题目：Demarcation of Topologically Associating Domains Is Uncoupled from Enriched CTCF Binding in Developing Zebrafish

原文链接:http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

期刊：iScience

摘要

CCCTC结合因子（CTCF）是一种保守的结构蛋白，在基因调控和三维（3D）染色质组织中发挥关键作用。为了更好地理解脊椎动物基因组组织的机制与进化，我们利用内源性表位标记的CTCF敲入等位基因分析了斑马鱼中CTCF的基因组占据情况。斑马鱼CTCF与其哺乳动物同源物具有相似的特征，包括与增强子、活性启动子和重复元件的结合，以及其结合位点的双分基序。然而，我们发现，在发育中的斑马鱼体内，CTCF的体内结合并未在拓扑关联结构域（TAD）的边界处富集，而染色质标记对TAD的划分与哺乳动物并无差异。我们的数据表明，3D染色质组织的通用机制，尤其是CTCF在该过程中的参与机制，在亲缘关系较远的脊椎动物物种之间存在差异。

引言

CCCTC结合因子（CTCF）是基因表达的关键调控因子，在哺乳动物基因组的三维组织结构中发挥核心作用（Dixon等人，2012；Guo等人，2015；Nora等人，2017）。在哺乳动物中，CTCF界定了拓扑关联结构域（TAD）的边界，而这些区域CTCF结合位点的破坏会导致相邻结构域之间形成异位接触（Despang等人，2019；Dowen等人，2014；Lupiańez等人，2015）。CTCF及其在基因调控中的功能在两侧对称动物中高度保守（Heger等人，2012），但其在三维基因组组织中的功能在无脊椎动物和脊椎动物之间存在分化。与哺乳动物不同，果蝇CTCF对胚胎发生并非必需，且其结合在TAD边界处并未富集（Gambetta和Furlong，2018；Rowley等人，2017）。鉴于CTCF在果蝇和哺乳动物中的功能分化，对其他非哺乳动物脊椎动物的CTCF分析是理解三维染色质组织进化与调控的关键。尽管斑马鱼发育过程中CTCF的功能已被先前研究探索（Carmona-Aldana等人，2018；Delgado-Olguín等人，2011；Meier等人，2018；Rhodes等人，2010），但目前尚未获得斑马鱼全基因组范围内的CTCF体内结合数据。与哺乳动物类似，斑马鱼TAD边界处预测的CTCF结合基序以反向 divergent方向分布（Gómez-Marín等人，2015；Kaaij等人，2018），这表明CTCF在TAD界定中的功能具有保守性。本研究通过构建ctcf表位标记等位基因，鉴定并分析了斑马鱼胚胎发育过程中的CTCF结合分布。尽管斑马鱼CTCF的部分基因调控特征与哺乳动物相似，但在斑马鱼胚胎的TAD边界处未检测到CTCF体内结合的富集，这提示脊椎动物之间CTCF在三维基因组结构中的功能存在差异。

结果与讨论

利用ctcf HPSH斑马鱼等位基因鉴定体内CTCF结合位点

为确定斑马鱼基因组中的CTCF结合占有率，我们构建了ctcf的标签等位基因，在ctcf的起始密码子后框内插入了三部分HA-PreScission-His标签，使N端内源性CTCF被HPSH标记（ctcf^HPSH等位基因）（图1A、图S1A及透明方法）。我们验证了标记蛋白在ctcf^HPSH/HPSH斑马鱼中的表达（图1B）。纯合ctcf^HPSH/HPSH斑马鱼发育正常，具有生存能力且可育，表明CTCF的功能未受该标签影响（图S1B、图S1C）。对受精后24小时（hpf）ctcf^HPSH胚胎中CTCF结合的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析显示，生物学重复之间具有高度相关性（图1C、图S1D），并证实了此前报道的CTCF对其启动子的自调控结合（图S1E）。（普加乔娃等人，2006）。在合并两次重复实验的ChIP-seq数据中，我们鉴定出36540个CTCF峰，这些CTCF峰的phastCons序列保守性高于随机对照区域（图1D及透明方法）；仅考虑不与外显子重叠的CTCF峰时，也观察到了相同趋势（图S1F）。值得注意的是，在斑马鱼基因组中鉴定出的CTCF峰数量大致与哺乳动物基因组中的CTCF结合位点数量相当（普加乔娃等人，2020）。因此，ctcf HPSH斑马鱼等位基因能够可靠且可重复地检测斑马鱼基因组中CTCF的体内结合情况。

图1. 斑马鱼中CTCF结合的鉴定(A)ctcf HPSH 斑马鱼等位基因的示意图。橙色和紫色框分别代表插入序列和外显子。(B) 对野生型（WT）和 ctcf HPSH/HPSH 完整胚胎及成年大脑提取物使用抗血凝素（HA）抗体进行的蛋白质印迹分析。右侧标注了分子量。γ-微管蛋白作为上样对照。(C) 轨迹图展示了 neurod2 和 mycla 基因座（均位于反义链）上 CTCF 峰（紫色条）的示例。展示的信号分布和峰对应生物学重复样本（重复1、重复2）。Y轴信号以 CTCF 染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）信号的 p 值 (-log10) 表示。(D) 以峰中心为参考点，CTCF 峰与对照区域的平均序列保守性分布。另见图S1及表S1、S2。

脊椎动物中CTCF结合位点的共同特征

由于哺乳动物CTCF在建立增强子-启动子相互作用中发挥作用（Sanyal等人，2012），我们分析了24小时斑马鱼胚胎中斑马鱼CTCF结合与组蛋白修饰及DNA可及性的关系（Aday等人，2011；Bogdanovic等人，2012；Gehrke等人，2015；Irimia等人，2012；Ulitsky等人，2011）（表S1、表S2及透明方法）。我们发现，斑马鱼CTCF峰富集于 poised 染色质（H3K4me1）、活性染色质（H3K4me3、H3K27ac）和可及性染色质（ATAC-seq），而非非活性染色质（H3K27me3）（图2A）。此外，从头基序识别发现一个20bp的核心基序，该基序存在于78%的CTCF峰中，且与人CTCF基序的相似性高于人CTCF样基序或果蝇CTCF基序（图2B及数据S1）。与其他脊椎动物的研究结果一致（Boyle等人，2011；Filippova等人，1996；Kadota等人，2017；Rhee和Pugh，2011；Schmidt等人，2012），我们还识别出富集的CTCF上游基序，其与核心基序之间由8bp或12bp的间隔序列分隔（图2C及图S2A）。与哺乳动物CTCF结合位点类似（其中部分位点通过重复元件的逆转录转座在基因组中传播；Schmidt等人，2012），非自主性DNA转座子在CTCF结合位点上显著富集（图2D、图S2B、图S2C及表S3）。综合来看，我们的分析表明斑马鱼与哺乳动物的CTCF结合位点具有相似的特征。

尽管 CTCF 峰主要位于内含子和基因间区，但有 6% 的峰出现在启动子内（图 3A）。在人类中，启动子和基因内区域的一部分 CTCF 位点参与形成环状结构这些因素会影响外显子的包含情况（Ruiz-Velasco 等人，2017），这也为斑马鱼中存在类似机制的可能性提供了依据。由于现有斑马鱼高通量染色体构象捕获（Hi-C）数据的分辨率仅为20千碱基对（kb）（Kaaij 等人，2018），无法对这类环状相互作用进行研究，因此我们旨在确定CTCF结合启动子基因的独特特征。我们根据CTCF峰的信号强度，将所有在启动子处表现出CTCF结合的基因分为三类，信号强度从高（前10%分位数）到低（后10%分位数）不等（图3B及透明方法部分）。我们发现，无论CTCF基序相对于转录的方向如何，其存在与CTCF结合丰度均呈正相关（图S3A）（独立性检验，p值<0.05）。启动子处CTCF结合丰度的增加也与基因表达水平的升高（White 等人，2017）（图3C）以及DNA可及性的提高（图3D）呈正相关。值得注意的是，启动子处的CTCF结合并非仅仅是染色质开放状态的反映，因为我们还发现了一些ATAC-seq信号较高但无CTCF结合的启动子（图S3B）。CTCF启动子结合丰度高的基因，其组蛋白修饰信号也较高，这些组蛋白修饰分别与增强子（H3K4me1、H3K27ac）、活性启动子（H3K4me3、H3K27ac）以及转录延伸相关（图S3C-S3F）。相比之下，我们未发现抑制性染色质修饰（H3K27me3）与CTCF丰度之间存在相关性（图S3G），但在CTCF结合的启动子处，H3K27me3这一抑制性修饰的整体富集程度高于无CTCF峰的启动子（图S3H）。综上，我们的研究结果表明，启动子处的CTCF结合通常与有利于转录的染色质状态相关。这一现象可归因于CTCF在核小体缺失区域形成过程中发挥作用（Nora 等人，2017），也可能反映了CTCF在特定细胞类型中结合以阻止异位基因表达的作用，这与此前关于斑马鱼runx1顺式调控元件的研究报道一致（Marsman 等人，2014）。

图2. CTCF峰与结合位点的特征分析(A)四种组蛋白修饰和ATAC-seq数据在CTCF峰的热图谱，按显示区域内CTCF ChIP-seq信号从高到低排序。ATAC-seq的归一化信号以每百万映射片段数（FPM）表示，组蛋白修饰的归一化信号以每千碱基百万读数（RPKM）表示。所有数据集均对应24小时 post-fertilization（hpf）的斑马鱼胚胎阶段。(B) 代表CTCF和CTCFFL基序层级聚类结果的树状图。36540个CTCF ChIP-seq峰中，共有28538个包含至少一个与斑马鱼基序匹配的位点，而36540个对照序列中仅有7360个包含该匹配位点。x轴上每个位置的信息量以y轴的比特值表示。Ncor为归一化皮尔逊相关系数。(C) 直方图显示CTCF核心基序与上游基序在不同间距（6–25个碱基对）下的共现次数。未显著富集的间距以灰色显示，富集间距以粉色显示，最高富集间距以红色显示。下方为从与CTCF核心基序指定距离处的参考基序匹配的序列中推导的上游基序。x轴上每个位置的信息量以y轴的比特值表示。(D) 富含CTCF结合位点的前五类DNA转座子类型。y轴显示至少与一个CTCF基序重叠的重复序列比例。对于对照区域，展示了通过自举分析计算的平均值和标准差（误差棒）。另见图S2、表S1–S3及数据S1。

图3.启动子处CTCF结合的高丰度与高基因表达水平相关（A）CTCF峰在不同斑马鱼基因组区域的分布。百分比代表每个类别的CTCF峰的数量。（B）启动子上的平均CTCF ChIP-seq信号谱。每条线代表由启动子上的CTCF丰度（低、中、高）或没有CTCF峰的启动子（无峰）定义的三个基因类别之一。（C）启动子上无CTCF峰的分层基因类别和基因的表达。根据双面Wilcoxon秩和检验，分布差异表示为显着（*）和非显着（n. s.）((p value ≤1.5 ×10^{-5} ))（D）CTCF丰度定义的基因类别启动子上的平均ATAC-seq信号谱，如（B）中所述。另见图S3。

斑马鱼胚胎中TAD边界处不存在CTCF结合的富集现象

接下来，我们试图通过分析CCCTC结合因子（CTCF）在拓扑关联结构域（TAD）边界的分布，来探究其在斑马鱼3D基因组组织中的作用。对现有24小时受精后（hpf）的高通量染色体构象捕获（Hi-C）数据的可视化分析显示，着丝粒与端粒的相互作用富集，且信号在染色体上分布不均（图S4A），这一现象在发育早期阶段更为显著（图S4B）。尽管这种信号分布反映了细胞分裂周期中染色体连续臂配对的拉布（Rabl）构型（Stadler等人，2017），以及(size =580 ~kb)绝缘评分的细胞周期异质性（Crane等人，2015）（图S4D、表S4及透明方法）。之所以能实现后者，是因为24 hpf的Hi-C图谱是分裂期细胞和间期细胞中相互作用的综合结果，而这两种细胞的特征分别是缺乏拓扑关联结构域（TAD）和存在拓扑关联结构域（TAD）。

尽管带注释的CTCF基序在TAD边界的可访问染色质位点中富集，但这种富集并非边界特异性的，因为它也在TAD内部的可访问位点中被发现富集（富集结果见(p values <1 ×10^{-20})) 图S5A）。我们的分析显示，计算机预测的CTCF位点及其反向取向偏倚在TAD边界的可访问染色质中呈中等程度富集，这与之前的研究报道一致（Gómez-Marín et al., 2015; Kaaij et al., 2018）（图4A和S5B）。与小鼠CTCF类似（Dixon et al., 2012），只有一小部分斑马鱼CTCF峰位于TAD边界（图S5C）。然而，与哺乳动物中TAD边界处CTCF结合富集的情况不同（图4B），在24小时 post-fertilization（hpf）的斑马鱼胚胎中，无论是CTCF峰还是体内鉴定出的CTCF基序，均未在TAD边界处表现出富集（图4C和S5D）。为了排除分析偏倚，我们采用了反向绝缘分析方法并确定了层级结构域（Zhan 等人，2017）。与哺乳动物 CTCF 形成对比，且与我们上述斑马鱼的研究结果一致，研究未发现斑马鱼 CTCF 富集程度明显达到最大值的互作绝缘值（图 S5E、S5F 及透明方法部分），这可能反映了斑马鱼基因组序列组成的变异性较低（Costantini 等人，2007）。同样，我们发现在互作绝缘值为 72.5%（即边界与 CTCF 峰 summit 重叠百分比最高的数值）所确定的结构域边界处，斑马鱼 CTCF 并无富集（图 S5G）。与先前的研究报道一致（Kaaij 等人，2018），我们发现斑马鱼 TAD 边界处富集与活跃转录相关的染色质标记（图 4D、4E），缺乏 H3K27me3 抑制性标记（图 4F），且未显示 H3K27ac 富集（图 S5H），这表明斑马鱼 TAD 边界的生化特征与哺乳动物相似。我们的研究结果并非意味着 CTCF 对斑马鱼基因组中 TAD 的建立不可或缺，因为我们发现 TAD 边界处开放染色质中预测的 CTCF 基序存在中等程度的富集，且基序方向存在偏好；但这些结果表明，与哺乳动物不同，斑马鱼 TAD 边界与 CTCF 高度富集之间并无强相关性。重要的是，还需进一步研究来确定 CTCF 的这种中等富集是否足以在斑马鱼中建立 TAD 边界。此外，有理由提出，与果蝇及其他缺乏该结构蛋白的真核生物类似，其他结构蛋白或活跃的染色质状态可能在斑马鱼 TAD 建立过程中发挥作用。有趣的是，与 TAD 分布紧密相关的复制时序与斑马鱼的转录状态相关（Siefert 等人，2017），这为后一种假说提供了支持。此外，探究斑马鱼中 CTCF 与黏连蛋白结合的共定位情况至关重要，因为哺乳动物中介导与黏连蛋白相互作用的 CTCF N 端区域，其氨基酸组成在斑马鱼中存在差异（Li 等人，2020；Pugacheva 等人，2006，2020）。事实上，这一 N 端区域在 CTCF 富集于 TAD 边界的生物（包括哺乳动物和鸡）中高度保守（Fishman 等人，2018），但在 CTCF 不界定 TAD 边界的果蝇中则不保守（Moon 等人，2005；Rowley 等人，2017）。因此，斑马鱼中 CTCF 与黏连蛋白相互作用的潜在差异，或许能解释其 TAD 边界处缺乏 CTCF 富集的现象。未来需在特定细胞类型中采用单细胞技术开展 CTCF/黏连蛋白的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）及高分辨率染色体构象捕获（Hi-C）分析，以进一步探究 CTCF 在斑马鱼基因组高阶组织中的功能。

图4. 活性染色质标记而非CTCF在TAD边界处富集(A)24小时份斑马鱼中，以TAD边界为中心的600千碱基区域（x轴）上，ATAC-seq峰（紫色）内预测的CTCF基序的分布。y轴表示位于每个基因组位置的600千碱基区域中总峰数的百分比。虚线代表平均背景分布，灰色带表示相对于平均值的G1标准差范围。通过Z评分评估平均百分比（中心60千碱基）的差异。无显著性差异，n.s.；*p < 1 (^{*} p<1 ×10^{-5}) (* p<1 ×10^{-20}) (B) 参照(A)中的方法，小鼠胚胎干细胞中鉴定的TAD边界相对的CTCF峰（橙色）的分布。(C) 参照(A)中的方法，24小时份斑马鱼胚胎中鉴定的TAD边界相对的CTCF峰（橙色）的分布。(D) 参照(A)中的方法，TAD边界处H3K4me3富集峰的分布。(E) 参照(A)中的方法，TAD边界处H3K36me3富集峰的分布。(F) 参照(A)中的方法，TAD边界处H3K27me3富集峰的分布。另见图S4、图S5及表S4。

本研究的局限性

尽管我们发现启动子处的CTCF结合与基因表达升高呈正相关，但24小时pf斑马鱼胚胎的细胞异质性无法区分CTCF在特定细胞类型中促进基因表达、同时在其他细胞中充当绝缘子的情况。未来需要对CTCF进行细胞类型特异性敲除，随后纯化这些细胞，以研究CTCF结合和基因表达的变化。此外，分析特定细胞类型中CTCF富集与TAD边界之间的关系也十分重要，以确定边界处缺乏强CTCF富集的现象是在不同细胞类型中均存在，还是具有细胞特异性。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。