题目：A multimodal zebrafish developmental atlas reveals the state-transition dynamics of late-vertebrate pluripotent axial progenitors

原文链接:cell

期刊：https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.09.047

摘要

阐明生物体的发育过程，需要从空间、时间和分子层面全面理解细胞谱系。本研究中，我们推出了斑马鱼胚胎发育动态图谱Zebrahub，该图谱将单细胞测序时间序列数据与光片显微镜辅助的谱系重建相结合。通过对十个发育阶段的单个胚胎进行测序，并结合细胞轨迹重建，该图谱为斑马鱼发育提供了高分辨率、深层次的分子解析。Zebrahub还整合了一款交互式工具，可用于解析光片显微镜数据中的复杂细胞流动与谱系，支持计算机模拟命运定位实验。为验证这一多组学资源的通用性，我们借助Zebrahub对神经中胚层前体细胞（NMPs）的多能性以及肾-血血管内皮前体细胞群体的起源展开了全新解析。

图文摘要

引言

受精卵发育为多细胞生物体需要多种过程的协调，包括基因调控、细胞运动和组织形态动力学。发育生物学的一大挑战一直是探究单个细胞在不同尺度上组织形成组织和器官的细胞谱系。胚胎细胞谱系的研究始于一个多世纪前，研究人员通过光学显微镜对细胞进行可视化追踪。1983年秀丽隐杆线虫完整细胞谱系的发表是一项关键里程碑。然而，完整谱系树的构建仍仅限于细胞命运高度定型且便于光学观测的生物体⁵。荧光光片显微镜技术的进步，使得研究人员能够利用斑马鱼、小鼠和果蝇以细胞分辨率对胚胎发育进行整体成像，从而可基于细胞随时间的位置重建特定的细胞谱系。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术多种技术为基于转录组追踪发育过程中的细胞谱系提供了互补手段。这些工具产生了重大影响，开启了发育生物学中令人振奋的新时代。然而，该领域尚缺乏整合了时空与转录组学图谱的发育谱系多组学图谱。本研究我们将光片显微镜与单个发育中斑马鱼胚胎的单细胞RNA测序相结合，以时空分辨率构建了细胞谱系和分子状态的全面多组学图谱。我们将数据和分析工具整合为公开可用的资源：zebrahub.org。

为评估斑马人数据集和工具的实用性与适用性，我们研究了两个发育谱系仍存在争议的祖细胞群的细胞命运。首先，我们分析了最近发现的轴向祖干细胞群——神经中胚层祖细胞（NMPs）的分化动态。神经中胚层祖细胞是一类关键且在进化上保守的双潜能细胞群，改变了对轴向发育的经典认知。这些位于胚胎尾端的前体细胞可产生骨骼肌和后部神经细胞，其特征是共表达神经标志物sox2以及中胚层标志物T/短尾（斑马鱼中为tbxta）。22-27 尽管近年来相关研究日益增多，28 但其发育动态仍不明确。借助斑马鱼发育多组学数据库（Zebrahub），我们在转录组和形态动态层面揭示了神经中胚层前体细胞命运动态的转变。其次，我们研究了位于胚胎腹外侧的早期体节发生期侧板中胚层细胞。29 这些细胞在原肠胚形成后可能同时参与成血干细胞（内皮-造血系统31）和发育中的前肾（未来肾脏32）的形成，对侧板中胚层谱系分离模型构成挑战，30 且它们共表达这些谱系的特征基因。33 借助斑马鱼发育多组学数据库（Zebrahub），我们通过转录组分析和基于显微镜的谱系重建证实了多能性侧板中胚层前体细胞的存在。这两个案例证明了斑马鱼发育多组学数据库（Zebrahub）可通过成像和转录组学两种手段，助力解析发育过程中复杂的细胞转变。

结果

斑马枢纽的测序资源包含一个数据集，该数据集涵盖了来自40个斑马鱼胚胎和幼体的120,444个细胞，这些样本覆盖了从原肠胚末期胚胎到10日龄幼体的十个发育阶段（受精后10、12、14、16、19、24小时，以及受精后2、3、5、10天）。为了捕捉个体间单细胞RNA测序的变异性，研究人员优化了细胞解离方案以避免胚胎混合，从而实现了非混合的单胚胎单细胞RNA测序（图1A、STAR方法及方法S1）。十个发育阶段每个阶段均对四条斑马鱼进行测序，共获得40个单独测序的胚胎。我们采用严格的质量控制标准（图S1A、S1B；STAR方法），在早期发育时间点获得了至少1000个高质量单细胞转录组图谱，在后期阶段获得了超过20,000个细胞（图1A左图；方法S1）。尽管我们测序的细胞总数处于其他基于混合胚胎11,13,14,34或多重胚胎18的斑马鱼发育单细胞图谱的典型范围内（图S1C、S1E），但我们平均每个细胞检测到的基因数量比现有任何数据集都多（图S1D、S1F）。针对发育在24小时受精后阶段之前，我们每个细胞平均获得了超过4000个基因（每个细胞50000个唯一分子标识符，参见图S1A和S1D）——这比其他任何类似资源都显著提高了2倍（图S1D）。

图1. 斑马鱼多组学发育图谱Zebrahub

细胞类型聚类与注释

为了可视化这120,444个细胞的转录组，我们为每个发育阶段（图1A，中间；方法S1）和整个数据集（图1B）生成了均匀流形投影（((UMAP ^{35} ))）。观察到了概括胚胎发育进程的分支模式，早期胚胎来源的细胞位于分支起始处，而大龄幼体来源的细胞则分布在外围区域（图1B；视频S1A）。通过检测富集基因并结合已发表文献以及斑马鱼数据库ZFIN36对总共529个细胞簇（莱登聚类）进行注释（表S1）。随后将鉴定出的细胞类型归为更高层级的组织类型（图1C；视频S1B）。不同发育阶段的投影结果显示，随着时间推移细胞类型数量增加，这与发育过程中的细胞分化情况一致（数据S1）。为了进一步理解发育过程中的细胞分化并提高数据集的注释分辨率，我们对图1C中展示的更高层级组织类型的单个UMAP簇进行了重新注释（数据S1）。随时间变化的注释细胞类型堆叠柱状图呈现了发育过程中转录组分化的细胞状态快照（数据S1）。整个数据集（包括投影和注释信息）可通过zebrahub.org上的用户友好型门户在线浏览和下载（图1A，右侧）。

基于单细胞成像的斑马鱼发育命运图谱绘制

为了补充基于序列的转录组学状态信息，研究人员使用自适应多视图光片显微镜对发育中胚胎的单个细胞动态进行了成像方法S1）。为加速该技术的推广，其硬件设计和控制软件均为开源（方法S1）。该平台使我们能够利用转基因报告基因系对目标细胞群的时空细胞动态进行成像，中内胚层细胞标志物（转基因系mezzo:eGFP39，见图1D和视频S2）的应用便印证了这一点。然而，针对所有目标细胞谱系的转基因报告基因系，目前既难以获取，也不易构建。在没有报告基因系的情况下追踪感兴趣的细胞和组织群，我们的仪器还可以对特定亚群进行标记通过光转化荧光团（如 Dendra240）对细胞进行标记(图1E)。

用于谱系重建的高分辨率光片成像

为了对高密度且快速发育的胚胎中细胞的运动进行成像并精准追踪，我们采用了单目标光片显微镜（DaXi），该设备可在大视野下实现高分辨率成像（数值孔径1.0），且无需耗时的样品制备流程即可实现这一效果（((>1 mm^{3} ))；图1F；方法S1）。我们使用了一种普遍表达的组蛋白报告品系来驱动mCherry的表达，以此对细胞核进行成像。图像采集完成后，我们对其进行了处理和增强，以方便细胞核的识别与追踪（图1G；视频S3A、S3B）。我们的细胞追踪流程借助神经网络来检测图像中的细胞核，并划分细胞间的边界（STAR方法；视频S3C、S3D）。随后，该信息被用于获取细胞核的分割结果及对应的追踪轨迹（图1G；视频S3E、S3F；STAR方法；方法S1）。我们为多维图像查看器napari开发了一个虚拟命运图谱插件，以帮助用户探索和利用这些海量数据集（图1H；STAR方法；方法S1）。这款软件允许用户基于我们的追踪数据，通过标记区域并追踪细胞及其后代的轨迹来开展“虚拟”命运图谱实验（详见STAR方法）。所有成像数据集和相关工具均可在zebrahub.org网站上获取，它们与单细胞RNA测序数据集共同构成了用于研究脊椎动物发育的多模态资源。

同胞胚胎间的转录组差异

单细胞RNA测序数据集的单胚胎分辨率和高测序深度（图S1及STAR方法）为通过比较同胞个体的单细胞转录组来研究发育过程中基因表达的变异性提供了机会（图2A）。此外，四个测序重复样本均未表现出任何批次效应（STAR方法及数据S1）。因此，无需进行批次校正，这还避免了对下游分析结果产生偏倚的额外优势。为量化同胞个体间基因表达模式的差异，研究人员开发了一种比较细胞间基因表达分布的分析框架，该框架利用了库尔贝克-莱布勒散度（KLD；图2B）。KLD值为0表示两种分布完全相同，而大于零的数值则表示分布间的差异逐渐增大（图2B）。例如，在受精后12小时（12 hpf），多个基因在同胞个体间表现出看似相同的表达模式（如图2C中的sox11a、notch1a和dnaia2a），而其他基因则呈现胚胎特异性的分布特征（如图2D中的ybx1、tma7和meta2b）。研究人员计算了每个基因的所有成对KLD值，并使用中位数对这些值进行汇总（中位数成对KLD记为mpKLD；图2C和图2D中的灰色热图；STAR方法）。在受精后12小时，大多数基因在不同胚胎间的表达水平极为相似（mpKLD z(0.06)，少数基因呈现出极低的mpKLD值((<0.01))（<0.01）——这表明不同胚胎间的基因表达几乎完全一致（图2E中蓝色标注的为排名后2%的基因）。然而，也观察到存在尾部基因具有较高的mpKLD值（>2）——这意味着同批次胚胎间的基因表达差异显著（图2E中红色标注的为排名前2%的基因）。采用相同方法，我们在不同时间点和特定组织中发现了表达模式相同或胚胎特异性的基因（数据S1）。总体而言，我们观察到同年龄胚胎的大多数基因表达水平相近。此外，通过证明同批次胚胎间的mpKLD值与零分布所得结果存在显著差异，我们证实了这种差异并非由抽样误差导致（详见STAR方法与方法S1）。其他早期发育阶段也观察到了相似的mpKLD分布（数据S1）。这些结果表明，单胚胎分辨率的应用能够实现转录组变异的分析。我们发现同批次胚胎间的转录组变异程度极低，这说明发育过程中不同胚胎间的转录调控具有稳定性。

图2. 个体间转录组变异性分析

时间分辨的转录组变异性在受精后19小时达到最低值

为了更好地理解转录组的变异性，本分析扩展至另外六个早期发育时间点（受精后10-24小时）。所有时间点的mpKLD分布峰值均较低（介于0.065至0.015之间；图2F），表明大多数基因在不同胚胎间的表达模式相似。我们观察到mpKLD值整体呈下降趋势，表现为分布的偏移（图2F；连续时间点间的双样本柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验，(p value <10^{-15})）。同胞胚胎间的基因表达分布在受精后19小时达到基因表达变异性的最低点，而在24小时时变异性又出现回升（图2F）。在检测特定细胞类型时也观察到了这一模式（数据S1）。我们推测，19小时时更高的相似性水平反映了此时基因表达受到的严格调控体节形成期结束。

验证转录组变异性

我们在24小时受精后（hpf）的第二组四个胚胎中重复了该分析，以确保结果具有可重复性（图S2A）。我们观察到两组胚胎中基因的mpKLD值高度相关：在两个重复实验中，63%的高mpKLD值基因（个体间变异性高）是相同的（图S2B）。这表明特定基因及其调控程序具有在个体间表现出表达变异性的内在倾向（图S2E），而大多数基因的转录组变异性较低（mpKLD值低；图S2B）。为确保观察结果并非实验伪影所致，我们对高mpKLD值基因进行了通路分析⁴⁸，结果显示与肌肉收缩和肌生成相关的基因具有高度变异性（图S2F及STAR方法）。这一发现很有意思，因为斑马鱼的肌生成发生在受精后24小时⁴⁷。通过分析不同实验组中特异性高变异性的基因，未发现证据表明观察到的变异性是由细胞应激、细胞凋亡等实验伪影相关程序引起的（图S2F）。

非同胞胚胎的转录组变异性

为了理解转录组变异在同胞与非同胞之间的差异，我们对非同胞对重复了该分析（图S2A）。首先，我们观察到非同胞的mpKLD分布比同胞的分布更偏斜，表现出更高mpKLD值的基因比例更高（图S2C和S2D，黄色分布）。这一结果符合预期，因为非同胞胚胎对之间的遗传变异度更高。实际上，我们发现非同胞对之间的mpKLD值相关性低于同胞1（图S2C）或同胞2（图S2D）。我们注意到，在非同胞与重复样本1之间，40%的高mpKLD基因具有保守性，且35%，而重复样本2的这一比例显著低于24小时胚胎期两个重复样本间共享的基因比例（63%；图S2E）。

斑马鱼RNA速度重现谱系形成过程

为了更深入地理解基因表达动态在早期发育阶段（10–24 小时 post-fertilization，hpf），RNA 速度49已计算（STAR 方法）。将 RNA 速度向量投影到注释的 UMAP 上（图 3A；视频 S1C）。这些向量概括了胚胎时间的进程（数据 S1），并证实了中胚层分化轨迹——从体节前中胚层开始，经过体节，最终形成肌肉（图 3A 右上角，绿色星号*）。有趣的是已计算（STAR 方法）。将 RNA 速度向量投影到注释的 UMAP 上（图 3A；视频 S1C）。这些向量概括了胚胎时间的进程（数据 S1），并证实了中胚层分化轨迹——从体节前中胚层开始，经过体节，最终形成肌肉（图 3A 右上角，绿色星号*）。有趣的是中胚层分支起源处的簇，由红星*表示，也是前往神经组织的分支的起源。该簇中的细胞富集神经和中胚层转录因子（分别为sox2和tbxta；数据S1）。这些转录因子是NMPs的分子特征——一种最近特征化的晚期多能轴向祖细胞群体，被认为有助于中胚层和神经原肠胚形成后的组织。

图3.全胚RNA速度和衍生细胞状态

细胞状态转换图分析揭示胚胎发生过程中的转录组细胞动态

为了定量证实这些发现并避免因UMAP投影带来的混杂效应，我们将RNA速度数据粗粒度化为一个细胞状态转换图，该图反映了细胞类型和组织间分化的动态变化（图3B）。将基于RNA速度的单细胞转录组转换建模为马尔可夫过程，使我们能够探究多种细胞类型轨迹⁵⁰（详见STAR方法和图3C）。祖细胞群相关的细胞状态转换为其对应的分化状态（例如，图3C上图中的神经管向神经元的转换）。相比之下，成熟或完全分化的细胞状态未转换为任何其他状态（例如，图3C中图中的内皮细胞）。细胞状态转换在粗粒度图中得到了重现（图3D）。该细胞转换图很好地印证了已知的谱系，如中胚层谱系（体节中胚层/体节/肌肉）。该图还支持了神经中胚层前体细胞（NMPs）向中胚层和神经状态转换的观点（图3D）。同时，该图还揭示了转录空间中相邻的细胞类型之间存在双向转换，而这些细胞类型目前已知不属于同一发育谱系（例如，原始生殖细胞与内胚层；图3D及表S1列出了用于注释细胞簇的基因）。这是一项有趣的发现，但需注意的是，这种关联较弱，应谨慎解读（见讨论部分）。总体而言，我们的细胞状态转换图重现了主要的发育谱系，同时也提示了早期细胞类型之间存在与已知时空发育谱系不相符的转换关系。

基于图像的发育命运图谱重建：利用计算命运图谱进行分析

RNA 速度能提供转录组学空间中细胞状态动态的宝贵信息。然而，预测性转录组学未必始终与实际发育谱系相符。因此，有必要采用基于系统成像的细胞轨迹重建方法，以全面捕捉发育过程中细胞的时空动态。借助我们的 DaXi 成像平台，我们以高时空分辨率获取了五组胚胎发育延时影像，覆盖了大部分分节期和器官发生的初期阶段（图1G；数据S1）。我们采用基于深度学习的细胞核分割和细胞追踪算法（Ultrack⁴³），从单细胞轨迹重建了高分辨率命运图谱（图1G；方法S1）。在细胞追踪挑战赛⁴³,⁵¹中，Ultrack 是针对 3D 胚胎数据集的高分算法（图S3A）。我们还在自身数据上对其有效性进行了人工验证（图S3B、S3C；STAR 方法）。为了便于这些数据的可视化和分析，我们开发了一款 napari 插件，用户可通过该插件选择并追踪细胞群以确定其命运（图1H、STAR方法及方法S1）。我们将这一技术称为**计算机模拟命运图谱分析**。作为对照，我们研究了前脑中一组前神经前体细胞，发现其命运仅限于前脑区域（图S4A，紫色星号*）。这一发现与神经前体状态分化的RNA速度动态特征相符（图3A中紫色星号*）。随后，我们对转录组空间中可见的、对应实际发育谱系的一种经典中胚层52组织分化过程进行了计算机模拟命运图谱分析（图3A，绿色星号*）。我们标记了早期体节前中胚层的细胞，结果正如预期，观察到这些细胞的克隆整合到了体节中（图S4B，绿色星号*）。总体而言，我们这种基于成像的命运图谱分析方法，完整再现了在转录组空间中已发现的已知细胞转化过程。

高分辨率时间分辨的计算机模拟命运图谱可预测时间依赖性的神经中胚层前体细胞命运限制

接下来，我们将注意力转向神经中胚层前体细胞（图3A，红色星号*）。为确定神经中胚层前体细胞的推定区域，基于其同时表达sox2和tbxta的特性，通过杂交链反应（HCR）对神经中胚层前体细胞的时空定位进行了定位（STAR方法与数据S1）。对早期神经中胚层前体细胞区域（14小时受精前）的计算机命运图谱分析证实，神经中胚层前体细胞可分化为中胚层和神经前体细胞（图4A；数据S1；视频S4A）。我们对其子代细胞比例进行了量化：72%的细胞分化为中胚层组织（体节和体节前中胚层），28%分化为神经管（图4B）。神经中胚层前体细胞的命运图谱在后续时间点（14小时受精后；见图4C、方法S1和视频S4D）发生了变化，此时神经中胚层前体细胞主要分化为中胚层组织。大多数晚期神经中胚层前体细胞（14小时受精后）的子代细胞整合到中胚层中（96%；图4D），仅有4%整合到神经管中。我们通过重现斑马鱼后部发育特化区域的已确立模型，进一步验证了计算机命运图谱22,53（图S4C–S4E）。神经中胚层前体细胞后方的腹外侧区域是中胚层前体细胞区域（图S4C和S4E；视频S4B），而神经中胚层区域后方的背内侧区域是神经前体细胞区（图S4D和S4E；视频S4C）。综上，对轴前体细胞的计算机命运图谱分析表明，神经中胚层前体细胞仅在轴突伸长初期具有真正的多能性。

图4. 神经中胚层前体细胞的计算机命运图谱绘制及通过光转化和活细胞成像进行的体内验证

通过光转化的体内命运图谱验证了计算机模拟命运图谱

为了验证**硅内**命运图谱实验以及观察到的神经母细胞命运限制，我们进行了光转换实验随后对发育中的斑马鱼胚胎进行活体光片成像（STAR 方法学；方法学 S1）。使用转基因胚普遍表达光可转换蛋白Dendra2⁴⁰根据先前的观察，在不同发育阶段对神经中胚层祖细胞（NMPs）的预设区域进行光转化（STAR 方法与数据 S1）。在早期分节阶段（受精后10小时；图4E），经光转化的早期神经中胚层祖细胞区域产生的子细胞分布于中胚层和神经组织中（图4E；视频S4E；数据S1）。然而，当对晚期神经中胚层祖细胞的预设区域进行光转化时，其子细胞仅整合到中胚层中（图4G；视频S4F；数据S1）。通过对三维图像进行分割并量化中胚层和神经区域内神经中胚层祖细胞子细胞的数量，确定了克隆的分布情况（STAR 方法与数据 S1）。早期光转化导致子细胞在神经组织和中胚层组织中分布几乎均等（图4F），而晚期光转化则主要导致子细胞向中胚层分化（96.5% 分布于中胚层，3.5% 分布于神经管；图4H）。为了确认神经中胚层祖细胞的多能性，而非仅仅是谱系特异性前体细胞的混合（即“椒盐状”分布），我们追踪了在后续阶段整合到神经管和中胚层中的细胞（图S5A）。这一过程需要耗费大量人力回溯以在神经中胚层祖细胞区域寻找共同祖先，结果发现早期神经中胚层祖细胞的子细胞同时存在于神经和中胚层组织中，而在晚期神经中胚层祖细胞的实验中未发现此类共同祖先（图S5B；视频S4G）。这些结果在体内验证了计算机模拟的命运图谱分析结果。

组织形态动力学限制神经中胚层前体细胞的命运

接下来，我们测试了空间位置和不同的组织变形环境是否会影响神经中胚层前体细胞（NMPs）的命运特化。我们运用了最新开发的动态形态骨架（DMs）框架⁵⁴。该框架旨在识别拉格朗日相干结构（LCSs）：胚胎细胞流中组织和划分细胞轨迹的独特结构⁵⁴。通过计算追踪数据得出的细胞流拉格朗日拉伸量，确定了排斥区（即细胞随时间发生明显分离的区域）（图S6A；STAR方法与方法S1）。分析显示，早期神经中胚层前体细胞（通过杂交链式反应定位；STAR方法与数据S1）位于一个排斥区上（方法S1）。该排斥区的特征是相邻细胞快速相互分离（图S6A与STAR方法）。排斥结构在12至14小时受精后（hpf）最为显著，这一时期早期神经中胚层前体细胞具有有效的多能性（图S6B-S6D，中间部分），这与神经中胚层前体细胞区域内的拮抗细胞流相一致。（图S6B–S6D，中间）。相比之下，在随后晚期神经中胚层前体细胞（NMPs）命运限定为中胚层的时间窗口内（14小时后；图S6B–S6D，下方；数据S1中的更晚时间点），并未出现排斥结构。此时，细胞流呈连贯状态，且仅朝向外胚层方向（图S6B–S6D，下方）。这些结果表明，组织分区化与观察到的晚期神经中胚层前体细胞命运限定相关，且可能是其成因。

利用基于单细胞成像的命运图谱重建技术，我们观察到了神经中胚层前体细胞的状态转变。研究发现，早期神经中胚层前体细胞具有真正的双潜能祖细胞特征，其产生的子代细胞可整合中胚层和神经组织。但在体节发生中期，晚期神经中胚层前体细胞的命运仅局限于中胚层谱系。我们借助斑马鱼转录组测序资源对神经中胚层前体细胞的转录组图谱进行了表征。

NMPs 中 sox2/tbxta 梯度的转录组景观可预测其未来转录组状态

通过研究神经中胚层前体细胞（NMPs）的转录组特征，我们发现Sox2/Tbxta的表达梯度可预测NMPs未来的分化路径。通过将转录组数据重新投影到新的均匀流形逼近与投影（UMAP）上，我们定位到NMPs位于体节前中胚层与神经管之间（图5A及方法S1），并观察到NMPs的RNA速度朝着中胚层或神经方向流动（图5B）。Sox2和Tbxta的表达水平可指示细胞的命运，其中Tbxta表达水平更高会推动NMPs向中胚层身份分化，而Sox2表达水平更高则会推动其向神经身份分化（图5C）。这一结果表明，tbxta和sox2转录因子分别在NMPs向中胚层和神经命运分化过程中发挥关键作用。此外，单细胞RNA测序（scRNA-seq）（图5D）和原位杂交链式反应（in situ HCR）（STAR方法及数据S1）均证实，NMPs的群体数量在早期发育过程中呈下降趋势，尤其是在受精后12至16小时（hpf）期间，这两种技术均显示同时表达Sox2和Tbxta的细胞数量随时间减少（图5E-5G；数据S1）。

图5. 早期发育过程中神经中胚层前体细胞的转录动态

基因表达动态表明早期神经中胚层祖细胞具有多能性，而晚期神经中胚层祖细胞主要向中胚层分化

时间特异性RNA速度分析表明细胞从多能性向中胚层定型转变（图5H）。早期神经中胚层前体细胞（10–14小时受精后）的基因RNA速度动态显示其同时朝向神经和中胚层命运。然而，晚期神经中胚层前体细胞的潜能范围缩小，RNA轨迹仅与中胚层发育模式在受精后19至24小时持续存在（图5H）。几乎在每个发育阶段，源自神经中胚层祖细胞的细胞流也部分导向脊索（中胚层），在较小程度上导向底板（神经组织）。为量化这一观察结果并消除UMAP投影带来的歧义，我们计算了每个发育阶段神经中胚层轴上神经中胚层祖细胞的RNA速度分布（图5I），结果显示出相似的趋势。神经中胚层祖细胞沿神经中胚层轴的拟时发育轨迹重现了在神经和中胚层分化中起关键作用的基因表达（图5J）。我们还鉴定出了这些轨迹中的关键细胞类型（图5K），并在发育时间维度上可视化了其分布（图5L），该分布与RNA速度结果一致。总体而言，对转录组空间的动态分析和基于图像的谱系重建有力表明，神经中胚层祖细胞发生了状态转变，从双能祖细胞转变为具有中胚层命运的定型祖细胞。

解析神经中胚层祖细胞的分子动力学

在神经中胚层前体细胞（NMPs）中特异性富集的转录本（表S2）包括参与体轴伸长调控的基因（cdx1a、lin28a、cdx4和gdf11），以及与成纤维细胞生长因子（FGF）、视黄酸（RA）和Wnt信号通路相关的基因，这些通路对中胚层和神经诱导至关重要（图S7A）。富集基因在早期神经中胚层前体细胞中表达达到峰值（图S7A；10、12和14小时受精后）。值得注意的是，著名的多能性因子oct4也属于富集基因，且仅在早期神经中胚层前体细胞中表达（由pou5f1基因编码，图S7A和S7B中箭头所示）。对细胞周期至关重要的基因在早期神经中胚层前体细胞中上调，表明该阶段细胞增殖能力增强（图S7C）。此外，我们观察到存在一个独特的神经中胚层前体细胞亚群，该亚群位于早期和晚期发育簇之间，高表达tbxta、sox2基因以及与脊索发育相关的基因（图S7D，混合群体）。这与已报道的可分化为脊索的多能前体细胞特征相似。我们还发现hox基因呈现显著的共线性激活，表明随着体轴的延伸，神经中胚层前体细胞发生时间上的成熟（图S7E）。总体而言，早期神经中胚层前体细胞似乎兼具中胚层和神经潜能相关的基因特征，以及多能性标志物。

超越神经中胚层前体细胞：内皮、造血和原肾谱系

细胞状态转换图（图3D）也表明了前肾管与造血内皮细胞之间存在谱系关系，这与斑马鱼的一项近期研究结论相符。我们通过放大并投射造血内皮细胞、前肾管及其起源组织——侧板中胚层（LPM）的转录组数据，对这一问题进行了更深入的探究（图6A）。我们依据相关文献对所得数据集进行了细致注释（图6B）。我们观察到一个由早期细胞构成的细胞簇（图6B和6C中蓝色箭头所示；主要出现在受精后10、12和14小时），该细胞簇既表达成血管细胞（造血与内皮祖细胞31）的特征基因etv2、tal1和lmo2，也表达前肾祖细胞相关基因pax2a、pax7，以及hand2这一与指向侧板中胚层（LPM），该区域分化形成平滑肌细胞和间皮细胞32（图6D，蓝色箭头）。源自这些早期成血管细胞的RNA速度流，几乎指向UMAP中存在的所有其他细胞类型，包括原肾细胞、内皮细胞，以及一定程度上的红细胞和其他侧板中胚层衍生物（图6A）。而由不同时间点细胞组成的“祖细胞”群体（图6B和6C，黄色箭头），其RNA速度流并未指向原肾细胞簇。这些祖细胞表达成血管细胞标志物（图6D——etv2、tal1和lmo2——黄色箭头），但不表达原肾祖细胞相关基因（图6D——pax2a和pax7——黄色箭头）。综上，研究结果表明侧板中胚层中存在早期成血管细胞样祖细胞群，这些细胞可分化为原肾细胞系和内皮细胞。

一组早体节期侧板中胚层前体细胞整合内皮和前肾组织

我们使用计算机模拟命运图谱工具追踪早期体节发生过程中的侧板中胚层细胞。我们通过以下方式确定其推定的子代细胞位置：解剖学标志以及二维和三维投影（图6E；数据S1）。为提高结论的可信度，我们生成了命运图谱密度图（STAR 方法），该图谱可模拟数百次命运图谱实验，从而减少个体追踪误差的影响。我们的结果表明，侧板中胚层（LPM）的子代细胞是体间血管（ISVs）的内皮细胞（图6E和6F，橙色箭头；数据S1），以及看似其他成血管细胞的衍生物（背主动脉；图6E；数据S1），同时也出现在原肾管中（图6E和6F，红色箭头；数据S1）。综上，对早期侧板中胚层（LPM）的计算机模拟命运图谱分析表明，存在既参与原肾形成又参与内皮-造血细胞形成的前体细胞。

图6. Zebrahub证实存在有助于前肾单位和内皮细胞的早期LPM祖细胞

Zebrahub.org 上的交互式数据探索

为确保广泛获取 Zebrahub 数据集、实验方案、软件和仪器，我们开发了一个交互式网站（图7A）。用户可在网页浏览器中访问单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集和光片显微镜的延时成像数据（图7B）。单细胞RNA测序数据集可通过交互式工具进行可视化，使用户能够探索元数据和注释、搜索特定基因并创建基因集（图7C；视频S5A）。处理后的光片成像延时视频易于获取，支持用户通过多种正交视图随时间可视化三维体积数据集（图7D和视频S5B）。虚拟命运定位软件可与各类数据集一同下载，并附带清晰的运行和使用说明（STAR 方法学、方法学S1；视频S5D）。这款用户友好且内容全面的资源架起了技术知识与领域专业知识之间的桥梁，助力复杂高维数据集的探索与研究发现过程。

图7. Zebrahub网站

讨论

我们介绍了斑马鱼发育综合分析的多模态资源Zebrahub，该资源包含单胚胎单细胞时间分辨转录组。用于数据探索的光片成像数据集和工具。所有数据集、设计和软件都可以下载。可以交互式地探索测序和成像数据集，并且可以使用我们的napari44插件可视化和查询基于图像的谱系。Zebrahub的创建得益于广泛的多学科进步，例如高效单胚胎细胞解离协议、框架为了研究单个胚胎的转录组变异性，自适应多视图光片成像和照片操作的开源设计，以及用于从光片成像数据进行硅命运映射的计算工具。

此外，与以前的scRNA-seq研究相比，我们的研究资源涵盖了更广泛的发育阶段。它在单胚胎水平上实现了非合并分辨率，且具有较高的每个胚胎的基因覆盖度足以测量个体间转录组的变异性。此外，我们使用了高分辨率（1.0 NA）和大体积（>1 立方毫米，编号 ((>1 ~mm^{3}))）的光片显微镜、自动化的全胚胎细胞追踪技术，以及一套理论框架来研究脊椎动物胚胎发育后期的细胞谱系和细胞运动。我们能够在发育中的尾部这类高度动态且细胞密集的组织中实现这一研究。我们在成像方面超越了以往基于光片显微镜的脊椎动物胚胎学研究时长。我们使用了一款细胞追踪软件（Ultrack43）基于发育胚胎的大型三维数据集，我们重构了多个发育胚胎的完整发育轨迹（方法S1）。为了便于利用这些高维成像与追踪数据集，我们开发了一个用于**虚拟**命运图谱绘制的napari插件。我们将该方案与已知的时空发育轨迹进行了基准测试（图S5），并在体内对结果进行了验证（图4）。

我们观察到特定细胞类型的已知发育轨迹与其相应的转录组空间（原始胚芽和内胚层；见图3D和结果）中预测的细胞状态进展之间的差异。这一观察可能归因于RNA速度在准确重建细胞动力学方面的固有限制基于scRNA-seq数据，或它可能受到注释簇的分辨率的影响。然而，由于空间环境影响细胞信号传导和细胞命运，细胞身份在早期阶段仍然具有高度可塑性。69-71尽管如此，这些观察突出了基于图像的细胞谱系重建对补充转录组学研究的重要性。

Zebrahub的数据集和技术的结合有助于完善我们对谱系的理解，帮助回答关于细胞命运动力学的更精细的问题。我们可以精确地表征轴伸长祖细胞的转变动力学。我们提出了一个NMPs命运动力学模型，该模型结合了来自转录组状态、图像衍生谱系和组织运动学的数据。我们发现，在轴伸长期间，NMPs从促进多种中胚层和神经谱系转变为专门促进中胚层。关键分子通路组件（Wnt、FGF和RA通路）的峰值表达和多能性因子oct4的存在，与维护和dif相关早期发现轴突祖细胞60,72-75多能NMPs。结合基于计算机和体内图像的命运证实了晚期NMPs从多能到完全中胚层祖细胞的命运限制。在组织水平上，我们观察到排斥器结构，表明细胞迅速分化在早期NMPs中流动，支持NMPs后代整合两个不同的组织（方法S1）。总之，这些结果挑战了原肠胚形成后谱系承诺的传统观点，并支持晚期和宽分化可塑性的概念。RNA速度研究还表明NMPs可能位于其他轴向组织的起源，即脊索和底板。然而，在我们基于图像的命运映射分析中没有明确的证据表明这种关系（图4和5）。因此，多模态命运映射图谱（如Zebrahub）对于理解胚胎发生过程中发生的复杂动态以及调和关于细胞命运和谱系规范的空间和转录组见解的关键作用。

最后，我们的数据，alongwithpreviousobservations，为位于LPM中的血管母细胞和原肾细胞建立谱系分离模型。这些发现表明，早期躯体发生LPM的群体可以分化为血管母细胞和原肾细胞池。在转录组水平，该群体表达最近与内皮和原肾细胞命运决定有关的转录因子Npas4l、Tal1和Lmo2（图7D）。通过基于显微镜的谱系跟踪，我们确定了一个早期躯体发生LPM群体，其后代在内皮细胞和原肾细胞中。然而，需要进一步验证才能将这些祖细胞的分子和时空命运联系起来。

Zebrahub收集的易于访问的数据集和工具代表了科学界的资源。通过结合成像和测序数据集，我们结合了两种模式的优势。除了NMP，该资源还将揭示其他重要的发育过程。Zebrahub准备扩展更多的发育阶段、多组学数据集，并最终，多个胚胎的共识数字谱系重建。整合现有数据集，包括来自其他物种的数据集，将能够创建脊椎动物胚胎发生的综合图谱，开创发育和进化生物学的新时代。

研究的局限性

Zebrahub以单细胞分辨率提供了脊椎动物发育的多模态制图，包括躯体发生和器官发生的开始。然而，我们基于显微镜的谱系重建并没有捕捉到组织的最终分化状态，因此限制了谱系重建的解释。先进显微镜的进一步改进对于以光学方式捕捉从受精到器官发生结束的细胞谱系是必要的。基于RNA速度的细胞转移图（图3）显示了高度特化的生殖细胞谱系和内胚层之间的关系，这是一个非常出乎意料的发现，显示了利用转录重建发育谱系的计算技术的局限性。除了对已知发育轨迹的解释之外，在基于RNA速度或伪时间等生物信息学工具的谱系重建解释中应该采取许多预防措施。我们的观点是，基于图像的谱系重建仍然是描述发育谱系的黄金标准。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。