题目：H2S promotes developmental brainangiogenesis via the NOS/NO pathway in zebrafish

原文链接：https://doi.org/10.1136/svn-2020-000584

期刊：Stroke and Vascular Neurology

摘要

背景：硫化氢（H₂S）与一氧化氮（NO）、一氧化碳一同被认为是气体递质家族的第三种成员。有研究报道，H S可通过促进内皮细胞的生长、迁移及管样结构形成来诱导血管生成。相关研究均在细胞培养、小鼠基质胶栓塞实验模型、大鼠伤口愈合模型或大鼠后肢缺血模型中开展。近期的体内研究表明，H₂S 在肌肉血管生成中具有重要的生理意义。然而，内源性H,S在发育过程中对脑部血管生成的重要性目前仍不明确。因此，本研究旨在探究 H₂S在脑血管发育中的作用。

方法与结果：采用吗啉代寡核苷酸（MO）以及 CRISPRCas9 基因编辑技术，对硫化氢合成酶 ——胱硫醚 β合成酶（cbs）与胱硫醚 γ裂解酶（cth）分别进行基因敲低与敲除处理，结果会造成斑马鱼幼鱼脑部血管发育受损。使用缓释型硫化氢供体 GYY4137 进行孵育处理，能够改善cbs和cth敲低模型的脑部血管发育缺陷。对中脑血管网络开展定量分析发现：硫化氢可促进血管生成，但不会改变脑血管的拓扑结构。机制层面，cbs、cth敲低幼鱼体内一氧化氮合酶 2a（nos2a）的表达水平与一氧化氮（NO）生成量均出现下降；将cbs或cth吗啉代寡核苷酸与斑马鱼全长nos2a mRNA 共注射实现nos2a过表达，可缓解cbs、cth敲低导致的脑部血管发育异常。

结论:H₂S通过NOS/NO通路促进斑马鱼脑发育血管生成。

引言

自从1989年在哺乳动物大脑中发现以来，“硫化氢(H₂S)在中枢神经系统中的生理和病理生理作用一直受到人们的关注。H₂S与一氧化氮和一氧化碳一起被认为是气体递质家族的第三个成员。胱硫醚β-合成酶（CBS）和胱硫醚γ-裂解酶（CTH）是哺乳动物组织中半胱氨酸和同型半胱氨酸产生H₂S的两种主要酶。 CBS在大脑，尤其是海马体和小脑中。 在发育中的小鼠大脑中，H₂S优先在放射状胶质细胞/星形胶质细胞谱系中产生。胱硫醚-γ-裂解酶（CTH）的表达在肝脏、胰腺、子宫和肠道等外周组织中分布相当广泛。 蛋白质印迹实验在新生猪的脑微血管中检测到了胱硫醚-γ-裂解酶（CTH）而非胱硫醚β合成酶（CBS），且胱硫醚-γ-裂解酶（CTH）是血管中主要的H₂S-生成酶。

在中枢神经系统（CNS）中，已被广泛研究的硫化氢（H₂S）功能包括神经递质传递的调控与神经保护作用 。在外周血管系统中，有研究报道硫化氢可诱发血管舒张并促进血管生成。体外研究证实，生理浓度下的外源性硫化氢能够通过促进血管内皮细胞（ECs）增殖、迁移以及管样结构形成，进而诱导血管生成；而原位动物实验显示，在小鼠基质胶栓模型 、大鼠创面愈合模型以及大鼠后肢缺血模型中，硫化氢均可促进新生血管形成。近期两项在体研究表明硫化氢对肌肉组织的血管生成具有重要意义。但内源性硫化氢在机体发育过程的脑血管生成中发挥何种作用，目前尚不明确。

斑马鱼是研究血管发育体内机制的成熟脊椎动物模型。其胚胎体积小、透明且易于操作，便于对脑血管进行高分辨率体内成像。 在本研究中，我们以斑马鱼幼鱼为模型，发现内源性H₂S可通过促进血管生成，在脑血管发育中发挥重要作用，且该作用主要通过一氧化氮合酶（NOS）/一氧化氮（NO）通路介导。

结果

内源性 H₂S 对斑马鱼的脑血管发育至关重要

为探究cbs与cth基因在斑马鱼中的表达模式，本研究对受精后 3 天（3 dpf）的斑马鱼幼鱼开展全胚胎原位杂交实验，结果发现cbs和cth在斑马鱼脑组织中广泛表达（图 1A）。为明确硫化氢(H₂S）是否参与脑部血管发育，我们首先利用吗啉代寡核苷酸（MO）进行基因敲低，抑制cbs和cth的表达。MO 可有效下调斑马鱼幼鱼体内cbs、cth的表达水平（网络补充图 S1）；同时，cbs、cth敲低突变体的硫化氢生成量也显著下降（网络补充图 S2）。本研究使用Tg(Flk1:eGFP)转基因斑马鱼品系开展实验，该品系的血管内皮细胞可表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）。我们对同一尾幼鱼，在受精后 35 天（35 dpf）对其中脑血管进行在体长时程连续共聚焦成像。与注射对照 MO（Ctrl MO）的胚胎相比，cbs敲低突变体与*cth*敲低突变体均出现脑部血管发育异常（图 1B，网络补充图 S3A），表现为 35 dpf 阶段中脑血管密度降低（图 1C，p＜0.01）。

与此同时，在受精后 3 天，cbs、cth敲低突变体的脑大小（以上丘宽度作为评价指标）以及细胞凋亡水平和对照组相比无统计学差异（网络补充图 S4A、B、D、F）。这提示，cbs、cth敲低突变体的脑部血管发育缺陷，并非由大脑发育迟缓或者神经元死亡。此外，通过共注射cbs或cth单导向RNA（sgRNA）与CRISPR相关蛋白9（Cas9）核酸酶构建的cbs和cth突变体（在线补充图S5），也导致F0代胚胎在3-5天龄（dpf）期间中脑血管密度显著降低（图1D、E，在线补充图S3B；p<0.01）。进一步而言，通过将稳定的杂合突变体品系与Tg(Flk1:eGFP)背景品系互交获得的cbs和cth纯合突变体（在线补充图S6），在3天龄（dpf）时也表现出脑血管发育受损，而5天龄（dpf）时血管发育相对正常，这可能是由于稳定品系的代偿效应（图1F、G，在线补充图S3C；p<0.05）。尽管cbs和cth纯合突变体的大脑体积略小在受精后3天（见在线补充图S4C；p<0.05），它们未显示细胞凋亡增加（见在线补充图S4E、G）。

图1 敲低或敲除cbs或cth会损害斑马鱼幼鱼的脑血管发育。(A) 3天胚胎期（3 dpf）全斑马鱼幼鱼的原位杂交结果，显示cbs和cth在脑部普遍表达（侧视图）。(B和C) 吗啉代寡核苷酸介导的cbs或cth敲低对脑血管发育的影响。(B) 从同一幼鱼3-5天胚胎期（3–5 dpf）的cbs或cth morphant共聚焦图像重建的代表性中脑血管结构。(C) 数据汇总。实验重复三次，每组在每个时间点检测6个胚胎。(D和E) cbs或cth敲除（F0代）对脑血管发育的影响。(D) 从同一F0代突变体幼鱼3-5天胚胎期（3–5 dpf）的共聚焦图像重建的代表性中脑血管结构。(E) 数据汇总。每组检测6个胚胎。(F和G) cbs或cth纯合突变体对脑血管发育的影响。(F) 从同一cbs或cth纯合突变体幼鱼3天和5天胚胎期（3和5 dpf）的共聚焦图像重建的代表性中脑血管结构。(G) 数据汇总。每组检测6个胚胎。比例尺：(A) 300微米，(B、D、F) 25微米。误差线代表均值标准误（SEM）。（非配对双尾Student’s t检验） 

接下来，我们通过浸泡施用GYY4137（200微摩尔）对cbs和cth morphant进行了挽救实验。GYY4137是一种缓释供体H₂S，能够稳定产生H₂S，浓度至少约为5-10微摩尔，持续时间可达7天。28 注射了MO的胚胎从受精后24小时起，便置于用GYY4137稀释的汉克氏溶液中处理。GYY4137处理缓解了cbs和cth morphant的脑血管发育缺陷（图2）。值得一提的是，对对照组斑马鱼施用GYY4137并未增加其中脑血管密度（在线补充图S7）。

综合来看，这些结果表明内源性的 H₂S对脑血管的发育具有重要作用。

图2 GYY4137对cbs和cth morphant斑马鱼脑血管发育缺陷的挽救效应。(A) 代表性共聚焦投影图像显示，GYY4137处理可改善cbs和cth morphant斑马鱼受损的脑血管发育。共聚焦图像拍摄于同一条斑马鱼幼鱼的3-5天胚胎期（dpf）。(B) GYY4137挽救效应的汇总结果。每组检测6个胚胎。比例尺，50微米（图A）。误差线表示均值标准误（SEM）。(*P<0.05)、(^{* *} p<0.01)、(^{* * *} p<0.001)（单因素方差分析）。MO，吗啉代寡核苷酸。  

H₂S 促进脑部血管生成而非拓扑结构形成

血管网络的成熟过程涉及复杂的环节，包括血管发生、血管生成，以及随后的血管形成、稳定、分支、修剪和特化。 这一过程可概括为两个主要方面：血管生长（通过血管生成）和拓扑结构形成（即分支与修剪）。为了明确 (H_{2} ~S) 的具体作用，我们对中脑血管的特征进行了定量分析。我们分别用总长度和血管节段数来量化血管生成过程中的血管伸长和新血管生成，用血管节段的平均级数和血管环数来量化血管网络的复杂程度。 在受精后3天的 cbs 和 cth  morphants 中，总长度和血管节段数均显著降低（图3A-C；p<0.001），而平均级数和环数则无明显变化（图3A、D、E）。这些结果表明，H₂S 可促进斑马鱼脑血管发育过程中的血管生成，且不影响其拓扑结构。

图3 cbs和cth morphant中脑血管的结构分析。(A) 3天受精后幼虫的图像，显示用虚线勾勒的中脑位置（左上），以及对照组吗啉代寡核苷酸（MO；右上）、cbs MO（左下）和cth MO（右下）3天受精后幼虫的代表性脑血管中心线。C，尾侧；L，外侧。(B–E) 对照组MO、cbs MO和cth MO组脑血管总血管长度(B)、血管节段数(C)、加权平均节段斯特拉勒等级(D)和内部血管环数(E)的变化汇总。每组检测6个胚胎。误差线为均值标准误。(****P<0.001)（非配对双尾Student’s t检验）。 

NOS/NO 通路参与了 H₂S 的促血管生成作用

一氧化氮（NO）由L-精氨酸与O₂反应生成，该反应由一氧化氮合酶（NOS）催化。在哺乳动物中已鉴定出三种NOS同工型：神经元型NOS（NOS1）、诱导型NOS（NOS2）和内皮型NOS（NOS3）。而在斑马鱼基因组中，存在1个nos1同源基因和2个nos2同源基因（nos2a和nos2b）。研究发现，cbs和cth morphant（吗啉代寡核苷酸敲低胚胎）中nos2a的表达均下降，而cth morphant中nos2b的表达则上升，这可能是一种代偿效应（图4A (p<0.05)）。同时，nos1的表达未受影响（图4A）。与之一致的是，cbs和cth morphant中的NO生成量也均降低（图4B；(p<0.01)）。随后，通过将cbs或cth吗啉代寡核苷酸与全长斑马鱼nos2a mRNA共注射进行拯救实验，发现cbs或cth敲低导致的NO生成减少和脑血管缺陷均得到显著缓解（图4C、D；NO生成对应(p<0.01)，血管密度对应(p<0.05)。值得注意的是，cbs和cth morphant中ERK1/2（p44/42丝裂原活化蛋白激酶）、磷酸化ERK1/2以及血管内皮生长因子（VEGF）的表达均无显著变化（图4E、F）。综上，这些结果表明NOS/NO信号通路在H₂S的脑血管生成促血管生成作用中发挥重要作用。

图4一氧化氮合酶（NOS）/一氧化氮（NO）途径参与cbs和cth敲除诱导的脑血管发育缺陷。（A和B）cbs和cth敲除对NOS/NO信号通路的影响。受精后3天（dpf）胚胎中nos1、nos2a和nos2bRNA表达（A）和总NO产量（B）的总结。（C和D）nos2a mRNA对cbs和cth形态中脑血管发育缺陷的拯救作用。与注射cbs或cth MO和nos2a mRNA的3-dpf胚胎相比，共注射cbs或cth MO和nos2a mRNA的3-dpf胚胎中总NO产量（C）和中脑血管密度（D）增加的总结。每组检查六个胚胎。（E和F）cbs和cth组合式对p-ERK1/2、ERK1/2和VEGF蛋白表达无影响。蛋白质印迹数据的代表性印迹（E）和总结（F）。误差条，扫描电镜。(*P<0.05)，(^{* *} p<0.01)（不成对的双尾学生t检验）。

讨论

H₂S已被证实能在体外及病理模型中发挥强效的促血管生成作用。 近期，两项体内研究揭示了 H2S 在肌肉中的重要作用,血管生成。通过对斑马鱼幼虫进行活体共聚焦成像，本研究揭示了内源性H₂S在脑部发育性血管生成中的作用。

外源性H₂S在外周血管上的促血管生成作用所涉及的信号通路，已通过体外制剂得到了充分研究。H2S的促血管生成作用通过以下途径介导：（1）通过KATP通道/MAPK实现与内皮细胞相关的血管生成特性通路；(2) 血管内皮生长因子（VEGF）的表达上调及从细胞中释放；(3) 一氧化氮合酶（NOS）/一氧化氮（NO）信号通路的激活。本研究检测了细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）的磷酸化水平与VEGF的表达，发现在胱硫醚β合成酶（cbs）和cth基因敲低胚胎中，这些信号均无变化。NO与H2S具有诸多相似的调控作用，包括促进血管生成、血管舒张、减轻细胞凋亡以及发挥抗氧化作用。据报道，H2S可通过NO依赖性和非依赖性两种机制发挥促血管生成功能。外源性给予H2S可上调培养的内皮细胞（ECs）中NOS的表达并促进其磷酸化，同时还能刺激NO的生成。在斑马鱼幼虫中，nos2a的表达主要定位于头部、眼部和肠道区域，这与我们观察到的cbs和胱硫醚γ裂解酶（cth）的表达模式一致。本研究发现，敲低H₂S会导致nos 2a的表达降低及NO生成减少。向cbs和cth基因敲低胚胎中注射全长斑马鱼一氧化氮合酶2a（nos2a）mRNA，可缓解其脑血管发育缺陷。因此，H₂S可通过斑马鱼体内的NOS/NO通路促进脑血管血管生成。

证实内源性硫化氢（H₂S）促血管生成作用的多数研究，主要通过调控 CTH 开展；如前文所述，普遍认为硫化氢的细胞作用靶点为血管内皮细胞（ECs）。但本研究发现，CBS来源与CTH来源的硫化氢，在脑部发育性血管生成过程中均发挥关键作用。事实上，大脑内星形胶质细胞产生的硫化氢，产量几乎是其他脑细胞类型的10倍，这使得星形胶质细胞成为硫化氢发挥作用的重要靶细胞，同时 CBS 也是脑内硫化氢的重要生成来源。我们推测，硫化氢通过直接、间接两种方式作用于血管内皮细胞，进而促进脑部血管生成。硫化氢调控脑部血管生成的细胞分子机制仍有待进一步研究。

目前，大量动物和细胞研究已表明，H₂S 凭借其神经保护作用，会对缺血性卒中的预后产生影响。借助缓释型H₂S 供体，H₂S 正逐渐成为治疗脑缺血的潜在疗法。本研究揭示了内源性 H₂S 在脑血管生成中的作用，这使得基于H₂S 的脑缺血治疗方案更具前景。

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