题目：Deficiency of Werner RecQ-type DNA helicase causes premature malnutrition in zebrafish

原文链接:https://doi.org/10.1016/j.isci.2026.114760

期刊：iScience

研究亮点

l 斑马鱼wrn截短突变体分为轻度和重度表型类别

l 严重的wrn突变体表现出严重的DNA损伤和细胞凋亡，进而引发肠道和胰腺缺陷

l 严重的 wrn 突变体表现出葡萄糖、糖原和脂肪水平降低，这表明存在营养不良的情况

l 增加食物供应量部分挽救了wrn突变斑马鱼的存活能力

摘要

沃纳综合征是一种以早衰症状为特征的遗传性早老症，但其早发性病理机制仍不明确。我们利用CRISPR/Cas9技术构建了wrn截短突变体（((wrn ^{-1-} ))）斑马鱼，并鉴定出两个过早死亡阶段：受精后7-21天和60-90天（dpf）。时间序列转录组学揭示了两个(wrn-1-)亚群。其中一个亚群在受精后7-9天出现肠道和胰腺外分泌基因表达降低，另一个亚群初期维持正常表达，但在21-35天时胰腺外分泌基因最终出现表达降低。过早死亡的wrn-/-幼鱼表现出肠道绒毛和胰腺缺陷，同时存在DNA损伤、细胞周期阻滞及细胞凋亡现象。与野生型和晚期死亡的wrn-/-幼鱼相比，它们的糖原、葡萄糖和脂肪水平更低，提示存在营养不良现象。值得注意的是，过量喂食可部分改善其存活率。这些研究结果揭示了沃纳综合征斑马鱼模型中的早期病理特征。

图形摘要

引言

早老症及相关早老样综合征是一类以与年龄相关的疾病过早发作为特征的遗传性疾病。典型例子包括哈钦森-吉尔福德早老症综合征、布卢姆综合征、科凯恩综合征、着色性干皮病（XP）、共济失调毛细血管扩张症（A-T）和沃纳综合征。哈钦森-吉尔福德早老症综合征、布卢姆综合征和科凯恩综合征多在生命早期（1–10岁）发病，而沃纳综合征则在20岁左右发病。沃纳综合征的症状包括头发变白、白内障、皮肤萎缩、胰岛素抵抗性糖尿病和动脉硬化。沃纳综合征患者还表现出特征性的身材矮小。在人类患者中已发现沃纳综合征基因WRN的多种变异型。人类WRN蛋白由1432个氨基酸组成，包含外切核酸酶、解旋酶、Recq羧基端（RQC）、解旋酶-核糖核酸酶D样羧基端（HRDC）和核定位信号（NLS）等多个功能结构域。该蛋白在DNA修复、复制、转录和端粒维持中发挥关键作用，且从细菌（大肠杆菌）到人类的多个物种中均高度保守。然而，其致病机制沃纳综合征中WRN缺失导致加速衰老的机制目前仍 largely 不明确，且尚未确立预防早衰的有效治疗方法。此外，20岁之前出现的早发症状也未得到深入研究。

在以往的细胞研究中，从WRN缺失型胚胎干细胞分化而来的间充质干细胞表现出细胞增殖能力降低、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性升高，同时(p15 ^{lnk4a })和(p21 ^{Waf1 })等衰老标志物的表达水平也有所升高。有趣的是，尽管有研究报道从沃纳综合征患者皮肤成纤维细胞诱导获得的多能干细胞（iPS细胞）在长期培养两年后仍能维持未分化状态，且未上调衰老相关基因， 但近期一项研究表明，在特定条件下，沃纳综合征iPS细胞相比野生型细胞会表现出加速衰老的特征，这提示衰老表型存在依环境而异的差异性。WRN基因敲除小鼠模型的研究结果则较为复杂。缺失部分基因的小鼠解旋酶结构域的部分（((W m^{Delta heV Delta heh }))）表现出基因组不稳定性增加不稳定以及寿命略有缩短。相比之下，完全缺乏 Wrn ((W r n^{-1})) 的小鼠则未表现出明显的（小鼠）仅缺失Wrn基因时，不会出现明显早衰特征，可存活两年以上，无显著衰老相关表型。但当Wrn敲除与p53或端粒酶 RNA 组分（Terc）突变组合时，这些双突变小鼠会出现寿命缩短，同时表现出基因组不稳定与早衰相关特征 。以上结果表明：仅敲除小鼠Wrn基因，不足以诱发显著的早衰表型，这也凸显了需要借助其他模式生物来研究维尔纳综合征的生理发病机制。

本研究选用斑马鱼（Danio rerio）构建维尔纳综合征模型。斑马鱼是一种应用日益广泛的脊椎动物模式生物，用于发育、行为与疾病研究 。标准实验室饲养条件下，斑马鱼寿命通常为 23 年。在早期发育阶段，胚胎依赖卵黄获取营养，直至受精后约 5 天（dpf），此后开始外源摄食 。仔鱼期为受精后 5 天至约 30 天；之后进入幼鱼阶段（3090 dpf），约 90 dpf 达到性成熟 。这些清晰明确的发育阶段转换，使斑马鱼成为研究脊椎动物生长、代谢和衰老的理想模型。

已有研究报道斑马鱼wrn的无义突变等位基因（wrn^sa34829，Q431*），该突变会造成解旋酶结构域发生截短 。该突变胚胎在胚胎发生的受精后 40 小时（hpf）就表现出体长缩短，同时软骨与骨骼发育受损。另有研究报道了斑马鱼wrn的两个突变等位基因：无义突变wrn^cq216（L173*），导致核酸外切酶结构域截短；以及内部缺失等位基因wrn^cq217，发生大片段缺失，缺失范围从核酸外切酶结构域中部一直延伸至 HRDC 结构域末端 ²²。上述突变体在受精后 8 天，肠道未出现明显形态异常，但 SAβ半乳糖苷酶活性升高；受精后 30 天体长降低，并且在 60 dpf 之前死亡。使用 mTOR 抑制剂 sapanisertib 处理，可抑制突变体肠道内 SAβ半乳糖苷酶活性。

本研究独立构建了一例斑马鱼wrn突变体，该突变发生 2 个碱基缺失，在解旋酶结构域产生移码突变。与既往研究不同，本研究的wrn突变体胚胎阶段并未出现体长缩短。约 90% 的wrn突变仔鱼在受精后 30 天前过早死亡；剩余 10% 个体出现生长迟缓，最终在 90 dpf 前死亡。转录组分析显示，发生早亡的wrn突变仔鱼存在胰腺外分泌细胞与肠道细胞功能缺陷。与该结果相吻合，本研究发现，wrn突变仔鱼因消化、吸收功能受损，出现营养不良。

结果

wrn 突变斑马鱼仔鱼阶段体型偏小且寿命缩短

为构建wrn/斑马鱼，本研究设计靶向wrn基因的 CRISPR 系统，获得 19 号外显子发生 2 个碱基缺失的突变等位基因（附图 S1A、S1B）。该突变等位基因在第 716 位丙氨酸残基之后发生移码突变（T717Sfs9），该位点位于解旋酶结构域三分之二处（图 1A、附图 S2）。该 2bp 缺失可通过 PCR 检测，能够实现对wrn^+/+、wrn^+/-与wrn^-/-的基因分型（附图 S1C）。wrn/个体中wrn的 mRNA 转录水平与wrn^+/+、wrn^+/-* 相比无明显差异（附图 S1D，附表 S1）。

为探究wrn基因缺陷是否影响胚胎发育，首先观察受精后 15 天（dpf）wrn^+/+和wrn/斑马鱼的形态。直至 5 dpf，并未观察到wrn/胚胎 / 仔鱼存在形态缺陷。已有报道的另一wrn突变斑马鱼，其无义突变（Q431*）发生在解旋酶结构域上游，该突变体在 2 dpf 即出现发育畸形、体长缩短 ²¹；与之相比，本研究获得的突变等位基因表型更温和，适合开展胚胎后发育阶段研究。

为明确wrn缺陷是否影响斑马鱼寿命，开展生存实验。由wrn^+/-亲本交配得到的wrn^+/+、wrn^+/-、wrn/仔鱼，在 5 dpf 时表型无法区分。5 dpf 将仔鱼转移至水循环养殖系统，持续饲养至 90 dpf。每日收集死亡仔鱼 / 幼鱼并进行基因分型。 总体来看，wrn^+/+仔鱼 90 天存活率为 86%（185/214），wrn^+/-仔鱼存活率 75%（353/472）；而86%（114/133）的wrn/仔鱼在 721 dpf 死亡（图 1B）。部分wrn/仔鱼存活超过 21 dpf，该阶段外观健康，和wrn^+/+无肉眼差异（图 1C、1D、1G，附表 S2）；但到 75 dpf 时，这些幼鱼体型显著小于野生型，色素沉着紊乱，条纹模式不规则（图 1E1G，附表 S2）。剩余 14%（19/133）的wrn/幼鱼于 6090 dpf 死亡。

上述结果表明：wrn/斑马鱼存在两个死亡阶段：早期 721 dpf，称为早亡期；后续 6090 dpf，称为晚亡期。本研究wrn/的表型与既往报道的wrn突变体均不相同 。

图1. (wrn-1-)斑马鱼表现出体型矮小且会过早死亡(A)野生型和突变型斑马鱼 Wrn 蛋白的结构域。（上）野生型 Wrn 蛋白包含核酸外切酶结构域、解旋酶结构域、Recq 羧基端（RQC）结构域、解旋酶与 RNaseD 样羧基端（HRDC）结构域以及核定位信号（NLS）结构域。（下）移码突变导致解旋酶结构域内发生截短。(B) (w m^{+1+}) 斑马鱼（黑色，(n=214)）、(w r n^{+/ *}) 斑马鱼（绿色，(n=472)）和 (wm~) 斑马鱼（红色，(n=133)）的生存曲线。采用对数秩检验评估统计学显著性。(C–F) 21 日龄（dpf）斑马鱼幼鱼图像：(C) wrn+/+ ((n=9)) 斑马鱼和 (D) wrn ((n=4)) 斑马鱼（比例尺：1 毫米）；75 日龄斑马鱼幼鱼图像：(E) (w r n^{+/+}(n=7)) 斑马鱼和 (F) (w m^{-1}(n=5)) 斑马鱼（比例尺：5 毫米）。(G) 21 日龄 (w m^{+/+}) 斑马鱼幼鱼（((n=9)) 斑马鱼和 wrn 斑马鱼 ((n=4))）以及 75 日龄幼鱼（(wrn ^{+/+}) 斑马鱼、((n=7)) 斑马鱼和 (wrn) 斑马鱼、((n=5)) 斑马鱼）的体长测量结果。采用非配对双尾 Student’s t 检验评估统计学显著性。数据以平均值±标准差（SD）表示。详细的平均值±标准差见表 S2。

wrn/斑马鱼肠道与胰腺外分泌相关基因表达下调

为解析仔鱼期wrn/发生早亡的内在变化，对单条仔鱼开展时间序列转录组分析。选取覆盖早亡窗口期的 13 个时间点（435 dpf），分别提取wrn^+/+与wrn/斑马鱼全鱼 RNA 开展转录组测序，每个时间点样本量 38 例（附表 S3）。

主成分分析（PCA）结果显示：59 dpf 野生型仔鱼基因表达模式相对均一；910 dpf 基因表达轨迹发生明显转变（图 2A、2B）；1021 dpf 样本形成离散聚类；2128 dpf 基因表达轨迹再次发生偏移。 在 6 dpf 之前，wrn/仔鱼转录组数据分布与野生型接近（图 2C）。但自 79 dpf 起，部分wrn/样本开始与野生型分组发生偏离，该时间点与早亡发生时间重合。值得注意：转录组的改变早于肉眼可见的形态异常，提示分子层面变化发生在表型显现之前。 大部分存活超过 9 dpf 的wrn/仔鱼，在 1021 dpf 转录组与野生型相近；但在 2835 dpf，二者基因表达模式再次出现分化。聚类分析将全部样本划分为 10 个组别（图 2D、2E）。值得注意的是，8号簇仅包含编号为(wrm)、日龄7至9天的幼虫，这大概率代表早亡群体，该群体在日龄21天时发生死亡（图2F）。相比之下，编号为(wrn ^{+/+})和(w m^{-1-})、日龄28至35天的幼虫均被归为2号簇。2号簇中编号为(wrn ^{-1-})的幼虫大概率代表晚亡群体，该群体在日龄60至90天时发生死亡。

我们对(w m^{-1-})幼虫的基因表达变化进行了研究，以探究其致死性的潜在原因。在所有样本中检测到的21887个差异表达基因中，有108个基因在受精后7-9天的8号簇中显著上调（图S3A）。但对这些基因进行基因本体（GO）富集分析后，未得到具有统计学显著性的条目。相比之下，有146个基因在8号簇中呈下调趋势（图2G、图S3B和图S3C）。其中，35个基因在wrn-/-幼虫的8号簇和2号簇中均出现下调，而这两个簇均与死亡率升高相关（图2G、图2H、图S3D，表S4）。利用斑马鱼单细胞转录组在线图谱进行分析发现，35个基因中有26个特异性表达于胰腺外分泌细胞、ε细胞，以及肠道肠上皮细胞和杯状细胞中（图2I和图S3E）。胰腺外分泌标志物prss1和amy2a的表达水平，在(wrm)幼虫的受精后7-9天和21-35天均出现降低（图2J和图2K；表S5），而肠道标志物fabp2和apoa1a则在受精后8-9天出现下调（图2L和图2M，表S5）。这些结果表明，(wrn ^{-1-}) 致死性的病理特征归因于胰腺外分泌功能和肠道功能受损。

我们还评估了DNA损伤和细胞衰老的时间进程。从受精后7天开始，(w m^{-1-})幼虫的DNA损伤标志物(p53)表达量升高，且此后逐渐增强（图S3F、表S5）。相比之下，在受精后35天内，(w m^{+/+})和(wrn ^{-1-})幼虫的细胞衰老标志物p21和(p16)表达水平无差异（图S3G、S3H、表S5）。这些结果表明，(wrn ^{-1-})幼虫的DNA损伤最早出现在受精后7天，而细胞衰老至少在受精后35天前未发生进展。

图2 斑马鱼 wrn/突变体中胰腺与肠道细胞标志物的表达水平下降

(wrn ^{-1-})幼虫在濒死阶段肠道和胰腺的进行性组织学缺陷

为了研究 (wrm-1-) 幼虫的组织学异常，我们使用了转基因斑马鱼品系 Tg(ptf1a:EGFP)，该品系可标记胰腺外分泌细胞，从而揭示其整体形态胰腺。24,25 在5 dpf时，GFP阳性的外分泌细胞为在 (w r n^{+/+}) 和 (w m^{-1-}) 幼虫的身体右侧鱼鳔下方观察到（图3A、3B和3O；表S6）。到7天胚胎期（dpf）时，(w m^{-1-}) 幼虫可分为两类（突变个体可分为）两种截然不同的表型组。其中一组下文称为wrn/_mild（wrn 纯合轻症型），形态表现基本正常，但 GFP 信号出现中度减弱（图 3C、3D、3O，附表 S6）。另一组称为wrn/_severe（wrn 纯合重症型），个体体态消瘦，GFP 阳性区域显著缩小，常伴随信号不连续、片段化现象（图 3E、3O，附表 S6）。无论是受精后第 9 天还是第 12 天（9、12 dpf），wrn/_mild 仔鱼胰腺外分泌细胞的 GFP 阳性区域均小于野生型 wrn^+/+仔鱼；而 wrn/_severe 仔鱼的 GFP 表达稀疏且断断续续（图 3F3K、3O，附表 S6）。这些重症个体在肉眼可见消瘦后的 5 天内便会死亡。

图3. wrn-/- 斑马鱼幼鱼胰腺和肠道的形态异常

以上结果提示：在受精后 5 dpf 之后，一部分 wrn/仔鱼会随机发生胰腺外分泌功能缺陷，进而出现进行性消瘦并过早死亡。对 9 dpf 石蜡切片进行苏木精伊红（H&E）染色证实：wrn/_mild 仔鱼的胰腺体积略小于野生型 wrn^+/+；而 wrn/_severe 仔鱼的胰腺体积相较于野生型与轻症个体均显著缩小（图 3L3N）。斑马鱼肠道上皮存在向外突起的肠绒毛结构，该结构用于提升营养吸收效率 ²⁶,²⁷。野生型 wrn^+/+仔鱼肠道腔内可见完整肠绒毛；但 wrn/_mild 与 wrn/_severe 仔鱼的肠绒毛均出现缩短（图 3L3N、3P，附表 S7）。此外，与野生型相比，轻症、重症突变仔鱼的肠道表面积均出现下降（图 3L3N、3Q，附表 S7）。胰腺与肠道的这些组织学缺陷，和转录组异常结果相互印证。原位杂交实验证实，在 5 dpf 与 7 dpf 仔鱼中，wrn基因可在胰腺与肠道组织表达（图 3R、3S），进一步支持该观点：消化器官是wrn功能缺失后主要受损的靶组织。WRN 蛋白是参与 DNA 损伤修复的 DNA 解旋酶，据此我们提出假设：wrn/仔鱼无法修复 DNA 损伤，造成胰腺、肠道组织发生细胞周期阻滞与细胞凋亡。利用 Tg (ptf1a:EGFP) 转基因品系仔鱼做冰冻切片，开展 γH2AX 免疫染色：5 dpf 时，野生型wrn^+/+仔鱼的肠道、GFP 标记胰腺组织均未检测到 DNA 损伤信号（图 4A）；但 wrn/仔鱼的这两种组织均可检测到 γH2AX 信号（图 4B、4F、4G，附表 S8）。7 dpf 时，野生型两种组织依旧无损伤信号（图 4C）；而 wrn/_mild、wrn/_severe 均出现明显 γH2AX 信号（图 4D4G，附表 S8）。有意思的是，重症个体两种组织的信号强度反而有所下降（图 4F、4G，附表 S8）。

EdU 增殖标记结果显示：5 dpf 时，野生型与 wrn/仔鱼的肠道、胰腺均存在增殖细胞（图 4H、4I、4M、4N，附表 S8）。7 dpf 时，野生型与 wrn/_mild 仔鱼胰腺仍可检测 EdU 阳性增殖细胞；但 wrn/_severe 仔鱼胰腺完全消失增殖信号（图 4J4M，附表 S8）。在肠道组织中，相比野生型，wrn/_mild、wrn/_severe 仔鱼 EdU 阳性细胞数量均显著降低（图 4J4L、4N，附表 S8）。TUNEL 凋亡染色结果：5 dpf，野生型和 wrn/仔鱼的胰腺、肠道几乎检测不到细胞死亡信号（图 4O、4P、4T、4U，附表 S8）。7 dpf，野生型、wrn/_mild 仔鱼胰腺、肠道凋亡细胞仍然很少（图 4Q、4R、4T、4U，附表 S8）；而 wrn/_severe 仔鱼的两种组织均出现 TUNEL 阳性凋亡细胞，胰腺凋亡尤为突出，肠道凋亡程度次之（图 4S4U，附表 S8）。

图4.(wrm)幼虫胰腺和肠道发生DNA损伤、细胞死亡和增殖阻滞

综合上述结果：在早亡阶段，wrn基因缺失会诱发 DNA 损伤，进而造成消化组织细胞增殖受损、细胞凋亡增多。既往文献报道：wrn 缺陷斑马鱼的肠道端粒长度短于野生型 。本研究采用 qPCR 方法检测全鱼端粒长度，结果显示 7 dpf 时，wrn/_severe 重症仔鱼的端粒长度，与野生型、wrn/_mild 轻症相比没有显著缩短（附图 S4，附表 S9）。该结果提示：在该发育阶段，胰腺、肠道的组织异常更可能来源于DNA 损伤累积，而非端粒缩短。

wrn/斑马鱼出现营养不良

胰腺和肠道分别在营养消化、营养吸收过程中发挥关键作用²⁸,²⁹，因此我们探究wrn/仔鱼是否存在营养缺乏。 将转基因品系 Tg (ptf1a:EGFP) 与wrn^+/-斑马鱼交配获得仔鱼，依据 GFP 信号强弱将仔鱼分为三类：wrn/_mild（wrn 纯合轻症）、wrn/_severe（wrn 纯合重症）以及表型正常仔鱼。收集受精后 9 天（9 dpf）仔鱼的全鱼裂解样本，测定葡萄糖与糖原含量；之后再进行基因分型，确认个体的基因型分组。 检测结果显示：wrn/_severe重症仔鱼的葡萄糖水平显著低于野生型wrn^+/+和wrn/_mild轻症仔鱼（图 5A，附表 S10）。与之类似，相较于野生型与轻症个体，重症仔鱼的糖原水平也出现明显下降（图 5B，附表 S10）。油红 O 染色结果显示，在受精后第 9 天，wrn/_mild轻症与wrn/_severe重症仔鱼的脂肪蓄积量均低于野生型wrn^+/+仔鱼（图 5C5F）。

如果wrn-/-_严重型幼虫在受精后5天因营养不良死亡，提供过量食物或许能通过让它们更易获取营养来提高存活率。为验证这一假设，我们利用wrn+/-杂交的幼虫重复了存活率测定实验，将这些幼虫分别置于过量喂食和正常喂食条件下培养。当wrn+/+和(wrn ^{-1-})幼虫在无食物条件下培养时，无论基因型如何，所有个体均在受精后9至14天死亡，这与wrn-/-_严重型幼虫过早死亡的时期一致（图5G）。在过量喂食条件下，(w m^{+/+})幼虫的存活率相较于正常喂食的对照组无明显改善，而(w m^{-1-})幼虫的存活率在受精后21天时提升了约20%。为进一步探究过量喂食对wrn-/-幼虫的挽救作用，我们根据胰腺外分泌组织的形态，将正常喂食和过量喂食的(wrn-1-)幼虫分为(w m^{-1})_轻度型和(w m^{-1-})_严重型两组（图5H-5M）。与正常喂食的幼虫相比，过量喂食使wrn-/-_严重型幼虫的胰腺体积增大（图5N，表S6）。这些结果表明，营养不良是(w m^{-1-})幼虫过早死亡的主要原因，而营养补充可通过促进胰腺状态的恢复来延长其存活时间。

图5. 过早死亡的(wrm-1-)斑马鱼出现营养不良

讨论

wrn基因缺陷的斑马鱼表现出两个死亡阶段：90%的<severe>个体在受精后7至21天过早死亡，而10%的<mild>个体则在受精后60至90天死亡（图6）。我们推测，早发性和迟发性死亡的出现是由突变表型的随机变异导致的，而非额外突变引起，因为我们通过与野生型品系反复回交来维持斑马鱼wrn突变等位基因，且这两个不同亚群的出现情况在多代中保持一致。<severe>幼虫的肠道和胰腺外分泌细胞出现DNA损伤、细胞增殖减少以及细胞死亡增加的情况。由于这些组织对营养物质的消化和吸收至关重要，其功能障碍会导致营养不良和早期死亡，而过量喂食可部分挽救这一表型。

图6. wrn-/-斑马鱼的示意图

RNA测序的应用

我们开发了一种高通量RNA收集方案38，并对(wrn ^{+/+})和(w m^{-1-})幼虫进行了时间进程RNA测序。这揭示了(wrn-1-)个体中胰腺和肠道基因的下调，确定消化组织缺陷是导致过早死亡的原因。尽管我们尝试寻找区分wrn-/-_轻度和wrn-/-_重度的早期标志物，但未找到明确的候选基因，这可能是由于单幼虫RNA样本的细胞分辨率有限。时间进程单细胞RNA测序可能有助于鉴定表型出现前细胞类型特异性的脆弱性或信号。

自噬-线粒体自噬-氧化应激轴

我们的RNA测序分析显示，在(wrn-1-)斑马鱼中，参与自噬、线粒体自噬和氧化应激反应的基因出现上调。这一发现与以往研究结果一致，以往研究表明，人类细胞中WRN蛋白的缺乏会导致线粒体功能障碍、(NAD+)耗竭以及氧化应激水平升高¹²。此外，(NAD+)补充剂可恢复线粒体自噬并缓解WRN缺陷型细胞的衰老。在我们的斑马鱼模型中，自噬和线粒体自噬相关基因（atg9a、optn、bnip3lb 和 fis1）的表达升高，可能反映了对氧化应激增加和线粒体损伤的一种代偿反应。这些转录组学这些变化支持以下观点，即代谢和线粒体功能障碍是WRN缺乏症中组织变性的诱因。未来的研究需采用活性测定法（如活性氧、NAD+/NADH比率以及线粒体自噬通量的检测），以确定这些转录变化是否会在本研究模型中转化为生理缺陷。

斑马鱼营养不良引发的脆弱性

为了确定营养不良是否导致(w m^{-1-})幼虫过早死亡，我们在各种喂养条件下进行了生存测定。在饥饿下，(wrn ^{+/+})和(wrn-1-)幼虫都在相似的时间内死亡（9-14 dpf），这表明食物摄入提高了两种基因型的存活率。过度喂养提高了(wrn-1-)幼虫的存活率，并增加了胰腺外分泌细胞中表现出正常水平荧光的个体比例，这表明饮食条件是在(w m^{-1-})幼虫中观察到的早期致死性的基础。因此，增加营养可用性可以减轻斑马鱼的死亡率。虽然外分泌胰腺功能不全尚未被报道为沃纳综合征的常见临床特征，但身材矮小，这是该疾病的常见症状，可能部分归因于营养供应不足。事实上，一个伴有营养不良的沃纳综合征病例在营养和维生素后表现出明显改善补充.39

过度喂养和mTOR抑制的有益效果之间的明显差异22可以用潜在机制的差异来解释。过度喂养可能通过改善营养可及性来减轻营养不良的次要影响，从而支持wn-/-幼虫的整体新陈代谢和器官维护。相比之下，mTOR抑制剂直接作用于营养传感途径，以减少mTOR信号的过度激活，这与wn-/-缺乏的发病机制有关。因此，尽管这两种干预措施都提高了存活率，但它们可能通过不同的机制发挥作用：过度喂养在机体水平上补偿营养缺乏，mTOR抑制在分子水平上减轻细胞应激。

表型变异取决于突变类型

我们的斑马鱼WRN突变体（((wrm ^{agu26 } ))）表现出比报告的WRN突变体（((wm ^{c q 216})和(wm cq217)）更强的表型Ma等人，尽管保留了更大部分的蛋白质一种可能的解释是我们的突变体中的截断蛋白保留了完整的N末端核酸外切酶结构域，该结构域可能表现出改变的生化特性或异常的相互作用，而不是产生典型的WRN功能。此外，截断蛋白中的残余结构域可能会错误折叠或错位，进一步加剧表型。发育分析时间的差异、组织特异性敏感性和用于评估表型的分析也可能导致明显的差异。有趣的是，在沃纳综合征小鼠模型中也有类似的观察报告。Wrn功能的完全丧失产生相对温和的表型，而保留部分结构域的突变可能会导致更明显的异常，可能是由于错误折叠或错误处理的截断蛋白扰乱了细胞同源性stasis.14,16,40,41这些事实表明，trun的存在阳离子化的、部分功能性的WRN蛋白有时比蛋白质完全丧失更有害，这与我们在斑马鱼突变体中观察到的更强的表型一致。因此，在斑马鱼和小鼠中，突变类型和保留的域严重影响表型严重性，突出了WRN缺乏模型中突变特异性影响的重要性。携带WRN基因突变的沃纳综合征个体也表现出不同的临床特征与WRN蛋白保留的程度密切相关。

其他RecQ解旋酶在RN缺陷斑马鱼中的潜在补偿作用

先前的研究表明RecQ解旋酶在维持基因组中具有重叠和补偿功能在人类细胞中，RECQL5与WRN合作确保正确的脱氧核糖核酸复制和修复，同时失去两种解旋酶会导致复制叉恢复和基因组维护的协同缺陷停滞的复制叉和同源重组中间中间体。RECQL4 在DNA修复过程中也与WRN存在部分冗余的作用在DNA修复过程中与WRN相关。这些研究结果表明，其他RecQ解旋酶，如recql5、blm和recql4，可能会补偿斑马鱼中WRN的缺失。因此，在wrn-/-幼虫中观察到的可变表型严重程度可能反映了此类代偿反应程度的差异。为了验证这一可能性，构建同时缺失WRN和另一种RecQ解旋酶（如recql5或blm）的双突变体将具有重要意义。对它们的存活率、生长情况和基因组稳定性进行比较分析，能够揭示这些基因是否在体内减轻了WRN缺失带来的影响。此类研究将加深我们对RecQ解旋酶家族功能冗余性的理解，并阐明沃纳综合征表型变异背后的分子基础。

晚亡型wrn-/-斑马鱼作为沃纳综合征模型的潜力

在人类中，WRN 基因突变会导致沃纳综合征，患者在20岁左右就会出现早衰症状。相比之下，仅缺乏 WRN 基因的小鼠仅表现出轻微的早衰特征，除非同时存在 p53 基因缺陷或端粒酶功能异常突变。另一方面，wrn 基因缺陷的斑马鱼斑马鱼在单基因敲除后会表现出特定表型。部分带有严重表型的个体在幼体阶段会因肠道和胰腺发育缺陷出现营养不良，而另一些轻度表型的个体则会在后续出现生长迟缓与寿命缩短的情况。在人类中，不孕不育是沃纳综合征的主要临床特征之一。然而，我们无法评估wrn-/-斑马鱼是否达到性成熟，因为它们在约90天pf时死亡，这与斑马鱼性成熟的典型起始时间相符。在本研究中，我们主要关注wrn-/-斑马鱼的幼体阶段，以确定其基础表型。不过，一部分突变体出现了晚期死亡的情况，这可能与人类沃纳综合征中观察到的成年发病表现相关。这一晚期死亡阶段为研究该疾病的进展性特征提供了重要契机，包括细胞衰老、代谢损伤以及氧化应激积累等方面。未来针对这些后期阶段的研究，结合分子衰老标志物和线粒体功能的评估，将有助于阐明早衰的潜在机制，并进一步验证(wrn ^{-1-})斑马鱼作为成年发病型沃纳综合征综合模型的有效性。

本研究的局限性

本研究证实(wrn ^{-1-})斑马鱼表现出沃纳综合征样表型，但仍存在若干局限性需予以说明。首先，斑马鱼与哺乳动物在生理层面存在差异，包括免疫和内分泌调控等方面，这可能会限制本研究结论向人类的直接转化。其次，尽管批量RNA测序为整体转录组变化提供了宝贵见解，但该技术缺乏细胞分辨率，可能会掩盖组织特异性或细胞类型特异性的效应。鉴于部分观察到的缺陷（如生长迟缓、消化组织缺陷）很可能具有组织和细胞类型依赖性，未来研究需采用单细胞技术RNA测序（RNA-Seq）或空间转录组学对于解析与WRN基因缺失相关的异质性细胞反应至关重要。斑马鱼单细胞和空间转录组学的最新进展已成功绘制出发育阶段和成年阶段组织及细胞类型特异性的表达谱。整合此类方法将使我们能够确定驱动组织特异性变性的分子通路，并识别出对(w m^{-1-})最敏感的细胞群。第三，我们主要从转录水平而非蛋白质丰度或活性推断功能变化。未来将单细胞或空间转录组学与蛋白质组学或代谢组学分析相结合的研究，将更全面、更深入地理解WRN基因在脊椎动物衰老中的作用，以及其与人类沃纳综合征的相关性。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。