题目：Article Scale space detector for analyzing spatiotemporal ventricular contractility and nuclear morphogenesis in zebrafish

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36034231/

期刊：iScience

研究亮点

l 人类的心脏缺陷基因在斑马鱼中存在对应的直系同源基因

l 光片成像技术对斑马鱼的无创四维建模非常有效

l Hessian 检测器对不同的细胞核尺度和几何变换具有鲁棒性

l 分水岭滤波器可有效分离融合的细胞体积

摘要

对结构与功能生物标志物开展在体定量评估，是解析先天性疾病病理生理特征的关键手段。固定组织分析为理解细胞底层结构带来了突破性认知，但组织学分析存在显著短板：既无法实现时空维度采样，还会在样本制备过程中产生组织假象。本研究证实，光片荧光显微镜（LSFM）可作为一种无创四维（三维空间 + 时间）光学切片工具，用于揭示斑马鱼心脏的机械信号转导机制。此外，本文介绍了一种尺度大小不变特征检测器，可用于解析相互融合的心肌细胞核个体形态，并表征斑马鱼心室收缩功能。

图文摘要

引言

斑马鱼正成为研究人类先天性心脏病（CHD）极具价值的脊椎动物模型。斑马鱼具备诸多突出优势：胚胎身体光学透明、繁殖力高，便于开展基因与生物力学调控，以此模拟人类先天性心脏病的病理生理过程。因此，斑马鱼可用于表型筛选，研究收缩力、血流等动态生物力学刺激对心脏成熟的调控作用。

既往斑马鱼相关研究发现，在各个发育阶段，心肌细胞数量保守，与心房 / 心室的质量或体积呈比例关系。此外，近期研究表明，除心房心肌细胞形态存在特异性外，心室的三个区域 —— 房室管（AV）、心室外侧曲率（OC）、心室内侧曲率（IC）均会出现心肌细胞形态肥大的现象。同时，生物学家提出科学问题：房室管前方的心室外侧曲率心肌细胞形态膨大，而内侧曲率心肌细胞呈球形（各向同性），心脏机械信号转导在这一差异中发挥何种作用。然而，组织双折射现象会严重干扰心肌细胞在体形态发生的观测，阻碍上述心血管表型的解析。在此背景下，自动化特征检测器成为不可或缺的工具：无需人工干预即可完成细胞体积分割，避免人为造成的巨大结果偏差，输出高质量数据集。

传统的侵入式切片技术，能够在细胞层面揭示病变组织特征，带来诸多突破性发现。但组织病理学分析目前存在严重局限，最主要问题是会破坏组织稳态。针对上述缺陷，光片荧光显微镜这一光学切片技术，可对组织内部数毫米深度的动态器官发生过程开展观测，发挥重要作用。光片荧光显微镜极大助力胚胎学家认识各类动态生物学现象，例如机械信号转导、未分化前体细胞信号通路。

然而，受视场内各向异性对比度的影响，依靠内源荧光基团获取动态器官发生图像十分困难。该现象源于光子在非均一组织中的传播过程。因此，要精准构建活体三维体积图像，算法必须对组织动态运动、物体尺度差异具备高灵敏度。但光学像差常会造成成像样本空间出现冗余信息，影响特征参数的解读。

此外，适用于非均匀对比度分辨率的二分类算法十分稀缺，致使细胞研究大多只能依靠人工勾勒细胞边界。传统基于强度的分割算法，如大津法、自适应阈值法、迭代自组织阈值法、基于熵的阈值法，凭借简单、快速的优势被用于自动化细胞追踪。但面对相互靠近、信号衰减的目标，这类算法无法将其分割为具备生物学意义的独立区域。分水岭算法是另一类生物医学图像常用分割方法，但在细胞密集组织中，该算法经常发生过分割，或是检测出并不真实存在的伪目标。

因此，迫切需要一种可适配低信噪比生物图像的特征检测器，实现在组织结构内部完成精准的细胞分割。

本研究引入尺度空间特征检测器，在不同胚胎发育阶段，对粘连在一起的心肌细胞核斑点形态进行分离。本文搭建的分割框架将海森高斯差（HDoG）特征检测器与分水岭算法相结合，提升识别单个细胞核的检测灵敏度。两种算法联用，能够在背景噪声干扰下实现流畅可靠的分割效果。借助这套算法，本研究实现对野生型斑马鱼心室收缩功能、心肌细胞核多项形态指标（细胞核数量、面积、球形度）的在体解析。

结果

在动态变化的斑马鱼心室三维图像中分离单个心肌细胞核

细胞核互相重叠，像素强度高低不一，无论是人工轮廓分割区分粘连细胞核边界，还是为光片共聚焦范围（聚焦区域）之外发生畸变的细胞核设定强度阈值，都是难度很高的工作（图 1A1D）。同时，自发荧光、心脏动态搏动会混淆横向与轴向成像平面（图 1I1J）。 为将细胞核簇拆分为互不连通的独立区域，本研究先使用高斯差（DoG）滤波器强化细胞边界，再采用分水岭算法分割受各向异性对比度影响而融合的边界。借助该方案，在受精后 48 h（hpf）的中等细胞密度样本中，成功完成不同尺度细胞核的定量分析（图 1E1H）。更为关键的是，高斯差尺度空间检测器结合分水岭算法，能够把沿轴向相互融合的细胞核分离开（图 1K1L）。光子穿过非均质组织，再加上可解析样本深度存在物理限制，很容易造成样本成像失焦（图 2A）。

图1. 结合高斯差分（Difference of Gaussian, DOG）滤波器与分水岭算法从收缩心脏中分离并分割心肌细胞核（A-D）受精后48小时斑马鱼心室体积通过光片显微镜重建，以可视化心肌细胞核的时间依赖性运动。原始体积包含融合的细胞核簇（黄色高亮框），组织散射使该情况加剧（B-D）放大区域显示细胞核的融合轮廓，这对单个细胞核分析产生不利影响（E）使用高斯差分（DoG）边缘检测器结合分水岭算法处理心室体积，以将单个细胞核与相邻细胞核区分开。（F-H）放大区域显示细胞核成功分离，有助于细胞追踪和计数。（I-J）二维侧面和轴向视图显示组织双折射导致细胞核沿纵向融合（K-L）重建分割后的侧面和轴向视图，用于定性评估重叠细胞核的轮廓分离情况。（比例尺=100微米），a：心房，v：心室。

结合海森与高斯差算法（HDoG），从高密度环境中分割心肌细胞核

和基于针孔的显微技术相比，光片荧光显微镜存在一项突出问题：相邻心肌细胞之间会产生背景对比度干扰（图 2B、2C）。细胞核在视场内动态移动时，光学切片光束腰以外荧光基团结合位点发出的杂散荧光，会干扰三维体积重建的准确性（图 2A）。此外，低数值孔径物镜带来的信号强度衰减，会进一步恶化图像信噪比。

虽然利用高斯差检测器能够成功分割受精后 48 h 样本中轴向粘连的心室心肌细胞核，但当发育时间超过 72 h，细胞核计数结果就会出现明显偏差。我们认为，二值化处理前高斯差边缘检测器输出的像素信号偏弱，造成细胞核统计数目偏低（图 2D、2E）。为解决该问题，我们引入海森高斯差算法。结合分水岭算法的Hessian差方向梯度检测器（HDoG），可实现精准的轮廓分离，并用于体内评估野生型心肌细胞核的形态。海森矩阵行列式被用于定位鞍点。鞍点可被定义为既非强度最大值也非最小值的点，其代表细胞核边缘的连接区域。该方法在单一生物标志物存在多个强度峰值的情况下提升了检测灵敏度（图2F和图2G）。除了细胞核计数外，分割后的标记还被进一步用于研究细胞核形态和心室收缩性。

图2. 在心室收缩周期不同阶段的高密度心肌细胞簇中分离单个细胞核体积（A）示意图展示斑马鱼心室心肌细胞核切片，通过高斯光片（蓝色实线）扫描。共焦参数（即激发横向范围）与束腰（BW，即光片轴向分辨率）之间存在权衡，因此需要优化高斯聚焦点，以有效采样不同生长阶段的胚胎发生过程。检测物镜调节有效视场（FOV）。使用机械换能器以离散增量（dx）通过静态光学截面扫描样本，从单个切片重建完整的体内3天及以上时间体积。红色箭头代表斑马鱼心脏的血流方向。（B和C）受精后96小时（约4天）收缩期和舒张期细胞核的原始重建图像，与受精后48小时相比，细胞核团块排列更为紧密。动态的收缩和舒张进一步加剧了细胞核定位的不准确。（D和E）高斯差分（DoG）检测器结合分水岭算法的应用，导致特征检测灵敏度降低，进而使得细胞核数量报告不准确。（F和G）Hessian DoG特征检测器对图像采集过程中细胞核像素邻域发生的局部仿射变换具有更高的灵敏度。（比例尺=50微米），av：房室管，v：心室，ot：流出道。 

分割精度评估

针对每个不同的发育阶段对细胞核进行了检测：48小时受精后（图3A-3C）、72小时受精后（图3D-3F）和96小时受精后（图3G-3I），以此对比48小时受精后稀疏细胞核分布与96小时受精后心室密集分布情况下的分割鲁棒性。我们采用分割比率来评估分割精度，具体是将Hessian差分高斯细胞核图像与手动细胞核分割结果进行对比，参照静态三维斑马鱼心脏共聚焦图像。分割比率指的是尺度空间分割出的细胞核数量，除以作为真实值在共聚焦图像中手动计数的心肌细胞核数量。若该数值等于1，说明分割结果与原始图像一致；若数值大于1，说明分割图像存在过度分割现象；若数值小于1，则说明分割图像存在分割不足问题（图S1）。分析表明，利用Hessian尺度空间方法，在各发育阶段均能实现理想的重复分割效果（图S2）。

图3. 可视化cmlc:GFPnuc斑马鱼心室细胞核在不同发育阶段（受精后48至96小时）及整个心脏收缩周期的形变（A-I）。利用Hessian差分高斯尺度空间表示法对不同大小的心肌细胞核进行定位，借此实现了对心室收缩能力和复杂细胞核形态的活体评估（A-C比例尺=100微米，D-I比例尺=50微米）。A：心房，v：心室。 

通过追踪心肌细胞核对局部收缩力进行定量分析

我们对图像进行处理以实现单个细胞核的可视化后，通过追踪48至120小时胚胎阶段的心肌细胞核，基于这种新型分割方法对局部心脏收缩力进行量化分析，从而完成了收缩力分析（图4A-4G）。我们探究了发育中斑马鱼的拉伸水平变化对每个发育阶段的最内侧和最外侧曲率的时间变化拉伸值进行了心脏相关的归一化处理（图S3）。除拉伸量外，我们还计算了最内侧曲率与最外侧曲率区域的面积比对比。面积比是对三个标记物二维拉伸比内部区域局部变形的描述。我们以三个心肌细胞为标记物，分析了面积比随时间的变化情况。研究发现，最外侧曲率区域（即房室管直接从心房接收血液的一侧）的面积比高于心室最内侧曲率区域（图4H-4J）。

图4 所选标志物的面积比分析。(A–F) 分别代表48小时受精后、72小时受精后和96小时受精后心室肌细胞的收缩期重建图像，(D–F) 则代表不同发育阶段心肌细胞的舒张期重建图像。(G和H) 为细胞核目标区域的示意图，蓝色窗口代表光片切片。对斑马鱼心室体积进行采样，对比最内层曲率（绿色标志物）与最外层曲率（红色标志物）的收缩性（H）：通过追踪蓝色光学平面中以绿色标记的三个心肌细胞，得到最内层曲率的面积比，这揭示了不同发育阶段收缩性呈上升的趋势。(I) 通过追踪蓝色光学平面中以红色标记的心肌细胞，计算得到最外层曲率的面积比，结果显示最外层曲率的收缩性高于最内层曲率。(J) 72小时受精后，最外层曲率的面积比显著高于最内层曲率（n=3，p=0.05，单样本t检验）。

量化斑马鱼心肌细胞核的发育

在发育中的斑马鱼心脏中，细胞核数量的平均值在48、72、96和120小时受精后（hpf）分别为159±13、222±17、260±13和284±10（图5A）（n=15）。我们观察到，最外侧弯曲处的心肌细胞核的收缩期和舒张期体积大于最内侧弯曲处的体积（图5B-5E，表S1）。因此，我们推测由于房室管（AV canal）的血液直接流入（图4G），心室最外侧弯曲处承受了更大的机械变形（图4H和4I），进而导致细胞核体积更大。

图5. 斑马鱼心肌细胞核分析（A和B）：我们观察到，随着发育阶段的推进，心室心肌细胞核的数量有所增加。星号表示与前一时间点相比存在统计学显著差异，p＜0.05。（B）内曲率出现收缩期和舒张期细胞核体积扩张现象。（C）外曲率出现收缩期和舒张期体积变化趋势。（D和E）内曲率出现收缩期和舒张期细胞核表面积增长；（E）外曲率的收缩期和舒张期细胞核表面积情况。样本量n=15。

收缩力对心肌细胞核形态的影响

除了区域特征外，我们还量化了心肌心室细胞核的圆度（图6）。最内侧弯曲区域的各向同性/球形细胞核（图6A和6B）的平均伸长指数经评估为0.91，而外侧弯曲区域的细胞核则更细长/呈椭球形，平均伸长指数为0.71，这表明存在结构各向异性。有趣的是，尽管整个心动周期中细胞核会经历动态的扩张和收缩，但根据其在心室的位置不同，细胞核表现出明显的偏心率（长轴/短轴比值）差异（图5B–5E）。在这一方面，我们观察到了空间上的与更大的外曲率细胞核相比，最内侧曲率处的心肌细胞核受到限制，其长轴和短轴长度更短（图S4）。因此，我们推测不同心室区域的收缩力变化会调控心肌细胞的不同形态（表S1）（图4H和图4I）。这与心室外侧凹陷区域的细胞核体积更大以承受更大机械应力的情况相符，而内侧凸面区域的细胞核体积则更小。

图6 收缩期与舒张期圆度分析（A）观察到内曲率细胞核呈圆形（对称圆的伸长率=1，椭圆则<1），且舒张期的数值略高。（B）观察到外曲率心肌细胞核呈细长形，且舒张期的伸长率更高。（C和D）分别直观展示了内曲率细胞的圆形形态与外曲率细胞的椭圆形态的三维重建结果。此外，还通过二值图像展示了对应的侧视图和轴视图（比例尺=15微米）。 

讨论

尺度空间理论可理解为为每个光学切片生成的一组分层二维图像，这些图像是通过将图像从精细尺度模糊到粗尺度得到的。这会抑制所有与高斯核尺寸相当的图像目标。每张离焦图像都包含不同数量的边缘，这些边缘是通过将未解析的像素子集模糊到更低的分辨率而得到的。因此，无需预先了解细胞核大小即可实现多尺度边缘可视化。

由于斑马鱼心肌细胞核的长度在空间和时间上存在差异，范围为2至6微米（图S4），我们提出将尺度空间理论与分水岭分割相结合，以实现鲁棒的尺度不变边缘检测。利用HDoG斑点检测器固有的散焦适配能力，我们成功分离出单个质心（视频S1、视频S2），用于追踪动态心肌细胞核（视频S3、视频S4）。据此，我们得以成功表征房室瓣形成后至心脏成熟阶段的心室心肌拉伸情况。尽管使用PTU使斑马鱼实现了透明化，但组织双折射（折射率1.3–1.5）会导致发射光子的光程发生变化。因此，光散射会削弱光学成像的穿透能力，导致共聚焦区域外的细胞核发生融合（图2A））。考虑到这一点，我们旨在设计一种自动化斑点检测框架，该框架能对对应每个细胞核质心的单个高斯强度峰实现高灵敏度和可重复性检测。此外，所提出的框架还实现了对细胞核体积、表面积和形态等形态学特征的活体定量分析。野生型Tg(cmlc2:egfp)斑马鱼在直管心管阶段（24小时胚胎期）和心房腔心室心肌中呈现立方状心肌细胞形态，而在流出道心肌中则为伸长的心肌细胞形态。研究表明，心脏成熟过程中，细胞数量、面积或球形度等区域特异性心肌细胞表型受收缩力或血流等机械刺激的调控。这一点已通过缺乏心室收缩力的半心突变体（haf）突变表型得到验证。haf突变体的心室各区域（包括心房腔）心肌细胞均呈伸长状，且表面积增大，导致心室扩张。值得注意的是，haf突变体与野生型斑马鱼心室的心肌细胞数量一致，这表明收缩力是调控心肌细胞异常伸长的关键，而非心肌细胞异常增殖的原因。此外，既往研究显示，心肌细胞数量呈S形增长趋势（图5），并在发育后期（>96小时胚胎期）趋于稳定，标志着心肌细胞向心肌组织的特化。基于此，本研究提出的特征检测与细胞追踪算法，有望为解析心脏收缩对斑马鱼心肌细胞增殖的抑制作用及其对心肌细胞形态的次生影响提供重要见解。遗憾的是，目前因缺乏统计学上显著的数据，我们无法断定收缩力是抑制心肌细胞增殖的关键因素。不过，心室不同区域的心肌细胞所承受的机械负荷强度，似乎是其发育为不同形态的调控机制（图4、图6）。

分析心肌细胞运动（图S3），我们量化得出最外层曲率的面积比高于最内层曲率（图4H和4I），因此承受的机械负荷更大。此外，我们观察到，与内层呈球形形态的心肌细胞核相比，外层心肌细胞核呈现出伸长的形态。尽管尚未针对心肌收缩力的调控开展细胞核形态的表型筛选研究，但我们的数据表明，心肌细胞核的形状和大小与不同心室区域所承受的形变相关。外层的伸长状细胞核（图6）表明，为适应更大的外层机械强度，需要更大的表面积。另一方面，由于内层的形变小于外层，内层细胞核更小且呈立方形。从发育生物学角度来看，研究人员主要关注小梁形成的心室外层，但关于内层无小梁形成的相关研究缺乏充分的文献记载。因此，目前仍存在一个问题：究竟是何种不同的生物力学或分子信号机制，造就了有小梁的外层与光滑的内层。这一研究有望阐明斑马鱼同源基因中心室的发育过程，并助力儿科人群心脏再生相关的心脏病理生理学诊断或临床转化研究。不过，仍需开展进一步研究以验证这一假设。在这一方面，从新生大鼠心室分离出的心肌细胞中观察到的核形态也得出了相似结论，即心脏周期引发的形变会导致收缩期和舒张期的横截面积存在异质性。因此，本项创新性研究为探究人类心肌病的相关细胞数量、形态及细胞间作用力提供了极具价值的方向。未来研究将通过调节心肌收缩力，进一步分析心内区（IC）和心外区（OC）中心肌细胞的形态特征。

总之，我们提出了一种尺度不变特征检测器，用于量化融合细胞核的个体形态特征，并对斑马鱼心室进行生物力学分析。我们所提出的斑点检测与细胞追踪方法，将在分析细胞数量、体积、面积、球形度、增殖情况或心脏功能以表征心肌病表型方面展现出极大的应用价值。

结论

尽管我们成功地在不同尺度和密度下分离了融合的细胞核簇，但Hessian DoG特征检测器的可重复性高度依赖于高斯模糊权重的恰当识别（图S1）。此外，与DoG特征检测相比，先使用Hessian尺度空间检测器再进行分水岭后处理的方法更容易出现过分割现象，且细胞核数量的变异性更高。 

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。