题目：Clostridium perfringens Epsilon Toxin Compromises the Blood-Brain Barrier in a Humanized Zebrafish Model

原文链接:https://doi.org/10.1016/ j.isci.2019.04.016

期刊：iScience

摘要

产气荚膜梭菌ε毒素（ETX）被推测通过与内皮细胞腔面的髓鞘淋巴细胞蛋白（MAL）结合来介导血脑屏障（BBB）的通透性改变。然而，该相互作用的动力学特征以及对ETX在活体内行为的整体认知仍有待阐明。本研究在活体斑马鱼（斑马 Danio rerio）中探究了ETX的结合及血脑屏障的破坏情况。野生型斑马鱼内皮细胞不与ETX结合。当对斑马鱼内皮细胞进行基因改造使其表达人源MAL（hMAL）后，前体ETX的结合以时间依赖性方式发生。向表达hMAL的斑马鱼体内注射活化毒素会引发血脑屏障渗漏、hMAL表达下调、血管狭窄、血管周围水肿以及血液淤滞。我们提出了一个依赖MAL的ETX结合及神经血管病变的动力学模型。本研究通过构建人源化斑马鱼血脑屏障模型，有助于我们理解ETX诱导的血脑屏障通透性变化，并进一步支持MAL是ETX受体的假说。

图文摘要

引言

血脑屏障（BBB）将血液复杂的分子与细胞环境与脑脊液纯净的无细胞环境分隔开来。这一高度活跃的功能性和物理性屏障通过物质排除、被动转运和主动转运，维持人脑内蛋白质和电解质浓度的稳态，并调节单核细胞数量。然而，中枢神经系统（CNS）内的病理过程或血液来源的因素，可能会显著改变血脑屏障的选择性。此外，通过药理学调控血脑屏障以将治疗药物递送至中枢神经系统，或修复受损的血脑屏障，仍是生物技术领域的主要目标。为了更深入地理解健康与病变状态下血脑屏障的分子机制，我们需要能够实时可视化并量化人类血脑屏障功能的技术手段。

产气荚膜梭菌ε毒素（ETX）是气溶素家族成孔毒素的成员（Cole等人，2004）。作为效力最强的细菌毒素之一，ETX被视为潜在的生物恐怖武器（Anderson和Bokor，2012），也是反刍动物肠毒血症及相关严重多灶性中枢神经系统白质疾病的致病因子，这一点已被广泛证实（Finnie，2003，2004；Uzal，2004；Uzal等人，2002，2004）。关于ETX的研究大多集中在兽医领域，仅有少数ETX介导的疾病在人类中被报道（Mantis，2005）。有研究提出ETX是人类脱髓鞘疾病——多发性硬化症（MS）的致病因子之一（Murrell等人，1986），这一假说也得到了近期研究的支持（Rumah等人，2013，2017；Linden等人，2015；Wagley等人，2018）。ETX似乎通过血脑屏障（BBB）的开放进入中枢神经系统（Finnie，2003）。该毒素会严重破坏血脑屏障血管的完整性（Finnie，2004；Finnie等人，2014；Morgan等人，1975；Nagahama和Sakurai，1991；Worthington和Mulders，1975；Zhu等人，2001），进而使其进入脑实质（Soler-Jover等人，2007）。然而，ETX穿越血脑屏障的具体机制目前仍不明确。

ETX 对特定细胞类型具有特异性（博科里-布朗等人，2011；多尔卡-阿雷瓦洛等人，2008；林登等人，2015），且无法与不含蛋白质的膜模型相互作用（曼尼等人，2015），这表明该毒素通过蛋白质受体发挥作用。尽管 ETX 的受体尚未确定，但已有几种候选蛋白被鉴定出来（芬内西等人，2012；林登等人，2015；拉达拉姆等人，2011）。ETX 受体位于易感细胞（吉尔等人，2015；宫田等人，2002）的去污剂抗性膜（即脂筏）的顶端表面（珀蒂等人，2003）。ETX 的结合与细胞毒性依赖于四跨膜蛋白髓鞘与淋巴细胞蛋白（MAL）的表达（Rumah 等人，2015）。已知 MAL 在脂筏的形成、稳定和维持中发挥作用（Anton 等人，2011；Ramnarayanan 和 Tuma，2011；Schaeren-Wiemers 等人，2004；Zhou 等人，2012），作为 ETX 的受体候选分子极具吸引力，因为它在肾脏远端集合管和中枢神经系统髓鞘中均有表达（Schaeren-Wiemers 等人，1995），而这两个部位是 ETX 已明确的两个作用靶点（Nagahama 和 Sakurai，1991；Rumah 等人，2015；Soler-Jover 等人，2007；Tamai 等人，2003）。值得注意的是，研究还表明 MAL 在小鼠脑内皮细胞中特异性富集（Daneman 等人，2010；Tam 等人，2012；Zhang 等人，2014），在人原代脑内皮细胞中也同样富集（Urich 等人，2012）。我们此前已证实：（1）ETX 可特异性结合表达 MAL 的中国仓鼠卵巢细胞（CHO）；（2）ETX 可特异性杀伤表达 MAL 的 CHO 细胞；（3）ETX 与 MAL 共定位；（4）ETX 不与 MAL 缺陷型小鼠（MAL⁻/⁻）的血管或髓鞘结合；（5）ETX 不会在 MAL⁻/⁻ 小鼠小脑切片培养体系中引发体外脱髓鞘反应（Rumah 等人，2015；Linden 等人，2015）。近期，这些结果得到了验证，且通过免疫共沉淀实验证实了 ETX 与人 MAL 存在相互作用，这表明 MAL 可能是 ETX 的受体，或至少是 ETX 孔蛋白复合物的关键组成部分（Blanch 等人，2018）。

ETX 以 32.9 千道尔顿的原毒素（pETX）形式释放（Hunter 等人，1992），其活性约为活化形式的千分之一（Minami 等人，1997）。随后，pETX 会被细胞外丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）或λ毒素（一种类嗜热菌蛋白酶的金属蛋白酶）切割并活化，形成活性更强的形式（Hunter 等人，1992；Minami 等人，1997）。pETX 与活性 ETX 对其受体的特异性和亲和力基本一致（Buxton，1976；Dorca-Arevalo 等人，2008；Gil 等人，2015），这一点可由原毒素能够阻断活性 ETX 的活性，且二者均能结合脂筏和相同细胞类型得到证实。因此，pETX 是评估 ETX 结合动力学的有效工具，同时还能保留其定位组织的完整性。与 pETX 不同，活性毒素与受体结合后会诱导孔道形成，进而导致细胞死亡（Robertson 等人，2011）。活性 ETX 形成孔道的过程是毒素单体在细胞表面招募形成同源七聚体，进而生成前孔复合物的结果（Robertson 等人，2011）。该前孔复合物随后嵌入易感细胞的脂质双分子层，形成 0.5 至 1.0 纳米的孔道（Miyata 等人，2001，2002；Petit 等人，1997）。血脑屏障中的孔道形成被认为会引发血管选择性和结构的改变（Popoff，2011）。相比之下，原毒素无法形成寡聚体，这可能是由于其 C 端在复合物形成过程中产生的空间位阻抑制效应（Miyata 等人，2001）。研究 ETX 介导的细胞和分子病理机制时，通常采用体外技术、ETX 敏感细胞系或离体组织学方法。由于缺乏能够在完整微环境中实时探究 ETX 作用机制和活性的活体体内模型系统，我们对 ETX 介导的血脑屏障通透性的认知受到了限制。

为了在体内实时研究ETX诱导的血脑屏障通透性，我们开发了一种表达hMAL的斑马鱼模型系统。斑马鱼体型小、成本低、繁殖量大、繁殖频率高，且最重要的是其幼虫阶段呈半透明状，可实现活体生物中报告基因的可视化，因此特别适合研究体内血脑屏障完整性和局部病理变化（Eliceiri 等人，2011；Kim 等人，2017）。研究人员已构建出在FLI1增强子/启动子下标记内皮细胞的转基因品系，可精准研究血管系统（Lawson 等人，2001；Lawson 和 Weinstein，2002）。近期关于斑马鱼血管形成的研究表明，斑马鱼会形成与哺乳动物相似的血脑屏障，早在受精后3天，其血脑屏障对500道尔顿分子的限制性就已形成（Fleming 等人，2013；Jeong 等人，2008）。此外，研究人员已在斑马鱼体内检测到ZO-1、紧密连接蛋白5等已知的哺乳动物血脑屏障紧密连接蛋白（Jeong 等人，2008；Xie 等人，2010）。科学家们利用这些发现与创新，借助斑马鱼探究了多种细菌、病毒感染以及毒性损伤对循环系统和血脑屏障完整性的影响（Bolcome 等人，2008；Ludwig 等人，2011；Mostowy 等人，2013；Takaki 等人，2013）。这些研究成果为在这一尚未充分利用的模式生物中检测ETX诱导的屏障功能障碍提供了依据。

尽管斑马鱼表达MAL，但我们此前已证实，表达斑马鱼MAL（zMAL）的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞不与ETX结合（Rumah等人，2015）。然而，这并不排除斑马鱼可能存在另一种不同于MAL的ETX受体的可能性。本研究证实，斑马鱼神经血管系统不与ETX结合，而将人MAL（hMAL）导入内皮细胞（EC）后，原毒素会发生特异性、高亲和力的结合。我们进一步通过研究发现，MAL家族中的四跨膜蛋白BENE无法结合原毒素（pETX），从而明确了MAL对ETX毒性的特异性需求。我们还通过动力学实验证实，ε毒素在活体中可快速影响血脑屏障（BBB）通透性、血管狭窄、局灶性血管周围水肿以及hMAL受体的下调。最后，我们证明抗ETX中和抗体可抑制ETX对血管产生的所有相关作用表达hMAL的鱼类中的病理变化。总体而言，这项功能获得性研究进一步证实了MAL对ETX发挥作用的必要性，在人源化血脑屏障模型中揭示了ETX介导的病理机制，更广泛地说，还阐明了ETX在完整微环境中发挥作用的精确时间线。

结果

野生型斑马鱼的血管系统不结合ETX

确立斑马鱼模型适用于 ETX 毒性研究的第一步，是检测野生型（WT）斑马鱼的血管是否对 ETX 具有亲和力。尽管此前有研究报道 ETX 不结合 zMAL（Rumah 等人，2015），但斑马鱼可能表达除 MAL 之外的特定 ETX 受体。为证明斑马鱼缺乏 ETX 的特异性结合位点，研究人员对斑马鱼冰冻切片进行了免疫组织化学检测（图1）。

制备了成年（8至16周龄）小鼠大脑和成年（受精后17个月）斑马鱼大脑的组织学切片。将矢状切片与pETX共同孵育，并使用针对ε毒素的高亲和力单克隆抗体进行毒素结合免疫染色。免疫组织化学结果显示，斑马鱼小脑分子层不与pETX结合（图1）。相比之下，pETX特异性结合小鼠颗粒层的髓鞘，并定位于小鼠血脑屏障微血管，这一点通过BSL1染色得到了证实（Lonchamp等人，2010；Linden等人，2015）。值得注意的是，pETX无法与斑马鱼小脑血管结合。

图1. 重组ETX结合野生型小鼠神经血管系统，而不结合野生型斑马鱼神经血管系统（A）小鼠和斑马鱼矢状切面示意图，突出显示了小脑和成像区域（蓝色方框）。（B）用pETX探针对两种生物的切片进行处理，并用兔抗ETX一抗孵育，随后与cy3抗兔二抗/BSL1共同孵育。蓝色的DAPI封片液标记细胞核，绿色的BSL1标记血管，pETX为红色，“合并”图像将三张彩色图像完全叠加。在小鼠阳性对照的每个切片的所有区域中，pETX均与BSL1标记的血管共定位（白色箭头），如“合并”图中的黄色血管所示，但在任何斑马鱼切片中均未检测到pETX。毒素还与小鼠阳性对照的颗粒层牢固结合（蓝色箭头）。中心图像以40倍放大倍数拍摄，所有条件下的曝光时间均相同。ML：分子层；GL：颗粒层。比例尺：50微米。

斑马鱼幼体将ETX特异性结合于表达hMAL的血管

因为斑马鱼不能结合pETX，我们在功能增益实验中使用模型生物来确定hMAL的细胞特异性表达是否赋予特定的ETX结合，以及该基因是否足以诱导ETX介导的血管病理学的标志。为了检查ETX是否与表达hMAL的斑马鱼脉管系统结合，斑马鱼合子被注射hMAL融合到FLI1内皮启动子/增强子下的GFP报告员（hMAL-GFP）以产生瞬时表达（图2A）。成功表达报告构建体的鱼随后在3-4 DPF处注射Alexa 647缀合的pETX以寻找结合。将这些制剂与注射含有相同蛋白脂质家族内受体hBENE-GFP的质粒的鱼进行比较，在相同的启动子下，以控制可能的非MAL或有结合并检查ETX-MAL相互作用的特异性。共聚焦显微镜显示pETX与表达hMAL-GFP的血管的结合和无法检测到的结合，超出循环未结合毒素的水平，在hBENE-GFP控件中（图2B）。

对hMAL-GFP-和hBENE-GFP-expressing血管的分析显示，与Alexa 647-pETX的共定位存在显著差异。通过首先设置GFP阈值以指定EC定位，然后确定与这些GFP体素特别相关的总Alexa 647 pETX信号的百分比，定量评估共定位（图2C，学生t测试，(p=0.0028)）。为了评估pETX结合动力学，表达hMAL-GFP或hBENE-GFP的斑马鱼受到强烈表达hMAL-GFP或hBENE-GFP的节间血管（ISV）的延时成像。结果表明，hMAL-GFP以时间相关的方式结合pETX，如Alexa 647 pETX强度在hMAL-GFP血管内随时间增加所展示的那样，峰值绑定发生在注射后54分钟（MPI），而pETX-647强度在hBENE-GFP血管内随时间减少，并且没有明显的可折叠绑定程度（分别为图2D和2E）。延时视频证明pETX随着时间的推移从管腔移动到ISV血管壁中的hMAL-GFP区域（视频S1），而不是在hBENE-GFP控制血管中（视频S2）。为了控制非特异性蛋白质-蛋白质相互作用，我们利用了pETX H149A突变体，以前显示其对MDCK细胞的活性和对小鼠的毒性降低（Oyston等人，1998年），同时保持与WT毒素的结构相似性（Bokori-Brown等人，2013年）。pETX H149A被荧光标记并在FLI1启动子的控制下注射到瞬时表达hMAL-GFP的鱼体内。四条鱼中的两条在hMAL表达血管中显示出荧光pETX H149A的微妙积累，表明在活体环境中与hMAL的亲和力较低（图2E和视频S3）。相比之下，通过流式细胞术，H149A突变体毒素显示与表达hMAL的CHO细胞没有可检测的结合（图2F）。

图2. pETX结合到hMAL-GFP在斑马鱼ISV中以时间依赖的方式表达(A)示意图展示斑马鱼转化策略、毒素注射位点和显微镜观察焦点。将含有hMAL-GFP或hBENE-GFP的质粒与tol2转座酶共同注射到1细胞期斑马鱼胚胎的细胞中。受精后3-4天（DPF）的阳性鱼向库维管（duct of Cuvier）注射Alexa 647标记的pETX以进行全身性感染。蓝色框为(B)中的成像区域。(B) 表达hMAL-GFP的斑马鱼与表达hBENE-GFP的对照斑马鱼的节间血管（ISVs）的403张共聚焦z-stack图像。比例尺为25微米。ISV：节间血管；DLAV：背侧纵向吻合血管。(C) 共定位定量指标“GFP血管中共定位的ETX物质百分比”，表示注射后1小时，自动设定阈值以上，hMAL-GFP斑马鱼节间血管（标识符((n = 6 fish))）与hBENE-GFP对照节间血管（标识符((n = 7 fish))）中共定位的pETX体素百分比。数据以平均值±标准误（mean ± SEM）表示。统计分析：非配对双尾Student's t检验（标识符((^{* *} p<0.01))）。(D)将ISV管壁上等体积的绿色荧光蛋白（GFP）渲染为Imaris表面，每条斑马鱼每隔30秒追踪90分钟内该表面内GFP和647荧光的总强度。绘制了人麦芽糖结合蛋白（hMAL）和人BENE蛋白（hBENE）瞬时表达下647-pETX/GFP的比值随时间的变化情况。每个时间点每条斑马鱼的单独比值以不透明圆点表示，每个时间点的平均比值以较深色线条表示。（E）注射后三个时间点，647 标记的 pETX 或 647 标记的 H149A pETX 的快照图像，以及与受体的“合并”图像。蓝色箭头突出毒素积累。比例尺为 20 微米。（F）流式细胞术分析pETX或H149A pETX与hMAL、rMAL或GFP中国仓鼠卵巢细胞的结合情况。另参见视频S1、S2和S3。统计分析：采用Tukey检验的双因素方差分析 ((^{* * * *} p<0.0001))

活性ETX导致表达hMAL的鱼类血脑屏障泄漏

建立了pETX对hMAL的特异性亲和力及其在活体内环境中的结合动力学，然后进行实验以评估hMAL在被激活毒素挑战后对BBB泄漏的影响（图3A和4A）。共聚焦显微镜显示2,000 kDa罗丹明葡聚糖染料从15 MPI到注射后2小时（HPI）仅在表达hMAL的鱼（(n=6)图3C和视频S4）中进行泄漏，而不是在表达hBENE的对照中（(n=5)图3B和视频S5）。此外，表达hMAL的鱼与H149A突变体ETX共同注射也未能显示血管泄漏的证据（(n=4)图S3A）。在hBENE和H149A突变型ETX对照中，毒素被限制在血管内；当观察受体和毒素在2 HPI处的Imaris表面效果图时，这一点尤其突出（图3B和S3B），而不是注射活性毒素的hMAL鱼（图3C0）。葡聚糖渗漏的定量评估，以细胞外/细胞内葡聚糖（“E/I”见透明方法方程1）表示，确认hMAL+活性ETX条件与hBENE+活性ETX和hMAL+H149A pETX对照在2 HPI处的渗漏有显著差异（图3D，使用Tukey测试的双向方差分析，(p ≤0.0001)0.0001,0.0006），以及hMAL+活性ETX组在时间点15 MPI和2 HPI以及1 HPI和2 HPI之间的显著差异（图3D，双向方差分析通过Tukey检验，(p ≤0.0001) 0.0001、0.0006）。这一发现表明，血脑屏障完整性的进行性降低仅在表达hMAL且经活性ETX处理的斑马鱼中显著显现。

图3. 激活的ETX与2000千道尔顿若丹明葡聚糖共注射可显著揭示表达hMAL的鱼类中血脑屏障的明显渗漏(A)展示实验流程的示意图（B）代表性的hBENE-GFP瞬时表达对照斑马鱼的大脑背侧前象限脉管系统的403共聚焦z-stack图像。hBENE-GFP受体呈绿色，2000千道尔顿的若丹明葡聚糖呈红色，“合并”图像显示两个通道，“合并宏观”图像显示全脑神经脉管系统。“合并宏观”中的蓝色框突出显示了其他图像的聚焦区域；15分钟、1小时和2小时表示毒素或葡聚糖注射后开始进行z-stack成像的时间。比例尺：“合并宏观”图像中为50微米，其余图像中为30微米。（C）与（B）相同，但为在表达hMAL-GFP的鱼中。（B0）hBENE-GFP（绿色）和若丹明葡聚糖（红色）的Imaris“表面”渲染图，用于量化注射后2小时血管腔内GFP总荧光强度和血管内总若丹明荧光强度。（C0）与（B0）相同，但为在hMAL-GFP鱼中。(E)注射后15分钟、1小时和2小时，通过计算血管外葡聚糖总强度除以血管内总强度（“葡聚糖E/I”）来确定葡聚糖渗漏的量化结果。数据来自以下实验：注射了活性ETX ((n=5))的hBENE-GFP斑马鱼、注射了活性ETX ((n=6))的hMal-GFP斑马鱼，以及注射了突变体对照H149A pETX ((n=4))的hMal-GFP斑马鱼数据以平均值±标准误（SEM）表示。统计分析：采用双因素方差分析（ANOVA）结合 Tukey 检验 ((^{* * *} p<0.001)、(* * * p<0.0001)）。另参见图 S3 以及视频 S4 和 S5。

尽管FLI1内皮启动子/增强子将转基因表达限制在内皮细胞（ECs）中，但单条斑马鱼中表达相关转基因的内皮细胞比例在40%至70%之间。内皮谱系中的表达不全通常表现为仅一半大脑表达转基因，这为我们提供了一种新型内部对照。在单条斑马鱼中，我们将受体高表达区域与对侧半脑在伤后2小时（2 HPI）几乎无或无转基因表达的相同区域进行了对比（图4B和4C）。这一结果证实了hMAL的表达是血脑屏障（BBB）破坏的必要条件，在该时间点，仅在hMAL+活性ETX处理组中，这两个半脑（受体表达组与受体缺失组）之间的右旋糖酐渗漏存在显著差异（图4C，采用Tukey检验的双因素方差分析，(p=0.0008)）。

图4. 在个体表达hMAL-GFP的鱼中，右旋糖酐在受体表达血管分布的脑体积内的渗漏量显著高于无受体表达区域(A)注射与成像策略示意图。(B) 一条代表性斑马鱼的共聚焦z轴堆叠图像，该鱼瞬时表达hMAL-GFP（绿色），并注射了活性毒素和2000道尔顿的若丹明葡聚糖（红色），右侧为仅红色葡聚糖通道的图像。由于表达的嵌合特性，大多数斑马鱼仅在大脑的特定区域表达受体，如图所示，通常仅在大脑的一侧表达。白色箭头指示明显渗漏的区域。蓝色和橙色框代表(C)中量化的大脑象限。(C) 各条件下每条斑马鱼在注射后2小时，大脑葡聚糖高表达区域（蓝色）与低表达区域（橙色）的兴奋/抑制（E/I）比率量化结果：表达hBENE并注射活性ETX的斑马鱼（n=5/大脑半球）、表达hMAL并注射活性ETX的斑马鱼（n=6/大脑半球）、表达hMAL并注射H149A突变体pETX的斑马鱼（n=4/大脑半球）。仅在hMAL+活性ETX条件下，大脑两侧的该比率存在显著差异（采用Tukey检验的双因素方差分析，(p=0.0008)）。数据以平均值±标准误（SEM）表示

活性ETX导致hMAL短暂过程中血脑屏障血管狭窄、血管周围水肿及血流停止

除了明显的渗漏外，还对共聚焦图像进行了检查，以确认是否存在其他先前已报道的ETX诱导的血管病变，以及hMAL是否是这些现象出现的必要条件。先前报道的一个发现——血管腔压缩（Finnie, 1984a; Sakurai等人, 1983）——在大多数评估的表达hMAL的血管中均有体现（图5A）。对脑中央动脉（CCtAs）的评估显示，在用活性ETX处理的表达hMAL的血管中，血管腔直径在15分钟注射后（MPI）至2小时注射后（HPI）之间呈进行性缩小（图5B，采用Tukey检验的双因素方差分析），但在表达hBENE+活性ETX的对照组或表达hMAL+H149A突变体pETX的对照组中未观察到该现象。表达hMAL+活性ETX组与hBENE及H149A突变体对照组之间，脑中央动脉腔直径的显著差异始于1小时注射后（HPI）。此外，血管周围水肿是ETX毒性和多发性硬化症（MS）的共同特征，在两条表达hMAL的斑马鱼中均观察到了该现象，而对照组中未出现。在这两种情况下，水肿的位置均与葡聚糖渗漏的区域直接对应，且最早在15分钟注射后（MPI）就出现在受体高表达的血管中。值得注意的是，这些急性水肿区域优先出现在穿过小脑的血管中。在50分钟注射后（MPI），对脑部血管血流进行的10秒快速延时视频证实了这一推测，同时也表明了hMAL的必要性：在表达hMAL-GFP的血管中，血流似乎完全终止，而在同一条鱼内相同的未表达hMAL的血管中，以及对照组鱼的所有血管中，血流均未受影响。

图5. 活性ETX导致血管狭窄和血管周围水肿(A)注射活性毒素后15分钟、1小时和2小时，表达hBENE-GFP和hMAL-GFP的斑马鱼脑中央动脉（CCtA）的共聚焦放大图像。绿色通道显示这些血管中的受体表达，灰色通道为微分干涉对比图像，“合并”为两张图像的叠加图。比例尺，10微米。(B) 各条件下CCtA血管直径随时间的定量比较；从注射后1小时（HPI）开始，暴露于活性ETX的hMAL CCtA显著窄于暴露于ETX的hBENE CCtA或暴露于H149A突变体pETX的hMAL CCtA，且从注射后15分钟（MPI）到2小时（HPI）直径显著减小（采用Tukey检验的双因素方差分析，(^{*} p<0.05)、(^{* *} p<0.01)）。数据以均值±标准误（SEM）表示。(C) 表达hMAL-GFP的斑马鱼脑部显示血管周水肿的共聚焦微分干涉对比宏观z轴切片，以及(C0) 单条血管的放大图。(D) 图(C)中hMAL-GFP与右旋糖酐通道的合并图像，以及(D0) 合并后的单条血管放大图。完整图像比例尺为25微米，放大血管比例尺为10微米。另见图S3及视频S6、S7、S8、S9、S10。

活性ETX导致hMAL表达下调

在这项体内实验制备中，一个意外发现是活性ETX刺激下hMAL受体发生了明显的循环利用。至15分钟光镜单位（MPI）时，与hBENE-GFP相比，hMAL-GFP的表达在血管边缘呈现斑点状分布（图6A）。对比经活性ETX和H149A突变体pETX处理的hMAL-GFP血管可见，这种斑点状形态由活性毒素介导，并非仅由hMAL与hBENE受体表达差异导致——因为经突变体毒素处理的hMAL血管，与经活性毒素处理的表达hBENE的血管外观无明显差异。此外，图像和定量分析显示，在hMAL+活性ETX处理条件下，受体蛋白总水平随时间逐步降低，GFP荧光强度也出现显著百分比下降；且这种下降在hMAL+活性ETX ((n=6))组与hBENE+活性ETX处理组之间均存在ETX ((n=5)) 以及 hMAL + H149A pETX ((n=4)) 从感染后1小时开始出现（图6B，采用Tukey检验的双因素方差分析，(p=0.0029) P=0.0107）。

图6. ETX 导致 hMAL 受体减少与循环(A)表达hBENE-GFP或hMAL-GFP的等量神经血管系统在15分钟注射后、1小时感染后和2小时感染后分别用活性毒素或H149A突变型pETX处理的代表性共聚焦图像。比例尺，30微米。(B) 以15分钟注射后为起点，各条件下受体-GFP总强度的百分比变化。hMAL+活性ETX组与对照组相比，受体-GFP强度的显著百分比变化从1小时感染后开始出现（采用Tukey检验的双因素方差分析；(^{*} p<0.05)、(^{*} p<0.01)、(* * p<0.001)、(****p<0.0001)）。数据以平均值±标准误表示。

中和抗ETX抗体可抑制ETX毒性

为确定ETX细胞毒性在体内的特异性，在向表达hMAL-GFP的鱼注射前，将ETX与针对ETX的中和单克隆抗体JL008预孵育（((n=4)) Linden等人,2018）。在相同实验参数下的共聚焦图像分析显示，葡聚糖被良好限制在血管内，CCtA管腔直径正常，且血流稳定通过hMAL-GFP标记的血管（视频S11）。定量分析证实，在注射后2小时（HPI），中和处理的ETX与活性ETX的内皮/免疫（E/I）指标存在显著差异（采用Tukey检验的双因素方差分析，(p=0.0003)），而与H149A突变型pETX无显著差异（图7A）。表达hMAL的脑区与不表达hMAL的脑区之间，葡聚糖渗漏情况也无显著差异（图7B）。与活性ETX处理组相比，经中和ETX处理的动物，其CCtA管腔直径也存在显著差异（图7C，采用Tukey检验的双因素方差分析，(p=0.0004)）。与活性ETX处理组相比，经中和ETX处理的动物，其hMAL-GFP在注射后15分钟（MPI）至2小时（HPI）的减少百分比变化也具有显著性（图7D）。采用双因素方差分析结合图基检验（(p=0.0047)）。因此在所有毒性指标中，活性ETX均被中和性抗ETX抗体有效中和。综上，这些数据表明：（1）ETX诱导的病理具有特异性；（2）该抗体有望用于治疗ETX诱导的疾病。

图7. 抗ETX抗体的中和作用可消除所有毒性指标(A和B) (A) 从15分钟后注射（MPI）到2小时后注射（HPI），在表达人髓鞘相关糖蛋白绿色荧光蛋白（hMAL-GFP）的斑马鱼中，注射中和性内毒素毒素X（ETX）((n=4))、活性ETX ((n=6))或H149A突变型ETX ((n=4))后，右旋糖酐渗漏（右旋糖酐）的定量对比；以及(B) 大脑中受体高表达区域与低表达区域之间的右旋糖酐渗漏情况。(C) 对经上述三种制剂处理的表达hMAL-GFP的血管，其中央管腔（CCtA）直径的定量对比。(D) 以15 MPI为基线，各处理组hMAL-GFP荧光强度变化百分比的定量对比。所有统计分析均采用双因素方差分析结合图基检验；(^{*} p<0.05)、(^{*} p<0.01)、(^{* *} p<0.001)、(* * * * p<0.0001)。数据以平均值±标准误（mean ± SEM）表示。支持性图像见图3和图S2。

讨论

本研究整体上通过活体成像技术在完整动物体内证实了ETX的实时结合、受体下调以及血脑屏障（BBB）的破坏。斑马鱼模型技术的发展——包括易获取的门克隆构建体、可靠的注射方案，以及其在共聚焦显微镜下的便捷使用——使得本研究能够在完整的微环境中精准研究ETX的作用机制。斑马鱼暴露于ETX后，可揭示MAL受体在诱导ETX介导的血管病理特征方面的充分性，因为只有当人类MAL（hMAL）基因表达时，斑马鱼才会出现显著的血脑屏障渗漏、神经血管压迫、血流停止、血管周围水肿及受体下调现象。与稳定转基因斑马鱼相比，瞬时表达的嵌合斑马鱼的存在进一步证实了该受体的充分性，因为在单个斑马鱼体内，只有具有明显受体表达的血管段才会出现病理变化。延时成像技术可实时检测pETX与hMAL的结合动力学，毒素进入血管腔后约1小时达到结合峰值。毒素结合峰值对应ETX处理后首次出现显著神经血管变化的时间点。这一时间点与亚致死剂量活化ETX注射的小鼠首次出现内皮损伤的时间（Finnie, 1984a）以及pETX处理后内皮屏障抗原发生变化的时间（Zhu et al., 2001）一致，进一步证实了斑马鱼模型适用于此类研究。当然，这种血管病理的时间序列会随毒素浓度不同而改变；此前研究显示，使用更高的致死浓度并追踪更小的大分子时，早在静脉注射后30秒就观察到多种大分子的明显渗漏（Morgan et al., 1975; Nagahama and Sakurai, 1991; Worthington and Mulders, 1975）。此外，尽管仅在1小时时达到统计学显著性，但整体成像结果显示注射后15分钟就已出现渗漏和血管变化。与此前研究不同——有研究报道在体外极化的MCDK细胞中未观察到ETX诱导的大分子（38.5 kDa）右旋糖酐渗漏（Petit et al., 1997），或通过死后组织病理学未观察到BSA渗漏（Soler-Jover et al., 2007）——本研究发现2000 kDa的大分子右旋糖酐出现严重渗漏，该右旋糖酐会在特定表达hMAL的血管处聚集并随时间扩散。本研究与既往研究在右旋糖酐渗漏尺寸上的显著差异，可能源于斑马鱼与啮齿动物血脑屏障（BBB）在发育和进化层面的差异。尽管本研究选择的时间点（受精后6-7天）已超过斑马鱼紧密连接蛋白表达的起始时间（Xie et al., 2010），且晚于类似毒理学研究的时间点（Bolcome et al., 2008; Zhang et al., 2015），但斑马鱼血脑屏障在受精后6天之后的选择性会不断增强，开始对更大分子量的右旋糖酐产生排斥作用（Fleming et al., 2013）。因此，对ETX诱导的渗漏在受精后7天之后的评估是一项未来进行实验的可能性是存在的，不过这个较晚的时间点需要构建体的稳定表达。大分子右旋糖酐的渗漏也可能是由于hMAL蛋白的异位过表达导致的，尽管整体图像分析显示，hMAL表达最丰富的区域未必是渗漏最严重的区域，实际上仅需少量的MAL表达就能观察到局部渗漏。这种毒素引发如此大分子量示踪剂渗漏的最可能原因是本研究中注射的ETX剂量仍相对较高。本研究使用的ETX剂量很可能导致了受体饱和和最大程度的孔道形成，进而造成血脑屏障的大量渗漏。渗漏也有可能是由于内皮细胞暴露于ETX后产生的细胞毒性所致。尽管体外实验表明表达hMAL的中国仓鼠卵巢细胞在高浓度ETX暴露下具有极高的存活抗性（数据未显示），但仍需进一步的实验来在完整的微环境中排除这一可能性。

我们还评估了H149A突变体pETX作为结合和毒性实验对照的适用性。我们的研究表明，H149A与野生型（WT）ETX对MDCK细胞的结合亲和力相似（数据未展示），且既往研究显示该突变体与野生型原毒素的结构相似（Bokori-Brown等人，2013），但毒性降低（Oyston等人，1998）。本研究中pETX对hMAL细胞和组织的结合结果说服力较弱。尽管与野生型pETX相比，在表达hMAL的鱼体内，荧光共定位随时间的信号确实有所减弱，但在4个hMAL间充质血管（ISVs）中有2个观察到了突变体原毒素少量积累的明确证据。相比之下，流式细胞术结果显示突变毒素与hMAL无显著结合，却与rMAL存在显著结合。这种差异可能由多种原因导致。首先，该毒素对不同MAL同源物的结合亲和力可能存在差异。此外，使用细胞系的体外实验可能无法为H149A pETX与hMAL的结合提供最佳微环境。例如，ACHN细胞对H149A-ETX的敏感性极低，而MDCK细胞则对其敏感（Bokori-Brown等人，2013）。ACHN细胞中不表达但在体内血管中表达的潜在共受体，可能与MAL协同作用形成合适的H149A pETX结合位点。另外，已知该突变体在小鼠体内的毒性降低67倍（Oyston等人，1998），体外实验可能无法有效检测到突变体原毒素与hMAL的结合，因为我们发现野生型原毒素在基线状态下仅与不到50%的hMAL-CHO细胞结合。我们的体内活体实验灵敏度可能更高，因此检测到了突变体的少量积累。无论H149A pETX在体内和体外的结合存在何种差异，该突变体均适用于毒性实验对照，因为本研究结果表明，尽管其在4条鱼中的2条体内发生了结合，但未发现H149A pETX介导血管病变的证据。

本研究证实了此前关于ETX诱导血脑屏障血管狭窄（Finnie, 1984b）、血管周水肿（Buxton, 1976; Fernandez-Miyakawa等, 2008; Freedman等, 2016; Uzal等, 2004）以及随后血流速率降低（Sakurai等, 1983）的研究发现。Sakurai等（1983）提出假设，他们在注射活性ETX的小鼠中观察到血流速率降低，是由于该毒素的血管“升压”作用，因为研究中未检测到心率变化。随后，该研究团队又发现ETX介导了一定程度的主动脉收缩，但同时证实，ETX介导的血压升高最可能的原因是阻力动脉的收缩（Nagahama和Sakurai, 1992）。在本研究中，我们检测直径变化的血管（颈总动脉胸段，CCtA）属于阻力动脉，这一点可由其被平滑肌细胞包裹（Ando等, 2016）以及表达Yap1蛋白（该蛋白使血管能随血流变化调整直径）（Nakajima等, 2017）得到印证。因此，通过活体成像技术，本研究证实了ETX介导的血流速率变化源于其血管收缩特性。此外，本研究还实现了ETX注射后血流的实时成像，结果显示在表达人 MAL（hMAL）的血管内血流完全停止。如此剧烈的血流变化表明，高剂量ETX介导的神经病变可能包含缺氧或缺血症状。这一发现与早期一项基于多普勒技术、针对海马体且使用剂量低于本研究的分析结果相悖（Miyamoto等, 1998）。综合来看，低剂量ETX会导致中等分子量（最高38千道尔顿）示踪剂渗漏（Petit等, 2003）、内皮细胞出泡和血管周肿胀（Finnie, 1984b），但仍能维持稳定的血流（Miyamoto等, 1998）。相比之下，本研究中使用的高浓度ETX则会造成更大分子量（最高2000千道尔顿）的葡聚糖渗漏、血管严重受压以及血流终止。

最近，通过对经ε毒素处理的人淋巴细胞裂解物进行蛋白质印迹分析，研究发现MAL与ε毒素存在共免疫沉淀现象（Blanch等人，2018年）。这表明MAL与ε毒素会共同以蛋白质复合物的形式存在，也提示二者之间可能存在直接的蛋白质-蛋白质相互作用，不过这一结论尚未得到证实。本研究在体内实验中证实了这一发现，因为我们观察到了活性斑马鱼体内pETX与hMAL-GFP的共定位现象。此外，我们还检测到了ETX 处理后 hMAL-GFP 荧光出现下调，这表明 ETX 与 MAL 结合可能导致 MAL 的内吞与降解。我们还验证了此前的功能获得性实验结果，即 MAL 是 ETX 结合与毒性作用所必需的（Linden 等人，2015）。此前已有体外研究利用 MAL 蛋白的啮齿动物同源物（rMAL）和活性毒素报道了这种下调现象（Rumah 等人，2015），而本次针对 hMAL 的类似发现进一步将其相关性延伸至人类模型。此外，在完整的微环境中观察到这一显著现象，更增强了其生物学意义。综上，这些数据有力证明 MAL 是 ETX 的受体。

ETX特异性单克隆抗体JL008完全消除了经分析的所有ETX介导的病理指标。这既表明JL008可作为后续ETX研究的对照试剂，也使其在已测试的ETX中和抗体中成为潜在的ETX中毒治疗候选药物（McClain和Cover，2007；Sakurai等人，1983）。然而，该研究结果是在ETX注射到活体生物体内前孵育一小时的条件下获得的。需开展进一步实验，以探究在ETX注射后给予JL008是否能在体内减轻该毒素的作用，并确定预防ETX诱导病理所需的时间进程和剂量梯度。斑马鱼模型已逐渐成为药物研发和筛选的重要平台（Kari等人，2007；MacRae和Peterson，2015；Parng等人，2002；Serbedzija等人，1999；Taylor等人，2010）。构建一种内皮细胞特异性表达hMAL的转基因斑马鱼品系，将使该模型成为通过高通量药物筛选实验评估抗ETX治疗方案的理想选择。

要解答关于ETX介导的多发性硬化（MS）假说的最后一个问题，斑马鱼将是理想的研究模型：ETX进入中枢神经系统（CNS）后是否会引发脱髓鞘病变？针对这项脱髓鞘检测实验，此前的发育生物学研究已证实，斑马鱼拥有由少突胶质细胞和施万细胞构成的成熟髓鞘，这些细胞出现的时间节点与小鼠相对接近，且表达多种相同的蛋白质标志物（Ackerman和Monk，2016）。近期，研究人员利用经典的溶血卵磷脂（Preston和Macklin，2015）和实验性变应性脑脊髓炎（EAE）（Kulkarni等人，2017）多发性硬化模型成功诱导斑马鱼发生脱髓鞘病变，此后斑马鱼也被提出可作为多发性硬化建模的研究对象。

我们此前曾报道，野生型（WT）小鼠模型在ETX刺激下会发生脱髓鞘病变，而MAL基因敲除小鼠则不会；同时我们也发现，ETX与大鼠MAL（rMAL）的结合亲和力高于人类MAL（hMAL），且rMAL-CHO细胞的死亡率也高于hMAL-CHO细胞（Linden等人，2015）。因此，尽管这一推测看似合理，但目前尚不清楚ETX是否会导致人类发生脱髓鞘病变。即便ETX确实能引发人类脱髓鞘，引发此类中枢神经系统损伤所需的毒素浓度也仍未被探明。本研究中构建的人源化模型等，能够为解答这一关键问题提供必要且重要的见解。

斑马鱼是尤为合适的研究选择，因为正如我们在本研究中所证实的，与小鼠模型不同，斑马鱼通常对ETX不敏感。一项极具说服力的后续研究将是培育出同时在内皮细胞（ECs）和少突胶质细胞中表达两种报告基因标记的人源MAL（hMAL）构建体（采用两种不同的报告基因）的斑马鱼品系，进而观察血脑屏障（BBB）是否会被穿透、是否会发生脱髓鞘病变；若发生此类病变，还需探究其病理进程的动力学特征。本研究有望最全面地模拟ETX-MAL介导的多发性硬化病变，因为这一模拟场景可能发生在完整的微环境中。

表明人类对ε毒素（ETX）易感的直接证据较为有限；不过有报道称人类感染了表达ε毒素的产气荚膜梭菌毒素型并引发了相关疾病。一项病例报告证实，一名患者出现坏疽性髂骨炎，并分离出了分泌ε毒素的D型产气荚膜梭菌（GleesonWhite & Bullen, 1955）。在另一项报道中，研究人员直接从一名强直性脊柱炎患者的血清中分离出了ε毒素（Kohn & Warrack, 1955）。此外，有两项研究从气性坏疽患者体内分离出了D型产气荚膜梭菌（Morinaga et al., 1965; Miller et al., 2004）。越来越多的证据表明，ε毒素与多发性硬化症（MS）存在关联：研究人员从一名多发性硬化症患者体内分离出了分泌ε毒素的B型产气荚膜梭菌，且患者血清中富集了针对该毒素的抗体（Rumah et al., 2013; Wagley et al., 2018）。已知ε毒素可结合人类肾细胞系（Ivie et al., 2011; Fernandez Miyakawa et al., 2011; Shortt et al., 2000）以及马尾髓鞘（Dorca-Arevalo et al., 2008）。但目前尚无研究报道该毒素是否能结合人类血脑屏障（BBB）。本研究发现ε毒素与人类髓鞘相关脂蛋白（hMAL）存在关联，这种相互作用会对神经脉管系统产生一系列影响，而髓鞘相关脂蛋白已知在人类血脑屏障中表达（Urich et al., 2012），这为揭示ε毒素在人体血液循环中可能的作用机制提供了线索。

本研究的局限性

我们尚不清楚 ETX 与 hMAL 之间是否存在直接的蛋白质-蛋白质相互作用，也不清楚该复合物中是否涉及其他蛋白质。目前也仍不明确，随着血脑屏障（BBB）完全成熟，在发育后期 ETX 是否仍会引发本文所揭示的这种剧烈效应。ETX浓度降低是否会得出相同的研究结果仍有待探究。本研究结果推广性的另一项局限在于感染方式为静脉注射，这一方式无法阐释ETX从肠道向血液的转运过程。我们在注射毒素前通过定制单克隆抗体对其进行孵育，从而中和了毒素的作用，但从治疗角度来看，该抗体在毒素已进入血液后是否仍能减轻ETX的毒性，仍需进一步验证。最后，血脑屏障通透性增加开始后，脑实质会发生何种变化，目前尚不明确。

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