题目：The absence of telomerase leads to immune response and tumor regression in zebrafish melanoma

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39643971/

期刊：Cell Reports

研究亮点

l 黑色素瘤的起始和早期进展无需端粒酶（或端粒替代途径）即可发生

l 端粒酶的重新激活对于肿瘤在后期阶段的持续生长至关重要

l 端粒酶缺失通过基因组不稳定性和免疫反应导致肿瘤消退

l 尽管如此，端粒酶阴性的黑色素瘤仍具有侵袭性且致命

摘要

大多数癌症会重新激活端粒酶以维持端粒长度，从而获得永生能力。包括黑色素瘤在内的多种癌症中均发现了端粒酶启动子激活突变。然而，端粒酶在肿瘤发生过程中是否以及何时被严格要求发挥作用，目前尚不清楚。我们将端粒酶突变体 ((tert ^{-1-} )) 与两种已建立的斑马鱼黑色素瘤模型相结合。研究发现，(tert ^{-1-}) 黑色素瘤的初始发生率和侵袭性与 (tert ^{+/+}) 肿瘤相似。但此类肿瘤最终会出现生长停滞并消退。晚期 (tert ^{-1-}) 肿瘤表现出细胞增殖减少、凋亡增加以及黑素细胞分化增强的特征。值得注意的是，这些肿瘤显示出免疫细胞浸润增强的现象，且当移植到免疫缺陷宿主后可恢复生长。我们提出，斑马鱼黑色素瘤的发生需要端粒酶，尽管其作用发生在肿瘤进展的后期阶段，端粒酶需维持肿瘤生长，同时避免免疫排斥和肿瘤消退。因此，端粒酶的缺失通过肿瘤自主机制（细胞周期停滞、凋亡和黑素细胞分化）和非肿瘤自主机制（免疫排斥）限制黑色素瘤的发展。

图形摘要

引言

在大多数成人体细胞组织中，端粒会随着细胞的连续分裂而缩短。端粒缩短会导致端粒功能异常，进而引发复制性衰老和细胞周期停滞。端粒缩短形成了两个增殖屏障，癌前细胞必须克服这两个屏障才能完全恶变。第一个增殖屏障被称为M1期或衰老期，由p53依赖的机制构成，可通过p53/Rb功能的丧失来突破。第二个屏障被称为M2期或危机期，其特征是端粒间融合加剧了基因组不稳定性。为逆转这种状态，细胞必须启动端粒维持机制（TMM）。约90%的人类肿瘤会重新激活端粒酶，从而延长端粒并保护染色体末端。端粒酶由两个核心组分组成：逆转录酶DNA聚合酶亚基（TERT）和包含非编码RNA亚基的模板（TR）。端粒酶结合到端粒的(3'')末端，并持续添加（TTAGGG）n六核苷酸重复序列。在缺乏端粒酶的情况下，癌细胞可通过一种基于重组的机制维持端粒，即端粒选择性延长机制ALT（替代端粒延长机制）。 利用小鼠模型开展的体内研究表明，端粒较短的动物体内端粒酶的缺失会减少癌症的发生。此外，对已形成的肿瘤抑制端粒酶会导致肿瘤生长受限。 有趣的是，在部分检测到ALT的动物体内观察到了端粒酶抑制后的肿瘤复发情况， 这表明ALT可能是肿瘤发生过程中一种有效的端粒维持机制。斑马鱼脑肿瘤中也检测到了ALT。

与之前的观点相反，一项分析31种癌症类型的研究未能在6835个人类样本中的22%检测到端粒维持机制。此外，对黑色素瘤和神经母细胞瘤TERT/ALT肿瘤来源细胞的组织培养显示端粒进行性缩短，证实这些肿瘤缺乏活性患者中的端粒维持机制。 缺乏端粒维持机制的癌症需要付出一定代价这受到海弗里克极限的限制，从而降低了它们的复制能力。缺乏端粒维持机制的神经母细胞瘤就体现了这种权衡关系。这类癌症的预后较好，且与自发性消退相关。然而，情况并非总是如此案例。据报道，缺乏端粒维持机制的黑色素瘤极为罕见，尽管在细胞培养中增殖能力有限，但仍具有侵袭性。此外，肿瘤微环境（TMMs）可能在免疫治疗耐药性中发挥作用。研究表明，转移性黑色素瘤会产生耐药性，对免疫检查点阻断疗法的反应显示，与端粒维持相关的基因表达增加， 而端粒酶逆转录酶（TERT）突变可以预测对部分免疫疗法的反应，免疫检查点阻断疗法。 这些研究结果表明端粒酶的表达可能调控癌症的免疫原性，有望成为治疗的预测性生物标志物。

端粒维持机制（TMMs）赋予的复制性永生化是癌症公认的标志性特征。然而，目前尚不清楚端粒维持机制在肿瘤发生过程中的哪个阶段被激活，以及它们对于致命性癌症是否绝对必需。在多种人类肿瘤类型中，端粒酶启动子突变（TPMs）的激活频率很高。这些肿瘤包括皮肤黑色素瘤频率为60%–85%。 在早期和晚期肿瘤中均已检测到端粒酶相关蛋白（TPMs），这表明端粒酶的激活可能贯穿整个肿瘤发生过程。本研究探讨了端粒酶在黑色素瘤发生与进展中的作用，旨在明确肿瘤发生过程中严格需要端粒维持机制（TMMs）的具体阶段。出乎意料的是，我们发现黑色素瘤的发生和早期进展并不依赖端粒酶或端粒替代延长机制（ALT）。然而，在肿瘤进展后期，端粒酶活性的缺失会通过肿瘤自主和非肿瘤自主两种机制限制黑色素瘤的生长，并导致肿瘤消退。

结果

黑色素瘤的发生和早期进展不需要端粒维持机制

为了确定端粒酶在黑色素瘤中的作用，我们将端粒酶突变斑马鱼（((tert ^{pu3430/hu }^{2430})，下文简称(tert ^{-1-})，其端粒酶无酶活性）与赫尔斯通实验室开发的Tg(mitfa:Hsa.HRAS_G12V,mitfa:GFP)黑色素瘤模型（本文中称为mitfa:HRAS）进行杂交。研究表明，mitfa:HRAS斑马鱼的黑素细胞会出现增生、发育异常，并自发进展为侵袭性黑色素瘤²⁷。与此一致，我们观察到野生型（WT）端粒酶斑马鱼（((tert ^{+/+}))）会发生黑色素瘤，在4月龄时完全外显（图1A）。在该模型中，转基因还会在mitfa启动子下诱导绿色荧光蛋白（GFP）的表达，以此标记肿瘤的发生（图1B）。令人意外的是，携带mitfa:HRAS的端粒酶突变斑马鱼（mitfa:HRAS; (tert ^{-1-})）缺乏端粒酶活性，却并未影响黑色素瘤的发生动态（图1A）。因此，端粒酶并非在该模型中是黑色素瘤形成所必需的。这一结果与先前的数据存在差异，先前数据显示晚代端粒酶缺陷小鼠（((G5 TerC^{-1-} ))）对皮肤癌具有抗性。

为了拓展我们的研究发现，我们将端粒酶突变斑马鱼与第二种广泛使用的黑色素瘤模型相结合，该模型在tp53缺陷背景下表达人(BRAF ^{-1 / 600 E})癌基因，(Tg(mitfa:BRAF ^{-1600 E}))；(tp53 ^{-1-})。 同样，我们观察到(Tg(mitfa:BRAF ^{V 600 E} ))；(tp53 ^{-1-})；(tert ^{-1-})不影响黑色素瘤的发生率（图S1A）。这第二种黑色素瘤模型还使我们能够观察黑色素生成的不同阶段。在(tert ^{+/+})和(tert ^{-1-})两种模型中，我们均观察到黑色素瘤进展的三个不同阶段：良性病变、径向生长期和垂直生长期（图S1B）。研究结果表明，即使缺乏端粒酶，黑色素瘤仍能顺利完成所有这些阶段的进展。尽管BRAFV600E是黑色素瘤中最常见的突变，但我们选择继续使用mitfa:HRAS黑色素瘤模型开展后续实验。与(mitfa:BRAF ^{V 600 E})模型不同，mitfa:HRAS斑马鱼无需预先存在tp53突变即可形成肿瘤。 我们及其他研究者已证实，p53功能异常会抑制(tert ^{-1-})，且(tert ^{-1-} tp53 ^{-1-})双突变体不会表现出与端粒酶缺乏相关的表型。因此，(mitfa:BRAF ^{-1600 E})模型无法让我们直接研究端粒酶在肿瘤发生中的作用。值得注意的是，Ras突变虽发生频率较低，但仍存在于人类黑色素瘤中，且仍需研发有效的疗法。

为了评估端粒酶是否对黑色素瘤的发生有影响，我们研究了mitfa:HRAS; (tert ^{-1-})斑马鱼中早期肿瘤发生的发生率。我们的结果表明，端粒酶的缺失既不影响1至2月龄斑马鱼的微肿瘤形成（图S1C和S1D），也不影响其侵袭能力（图S1E和S1F）。端粒酶突变体斑马鱼中早期肿瘤的发生率相似，这进一步证实了癌症发生并不需要端粒酶的激活。

一旦实验鱼通过(tert ^{+/-})的同系交配培育出来，(tert ^{-1-})鱼会形成肿瘤的另一个原因可能是母体tert mRNA的存在，这使得黑色素细胞在发育过程中能够延长端粒。为了验证这一假设，我们将一只(tert ^{-1-})雌性与一只(tert ^{+1-})雄性进行杂交，培育出了(tert ^{+/-})和(tert ^{-1-})的混合后代。这种实验设置并不理想，因为子代将继承(tert ^{-1-})雌性极短的端粒。我们观察到数量减少了，与(tert ^{+/-})相比，(tert ^{-1-})品系的鱼在1.5月龄时数量更少，尽管两种基因型的预期比例均为50%。我们还记录到，在随后的一个月中，(tert ^{-1-})品系的鱼出现了高死亡率（图S2B；(p=0.000073)）。这表明，(tert ^{-1-})雌性与(tert ^{+1-})雄性杂交产生的(tert ^{-1-})子代，其表型比(tert ^{+/-})品系杂交产生的子代更为严重（图S2C）。此外，产生的(tert ^{-1-})品系的鱼表现出皮肤色素沉着显著降低的特征（图1C和1D；(p<0.0001)）。尽管存在这些表型，(tert ^{-1-})品系中有40%的鱼早在1.5月龄时就长出了肿瘤（图1E、(p=0.332922)和S2D），这表明端粒酶缺失时也可能发生致死性黑色素瘤。值得注意的是，唯一存活至实验结束的(tert ^{-1-})品系的鱼，在1.5至2.5月龄期间肿瘤持续生长（图S2E和S2F）。该实验进一步证实了我们之前的研究结果，即端粒酶并非斑马鱼肿瘤发生和生长所必需的。

接下来，我们分析了3月龄斑马鱼的可见肿瘤。鉴于几乎所有斑马鱼此时均已出现宏观病灶，我们将该日龄定义为肿瘤发生的早期进展阶段（图1A）。我们采用端粒限制性片段（TRF）印迹法测定端粒长度，并将肿瘤样本的端粒与同一条斑马鱼皮肤组织的端粒进行对比，以皮肤组织作为内部对照。与我们之前的研究结果一致，(tert ^{-1-})斑马鱼的端粒长度短于(tert ^{+/+})斑马鱼（图1F、1G）。出乎意料的是，与(tert ^{+/+})或(tert ^{-1-})品系3月龄斑马鱼的皮肤组织相比，肿瘤组织并未检测到端粒缩短现象（图1F、1G）。尽管如此，与(tert ^{+/+})肿瘤细胞相比，tert/黑色素瘤细胞的端粒损伤诱导灶（TIFs）数量显著增加（(tert ^{+/+})品系为5%，而(tert ^{-1-})品系为25%；图1I、1J）。因此，尽管(tert ^{-1-})品系黑色素瘤的平均端粒长度与皮肤组织相近，但我们的研究结果表明，(tert ^{-1-})品系黑色素瘤细胞即便在这一早期进展阶段，也存在极度缩短的端粒。

大多数癌症在癌变早期就会出现端粒酶启动子激活突变。为评估我们模型中的肿瘤是否具有端粒酶活性，我们进行了端粒酶重复扩增方案（TRAP）检测。我们以人类海拉细胞和斑马鱼黑色素瘤ZMEL细胞系作为阳性对照，以骨肉瘤U2OS细胞系作为阴性对照。与预期一致，斑马鱼(tert ^{-1-})肿瘤未表现出端粒酶活性（图1K）。令人意外的是，早期(tert ^{+/+})肿瘤也未检测到端粒酶活性。该结果表明，斑马鱼黑色素瘤在肿瘤发生早期并未激活端粒酶。

癌细胞还可通过端粒酶的替代机制（即ALT）来维持端粒。ALT细胞的特征是端粒长度异质性增加，其端粒比TERT阳性细胞的端粒更长或更短。然而，通过分析来自(tert ^{+/+})和(tert ^{-1-})两种肿瘤的端粒限制性片段（TRFs），我们观察到端粒大小呈现出相似的分布范围（图1C和1H）。ALT的另一特征是存在被称为C环的染色体外DNA。利用φ29 DNA聚合酶对端粒环进行扩增，可实现C环的扩增，这为评估ALT阳性细胞（如U2OS细胞）提供了可靠的方法。然而，该检测方法未能在(tert ^{-1-})肿瘤中检测到C环的存在（图1L和1M）。一致地，此前一项使用 Ras 诱导的斑马鱼黑色素瘤的研究也未观察到 C 环的增加。综上，我们的数据表明，斑马鱼黑色素瘤的发生和早期进展不需要端粒酶，且这些肿瘤也不通过端粒替代途径（ALT）来维持端粒长度。

图1.黑色素瘤的起始不需要端粒维持机制。（A和B）mitfa黑色素瘤的发病率：HRAS鱼不受端粒酶缺乏的影响。（A）(tert ^{+/+})和(tert ^{-1-})鱼之间无肿瘤鱼的百分比（对数秩检验）。（B）表达绿色荧光蛋白的3个月大的tert+/+和(tert ^{-1-})黑色素瘤鱼的代表性图像。比例尺：0.5厘米。（C-E）tert mRNA 的母源贡献无法解释 (tert ^{-1-}) 斑马鱼的致癌作用。（C和D）1.5月龄时 mitfa:HRAS:GFP、(tert ^{+1-}) 和 (tert ^{-1-}) 斑马鱼未着色皮肤面积的代表性图像及定量分析。(n( tert ^{+1-}=10;) (tert ^{-1-}=5 ))）；非配对t检验。比例尺：0.5厘米。（E）1.5月龄时患肿瘤斑马鱼的定量分析。n( (1( tert ^{+1-}=10) (tert ^{-1-}=5) )；(x^{2}) 检验。(F–H) 尽管在tert/fish中皮肤与肿瘤之间端粒缩短现象并不明显，但与(tert ^{+/+})鱼相比，(tert ^{-1-})皮肤/肿瘤组织存在端粒缩短。然而，(tert ^{-1-})肿瘤的端粒处DNA损伤程度更高。(F) 对3月龄鱼提取的肿瘤（T）和皮肤（S）基因组DNA进行Southern印迹的端粒限制性片段（TRF）分析（黄色柱代表端粒平均长度）；(G) 端粒平均长度的定量分析；(H) 端粒限制性片段的光密度分析（(varphi=4)；单因素方差分析）。（一）(tert ^{+/+}) 来源肿瘤细胞及 3 月龄 tert 斑马鱼肿瘤细胞的 r H2Ax/telG 免疫荧光原位杂交（免疫-FISH）图像。白色箭头指示肿瘤细胞中的端粒功能障碍诱导灶（TIFs）。比例尺：6 毫米。(J) 来自(I)的含R5 TIF的细胞百分比（((n=3)；非配对t检验）。（K–M）早期黑色素瘤未表现出端粒维持机制异常。（K）通过端粒重复序列扩增法（TRAP）评估来自3月龄鱼(tert ^{+i+})和(tert ^{-1-})的肿瘤样本的端粒酶活性((n=3))。HeLa和ZMEL细胞提取物用作阳性对照，U2OS细胞提取物用作阴性对照。（L）对来自tert+/+和(tert ^{-1-})的3月龄鱼的肿瘤样本进行C-环检测。HeLa细胞提取物用作阴性对照，U2OS细胞提取物用作阳性对照。（M）对C-环信号进行定量分析(eta n=4)；采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。误差线代表±均值标准误差；每个点代表一个肿瘤；**(^{*} p ≤0.01)和(^{* * *} p ≤0.0001)。ns，无显著差异

端粒酶缺失导致晚期进展过程中的生长受限

我们观察到端粒酶激活并非黑色素瘤早期进展所必需，这促使我们研究其对晚期的影响。我们追踪了肿瘤随时间的进展情况，并评估了5、7和9月龄斑马鱼的肿瘤面积（图2A、2B及图S3A）。在5月龄斑马鱼中，(tert ^{+/+})组与(tert ^{-1-})组斑马鱼的平均肿瘤面积无显著差异。然而，(tert ^{+/+})组的肿瘤体积随时间不断增大，而(tert ^{-1-})组肿瘤的平均面积则保持稳定，且显著小于(tert ^{+/+})组的肿瘤（7月龄时P=(p=0.0269)；9月龄时P=(p=)=0.0017）。若考虑单个肿瘤的变化轨迹，肿瘤体积的差异更为明显（图2C）。(tert ^{+/+})组的所有肿瘤体积均随时间增大，而(tert ^{-1-})组的大多数肿瘤体积则保持不变（图2C）。通过计算每种肿瘤体积变化的回归斜率（图2D），我们发现(tert ^{+/+})组的所有肿瘤均呈增长趋势，而(tert ^{-1-})组的大多数肿瘤要么未生长（((slope ≈0)），要么出现消退。这一结果表明(tert ^{-1-})组的肿瘤在晚期阶段的生长动力学更为缓慢。

尽管(tert ^{-1-})肿瘤的体积更小，但其致死性与(tert ^{+/+})肿瘤相当（图S3B）。我们此前曾报道过(tert ^{-1-}) 斑马鱼出现早衰现象且存活率降低。这一效应可以解释 (tert ^{-1-}) 斑马鱼的高死亡率，而非黑色素瘤本身所致。为进一步探究这种存活率降低的原因，我们分析了本研究中所用斑马鱼的近亲作为对照（图 S3B 和 S3C）。缺失 mitfa:HRAS 的斑马鱼在整个实验过程中的存活率接近 100%，且 (tert ^{-1-}) 斑马鱼的存活率与 (tert ^{+/+}) 斑马鱼无差异。这表明，mitfa:HRAS; (tert ^{-1-}) 斑马鱼观察到的高死亡率并非由早衰引起，而是黑色素瘤本身导致的结果。鉴于肿瘤大小存在差异，我们还检测了肿瘤大小是否能预测黑色素瘤的存活率。为解答这一问题，我们对每种基因型的斑马鱼进行了统计，量化了存活至 9 月龄的个体（“存活组”）以及在 7 至 9 月龄间死亡的个体（“死亡组”）的数量（图 2E）。我们发现，(tert ^{+/+}) 斑马鱼的存活组与死亡组之间，肿瘤大小并无差异，这表明肿瘤大小无法预测 (tert ^{+/+}) 斑马鱼的存活率（图 2E 中 (tert ^{+/+}) 斑马鱼的虚线和实线）。相比之下，(tert ^{-1-}) 斑马鱼的非存活组拥有比存活组更大的肿瘤（图 2E 中 (tert ^{-1-}) 斑马鱼的虚线和实线）。这一结果表明，肿瘤大小对 (tert ^{-1-}) 斑马鱼的存活率有显著影响。同时也表明，(tert ^{-1-}) 斑马鱼的肿瘤能够生长至与 (tert ^{+/+}) 斑马鱼的肿瘤相同的大小（图 2E）。然而，与 (tert ^{+/+}) 斑马鱼不同，携带更大肿瘤的 (tert ^{-1-}) 斑马鱼会死亡，并被排除在黑色素瘤进展的后期阶段之外。

我们之前的结果显示，到3个月大时，几乎所有(tert ^{+/+})和(tert ^{-1-})的斑马鱼都出现了肉眼可见的肿瘤（图2F），这些肿瘤在组织学上具有相似的侵袭特征（图2G和2H）。相比之下，到9个月时年龄方面，尽管所有(tert ^{+/+})处的肿瘤仍表现出明显的瘤体，但有相当比例的(tert ^{-1-})处斑马鱼（25%，(n=26)）未出现可见肿瘤，这提示黑色素瘤发生了消退（图2F）。我们仍能在这些鱼体内观察到侵袭性降低的黑色素瘤组织学残留（图2G和图2H）。发生黑色素瘤消退的鱼的肌纤维出现萎缩迹象，肌纤维之间出现空隙。一种可能的解释是黑色素瘤侵袭了肌肉，而当肿瘤消退时，肌纤维未能恢复。与(tert ^{+/+})处的肿瘤相比，剩余的(tert ^{-1-})处肉眼可见的肿瘤侵袭性显著降低（图2G和图2H）。总体而言，我们的研究结果表明，(tert ^{-1-})处的肿瘤生长程度可达(tert ^{+/+})处的肿瘤水平，但相较于(tert ^{+/+})处的斑马鱼，这类肿瘤会导致更早的死亡。因此，端粒酶不仅是黑色素瘤晚期进展中维持肿瘤生长所必需的，端粒酶的缺失会使生物体对更大的肿瘤更易感。

图2 端粒酶的缺失会限制肿瘤生长，进而导致黑色素瘤消退。（A-D）端粒酶缺乏影响肿瘤晚期生长。（A）(tert ^{+/+}) 和 (tert ^{-1-}) 斑马鱼黑色素瘤随时间演变的示例。比例尺：0.5 厘米。（B）对 5 月龄、(7-,) 月龄以及 9 月龄的 (tert ^{+/+}) 和 (tert ^{-1-}) 斑马鱼肿瘤大小进行定量分析（((n ≥7)) 单因素方差分析）。（C）单个斑马鱼（((n=6) 和 (n=7)）肿瘤大小随时间的演变情况。（D）通过三个时间点的线性回归计算肿瘤大小演变的斜率（((n ≥6))；非配对t检验）。（E）较大肿瘤与 (tert ^{-1-}) 斑马鱼的致死率相关。存活至 9 月龄的斑马鱼（实线：存活组）和 7 月龄后死亡的斑马鱼（虚线：非存活组）的肿瘤大小演变情况。统计学比较 7 月龄时 (tert ^{-1-}) 存活组与 (tert ^{-1-}) 死亡斑马鱼（((n ≥7)；非配对t检验）。（F-H）端粒酶缺乏的斑马鱼中黑色素瘤发生消退。（F）3 月龄和 9 月龄的 (tert ^{+/+}) 和 (tert ^{-1-}) 斑马鱼出现肉眼可见肿瘤。（G）对 3 月龄和 9 月龄的 (tert ^{+/+}) 和 (tert ^{-1-}) 斑马鱼黑色素瘤进行组织病理学分析。肿瘤以黑色箭头和虚线标注。高倍镜下可见黑色素瘤的浸润特征（黑色箭头），伴随明显的浸润、破坏和替代轴下肌（白色箭头）。上方比例尺：500 微米，下方比例尺：200 微米。（H）黑色素瘤侵袭性定量分析：（1）非侵袭性，（2）轻度侵袭性，（3）侵袭性（((n ≥5)；单因素方差分析）。误差线代表±均值标准误；每个点代表单个肿瘤；* (p ≤0.05) (^{*} p ≤0.01)、(^{* *} p leq) 0.001 以及 (cdots p ≤0,0001) 1.ns，无统计学意义；a.u.，任意单位。

端粒酶在黑色素瘤进展晚期被重新激活

鉴于端粒酶缺乏会导致黑色素瘤晚期进展异常，我们旨在确定(tert ^{+/+})斑马鱼的肿瘤中是否会重新激活端粒酶。我们通过端粒重复扩增方案（TRAP）检测了9月龄斑马鱼的端粒酶活性，结果确实在(tert ^{+/+})肿瘤中检测到了端粒酶活性，而正如预期的那样，(tert ^{-1-})肿瘤中未检测到（图3A）。由此可见，端粒酶仅在肿瘤形成并肉眼可见后，才会在黑色素瘤细胞中重新激活。我们接下来采用末端限制性片段分析（TRF）检测了7月龄斑马鱼肿瘤的端粒长度（图3B、3C）。我们发现，(tert ^{-1-})肿瘤的端粒较其配对的皮肤对照更短，而(tert ^{+/+})肿瘤的平均端粒长度与皮肤相近（图3B、3C）。与之相符的是，(tert ^{-1-})肿瘤在端粒处的DNA损伤灶水平（图3D、3E）高于早期肿瘤（图1E、1F）。值得注意的是，即使缺乏端粒酶，(tert ^{-1-})斑马鱼在9月龄时仍出现了肿瘤。为验证这些肿瘤我们将ALT开发为端粒维持机制（TMM）后，对C环的存在进行了检测。令人意外的是，在(tert ^{+/+})和(tert ^{-1-})这两种肿瘤中，均未通过F29 DNA聚合酶扩增出C环（图3F和3G），这表明mitfa:HRAS肿瘤在进展后期不会激活端粒替代延长机制（ALT）。综合这些结果，正如其他模型所预期的那样，在端粒酶阳性个体的黑色素瘤进展过程中，端粒酶确实会被表达。不过，我们重点指出，端粒酶激活是肿瘤发生中的晚期事件，且发生于端粒缩短以及端粒处DNA损伤增加之时。

有趣的是，(tert ^{+/+})和(tert ^{-1-})这两种肿瘤均表现出低突变负荷（图S4A），这与人类皮肤黑色素瘤的特征——高突变数量形成了鲜明对比。我们的研究结果与此前的研究一致，后者发现在无紫外线照射的情况下，(mitfa:BRAF ^{vee 600 E})：(tp53)和(mitfa:NRAS ^{Q 61 K})斑马鱼黑色素瘤模型也存在类似的低突变负荷。令人意外的是，端粒酶的缺失并未改变黑色素瘤的突变特征，仅使(tert ^{-1-})肿瘤的错义突变整体水平降低（图S4A）。此外，我们未在(tert ^{+/+})和(tert ^{-1-})肿瘤中检测到任何突变模式。针对端粒生物学和/或黑色素瘤形成相关的关键特异性基因，我们发现其突变多为同义突变（图S4B），这类突变不太可能影响蛋白质功能。我们对tert基因启动子进行检测，发现了ETS结合位点（GGAA/T）和一个E盒（增强子盒），这些位点在野生型鱼的皮肤中就已存在，而在肿瘤中未发现额外的突变（图S4C）。这些结果表明，端粒酶的重新激活并不依赖于tert基因启动子中从头产生的ETS结合位点。

图3. 端粒酶在晚期黑色素瘤中被重新激活，其缺失会导致端粒缩短。(A–D) 9个月龄斑马鱼的肿瘤中存在端粒酶活性，且(in tert ^{-1-})肿瘤出现端粒缩短。(A) 通过端粒重复序列扩增法（TRAP）评估9个月龄斑马鱼肿瘤样本中的端粒酶活性（分别对应((n=3)和(tert ^{-1-})斑马鱼）。(B) 对9个月龄斑马鱼肿瘤（T）和皮肤（S）组织提取的基因组DNA进行Southern印迹的端粒限制性片段（TRF）分析（黄色柱形代表平均端粒长度），(C) 平均端粒长度的定量分析及(D) 端粒限制性片段的光密度分析（((n ≥2))；单因素方差分析）。(E) (tert ^{+/+})和(tert ^{-1-})斑马鱼9个月龄肿瘤细胞的gH2Ax/端粒G重复序列免疫荧光原位杂交（FISH）图像。白色箭头指示肿瘤细胞中的端粒功能异常诱导灶（TIFs）。比例尺：6毫米。(F) (B)中含≥5个端粒功能异常诱导灶的细胞百分比（n=2；非配对t检验）。(G和H) (tert ^{-1-})斑马鱼晚期黑色素瘤不采用端粒替代延长机制（ALT）作为端粒维持机制（TMM）。(G) (tert ^{+/+})和(tert ^{-1-})斑马鱼3个月龄肿瘤样本的C-环检测。HeLa细胞和U2OS细胞提取物分别作为阴性和阳性对照。(H) C-环信号的定量分析（((n ≥7))；单因素方差分析）。误差线代表均值标准误（±SEM）；每个点代表单个肿瘤；*分别对应(^{*} p ≤0.05)、(^{*} rho ≤0.01)和(^{* * *} p ≤0.0001)。ns，无显著性差异。

tert/肿瘤生长下降的肿瘤自主原因

我们表明端粒酶的缺乏导致端粒缩短和晚期黑色素瘤进展中的生长限制。为了了解tert/肿瘤抑制生长背后的机制，我们使用早期（3月龄；图S5A）和晚期（9月龄；图4A）黑色素瘤肿瘤样本，通过RNA测序（RNA-seq）比较了(tert ^{+/+})与(tert ^{-1-})肿瘤的表达谱。基因集富集分析（GSEA）显示，9月龄鱼类(tert ^{-1-})肿瘤中的增殖途径下调，而细胞凋亡上调（图4B）。我们试图使用免疫荧光来确认这些结果。我们观察到(tert ^{-1-})黑色素瘤后期DNA损伤增加（(( gamma H 2 A x)，(p=)0.0054；图4C）。一致地，我们观察到晚期(tert ^{-1-})黑色素瘤的细胞增殖率较低（增殖细胞核抗原或PCNA，(p<0.0001)图4D），而凋亡水平较高（切割的caspase-3，(p=0.005)图4E）。相比之下，我们发现这些标记在肿瘤中没有差异数据来源于3个月大的斑马鱼（图S5C-S5E）。尽管如此，基因集富集分析（GSEA）显示，即便在早期的(tert ^{-1-})肿瘤中，也出现了细胞增殖减少和细胞凋亡增加的初步特征（图S5B）。研究结果表明，端粒酶的缺失会同时影响细胞周期进程与细胞存活。这一发现可以解释(tert ^{+/+})和(tert ^{-1-})斑马鱼在肿瘤生长方面存在的差异肿瘤发生的后期阶段。此外，我们的表达谱还显示，与黑素细胞分化相关的基因表达有所增加，这表明黑色素瘤细胞可能表现出向黑素细胞逆向分化的倾向。与此一致的是，黑色素瘤细胞的黑素细胞分化此前已被确定为主要的表达特征之一，我们的数据表明，晚期(tert ^{-1-})黑色素瘤的生长限制包括肿瘤自主效应，通过减少细胞增殖、增加细胞凋亡和黑素细胞分化。有趣的是，在以前的一项研究中观察到类似的GSEA模式，该研究侧重于小鼠端粒酶的非规范功能，包括E2F靶标、氧化磷酸化和mTOR途径。这表明端粒酶的非规范作用是可能也参与了我们的模型。

图4. 端粒酶缺乏会导致增殖能力降低，并使细胞凋亡、炎症及黑素细胞分化程度升高。(A)基于9个月龄鱼类肿瘤的非靶向转录组学数据的主成分分析（PCA）。(B) 与(tert ^{+/+})相比，(tert ^{-1-})鱼类晚期黑色素瘤的基因集富集分析（GSEA）特征，突出显示炎症通路、衰老和黑素细胞分化。(C–E) (tert ^{+/+})和(tert ^{-1-})肿瘤的代表性免疫荧光图像及相应定量分析。比例尺：20毫米。(C) 9个月龄鱼类肿瘤中gH2AX标记的DNA损伤（((n ≥4)；未配对t检验）。(D) PCNA标记的增殖情况。(E) 裂解半胱天冬酶-3免疫荧光标记的凋亡情况。误差棒代表±标准误（SEM）；每个点代表单个肿瘤；(n ≥4) … (^{*} p ≤0.05)、(^{*} p ≤0.01)以及(^{* * *} p ≤0.0001)

(tert ^{-1-})肿瘤生长下降的Non-tumor-autonomous原因

GSEA还揭示了免疫系统上调是晚期(tert ^{-1-})黑色素瘤的标志（图4B）。有趣的是，(tert ^{-1-})晚期GSEA上调的炎症途径之一是同种异体移植排斥（图4B和图5A）。与免疫系统改变一致的基因表达谱已经存在于早期(tert ^{-1-})肿瘤中，尽管在该时间点受影响的第四大细胞网络中排名第四（图S5B）。此外，对9个月大的鱼（图5B和图5C）肿瘤的基因本体（GO）富集分析强化了免疫系统可能在晚期(tert ^{-1-})黑色素瘤中发挥重要作用的观点。为了测试(tert ^{-1-})肿瘤是否更具免疫原性，我们比较了早期和晚期肿瘤黑色素瘤中的免疫浸润水平。我们对免疫细胞进行了免疫荧光染色，该分析显示晚期(tert ^{-1-})肿瘤（L-质蛋白，(p=0.0310)图5D）有稳健的肿瘤浸润，尽管在早期(tert ^{-1-})肿瘤中可以检测到一些浸润（((p=)0.0493；图S5F）。我们的结果表明(tert ^{-1-})黑色素瘤比(tert ^{+/+})肿瘤更具免疫原性。我们的数据还表明免疫反应可能在限制(tert ^{-1-})黑色素瘤生长的后期发挥作用。一致的是，MeLiM小型猪的回归黑色素瘤也被证明是伴随受到强大的免疫反应的影响。

为了测试免疫系统可以抑制(tert ^{-1-})黑色素瘤生长的想法，我们将来自9个月大肿瘤的黑色素瘤细胞移植到免疫受损蛋白激酶DNA激活催化亚基（((prkdc ^{-1-} ))）突变鱼中。这些鱼缺乏DNApk，缺乏成熟的B和T细胞。我们评估了移植后1到2个月之间的肿瘤生长。与以前的数据一致，在此期间(tert ^{+/+})肿瘤的大小增加（图5E）。引人注目的是，尽管生长更受抑制，(tert ^{-1-})肿瘤在移植到免疫受损鱼中时也会增加大小（(p=0.1312)图5E和5F）。为了表明肿瘤大小的增加是由于细胞分裂而不是简单的细胞扩增，我们通过免疫荧光测量细胞增殖。事实上，(tert ^{+/+})和(tert ^{-1-})肿瘤之间的细胞增殖率相似（(p=0.2872)图5G），表明(tert ^{-1-})肿瘤细胞能够持续细胞增殖。不幸的是，由于高死亡率，我们无法观察到注射后2个月以上的肿瘤生长。最后，为了测试移植的(tert ^{-1-})肿瘤是否是激活TMM的细胞的选择，我们测量了C圆来评估ALT激活。与(tert ^{-1-})鱼的原始肿瘤类似，我们没有在移植的肿瘤中检测到任何ALT的迹象（(p>0.9999)与HeLa相比；图S6A和S6B）。总而言之，我们的结果表明，即使(tert ^{-1-})肿瘤在(tert ^{-1-})鱼中停滞甚至倒退，但当移植到免疫受损的环境中时，它们可以增殖并在尺寸上生长。因此，(tert ^{-1-})肿瘤不仅更具免疫原性，而且它们还受到机体适应性免疫系统的抑制，类似于通过CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞在人类中观察到的情况。

图5. 免疫系统抑制端粒酶缺陷型黑色素瘤的生长 端粒酶缺陷型肿瘤具有强免疫原性。（A）同种异体移植排斥富集图。（B）针对(tert ^{-1-})斑马鱼晚期黑色素瘤上调基因与(tert ^{+1+})斑马鱼相比的基因本体论（GO）富集分析（C）火山图的差异表达基因的晚期黑色素瘤的(tert ^{-1-})鱼与(tert ^{+/+})相比，突出了基因包括在血白球迁移途径从GO分析。（d）晚期黑色素瘤免疫细胞浸润（L-质蛋白）的免疫荧光图像和定量。晚期(tert ^{-1-})黑色素瘤能够在免疫受损的鱼类中增殖和生长（((n ≥4))；未配对t测试）。比例尺：20毫米。（e）注射后1个月和2个月，免疫缺陷斑马鱼（((prkdc ^{-1-} ))）与来自9个月大斑马鱼的原发性黑色素瘤细胞移植的图像。比例尺：0.5厘米。（F）通过两个时间点（1和2 mpi）的线性回归计算的肿瘤面积的进展斜率（((n ≥4)；未配对t检验）。（g）使用PCNA免疫荧光定量的肿瘤细胞的细胞增殖（((n ≥4)；不成对t检验）。比例尺：20毫米。我们认为黑色素瘤可以在没有端粒酶激活的情况下启动和发展。然而，一旦端粒变得非常短，癌细胞就必须激活端粒酶来维持后期的增殖（a）。如果他们做不到这一点，肿瘤生长就会停滞，导致肿瘤消退（b）。误差条表示±SEM；每个点表示单个肿瘤；*(^{*} p ≤0.05). ns，不显著。

讨论

高频率激活TPM的识别几种人类癌症，包括皮肤黑色素瘤，强调端粒保护和TMM在肿瘤发生中的作用。以前的研究提供了证据，表明TPM可能作为癌症发生的早期步骤发生。这一事件可能会交换意见，这是一个有利的进化步骤，使细胞不朽于早期癌症前体。然而，TMM对早期肿瘤发生的绝对要求仍不清楚。

在我们目前的研究中，两个已建立的斑马鱼黑色素瘤模型（HRAS和BRAF）中端粒酶的缺失导致与WT对照组相同的肿瘤发病率。此外，早期(tert ^{-1-})肿瘤显示出与(tert ^{+/+})相似的侵袭性水平和肿瘤大小。因此，与我们最初的预期相反，端粒酶对于斑马鱼黑色素瘤的起始和早期进展并不是必需的。考虑到晚期telomerase-deficient小鼠((G5 TerC^{-/-}))）对皮肤肿瘤有抵抗力，这些结果也令人惊讶。这些模型之间的潜在差异可能在于G5(Terc ^{-1-})老鼠从出生开始端粒就相当短，因此，(G5 TerC^{-1-})癌前细胞会试图用能够限制细胞增殖的短端粒增殖。相比之下，(tert ^{-1-})斑马鱼在发育过程中拥有正常的端粒长度，差异只在成年鱼中可见，因为它们是(tert ^{+1-})交叉的结果。事实上，我们无法在(tert ^{+/+})或(tert ^{-1-}) 鱼。出现这种情况的原因可能是，在此阶段，与皮肤对照组相比，黑色素瘤尚未进行足够的细胞分裂，平均端粒长度未出现明显缩短。或者，在mitfa:HRAS模型中，黑色素瘤的起始可能并非单一来源，从而形成多个端粒长度不同的克隆。

与早期(tert ^{-1-})黑色素瘤类似，我们在(tert ^{+/+})肿瘤中既未观察到端粒酶活性，也未发现明显的端粒缩短。然而，在早期(tert ^{-1-})肿瘤中，我们已观察到端粒处的DNA损伤有小幅增加，这表明至少有一小部分(tert ^{+/+})黑色素瘤细胞在早期阶段就激活了端粒酶，但活性处于可检测水平以下。这一发现与在(tert ^{+/+})或(tert ^{-1-})鱼中观察到的相似肿瘤发生率相符，表明关键的端粒缩短无法在黑色素瘤形成的早期阶段抑制肿瘤发生。该结果与以往将端粒维持机制（TPMs）与肿瘤发生早期事件相关联的发现不同。然而，研究表明，尽管携带端粒维持机制，人类黑色素瘤细胞仍会以与其他原代细胞相似的动力学缩短端粒长度，且端粒酶上调仅在多次细胞分裂后发生，同时伴随临界缩短端粒的积累。 因此，即便端粒维持机制可能出现在肿瘤发生的早期阶段，癌前细胞中的端粒长度或许足以支持早期细胞分裂，而端粒酶的激活和端粒延长则是维持肿瘤持续生长所需的后期事件。与这一观点一致，Viceconte等人鉴定出一组具有侵袭性的人类黑色素瘤转移灶，既未表现出端粒酶活性，也未出现端粒替代延长机制（ALT），将其归为端粒维持机制阴性（TMMs）。 我们的研究似乎复现了这些人类黑色素瘤的相关发现，从而为研究无法激活端粒维持机制的癌症提供了及时的动物模型。

与早期黑色素瘤不同，我们观察到端粒酶在晚期才被激活，而其缺失会限制肿瘤生长，进而导致肿瘤消退。这些结果再次证实了端粒维持机制（TMM）在肿瘤发生过程中的必要性，尽管其作用阶段出现在癌症进展的后期，这一点出乎意料。尽管如此，斑马鱼体内的黑色素瘤仍会导致其死亡，即便在不存在端粒维持机制的情况下也是如此。有趣的是，(tert ^{+/+}) 斑马鱼的肿瘤大小与死亡率并无关联，而 (tert ^{-1-}) 斑马鱼中更大的肿瘤则更有可能致命。虽然我们发现 (tert ^{-1-}) 斑马鱼并不会仅因早衰（这是 (tert ^{-1-}) 突变体的一个特征）而更频繁地死亡，但我们认为，持续生长的 tert 肿瘤与 tert 斑马鱼自身的体质脆弱性共同作用，是导致其死亡率上升的原因。Ackermann 等人的研究表明，在研究的神经母细胞瘤（一种交感神经系统的儿童肿瘤）中，有一半同样不具备端粒维持机制。缺乏端粒维持机制的神经母细胞瘤也与肿瘤自发消退相关，且后续预后更好。

人类黑色素瘤自发消退的病例也常以意想不到的比例出现，占所有黑色素瘤病例的10%至35%。 然而，目前人类黑色素瘤消退的机制尚不明确。我们提出，端粒缩短可能通过对肿瘤生长形成双重屏障来解释黑色素瘤的消退：（1）一种“经典”的肿瘤自主机制，即短端粒会抑制细胞分裂，同时诱导细胞凋亡和黑素细胞分化。与此一致，其他模型中的黑色素瘤消退也伴随着细胞周期停滞、细胞凋亡和黑素细胞分化，尽管端粒缩短未被评估为潜在原因。（2）第二种未被预料到的障碍，由免疫系统施加的非肿瘤自主机制构成。(tert ^{-1-}) 肿瘤的免疫原性更强，拥有更多的免疫细胞浸润。一致地，(tert ^{-1-}) 肿瘤的基因集富集分析（GSEA）突出显示了免疫应答通路的上调，包括同种异体移植排斥等术语。最终，(tert ^{-1-}) 肿瘤一旦被移植到缺乏B细胞和T细胞的免疫缺陷鱼体内，就能够增殖和生长。此前在梅利姆小型猪和人类的消退性黑色素瘤中已观察到这第二种障碍，尤其是通过CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞实现的。 与我们的数据一致，此前有研究指出携带TERT突变的人类癌症具有免疫原性，从而在免疫治疗后生存率更高。此外，对免疫检查点治疗敏感的黑色素瘤，其端粒维持相关基因的表达水平更低。相反，在转移性肾细胞癌中，导致端粒酶表达的TPM与免疫治疗耐药相关，且被提议作为免疫治疗预后的负面预测因子。 综上，这些研究表明端粒酶表达可保护肿瘤免受免疫系统的攻击。

总之，我们的数据表明，端粒酶并非斑马鱼黑色素瘤发生启动和早期进展所必需（图5Ha）。然而，一旦端粒达到临界缩短阈值，细胞会重新激活端粒酶以维持细胞增殖和肿瘤生长。若细胞无法完成这一过程，端粒将持续缩短（图5Hb），肿瘤的生长会停滞甚至消退。这一现象由两种机制共同导致：一是肿瘤自主机制（细胞周期停滞、细胞凋亡及黑素细胞分化），二是非肿瘤自主机制（免疫反应）。我们的研究揭示了免疫系统在端粒酶阴性肿瘤形成过程中此前未被重视的作用。研究发现，尽管肿瘤在发生启动和早期进展阶段明显不依赖端粒维持机制（TMM），但黑色素瘤生长的后期阶段仍受免疫功能的影响。端粒严重缩短的人类肿瘤中，免疫激活是否能增强抑制肿瘤生长的能力，仍有待进一步验证。

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