内生长的淋巴管（图7D，箭头）延伸，至光照后4天完成脑血管再生。从光照后6天到7天，向内生长的淋巴管从损伤区域清除，脑血管再生过程全部完成（图7D）。上述结果表明，在光化学血栓形成模型中，淋巴管向内生长介导的脑血管再生是一种保守的机制。

图7. 光化学脑血栓模型中向内生长的淋巴管介导的脑血管再生具有暂时性。（A）斑马鱼脑部冷光诱导血栓的技术流程。（B）红色方框标注了（C）和（D）的成像区域，背侧视角，前方朝上。（C）向背主动脉（DA）注射若丹明后进行冷光照射，对脑部局部血管无效果（样本编号 (= 10/10))，比例尺 50 微米）。（D）向背主动脉注射孟加拉玫瑰红并照射 600 秒后 1 天（1 dpi），照射区域（虚线圆圈）出现明显的局部脑血管损伤；到 2 dpi 时，脑膜淋巴管（箭头）长入损伤区域，新生血管（前脑静脉 ACeV）沿向内生长的淋巴管形成，至 4 dpi 时完成血管再生；6 至 7 dpi 时，向内生长的淋巴管从损伤区域逐渐清晰（样本编号 ((n = 15/20))）。（E）向内生长的淋巴管介导的脑血管再生示意图。箭头头指示血管生长的前沿。AceV：前脑静脉；BV：血管；PrA：前脑动脉。比例尺 50 毫米。另见图 S7 和视频 S6。

讨论

总之，脑血管损伤会诱导脑膜淋巴管快速长入受损的脑实质，而这依赖于局部激活的血管内皮生长因子C。一方面，这些向内生长的淋巴管形成管腔，引流受损实质组织的组织间隙液，以消除脑水肿。另一方面，它们作为迁移支架，引导并支持新生血管的生长（图7E）。

kdrl启动子不仅在脑部脑微血管内皮细胞中具有活性，在躯干脑微血管内皮细胞中也同样具有活性。不过，二者对甲硝哒唑（Mtz）的敏感性存在差异。脑部脑微血管内皮细胞对甲硝哒唑的敏感度远高于躯干脑微血管内皮细胞。本研究中，我们使用极低浓度的甲硝哒唑（1毫摩尔）处理5小时，以诱导脑部脑微血管内皮细胞发生凋亡。与以往NTR-甲硝哒唑相关研究文献相比，这是最低的甲硝哒唑浓度和最短的处理时间（何等人，2014年；张等人，2013年；叶等人，2015年）。该浓度的甲硝哒唑和处理时长对躯干脑微血管内皮细胞完全无效脑微血管内皮细胞（BECs），因为从未观察到甲硝唑（Mtz）诱导躯干脑微血管内皮细胞凋亡的现象（图S1E和S1F）。目前尚不清楚脑微血管内皮细胞对甲硝唑更敏感的原因。脑血管的特殊结构（如血脑屏障）可能是原因之一。

斑马鱼中的脑膜muLEC-BLEC-FGP细胞无管腔结构，且富含大空泡（Bower等人，2017；Venero Galanternik等人，2017；van Lessen等人，2017）。脑血管损伤后，向内生长的脑膜淋巴管会发生管腔化。单细胞腔和多细胞腔的共存表明，淋巴管管腔化过程中同时存在细胞空心化和索状空心化两种机制。细胞空心化机制与muLECs中大量空泡的富集相一致。相关具体细节和机制淋巴管腔化需要进一步的全面研究。尽管液体引流功能的实现需要管腔形成，但淋巴管腔化并非其充当“生长轨道”的先决条件。研究已观察到，在移植后第2天，新生血管会沿着未腔化的淋巴管生长；而在移植后第3天及之后，新生血管则沿着已腔化的淋巴管生长。

在发育和再生过程中，一种细胞结构以其他预先存在的细胞结构为轨道进行迁移和生长以找到路径的现象备受关注（Cattin 等人，2015；Kojima 等人，2010；Tsai 等人，2016）。紧密连接蛋白5b和钙粘蛋白5在淋巴管-血管界面的富集表明，很可能是直接的物理黏附介导了新生脑血管的导向。在发育过程中的淋巴管生成等其他情境中，躯干淋巴管在趋化因子信号的引导下沿着预先存在的血管系统生长（Bussmann 等人，2010；Cha 等人，2012）。进一步探究新生脑血管的导向是否仅由物理黏附介导，还是由趋化因子信号或其他机制与物理黏附共同介导，具有重要研究价值。

脑血管再生完成后，向内生长的淋巴管会发生凋亡，但触发该凋亡的关键因子目前仍未知。研究发现新生血管灌注发生在黏附的淋巴管内皮细胞凋亡之前。这一观察为淋巴管凋亡可能由黏附的新生血管成熟及灌注所触发提供了初步的间接证据。血管内皮生长因子C的下调（图3D）不应是淋巴管凋亡的关键诱导因子，因为从损伤后第4天起持续过表达血管内皮生长因子C，无法抑制损伤后第8天淋巴管的清除（图S6E-S6G）。介导淋巴管凋亡的具体细胞和分子机制仍有待进一步阐明。

NTR-Mtz系统基于NTR介导的无毒前药甲硝唑（Mtz）转化为可导致细胞死亡的DNA链间交联剂。光化学血栓形成模型基于光敏剂的激发，该过程会产生活性氧（ROS），进而损伤血管内皮并启动血栓形成。尽管这两种模型导致损伤的机制不同，但二者均可诱导内皮细胞死亡、区域性脑血管损伤、脑缺血和出血。此外，NTR-Mtz模型和光化学模型会在闭合的颅骨内引发严重的脑水肿，这可能是刺激淋巴向内生长以消除水肿的关键因素。虽然在NTR-Mtz模型和光化学血栓形成模型中，淋巴向内生长介导的脑血管再生机制是保守的，但我们不能得出暂时性淋巴管是对所有类型脑血管损伤的普遍反应的结论。在聚焦多光子激光诱导的斑马fish单微血管破裂模型中，破裂的修复是由巨噬细胞产生的机械牵引力介导的（Liu等人，2016），而非由向内生长的淋巴管介导。这种机制差异可能由损伤的严重程度不同导致。微血管破裂既不会引发大规模的血管凋亡，也不会产生明显的脑水肿，因此不需要淋巴管来消除水肿。

脑膜淋巴管的暂时性入侵促使人们重新评估大脑中不存在淋巴管的观点实质组织，这使得有必要进一步深入了解脑膜淋巴管的病理受累情况。新生血管的“生长轨迹”也拓展了我们对淋巴管功能的认知。缺血性脑卒中有效血管生成疗法的开发，依赖于对脑血管再生的全面理解。本研究应为缺血后可转化疗法的开发提供参考，尤其是通过应用淋巴管生成药物。

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