题目：Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18371439/

期刊：Cell Stem Cell

摘要

斑马鱼是研究正常干细胞和癌症干细胞的有用模型，但由于成鱼不透明，相关分析一直局限于胚胎发生阶段。为解决这一问题，我们培育出了透明的成年斑马鱼，并向其移植造血干/祖细胞或肿瘤细胞。在造血辐射恢复实验中，移植绿色荧光蛋白标记的骨髓细胞后，可在移植后2小时至5周内对体内移植情况进行清晰的活体可视化评估。通过流式细胞术分选分析，透明斑马鱼与野生型斑马鱼的细胞移植成功率相当，但仅能在透明受体鱼中观察到这一过程。在肿瘤移植模型中，移植RAS黑色素瘤细胞后，短短5天内即可观察到肿瘤移植、增殖及远处转移的情况，而野生型受体鱼需3至4周才能观察到上述现象。这种透明的成年斑马鱼兼具灵敏度和分辨率，是活体干细胞研究的理想模型。

引言

过去三十年来，造血干细胞向免疫抑制受体的移植已被用作白血病等疾病的治疗手段。在动物模型中，通过分析受体动物骨髓或外周血的多系嵌合情况来评估特定群体的造血干/祖细胞（HSPC）活性。近年来，研究证实乳腺癌和髓母细胞瘤中存在肿瘤干细胞。这些罕见细胞被认为是所有其他肿瘤细胞的起源“种子”，研究人员通过筛选在连续移植实验中可反复增殖的细胞（即 CD133+ 细胞）对其进行分离。显然，肿瘤细胞在移植后会经历归巢过程，而这一过程尤其依赖于移植部位。长期以来，无论癌细胞是否经过纯化，其移植都被用作验证转移能力的检测方法能力。造血干祖细胞和肿瘤细胞均会归巢至小鼠骨髓血管腔室的相似位点，这一相互作用关键依赖于基质细胞衍生因子1-CXC趋化因子受体4通路。

我们实验室先前的研究已证实，斑马鱼是研究造血干祖细胞（HSPC）遗传学以及肿瘤干细胞生物学的有效模型。然而，与小鼠和人类研究体系一样，成年斑马鱼体内的空间分辨率受限于皮肤和皮下组织的正常不透明性，因此受到限制。现有的体内成像技术，如生物发光成像、正电子发射断层扫描（PET）、计算机断层扫描（CT）或磁共振成像（MRI），均在分辨率、灵敏度或所需设备成本等方面存在特定缺陷。

由于干细胞群体在体内的行为远比体外模型所能呈现的更为复杂，我们现在介绍一种透明成年斑马鱼模型，借助该模型，可在完整的体内脊椎动物系统中于单细胞水平上全面表征干细胞移植的动态与空间特征，且此系统适用于基因操作。

结果

组合色素突变体培育出透明成年斑马鱼

斑马鱼成体典型的色素沉着模式由三类排列成条纹的不同色素细胞构成（图1A）：黑色的黑色素细胞、反光的虹彩细胞以及黄色的黄色素细胞。nacre 突变体（图1B）因编码 mitfa 基因的突变而完全缺乏黑色素细胞。roy orbison（roy）斑马鱼（图1C）是一种自发突变体，其完全缺乏虹彩细胞，眼睛色素沉着均匀，黑色素细胞稀疏，皮肤呈半透明状。目前尚不清楚导致该突变体表型的基因。

图1D展示了同时发生nacre和roy双突变的斑马鱼。我们将这种因外形如幽灵而命名为casper的品系，在胚胎发育阶段和成年期均完全缺失所有黑素细胞和虹彩细胞。最显著的是，这种鱼的身体几乎完全透明。在成年雌性个体中，单个鱼卵清晰可见，如图1D所示。我们将casper品系的光学透明度与金色、白化、玫瑰色和豹纹等几种常用的斑马鱼色素突变体进行了比较。可观察到的器官在透明斑马鱼（casper）中，通过标准体视显微镜可观察到心脏、肠管、肝脏和胆囊。脑组织仅有少量可见。在其他研究的色素突变体中（见在线提供的图S1），除了玫瑰色突变体中的心脏和肠管外，这些器官均难以观察到。对透明斑马鱼（casper）心脏区域的观察（视频S1）显示，可观察到心室收缩，这使得该突变体可用于心脏功能遗传扰动的活体分析。透明斑马鱼（casper）完全具有生存能力，纯合交配的成鱼能以预期的孟德尔比例产生大量存活后代，且不存在杂合表型。

图1. 组合色素突变体培育出透明成年斑马鱼斑马鱼色素沉着突变体在神经嵴来源的特定细胞群中存在缺陷，表现为黑素细胞数量/分布模式被破坏，虹膜色素完全缺失。野生型斑马鱼（A）呈现出以黑素细胞为主的深色条纹交替分布模式。无黑素细胞的条纹间隙区域主要含有具有反光性的虹彩细胞和黄色黄色素细胞。nacre 突变体（B）因小眼畸形相关转录因子（mitf）缺失，导致胚胎和成体黑素细胞消失，同时虹彩细胞数量代偿性增加。roy orbison 突变体（C）的遗传缺陷目前尚未明确，其眼部色素沉着出现显著异常，光感受器层严重受损。我们将 roy;nacre 双纯合复合突变体（D）命名为 casper，该突变体体现了黑素细胞和虹彩细胞同时缺失的效应，成鱼身体因失去光的吸收和反射能力而整体呈透明状。

眼部和皮肤的透明性源于虹膜色素细胞晶体的缺失

对卡珀尔鱼进行切片，并用苏木精-伊红染色法以及马森三色染色法进行染色，以识别胶原纤维。卡珀尔鱼眼睛的大体形态正常，巩膜角膜边界保持完好，色素分布正常色素性视网膜上皮细胞。然而，巩膜虹色素细胞层完全缺失（图2A，箭头），这一点可通过折射性晶板的消失得到证实，这种晶板被称为虹彩细胞。在野生型个体中，色素性视网膜上皮通常会被反光性虹色素细胞覆盖；而在roy突变体中，由于虹色素细胞缺失，眼睛整个表面的黑色细胞得以显露。

皮肤的虹彩细胞是一种真皮-皮下组织结构，通常与周围的黄色细胞紧密相连，且恰好位于躯干骨骼肌上方。野生型斑马鱼（图2B，箭头）可见一层厚实的这类反光细胞，而casper突变体则完全缺失这一细胞层，但其剩余皮肤结构相对完整，包括表皮鳞片和真皮胶原纤维，马森三色染色也证实了这一点（数据未展示）。这些数据表明，casper突变体的相对透明性是由黑色素细胞缺失（通常会吸收入射光并保护皮下结构）和虹彩细胞缺失（通常会将入射光反射远离内脏器官）共同导致的。

图2. 眼部与皮肤的透明度源于虹膜色素细胞晶体的缺失野生型（A）和casper（roy;nacre）斑马鱼眼睛的横切面（B）显示，突变体斑马鱼眼睛呈现均匀色素沉着的主要原因是巩膜中反射性虹膜色素细胞的缺失（箭头指示野生型斑马鱼的虹膜色素细胞），这使得下方黑色的色素化视网膜上皮暴露出来。其余眼部结构保持完整。野生型（C）和casper（D）成年斑马鱼皮肤的横切面显示，野生型成年斑马鱼皮下组织中存在一层厚厚的虹膜色素细胞晶体（箭头），而casper斑马鱼的皮肤中该细胞层完全缺失。正常情况下会被表皮/真皮黑素细胞阻挡的光线能够深入穿透突变体斑马鱼的皮下组织，且由于缺乏虹膜色素细胞晶体，光线无法被反射出去。这使得正常波长的光线能够深入渗透组织。M：肌肉层；D：真皮层；Ir：虹膜色素细胞；C：角膜表面。

透明Casper突变体揭示造血干细胞归巢至骨髓腔的时机与归巢特性

本实验室此前的研究已证实，可移植的造血干/祖细胞（HSPC）骨髓群存在于成年肾脏中，且可通过前向散射和侧向散射的流式细胞术分析进行分离。我们从β-肌动蛋白：绿色荧光蛋白（GFP）转基因鱼（可标记除红细胞外的所有细胞类型）中分离出全肾骨髓细胞，并将 100,000 个全肾骨髓细胞与 200,000 个载体红细胞一起经心内（心室）移植到此前接受过 25 戈瑞辐射的卡斯特（casper）突变受体鱼体内。移植后 4 小时，心房心室周围出现一团血液，这很可能是心包囊中的外渗血液。2 周内（图 3A 左），在斑马鱼肾脏区域以及鳃血管中均观察到了绿色荧光蛋白标记的细胞群。到 4 周时，该绿色荧光蛋白标记细胞群的体积和分布均显著扩大，且此时主要集中在鱼的肾脏解剖区域（图 3B 右）。作为对照，展示了以相同方式移植的野生型鱼，结果表明在不透明的成年鱼体内通常几乎看不到绿色荧光蛋白。这些数据表明，透明的卡斯特突变体能够在亚致死剂量 25 戈瑞辐射后，直观地观察到造血祖细胞的植入，这与短期造血植入的结果一致。

从移植后4周的斑马鱼（casper突变体和野生型）中解剖出肾脏，分析其前向/侧向散射图谱以及绿色荧光蛋白（GFP）表达情况。尽管在野生型斑马鱼中，荧光体视显微镜下无法观察到绿色荧光蛋白（GFP），但在移植后4周可观察到造血细胞呈正常分布，且其中许多细胞为绿色荧光蛋白（GFP）阳性（图3B，上图）。根据散射图谱可判断已发生多系造血嵌合，这表明移植的细胞代表原始造血群体。casper突变体的肾脏也表现出相似的造血谱系重建，且这些造血细胞同样为绿色荧光蛋白（GFP）阳性，阳性程度相近（图3B）。这些数据表明，casper 突变体中绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞的解剖定位确实是骨髓重建的指示。

移植后4周的受体鱼被固定并进行苏木精-伊红（H&E）染色和抗绿色荧光蛋白免疫组化（IHC）处理。肾脏切片显示大量造血细胞（H）围绕肾小管（T）和肾小球（G）（图3C，左图），这与之前的观察结果一致。免疫组化显示所有造血细胞均呈强绿色荧光蛋白阳性（图3C，右图，棕色染色），而肾小管细胞均无绿色荧光蛋白染色。这证实了绿色荧光蛋白标记的骨髓细胞成功归巢至受体 casper 鱼的肾脏骨髓。

由于光学透明成年动物的主要优势之一是能够在活体动物中实现单细胞分辨率，我们接下来对4周前移植了β-肌动蛋白绿色荧光蛋白造血干祖细胞（HSPCs）的成年斑马鱼进行共聚焦显微镜观察。由于正常皮肤的不透明性，对移植的野生型受体进行成像未检测到可识别的绿色荧光蛋白信号。

相比之下，casper 突变体能够以约5微米的分辨率识别单个细胞和细胞簇（图3D）。蔡司共聚焦显微镜的最大成像深度距离皮肤表面为88微米。为了确保 casper 突变体普遍适用于干细胞生物学家，我们检测了野生型和 casper 受体在造血干祖细胞移植后的存活率。如图3E所示，尽管两组均显示初始操作在死亡率方面，各组间的存活率无显著差异，这表明casper在移植研究中的功能与野生型动物相似。

图3 透明casper突变体揭示造血干细胞归巢至骨髓腔的时间与归巢特性将β-肌动蛋白：绿色荧光蛋白（GFP）标记供体的全肾骨髓通过心内（IC）注射10万个细胞，移植到野生型((n=6))或透明（casper）((n=6))经辐照的受体中。从移植后4小时至5周，每周对斑马鱼进行一次成像。移植后2周（图A，左图），仅在casper品系中可观察到GFP阳性细胞循环并归巢至受体鳃部和头肾附近区域。至移植后4周（图A，右图），一群GFP阳性细胞紧密定位于斑马鱼肾脏——已知大多数成体造血组织的驻留部位。GFP阳性细胞仅能在透明的casper受体中被观察到。为确认GFP标记的细胞为真正的造血细胞，在移植后4周从野生型和casper受体中分离全肾并进行荧光激活细胞分选（FACS）分析（图B）。野生型受体（图B，左图）和透明突变体受体（图B，右图）的肾骨髓均成功重建了完整的造血细胞谱系。在两种受体中，分选细胞的GFP阳性亚群均占19%~22%，这与嵌合移植实验的预期结果相符。图C展示了移植后4周casper移植受体的组织学分析结果：苏木精-伊红（H&E）染色（图C，左图）显示大量造血细胞（标记为“H”）与正常肾小球（标记为“G”）和肾小管（标记为“T”）交织分布；使用抗GFP抗体的免疫组化染色（图C，右图）证实仅造血细胞呈强GFP阳性（棕色染色），而肾小管和肾小球为阴性。移植后4周，通过共聚焦激光扫描显微镜观察移植受体（图D），可清晰分辨肾骨髓腔中单个的GFP阳性细胞。野生型与casper突变体斑马鱼的移植后存活率无差异（图E）。比例尺为10毫米。

casper 突变株可快速识别移植的肿瘤细胞

接下来我们评估了透明 casper 斑马鱼能否用于分析移植后肿瘤的体内植入与迁移过程。将携带受黑素细胞特异性mitf启动子调控的人突变Braf或NrasGFP融合癌基因的稳定转基因斑马鱼，与p53⁻/⁻斑马鱼进行杂交。这些杂交鱼可在 412 个月内稳定发生高侵袭性黑色素瘤。取成年鱼的肿瘤组织制备成单细胞悬液，将 20 万个肿瘤细胞，通过腹腔注射（IP）或心室内注射（IC），移植到经过辐照处理的 casper 受体鱼体内。

NRASGFP 黑色素瘤细胞腹腔移植后 5 天内（图 4A 上图），可在腹腔内观察到一大团色素很深的肿瘤细胞；此外，还有少量细胞定位于背部表皮鳞片处（图 4A 上图圆圈标注区域）。NRASGFP 细胞经心室内注射移植 5 天后的植入模式（图 4A 下图），主要表现为肿瘤细胞沿移植针道局部聚集，但也能观察到部分细胞向背部迁移。图 4A 下图的插图显示，移植 10 天后采集的肿瘤细胞依旧呈强 GFP 阳性，这表明即便不存在黑色色素，依旧可以定位追踪这些肿瘤细胞。

图 4B 为注射 20 万个 BRAF;p53 黑色素瘤细胞、腹腔移植 14 天后形成的巨大肿瘤团块。通过采集该肿瘤的中外侧视角与腹侧视角图像，即可三维计算肿瘤体积（本例肿瘤体积为 1496 mm³）。该模型能够计算肿瘤三维体积以及肿瘤细胞的全身分布，为少量肿瘤细胞移植后的植入情况提供重要的定量分析手段，也有望用于监测治疗分子在体内产生的作用。

为量化肿瘤随时间的生长情况，我们使用普通体视显微镜对同一尾受体鱼连续成像，持续 4 周。如图 4C 所示，该实验鱼在此观察周期内存活状态良好，无需处死动物，即可在各个时间点检测肿瘤体积。由于无黑色素、仅带有荧光标记的肿瘤细胞也可以用同样方式观察，该肿瘤移植模型几乎适用于所有可移植肿瘤。

最后，为探究 casper 品系用于研究肿瘤转移进展的价值，我们对每尾移植了 BRAF;p53 黑色素瘤细胞的斑马鱼，检查是否存在肿瘤播散迹象。移植后 528 天，全部 24 尾受体鱼中有 9 尾（37.5%）出现远处转移，肿瘤初次播散的高峰期发生在移植后 510 天。图 4D 展示两尾代表性实验鱼，箭头指示最初的肿瘤接种位点。左侧图可见肿瘤细胞在鱼体内广泛播散，既有单个游离细胞，也有细胞团簇；右侧图中，一小簇细胞（见插图）已经远离接种位点，定植在背部皮肤，其中至少一个细胞具备迁移型黑色素瘤细胞特有的星状形态。由于（病灶与该远处细胞之间）不存在色素细胞在原发肿瘤团块与这个单一背侧细胞之间，这一发现支持了这些细胞源自原发移植灶扩散的观点。在同样进行移植的野生型斑马鱼中，移植后2至3周内未见明显肿瘤，也未检测到转移细胞。目前此类早期广泛扩散的机制尚不明确，但这可能是由于BRAF;p53供体细胞发生了复杂的遗传改变累积，因为供体肿瘤已存在超过一个月。未来我们计划研究决定移植细胞发生早期扩散能力的相关因素，以及扩散的微转移病灶与大量大转移病灶之间“转化”的机制。

图4。casper突变体可快速鉴定移植的肿瘤细胞在无需处死受体鱼的情况下，肿瘤体积可逐渐增大。腹侧和背侧视图可用于计算肿瘤的三维体积。在一项针对24条移植受体鱼的研究中，发现37.5%的鱼发生了远处转移，图(D)中展示了相关例子。单个迁移的（星状）黑色素瘤细胞（图D右侧插图框）在腹膜腔内移植14天后，已远离绿色荧光蛋白（GFP）阳性的移植位点并迁移至远处，且嵌入背侧皮肤。图B为移植后10天拍摄的(mitf-BRAF;p53)黑色素瘤细胞的腹腔内（IP）移植结果，可见细胞沿针道持续大量存在，但未向远处扩散。图A下方为腹腔内注射（IC）NRAS-绿色荧光蛋白（NRAS-GFP）细胞的结果，6条鱼中有3条（n=3/6）的细胞增殖并体积增大，还扩散至背侧表皮鳞片（圈出区域）。图A上方为将20万个NRAS-GFP驱动的黑色素瘤细胞通过腹腔内（IP，(n=6)）或心内注射（IC，(mitf-NRAS-GFP;p53)）移植至cas(C)成鱼体内后，移植后5天可观察到腹腔内出现一个大而深色素的肿块（(n=5)）。

讨论

casper突变体作为干细胞与肿瘤生物学体内成像模型

此处呈现的数据表明，青鳉鱼的光学特性实现了高分辨率（5毫米）、高灵敏度与适配常用实验室设备进行深层组织成像的独特结合。尽管与“透明”青鳉品系相似，但斑马鱼已成为研究干细胞和肿瘤生物学的更常用工具，且应广泛适用于干细胞研究人员。该品系的一个局限性在于，需要 nacre 和 roy 这两个突变均以纯合状态存在，这就需要至少两个繁殖周期才能利用现有的转基因品系。此外，由于 roy 基因的突变目前尚不明确（但正处于积极研究中），尽管该基因缺陷显然不影响存活率，但它仍可能对肿瘤或干细胞生物学的某些未知方面产生影响。明确 roy 基因的缺陷将有助于厘清这一点。最后，对极深层组织可能需要多光子显微镜技术，而该技术目前在斑马鱼系统中仍处于实验阶段。

透明斑马鱼与现有体内成像技术的对比

体内成像是研究细胞培养系统中分子过程的关键对应方法。所有成像技术的目标都是将分辨率（即单细胞或亚细胞水平）与灵敏度（全动物或器官水平）相结合，以全面了解具有独特体内行为的过程，例如肿瘤转移和归巢。目前的小动物体内成像包含多种技术，详见补充表 S1，这些技术通常互补使用。

生物发光已被用于检测荧光素酶阳性造血干细胞群移植后的植入和造血重建。尽管该研究中生物发光具有高灵敏度，但其空间分辨率有限（约 1–10 毫米），每只动物需要数分钟的成像时间，对深层组织的光检测能力受限，且需要静脉注射底物。利用移植肿瘤细胞的生物发光标记进行全动物成像，能够通过葡萄膜黑色素瘤细胞或肺癌细胞等细胞全面呈现肿瘤转移情况，但该技术在检测转移方面的灵敏度存在一定局限，因为转移扩散的生物发光证据可能需要 4 周或更长时间才能被检测到。我们能够在短短 3–5 天内清晰检测到明显转移灶，这在脊椎动物模型中是独一无二的，且其分辨率足以通过常规体视显微镜轻松观察到单个转移细胞。此外，生物发光技术在斑马鱼系统中的应用仅取得了有限的成功）。

荧光成像是一种应用广泛的技术，也是分析斑马鱼胚胎基因功能的标准方法；其图像采集速度快，但在成年野生型斑马鱼中的应用十分有限。我们的研究数据表明，得益于本研究模型的光学透明性，体视显微镜的有效成像范围可显著拓展至成年斑马鱼，且在可见光和荧光波段均能实现这一效果。结合共聚焦显微镜技术，可轻松实现单细胞分辨率成像，而双光子共聚焦显微镜的应用，有望在casper品系中实现更深层次的图像分辨率。将casper品系与多种标记脉管系统（如 fli-GFP，见图S2）或带有荧光标签的内脏器官（如标记胰腺的pdx-GFP、标记肝脏的LFABP-GFP）的转基因品系进行杂交，对于那些研究血管生成、器官稳态及损伤后再生的体内分析的研究者而言，具有重要的应用价值。不过，在casper遗传背景下直接注射转基因载体可能更具优势，因为这无需通过复杂的育种策略来维持roy和nacre基因的双重纯合状态。

尽管显微CT、磁共振成像（MRI）和正电子发射断层扫描（PET）在全身成像方面各有显著优势，但它们都需要高度专业的设备、大量的优化处理以及静脉注射造影剂。磁共振成像（MRI）是一种有用的技术在活体中可视化移植细胞，空间分辨率可达25–50微米，但需要对移植细胞进行大量磁性染料处理，灵敏度有限，且需要相当复杂且昂贵的设备。正电子发射断层扫描（PET）成像能够检测到数量相对较少的肿瘤细胞，但需要对细胞群进行放射性标记，灵敏度仅为中等水平，还需配备小型动物PET扫描仪，这类设备并未广泛普及。另一个问题是，计算机断层扫描（CT）和PET均需向斑马鱼施加一定剂量的辐射以获得足够分辨率，而这可能会产生独立的生物学效应。尽管这些技术未来都可能在斑马鱼成像领域发挥作用，但目前没有一种技术能像荧光显微镜那样，在透明斑马鱼（casper 斑马鱼）中实现快速成像、细胞级分辨率和高灵敏度。

未来应用

一种健壮、易繁殖且易于饲养的透明成年斑马鱼的培育，为在透明斑马鱼胚胎中开展的相关研究提供了重要的成年阶段补充模型。我们的研究数据表明，casper 斑马鱼将为那些关注干细胞移植与归巢等过程的研究者提供实用的研究平台。对于癌症生物学家而言，它为肿瘤生长、侵袭、转移及血管生成的纵向分析打开了新窗口，其解剖学分辨率在小鼠或其他实验系统中难以实现。当与标记血管（即 (fli) -GFP）或上皮组织（即角蛋白-GFP）等结构的转基因品系结合使用时，能够深入分析单个干细胞与其内源微环境相互作用的具体机制。由于成年斑马鱼非常适用于遗传和小分子筛选研究，casper 斑马鱼将为在脊椎动物体内开展干细胞与癌症生物学的体内精细研究提供条件，其研究结果与人类生物学具有高度相关性。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。