标题：Extracellular mechanical forces drive endocardial cell volume decrease during zebrafish cardiac valve morphogenesis

期刊：Developmental Cell 

原文链接： https://doi.org/10.1016/j.devcel.2022.02.011

研究亮点

l 斑马鱼心脏发育依赖于细胞体积减小所介导的组织聚集

l 组织汇聚伴随着细胞取向的改变以及肌动球蛋白网络的激活

l 机械力和机械敏感性通道触发细胞体积减小

l 细胞外基质成分透明质酸调控细胞体积变化

摘要

器官形态发生涉及组织特性的动态变化，同时细胞会通过机械敏感通路适应其机械环境。机械信号在形态发生过程中如何影响细胞行为仍不明确。本研究以心脏瓣膜发育的斑马鱼房室管（AVC）形成为研究对象。研究发现，房室管形成于组织汇聚区域，该区域伴随肌动球蛋白网络激活增强以及细胞取向改变。研究证实，组织汇聚的发生是由机械力以及机械敏感通道TRPP2/TRPV4触发细胞体积减小所导致。此外，研究发现细胞外基质成分透明质酸可调控细胞体积变化。综合来看，研究数据表明多种力敏感信号通路共同作用以调节细胞体积。研究得出结论，细胞体积减小是心脏血管形态发生过程中由机械转导激活的关键细胞特征。该研究进一步揭示了机械力和细胞外基质如何影响发育器官中的组织重塑。

图文摘要

引言

器官发生通过遗传和机械因素的相互作用在空间和时间上受到调控（Mammoto 和 Ingber，2010；Sivakumar 和 Kurpios，2018）。机械信号源自多种来源，例如细胞外基质（ECM）、细胞和组织的机械活动（Charras 和 Sahai，2014；Hannezo 和 Heisenberg，2019；Martino 等人，2018；Petridou 等人，2017；Villedieu 等人，2020；Xiong 等人，2020）（Boselli 等人，2015）。细胞是所有组织的功能单位，能够感知并对力做出反应。这驱动了组织重塑所必需的协调细胞行为（Heisenberg 和 Bellaïche，2013；Lecuit 等人，2011）。然而，机械力如何影响细胞行为和组织形态仍知之甚少。

在调控形态发生过程的不同细胞机制中（Heisenberg 和 Bellaı¨che, 2013；Lecuit 等人, 2011；Mao 和 Baum, 2015），细胞体积变化是组织形态形成的关键调节因子。在黑腹果蝇中，背侧闭合过程中，细胞体积减小驱动组织运动（Saias 等人，2015）。此外，细胞体积变化在调节类器官的管腔体积（Yang 等人，2021）以及斑马鱼的库普弗囊泡形态发生中也发挥关键作用（Dasgupta 等人，2018）。在体外研究中，细胞基质刚度等外部机械信号可触发细胞体积变化（Guo 等人，2017；Wang 等人，2020；Xie 等人，2018）。此外，细胞体积受渗透压调节、细胞骨架收缩力以及细胞生长分裂的控制（Cadart 等人，2019）。然而，在心血管系统等更广泛的组织环境中，细胞体积变化如何导致组织重塑仍不明确。

心脏在胚胎发育的早期就具备了向全身泵血的功能。心脏形成方面的缺陷，尤其是心脏瓣膜异常，可能导致先天性心脏病（林肯和尤茨伊，2011）。心跳产生的流体剪切应力和拉伸力对瓣膜形态发生至关重要（奥曼等人，2007；巴特曼等人，2004；霍夫等人，2003；卡洛吉鲁等人，2014；韦尔莫等人，2009年；Fukui等人，2021年）。心脏的内层组织对应心内膜，由被称为心内膜细胞（EdCs）的特化内皮细胞构成。与内皮细胞类似，心内膜细胞是机械力的强效机械传感器和机械转导因子（Campinho等人，2020年；Haack和Abdelilah-Seyfried，2016年）。膜结合的牵张敏感性通道Piezo1、TRPP2和TRPV4在心脏瓣膜发育过程中对机械力感知至关重要（Duchemin等人，2019a年；Faucherre等人，2020年；Heckel等人，2015年）。此外，心内膜细胞与由心肌细胞和心内膜细胞共同产生的细胞外基质（即心胶）的相互作用，对心脏形态发生至关重要（Walsh和Stainier，2001年；Steed等人，2016a年、2016b年；Derrick等人，2022年；Derrick和No€el，2021年；Grassini等人，2018年）。心胶的主要成分之一是透明质酸（HA），它是一种带负电荷的糖胺聚糖（GAG）。透明质酸具有产生渗透压的特性，因此能吸引水分，导致房室管（AVC）处的心胶局部肿胀（Camenisch等人，2000年；Cowman等人，2015年；Lockhart等人，2011年；Schroeder等人，2003年；Tong等人，2014年）。然而，心跳产生的力的作用，以及细胞外基质的生物物理特性在原始心管形成过程中对心内膜细胞形态调控的影响，目前尚不完全明确。

在斑马鱼中，房室管处单层心内膜薄片内局部细胞簇的形成标志着心脏瓣膜形成的开始（Pestel 等人，2016；Steed 等人，2016a、2016b）。在组织层面，这一事件之前发生了一次由组织向房室管汇聚所促进的对称性破缺事件（Boselli 等人，2017）。本研究利用这一形态发生模型，探究了心内膜组织汇聚过程中的早期细胞特征，研究时间从斑马鱼心脏呈管状结构的28小时胚胎期开始，直至心脏发生环化且形成两个腔室（心房、心室）的48小时胚胎期。研究发现，组织汇聚与指向房室管的整体内皮细胞方向改变相关，同时细胞聚集事件与房室管细胞的局部体积减小相关。在分子层面，研究表明细胞体积减小依赖于机械敏感性瞬时受体电位通道（TRPP2和TRPV4）以及细胞外基质成分透明质酸。这一过程可能是机械力塑造循环系统的一种普遍机制。

结果

房室结发育过程中心内膜细胞的极化

我们利用斑马鱼进行高精度活体成像，在细胞分辨率下分析了心内膜的形态发生模式。轴向细胞极性是内皮组织内细胞运动方向与协调性的公认表征指标（Franco 等人，2015；Kwon 等人，2016；Pouthas 等人，2008）。基于这一特性，我们在体内研究了房室结发育过程中 EdC 取向的动态变化，以揭示房室结形成背后的整体形态发生特征。我们使用了标记高尔基体和细胞核的斑马鱼转基因品系 Tg(fli1:nEGFP)；Tg(fli1a:B4GALT1-mCherry)（Kwon 等人，2016），以此来表征心内膜的整体组织模式。我们在受精后 28 至 36 小时内每 2 小时分析一次细胞核-高尔基体轴的取向，在受精后48小时（hpf）追踪内皮细胞（EdC）的方向变化（图1A和图S1A；视频S1）。我们将细胞分为三类：（1）核-高尔基体轴朝向外流方向，（2）核-高尔基体轴朝向流入方向，（3）无明确的核-高尔基体轴方向（图1B和图S1B）。为了进行统计分析，我们量化了心室（图1C）和心房中核-高尔基体轴随时间的变化（图1C'）。在心跳开始前（受精后22小时），48.6%±5.7%的细胞的核-高尔基体轴朝向外流方向（(= 130 cells)、(N=3)胚胎）（图S1C）。血流启动后，我们发现在受精后28小时，两个腔室中大多数细胞的核-高尔基体轴都朝向外流方向（图1C和图1C'）。尽管心房内的核-高尔基体轴模式在受精后28至48小时内保持不变（图1C'），但心室细胞在受精后28至48小时之间逐渐逆转其核-高尔基体轴方向，指向房室管（AVC）（图1C）。这些结果表明，组织汇聚伴随着核-高尔基体轴朝向房室管的整体定向，这是启动心脏瓣膜形成所需内皮细胞集体运动的基础（图1F）。

我们接下来评估了核-高尔基体轴的取向变化是否与组织运动相关。为此，我们利用了品系Tg(fli1a:gal4FF; UAS:Kaede)（Herwig等人，2011），在28小时胚胎形成期（hpf）时，该品系中心房和心室的细胞会从绿色光转化为红色。这一特性使我们能够分析组织汇聚的时间进程（图S1D）（Chow等人，2018；Steed等人，2016a，2016b）。房室管（AVC）的长度在28、36和48小时胚胎形成期之间逐渐缩短（图S1E）。这一结果表明，细胞取向的变化与组织向房室管区域的运动同步发生。

图1. 30至48小时pf期间，房室结处心室EdC核-高尔基体轴逆转与F-肌动蛋白重塑同时发生。(A) 来自 fli1a:B4GALT1-mCherry；fli1:nEGFP 胚胎的 28 至 48 小时受精后（hpf）心脏的最大投影图，突出显示EdC细胞核至高尔基体的轴取向。白色虚线勾勒出心内膜轮廓。比例尺为30微米（mm）。(B) 细胞取向分类示意图。(C和C') 对28至48 hpf胚胎中细胞取向百分比的定量分析：28 hpf对应((N=5)胚胎；30 hpf对应(N=5)胚胎；32 hpf对应(N=4)胚胎；34 hpf对应(N=4)胚胎和(N=5)胚胎；36 hpf的样本量N=5个胚胎；48 hpf的样本量N=7个胚胎；误差棒代表均值标准误（SEM）。该定量分析分别展示了心室(C)和心房(C')中的细胞取向百分比。(D) fli1a:LifeAct-EGFP 心脏的最大投影图，显示房室瓣（AVC）中纤维状肌动蛋白（F-actin）荧光强度增强。V=心室，At=心房。比例尺为30微米（mm）。(D') 基于(D)中的数据对F-actin荧光强度进行的定量分析。A.U=任意单位。误差棒代表标准差。采用双尾曼-惠特尼检验。(E) 房室瓣（AVC）中用鬼笔环肽和磷酸化肌球蛋白轻链（MLC）抗体进行的单Z平面免疫荧光成像。心肌中F-actin和磷酸化MLC信号（蓝色箭头）。房室瓣（AVC）中信号随时间从30、36到48 hpf逐渐增强（绿色箭头）。比例尺为20微米（mm）。(F) 房室瓣（AVC）发育背后的整体细胞形态发生特征示意图。

房室管发育过程中心内膜细胞的体积

考虑到房室管形态发生初期内皮细胞（EdC）取向的整体变化，我们推断位于汇聚区域的细胞必须在房室管（AVC）内发生特异性的形态改变。因此，我们假设局部细胞体积变化可能参与了房室管形态发生的过程。为验证这一假设，我们分析了内皮细胞的体积变化。我们首先分别量化了细胞面积和细胞高度（顶基方向），以比较心房、房室管和心室三个区域的细胞大小，进而计算平均细胞体积。为测量细胞顶端表面的面积，我们使用了标记血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）的转基因斑马鱼品系（TgBAC(ve-cad:ve-cad-TS)）（Lagendijk 等人，2017）（图2A和图S2A）。我们通过将细胞顶端表面积乘以细胞厚度来估算细胞大小（图2B和图S2B）。基于这些计算，房室管细胞的大小为(412.2 pm 21.6 mu m^{3}) ((n=41 cells ))，而位于心房和心室的细胞大小分别为(1,348 pm 67.9 mu m^{3}) (n=48 cells))和933.1± (47.8 mu m^{3})（(= 34 cells))）（图2C和图S2E）。我们得出结论，细胞大小随心脏不同区域而变化，房室管区域的细胞更小。

为了克服与3D手动分割相关的困难，我们开发了一套基于深度学习的稳健且定量的流程。在许多情况下，细胞核体积与细胞体积直接成比例（Cantwell和Nurse，2019；Greiner等人，2015；Huber和Gerace，2007）。因此，我们重点提取细胞核体积——在3D场景下，细胞核体积比细胞边界更容易分割，并获得了对基于细胞核分割得到的细胞体积（图S2C和S2D）。定量数据通过深度学习训练的分类器生成。为验证该方法的有效性，我们证实了在本研究体系中细胞核体积与细胞体积存在相关性（图2D）。通过分析单个细胞的细胞表面积及细胞核体积，进一步验证了这一结论（图2E）。

我们接下来评估了组织汇聚过程中细胞体积的时间变化。在28小时胚胎期，房室管内的细胞大小与位于内部的细胞并无差异心室，而它们从受精后36小时到48小时开始变小（图2F和图S2E）。我们发现，细胞体积变化与将形成房室结的细胞中肌动蛋白丝（F-肌动蛋白）和磷酸化肌球蛋白轻链（p-MLC）的富集相关，这表明这些细胞在房室结中表现出活跃的收缩性（图1D、图1E、图S1F和图S1G；视频S2）。总体而言，这些结果表明，房室结的内皮细胞随着肌动蛋白皮层的重塑发生显著的细胞体积减小，并且提示内皮细胞的收缩性和细胞体积减小参与了心内膜组织的重塑过程。

图2. 内皮细胞团大小的三维分析显示房室结区域的细胞体积显著减小。(A) ve-cad:ve-cadTS；fli1a:dsRed 心脏的最大投影。V 代表心室，At 代表心房。比例尺，30 毫米。(B) 描绘用于计算细胞体积的方法示意图。A = 细胞面积，(A_{N}) = 细胞核面积，(A_{C}) = 细胞质面积，H = 细胞高度，(H_{N}) = 含细胞核区域的细胞高度，(H_{0}) = 细胞其他区域的高度。我们估算，若细胞呈锥形，其体积会被高估 26%。(C) 对位于心房 ((n =41 cells))、房室结 ((n =48 cells)) 和心室 ((n=34 cells )) 的内皮细胞体积进行定量分析。采用曼 - 惠特尼检验。(D) 细胞核体积与细胞体积的比较。平均细胞体积（在 C 中计算）与通过深度学习定量的平均细胞核体积之间的相关性（((R^{2}=0.9979))）。误差棒代表两个轴的均值标准误。(E) 单个细胞顶端表面积与单个细胞核体积 ((Spearman coefficient =0.7781 )) 的相关性。每个点代表一个同时分析了顶端表面积和细胞核体积的细胞。(F) 对 28、36 和 48 小时胚胎阶段的细胞核体积进行定量分析。上图为 fli1:nEGFP 静止心脏的最大投影，蓝色虚线勾勒出心内膜，下图为同一胚胎心脏的细胞核体积热图。采用非配对双尾 t 检验。（(N=5) 胚胎，28 小时胚胎阶段；(N=5) 胚胎，36 小时胚胎阶段；(N=5) 胚胎，48 小时胚胎阶段。）

细胞体积减小与细胞增殖无关

原始心管的三个区域（心房、房室结和心室）之间不同的细胞增殖速率或细胞周期进程差异，可能会导致 EdC 簇的形成。因此，我们评估了细胞增殖是否与心脏腔室特异性细胞体积变化相关。为此，我们通过使用羟基脲和阿非迪霉素消除细胞分裂，诱导细胞在 S 期停滞（图 3A）。胚胎从受精后30小时至48小时接受处理，未出现明显的表型缺陷（图S3A和图S3A'）。抗磷酸化组蛋白H3免疫标记证实细胞增殖抑制处理有效（图S3B和图S3B'）。当细胞增殖被抑制时，内胚层细胞数量翻倍，而受精后30至48小时内细胞总数保持不变（图3A）。心内膜组织及心脏形态未发生改变（图3B、图S3C和图S3C'），且我们未检测到心脏三个区域间的细胞大小比例存在差异（图3C），也未发现对照组与处理组胚胎之间的平均核-核距离（图S3D）。重要的是，在无增殖的情况下，处理组胚胎房室间的细胞显著小于心室中的细胞（图3C）。因此，细胞体积减小与EdC增殖无关。此外，48小时胚胎阶段的核-高尔基体轴模式在处理组和对照组胚胎中相似（图3D和3D'）。总体而言，组织汇聚独立于细胞增殖发生。

图3. 房室管细胞体积减小与细胞增殖无关。(A) 对照组胚胎（用0.5%二甲基亚砜处理）和从受精后30小时开始用羟基脲和阿非迪霉素处理的胚胎中的EdC计数定量分析。（对照组：(N=5) 胚胎，26小时受精后；(N=5) 胚胎，28小时受精后；(N=5) 胚胎，30小时受精后；(N=4) 胚胎，34小时受精后；(N=5) 胚胎，36小时受精后；(N=7) 胚胎，48小时受精后；以及(N=10 HU+A) 胚胎）。误差线代表标准差。(B和B0) 48小时受精后对照组（二甲基亚砜）(B) 和处理组胚胎（羟基脲+阿非迪霉素）(B0) 的fli1:nEGFP最大投影图。蓝色虚线勾勒出心内膜轮廓。比例尺为50微米。(C) 对照组和处理组胚胎的细胞核体积定量分析。（(N=7) 胚胎，二甲基亚砜组n=10，羟基脲+阿非迪霉素组n=10）未配对双尾t检验。(D和D0) 48小时受精后对照组（二甲基亚砜）和处理组胚胎（羟基脲+阿非迪霉素）中心室(D) 和心房(D0) 细胞取向百分比的定量分析（((N=3) 胚胎，二甲基亚砜组；(N=4) 胚胎，羟基脲+阿非迪霉素组）。误差线代表均值标准误。

机械力调控细胞体积减小

由于机械力调控心内膜组织重塑（Steed 等人，2016a、2016b；Heckel 等人，2015；Dietrich 等人，2014），我们接下来探究了改变心脏收缩和血流对EdC大小的影响。我们首先基于沉默心脏突变体（((sin ^{-1-}))）中细胞核标记分析细胞体积变化，该突变体中肌钙蛋白T2a（tnnt2a）发生突变，心脏丧失收缩能力（Sehnert 等人，2002）（图4A和图4A'）。心脏的三个区域（心房、房室沟和心室）之间细胞体积无显著差异，房室沟细胞的体积也未比对照组更小（图4B）。与对照组相比，房室沟内的细胞数量更少（图4D），且(sih^{-1-})胚胎的房室沟中细胞核间距显著增大（图S4A）。有趣的是，(sih^{-1-})胚胎的房室沟细胞中几乎未观察到F-肌动蛋白的重塑（图S4B）。此外，位于心房的细胞呈现出细胞核-高尔基体轴的随机分布（图4F和图4F'）。这些数据与心脏无搏动时组织汇聚现象不发生的观察结果一致（Boselli 等人，2017）。据此，光转化实验显示房室管（AVC）长度异常且无心跳（图S1H和S1I）。为验证这些结果，我们通过注射低浓度的肌钙蛋白2a吗啉代寡核苷酸（MO）部分抑制心脏活动（图4A00；视频S3），此时血流速度低于对照组（图4E）。有趣的是，房室管处的细胞体积减小受到了影响（图4C），这表明即使血流动力学出现轻微下降也会改变细胞体积。不出所料，组织汇聚幅度有所降低，且房室管长度几乎保持不变（图S1H0和S1I）。综上，这些结果表明机械力是细胞体积减小的重要调控因子。

图4. 机械力与TRP通道介导房室环早期形态发生过程中心内膜细胞的体积减小((A-A^{prime prime}))) 48小时受精后（hpf）sih+/+ sih+/(A)胚胎中kdrl:nls-mCherry心脏的最大投影，(sih^{-1-}(A')))以及稀释的tnnt2a吗啉代寡核苷酸（MO）(A00)。比例尺为50毫米。蓝色虚线标记心内膜轮廓。(B) (sih^{+/+} sih^{+/-})、(sih^{-1-})和((N=8 sin ^{+/+} sin ^{+/-})胚胎中细胞核体积的定量分析，(N=12 sih^{-1-})胚胎)。采用非配对双尾t检验。(C) 对照组（假手术）与稀释的tnnt2a吗啉代寡核苷酸对照组[假手术]、(N=12)注射稀释tnnt2a吗啉代寡核苷酸的胚胎中细胞核体积的定量分析。采用非配对双尾t检验。(D) 根据(A)中的数据，统计对照组、稀释的tnnt2a (and sih^{-1-})胚胎中房室结（AVC）区域的5-乙炔基-2'-脱氧胞苷（EdC）阳性细胞数量。(E) 30小时受精后血流速度的定量分析。(F和F0) 48小时受精后，对照组（假手术）、tnnt2a ((N=3)胚胎、假手术组和(N=6)胚胎、tnnt2a吗啉代寡核苷酸胚胎中心室(F)和心房(F0)细胞取向百分比的定量分析。误差棒代表均值标准误（SEM）。(G和G0) 48小时pf时kdrl:nls-mCherry胚胎停搏心脏的trpp2、trpv4对照组（G）（包括trpp2+/+、trpv4+/+；(tmpp2) trpv4+/+；以及(trpp2 2^{+/+})、trpv4+/)及其同胞体(trpp2-1-)和(trpv4 ^{-1-})（G0）的最大投影。比例尺，50毫米。蓝色虚线勾勒心内膜轮廓。（H）trpp2和trpv4原位杂交探针在36小时胚胎期共聚焦显微图像的最大投影图。外部黑色虚线标记心肌层，内部紫色虚线标记心内膜层。（一）对trpp2、trpv4对照胚胎（包括trpp2+/+、trpv4+/+；trpp2+/、trpv4+/+；以及trpp2+/+、trpv4+//）及其(tmpp2)、trpv4同窝胚胎的细胞核体积进行定量分析。（(= 15)胚胎对应(trpp2 ^{-1-} trpv 4^{-1-})和(N=6)，n=6个对照胚胎）。采用非配对双尾t检验。（J 和 J0）量化对照组以及(trpp2 ^{-1-} trpv 4^{-1-})处理的胚胎在48小时受精后（hpf）心室（J）和心房（J0 ((N=3)）中的细胞取向百分比，对照组和(N=4)处理的胚胎，(trpp2^{-1-} trpv 4^{-1-}))。误差线代表均值标准误（SEM）。

张力敏感通道 TRPP2 与 TRPV4 调控细胞体积减小

牵张敏感性离子通道多囊蛋白2（TRPP2）和香草酸受体4（TRPV4）调控心脏瓣膜的发育（Heckel等人，2015）。有趣的是，TRPV4是一种渗透压敏感性离子通道，可调控星形胶质细胞的细胞体积（Benfenati等人，2011）。因此，我们假设TRP通道可能在房室管（AVC）形态发生过程中调节细胞体积，并对trpv4和trpp2通道的突变体进行了研究。trpp2 mRNA在胚胎中广泛分布，但在心脏的心内膜层中富集；而trpv4主要在心内膜中表达，且在房室管区域特异性富集（图4H）。(trpv4 ^{-1-})与(trpp2 ^{-1-})单突变体相比，胚胎是正常的在有对照组的情况下（图S4C和S4D），但trpv4 (^{-1-} ; trpp2)突变体（图4G和4G0）出现了异常的细胞体积减小；与对照组相比，trpv4 (^{-1-} ; trpp2 ^{-1-})（图4I）和trpp2-trpv4 MOs的房室中心（AVC）中核-核距离显著增加（图S4D）。重要的是，心率无显著差异（图S4E）。这些数据表明，Trpp2和Trpv4机械敏感性通道是细胞体积减小的重要调节因子。此外，与对照组相比，心室内皮细胞中核-高尔基体轴朝向流入方向的比例降低（图4J），而心房中核-高尔基体轴的分布未发生改变（图4J'）。这表明在缺乏TRP通道的情况下，组织汇聚过程受到影响。相应地，同时注射trpp2和trpv4吗啉代寡核苷酸的胚胎中，房室管长度出现异常（图S1H''和S1I）。这证实了TRP通道对组织汇聚至关重要。

我们接下来评估了TRP机械敏感性的潜在下游靶点。已知的血流作用力下游靶点如klf2a、klf2b、egr1或fn1b（Steed等人, 2016a, 2016b; Banjo等人, 2013）均未导致房室管（AVC）形成缺陷（图S4F-S4H）。我们重点关注了对心脏瓣膜发育至关重要的Notch信号通路（MacGrogan等人, 2018），该通路可被机械敏感通路激活（Samsa等人, 2015; Stassen等人, 2020; Vermot等人, 2009; Duchemin等人, 2019a; Paolini等人, 2021）。研究发现，notch1b突变体的房室管（AVC）中核-核距离增大（图S4I）。使用经典的Notch通路γ-分泌酶抑制剂DAPT也得到了相同结果（图S4J和S4K），尽管该处理会使心跳轻微减慢（图S4L）。与稀释的tnnt2a吗啉代寡核苷酸（MO）和trpp2-trpv4吗啉代寡核苷酸（MO）处理的胚胎相比，Notch报告基因Tg(tp1:dGFP)的活性显著降低（图S4M）。因此，Notch信号通路参与了TRPP2/TRPV4和血流下游的细胞体积减小过程。稀释的tnnt2a吗啉代寡核苷酸（MO）处理后，notch1b的mRNA表达水平降低（图S4N）。然而，notch1b的mRNA在双突变体 (trpp2 ^{-1-} trpv 4^{-1-}) 中表达正常trpp2-trpv4 吗啉代寡核苷酸（图S4O和S4P）。这些结果表明，Notch信号通路对于细胞响应外力的体积调节至关重要，但TRP通道并不调控notch1b的表达。

在渗透压驱动的细胞体积增加（即细胞肿胀）的背景下，TRPV4 与水通道蛋白相互作用以调节细胞体积（Benfenati 等人，2011；Conner 等人，2012；Iuso 和 Krizaj，2016）。水通道蛋白是被动跨膜通道，可增强膜通透性（Ibata 等人，2011；Mola 等人，2016）。值得注意的是，aqp8a.1 和 aqp1a.1 mRNA 均特异性表达于 EdC 层（图 S2F–S2H），且在 sih (-1-) 胚胎中未检测到其表达，这表明它们的表达依赖于机械力（图 S4Q）。这些数据表明，特异性定位于房室管（AVC）的细胞配备有水通道蛋白，其表达依赖于心脏功能。

透明质酸调节房室结心内膜细胞的体积变化

心脏胶状基质中含量最丰富的成分之一是糖胺聚糖透明质酸（HA）。已知糖胺聚糖的积累会产生渗透压并吸引水分（Cowman等人，2015；Lockhart等人，2011）。在体外实验中，糖胺聚糖会导致人胚肾（HEK）细胞皱缩（Joerges等人，2012）。透明质酸由透明质酸合酶基因合成，随后被分泌到细胞外基质（ECM）中。与预期一致，透明质酸合酶2（has2）在心脏中的表达始于受精后30小时（hpf），并在受精后30至48小时期间局限于房室管（AVC）（图S5A）（Patra等人，2011；Tong等人，2014）。我们利用透明质酸结合蛋白（HA-BP）研究其蛋白定位，发现该蛋白仅存在于心脏胶状基质中（图5A、图S5B）。随后，我们通过注射透明质酸酶（HAase）研究透明质酸链降解的影响（图5B）。注射透明质酸酶的胚胎在处理18小时后出现心包水肿（图S5C），但在受精后48小时时未出现心率异常（图S5E）。注射透明质酸酶的胚胎的心脏胶状基质中未检测到透明质酸，这证实了透明质酸的降解效果显著（图5C）。值得注意的是，处理后的胚胎中，心内膜细胞（EdCs）的纤维状肌动蛋白（F-actin）未发生重塑（图S5D）。与对照组相比，注射透明质酸酶的胚胎的房室管中未观察到细胞体积减小（图5E）。同样，注射透明质酸酶的胚胎的房室管细胞核间距增大（图S5F）。此外，与对照组相比，心室中细胞核-高尔基体轴朝向流入端的细胞数量减少（图5F），而心房的细胞取向未发生改变（图5F'）。此外，注射透明质酸酶的胚胎与对照组的房室管长度存在差异（图S1H'和S1J）。我们得出结论，机械敏感性和透明质酸均是房室管细胞体积减小的关键调节因子（图5G）。

图5. 位于心脏胶状基质中的透明质酸调节房室瓣心内膜细胞的体积变化。(A) 透明质酸结合蛋白（HA-BP，品红色，细胞核为绿色）在受精后30小时（30 hpf）、((N=10)胚胎、受精后36小时（36 hpf）、(N=8)胚胎以及受精后48小时（48 hpf）、((N=12)胚胎中的定位。比例尺为50微米。白色虚线勾勒出心脏轮廓。(B) 透明质酸酶（HAase）注射过程示意图。(C) 受精后36小时，对照组（注射磷酸盐缓冲液（PBS）的胚胎，((N=10 / 10))）和注射透明质酸酶的胚胎中，心肌胶内部无透明质酸结合蛋白分布（黄色箭头，((N=12 / 12))）。比例尺为30微米。黄色虚线标记心肌胶的轮廓。(D和D') 上图：受精后48小时，fli:nEGFP转基因胚胎中对照组（注射PBS）心脏（D）和注射HAase胚胎心脏（D'）的最大投影图；下图：房室结（AVC）区域放大图。比例尺为50微米。蓝色虚线勾勒出心内膜轮廓。(E) 对照组（注射PBS的胚胎，((N=8)，n=12）和注射HAase胚胎的细胞核体积定量分析。采用双尾非配对t检验。

讨论

通过活体成像技术，我们证实内皮细胞体积减小是组织汇聚和房室垫形成的关键因素，为后续瓣膜形成奠定了基础（Pestel 等人，2016；Steed 等人，2016a、2016b；Chow 等人，2022）。我们观察到，细胞体积减小与房室垫中心室细胞核至高尔基体轴的逆转以及丝状肌动蛋白的重塑同时发生。此外，我们还证实细胞体积变化与细胞增殖无关，而是由心脏功能产生的机械力、瞬时受体电位通道以及位于心胶中的透明质酸所调控。综上，我们的研究结果表明，细胞体积减小是响应瞬时受体电位通道激活的机械转导、参与心血管形态发生的重要细胞特征。我们提出，细胞体积变化可能是一种由机械力激活、用于调控组织形态的普遍细胞行为。

心脏胶的成分对于房室结的正常形成至关重要（Derrick 和 No€el，2021；Grassini 等人，2018；埃尔南德斯等人，2019）。例如，调控编码糖胺聚糖（GAG）基本构件的ugdh基因的表达，或改变透明质酸（HA）在心肌胶中的沉积，都会影响房室管（AVC）的发育（塞格特等人，2018；沃尔什和施泰尼尔，2001）。本研究发现，透明质酸（HA）可调控房室管（AVC）中内皮细胞（EdCs）的大小。糖胺聚糖（GAG）可形成渗透压（考曼等人，2015），而TRPV4通道是强效的渗透压敏感通道（霍夫曼等人，2009），其可与水通道蛋白发生物理相互作用，以响应渗透压胁迫调节细胞体积（本费纳蒂等人，2011）。值得注意的是，体积减小的细胞同样被发现携带水通道蛋白通道（aqp8a.1、aqp1a.1）。鉴于水通道蛋白可增强水的通透性（岩田等人，2011；莫拉等人，2016），TRPV4-水通道蛋白复合物可能在渗透压梯度形成后加快水的外排速率。此外，瞬时受体电位（TRP）通道开放后钙离子的胞内进入，可能促使水通道蛋白转位至质膜（康纳等人，2012）。基于此，我们提出一个模型：透明质酸（HA）的积累在内皮细胞（EdCs）与心肌胶之间形成渗透压，从而促使房室管（AVC）中出现细胞体积减小的现象（图5G）。在该模型中，瞬时受体电位（TRP）通道既参与渗透压感知，也参与切应力感知。

TRP通道是导致心脏瓣膜形成的机械转导途径中的关键参与者（Duchemin等人，2019a；Heckel等人，2015）。目前的模型表明，这些通道在AVC处感知振荡血流，随后将其转化为电化学信息，导致机械敏感基因的表达（Steed等人，2016a，2016b；Heckel等人，2015；Fukui等人，2021）。我们的结果表明，与振荡血流平行作用的额外线索可能会通过在心脏果冻中产生的渗透压的产生来影响TRP通道的活性。因此，目前尚不清楚我们系统中两种机械输入的各自贡献是什么，以及其中一种是否占主导地位。重要的是，没有流动导致比trpp2/trpv4突变体更强的表型，这表明该过程中涉及额外的机械敏感途径。当考虑系统中涉及的机械刺激的多重性时，观察到系统中有如此多不同的机械敏感通路在起作用也就不足为奇了。例如，ATP-NFat信号通路（Fukui等人，2021年；Chow等人，2022年），和Trpp2/Trpv4-Klf2a通路在瓣膜形态发生过程中在EdC中平行作用（Heckel等人，2015年；Fukui等人，2021年）。重要的是，我们发现切口信号作用于TRP通路的下游，表明这两个机械敏感通路是联系在一起的。需要做更多的工作来阐明这些通路如何相互作用以协调形态发生以响应心脏中产生的无处不在的机械力。

组织收敛背后的驱动力是什么？在组织水平，我们观察到伴随细胞体积变化的核-高尔基轴的变化。因此，AVC中EdCs的局部细胞体积减少可能会拉动周围的细胞和驱动组织收敛以及细胞聚类。然而，我们不能排除组织收敛部分是由于EdCs向AVC的主动迁移。事实上，在几项研究中，细胞外基质中HA的存在被报道为在细胞迁移的背景下至关重要（Derrick和No欧元el，2021），ECM是调节血管生成信号转换的关键（De Angelis等人，2017）。因此，两个主要场景可以解释我们的结果：向AVC的主动迁移正在发生，然后是自适应的细胞体积收缩和/或AVC处的细胞体积收缩拉动周围细胞并导致组织收敛。考虑到组织运动的小幅度，我们倾向于第二种情况，即细胞体积减少足以驱动其他物种中描述的组织运动（Saias et al.，2015）。有趣的是，尽管观察到的细胞体积减少非常稳健且特定于AVC，但沿心内膜的细胞体积存在广泛的异质性。我们认为，我们观察到的体积异质性的空间组织是随机的，代表了心内膜细胞体积的自然变异性。这种变异性可能反映了不同的细胞状态：细胞挤压、处于分裂边缘的细胞和凋亡细胞，突出了EdCs的动态行为。未来的工作将阐明这些行为是否特定于心内膜中发生的形态发生过程，与心脏发育的其他关键步骤（如小梁形成）相关（Gunawan等人，2021；Duchemin等人，2019b）或与组织生长协调相关的非特异性过程（Bornhorst等人，2019）。

研究的局限性

这项研究的一个限制是无法专门针对渗透压和测量渗透压梯度。渗透压变化的来源取决于离子泵和离子含量等多种元素。两者都很难在不影响体内心脏功能和血流的情况下进行实验操作。另一个限制是难以精确破译体内细胞体积。例如，虽然对我们的测量影响最小，但在执行我们的细胞体积估计时没有考虑梯形细胞形状。需要进一步的工作来详细解决这些有趣的问题。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。