题目：VEGF signaling governs the initiation of biliarymediated liver regeneration through the PI3KmTORC1 axis

原文链接:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.113028

期刊：Cell Reports

摘要

当肝细胞增殖受损时，胆管上皮细胞（BECs）是修复受损肝脏的潜在细胞来源。促进胆管上皮细胞向肝细胞转分化可能对终末期肝病患者的临床治疗有益。然而，胆管上皮细胞转分化启动的相关机制目前仍知之甚少。本研究发现，在肝细胞发生严重损伤时，vegfaa和vegfr2/kdrl分别在肝星状细胞和胆管上皮细胞中被显著诱导。血管内皮生长因子（VEGF）信号通路的药理学和遗传学失活会破坏胆管上皮细胞的去分化和增殖，进而抑制肝细胞的再生。在机制层面，VEGF信号通路调控PI3K-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）轴的激活，而该轴是胆管上皮细胞向肝细胞转分化的关键。在小鼠模型中，VEGF信号通路在卵圆细胞激活和胆管上皮细胞向肝细胞分化过程中发挥保守的作用。综上，本研究表明VEGF信号通路通过激活PI3K-mTORC1轴，成为介导胆管源性肝脏再生的启动因子。调控胆管上皮细胞中的VEGF信号通路有望成为治疗终末期肝病患者的新方法。

图文摘要

引言

肝脏是一种具有强大再生能力的重要消化器官。在部分肝切除或急性肝毒性药物暴露后，肝细胞介导的肝脏再生是修复肝功能的主要方式，即已存在的未受损肝细胞快速增殖以重建肝脏体积。然而，以往在斑马鱼中的研究表明，当肝细胞受到严重损伤时，胆管上皮细胞（BECs）会先去分化为双潜能祖细胞（BPPCs），再重新分化为新生肝细胞，这一过程被称为胆管介导的肝脏再生。后续在小鼠身上的研究证实，当小鼠肝细胞增殖受阻并发生慢性肝损伤时，会发生胆管上皮细胞向肝细胞的转分化。胆管反应过程（包括胆管上皮细胞的扩增）是终末期肝病患者中观察到的主要组织病理学特征。对肝硬化患者的研究发现，在胆管上皮细胞与肝细胞之间存在一类过渡细胞，这类细胞表达EpCAM等祖细胞标志物。此外，在人类肝硬化患者中，大部分远端胆管上皮细胞具有类干细胞特性，这提示胆管上皮细胞可能是终末期肝病患者实现肝细胞再生的替代来源。原位肝移植是终末期肝病患者的主要根治性治疗手段，但器官供体短缺，促进胆管上皮细胞向肝细胞转分化可能对临床治疗有益。

斑马鱼是研究胚胎发育、组织再生以及多种肝脏疾病的理想模型。斑马鱼胚胎发育迅速，且易于进行活体成像，因此与小鼠相比，更适合研究胆源性肝脏再生。在斑马鱼中，硝基还原酶-甲硝唑（NTR-Mtz）系统可实现肝细胞的大量缺失，这会导致胆管上皮细胞（BECs）发生形态改变，呈现出未成熟祖细胞的特征。与此同时，在胆管上皮细胞中，hex、foxa3 和 sox9b 等胆源性肝祖细胞（BPPCs）标志物的表达会被显著诱导，这表明胆管上皮细胞向胆源性肝祖细胞发生了去分化。随后，胆源性肝祖细胞快速增殖并重新分化为新生肝细胞和胆管上皮细胞。 截至目前，一些关键的已研究表明，参与肝脏发育的信号通路（如Wnt、Bmp和Notch通路）以及Dnmt1、P53、Hdac1、Tel2和FXR等其他关键因子，对肝脏发育具有调控作用晚期肝祖前体细胞的增殖或再分化。近期的一项研究有研究报道，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1) 信号通路是胆管上皮细胞去分化所必需的。10然而，支气管上皮细胞去分化启动的调控机制在很大程度上仍不明确。

血管内皮生长因子（VEGF）是一种分泌型多肽，它能与跨膜酪氨酸激酶VEGF受体结合，随后诱导其发生二聚化并激活。血管内皮生长因子（VEGF）因其在血管生成中的基础性作用而被广泛研究，尤其是通过血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）进行信号传导的相关机制。血管内皮生长因子大多被视为多种癌症的治疗靶点。血管内皮生长因子受体2拮抗剂索拉非尼和仑伐替尼已被用于肝细胞癌的治疗。部分肝切除术后，血管内皮生长因子-血管内皮生长因子受体2信号通路通过调控肝损伤后内皮细胞的增殖，促进血管生成过程。这些研究揭示了血管内皮生长因子信号通路在血管功能中不可或缺的作用；然而，关于其在肝再生过程中在内皮细胞之外的作用，目前仍知之甚少。

本研究利用斑马鱼和小鼠肝损伤模型，发现血管内皮生长因子（VEGF）信号通路在胆管介导的肝再生过程中，通过激活下游的磷脂酰肌醇3-激酶-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（PI3K-mTORC1）信号轴，调控胆管上皮细胞（BEC）的去分化与增殖。

结果

斑马鱼肝细胞重度损伤后，vegfaa与kdrl的表达水平会上调

尽管VEGF信号通路在血管生成中发挥关键作用，但其是否参与极端肝损伤后胆管上皮细胞向肝细胞的转分化过程仍不清楚。本研究基于斑马鱼NTR-甲硝唑（NTR-Mtz）系统，利用转基因品系Tg(lfabp:Dendra2-NTR)（本文简称为Tg(lfabp:DenNTR)）对肝细胞进行消融。对我们前期获得的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据11的分析显示，哺乳动物Vegfa的同源基因vegfaa的表达在肝损伤后再生0小时（R0h）显著上调，且在肝星状细胞（HSCs）中表达升高尤为明显（图1A-1C）。而肝脏区域中几乎未检测到其他VEGF异构体（vegfab、vegfba、vegfbb、vegfc和vegfd）的表达（图S1A），这表明vegfaa可能是介导肝再生过程中VEGF信号通路的主要VEGF配体。随后对VEGF受体的表达分析发现，三种受体VEGFR1/Flt1、VEGFR2/Kdrl和VEGFR3/Flt4均在血管内皮细胞（VECs）中高表达，而仅kdrl在胆管前体细胞样细胞（BPPCs）中存在表达（图S1B、S1C），提示VEGFA可能直接结合胆管上皮细胞中的VEGFR2并激活下游通路。与kdrl不同，斑马鱼另一个vegfr2同源基因vegfr2b/kdr在R0h时的BPPCs中未检测到明显表达（图S1B、S1C）。为定量分析VEGF配体和受体在肝星状细胞与胆管前体细胞样细胞中的表达水平，我们通过转基因品系Tg(hand2:GFP)11和Tg(tp1:GFP)21分离出hand2+肝星状细胞和tp1+胆管前体细胞样细胞，随后进行实时荧光定量PCR（qPCR）检测。结果与单细胞RNA测序数据一致，肝损伤后vegfaa在肝星状细胞中表达更高，而kdrl在胆管前体细胞样细胞中表达更高（图1D、1E）。通过荧光原位杂交（FISH）技术，我们进一步验证了vegfaa在肝星状细胞中的表达以及kdrl在胆管前体细胞样细胞中的表达（图1F、1G及图S1C）。上述数据表明，肝细胞损伤诱导产生的Vegfaa可能结合胆管前体细胞样细胞中的VEGFR2，进而参与胆管介导的肝再生过程。

图1. 严重肝细胞损伤后血管内皮生长因子配体vegfaa和受体kdrl被诱导表达(A)展示肝脏再生各阶段的实验方案。(B) 均匀流形逼近与投影（UMAP）图，显示受精后6天（6 dpf）和再生0小时（R0h）肝脏中的各类细胞类型，并叠加了vegfaa的表达情况（红色）。缩写说明：dpf=受精后天数；R0h=再生0小时；Hep=肝细胞；BEC=胆管上皮细胞；HSC=肝星状细胞；VEC=血管内皮细胞；BPPC=双潜能祖细胞；IC=免疫细胞。(C) 基于单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据的肝星状细胞中vegfaa表达定量分析。(D) 展示细胞分离与RNA提取流程的实验方案。定量聚合酶链式反应（qPCR）数据显示再生0小时（R0h）时肝星状细胞和双潜能祖细胞中血管内皮生长因子（VEGF）配体及受体的表达水平。(n=3) 为技术重复。采用未配对双尾Student's t检验。(^{*} p<0.01)、(^{++} p<0.001) 为实验标识。误差棒代表均值标准误（SEM）。(E) 定量聚合酶链式反应（qPCR）数据（上图）显示受精后6天（6 dpf）和再生0小时（R0h）肝星状细胞中vegfaa的表达水平；定量聚合酶链式反应（qPCR）数据（下图）显示受精后6天（6 dpf）的胆管上皮细胞和再生0小时（R0h）的双潜能祖细胞中kdrl的表达水平。(n=3) 为技术重复。采用未配对双尾Student's t检验。(^{*} p<0.01)、(^{* *} p<0.001) 为实验标识。误差棒代表均值标准误（SEM）。(F) 荧光原位杂交（FISH）与抗体染色结果，显示在Tg(lfabp:DenNTR; hand2:GFP)背景下，受精后6天（6 dpf）、再生0小时（R0h）和再生8小时（R8h）肝星状细胞中vegfaa的表达情况。比例尺：50微米。(GFP+) 为实验标识。(G) 荧光原位杂交（FISH）与抗体染色结果，显示在Tg(lfabp:DenNTR; tp1:GFP)背景下，受精后6天（6 dpf）、再生0小时（R0h）和再生8小时（R8h）双潜能祖细胞中kdrl的表达情况。比例尺：50微米。(GFP+) 为实验标识。另见图S1。

VEGF信号通路是胆管上皮细胞向肝原代祖细胞去分化以及肝原代祖细胞增殖所必需的

接下来，我们通过使用化学物质 AV-951 探究了血管内皮生长因子（VEGF）信号通路的作用，该物质可抑制所有 VEGF 受体的活性。22AV-951 处理显著减小了24小时和48小时时的肝脏再生体积（图2A），表明VEGF信号通路对于胆管介导的肝脏再生至关重要。在胆管介导的肝脏再生启动过程中，胆管上皮细胞（BECs）失去自身特性并去分化为胆管源性肝前体细胞（BPPCs），其特征为前体细胞标志物foxa3、hhex和sox9b表达上调，同时形态发生改变，呈现未成熟前体细胞的特征。膜联蛋白A4（Anxa4）是BECs和BPPCs的公认标志物。荧光原位杂交（FISH）结合Anxa4抗体染色结果显示，与对照组相比，AV-951处理显著降低了Anxa4阳性BECs中foxa3、hhex和sox9b的表达诱导（图2B-2D）。此外，对照组的BECs在初始时间点（R0h）出现直径增大，而AV-951处理显著逆转了这一形态改变（图2E），说明抑制VEGF会导致BECs去分化异常。

VEGF信号通路是已知的内皮细胞增殖调控因子，因此我们检测了VEGF抑制是否会影响BPPCs的增殖。通过将5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入实验与Anxa4抗体染色相结合，我们发现对照组在8小时（R8h）和24小时（R24h）时，大部分Anxa4阳性的BPPCs均被EdU信号标记（图2F-2H），这表明BPPCs处于快速增殖状态。然而，经AV-951处理后，EdU阳性/Anxa4阳性细胞的比例显著降低（图2F-2H），这说明VEGF信号通路对BPPCs的增殖至关重要。

图2. AV-951对VEGF的抑制导致有缺陷的BEC去分化和BPPC增殖（A）显示AV-951处理时间线的实验方案。显示lFabp的共聚焦投影图像：R24h和R48h处的DenNTR表达。比例尺：50毫米。显示R48h处身体表型的明场图像。比例尺：500毫米。（B-D）FISH和Anxa4抗体染色显示R0h处Anxa4+细胞中foxa3（B）、hhex（C）和sox9b（D）的表达。比例尺：50毫米。显示foxa3（B）、hhex（C）和sox相对表达水平的qPCR数据9b(n=3)技术重复。未成对的双尾学生t检验。(^{*} p<0.01)。(^{* *} p<0.001)。误差条代表SEM。（E）ROh处Anxa4*细胞直径的量化。(n=16)。未成对的双尾学生t检验。(^{* * *} p<0.001)。误差条代表SEM。（F和G）共聚焦投影图像显示EdU染色和R8h处的Anxa4抗体染色（F比例尺：50毫米。（H）量化所有Anxa4+(n=6)细胞中EdU+/Anxa4+细胞的比率。n=6（DMSO-R8h、AV-951-R8h和AV-951-R24h）和5（DMSO-R24h）。未配对的双尾学生t检验。(^{* *} p<0.001)。误差条代表SEM。

VEGF抑制会破坏胆管上皮细胞来源的肝细胞再生

鉴于VEGF抑制后胆管内皮细胞（BEC）去分化和肝祖细胞样细胞（BPPC）增殖存在缺陷，我们推测胆管内皮细胞向肝细胞的分化过程可能得以进行。全 mounts 原位杂交（WISH）和定量聚合酶链式反应（qPCR）结果显示，在48小时（R48h）时，对照组再生肝脏中高表达成熟肝细胞标志物GC维生素D结合蛋白（gc）、铜蓝蛋白（cp）、肝细胞核因子4α（hnf4a）和转铁蛋白-α（tfa）的mRNA，而AV-951处理组的这些肝细胞标志物表达则极少（图3A、3B）。随后，我们检测了肝细胞核因子4α（Hnf4a）及另一肝细胞标志物甜菜碱-同型半胱氨酸甲基转移酶（Bhmt）的蛋白表达。与对照组相比，AV-951处理显著抑制了Hnf4a和Bhmt的表达（图3C、3D），表明VEGF抑制会导致肝细胞再生缺陷。为进一步证实VEGF抑制在胆管介导的肝脏再生中的作用，我们使用转基因品系Tg(krt18:CreER;lfabp:loxP-STOP-loxP-DsRed;lfabp:DenNTR)进行了谱系示踪实验¹⁰。在二甲基亚砜（DMSO）组中，几乎所有DsRed+胆管来源的细胞均强表达Bhmt（图3E），证实肝细胞再生主要由胆管内皮细胞贡献。然而，AV-951组中dsRed+肝细胞的数量及占比均有所减少（图3E），证实VEGF抑制会导致胆管内皮细胞向肝细胞的转分化存在缺陷。

图3. AV-951处理破坏了胆管上皮细胞向肝细胞的分化(A) WISH 图像显示再生肝脏中在 R48h 时 gc、cp、tfa 和 hnf4a 的表达（红色箭头）。比例尺：100 微米。(B) qPCR 数据显示 gc、cp、tfa 和 hnf4a 的相对表达水平，附带技术重复样本。采用非配对双侧 Student's t 检验。误差棒代表均值标准误。(C) 单光学切片图像显示 R48h 时 Bhmt 和 Dendra2 的表达。比例尺：50 微米。对肝脏区域 Bhmt 表达的相对荧光强度进行定量分析，分别为 DMSO 组和 AV-951 组。采用非配对双侧 Student's t 检验。误差棒代表均值标准误。(D) 单光学切片图像显示 R48h 时 Hnf4a 和 Dendra2 的表达。比例尺：50 微米。对肝脏区域 Hnf4z 表达的相对荧光强度进行定量分析。采用非配对双侧 Student's t 检验。误差棒代表均值标准误。(E) 实验方案展示了利用转基因品系 Tg(krt18:CreER; lfabp:loxP-STOP-loxP-DsRed; lfabp: DenNTR) 对 4-OHT 和 AV-951 的处理方式。单光学切片图像显示 R48h 时 Bhmt 和 dsRed 的表达。4-OHT 为 4-羟基他莫昔芬。比例尺：50 微米。定量分析所有 dsRed* 细胞中特定细胞的比例，分别为 DMSO 组和 AV-951 组。采用非配对双侧 Student's t 检验。误差棒代表均值标准误。

选择性抑制VEGFR2会破坏胆管上皮细胞向肝细胞的转分化

鉴于kdrl表达在胆管源性肝前体细胞（BPPCs）中特异性上调（图S1C），我们推测VEGF信号通路在胆管介导的肝再生中的作用主要由通过VEGFR2。因此，我们使用了另一种化学物质SU5416，它能特异性抑制VEGFR2的活性。与AV-951类似，SU5416确实能够减弱斑马鱼体内VEGFR2的磷酸化，进而抑制VEGF信号通路（图S2A）。在甲硝咪唑（Mtz）诱导肝细胞损伤后，SU5416处理显著减小了肝脏的再生体积（图4A），这表明VEGFR2发挥着关键作用。荧光原位杂交（FISH）结合Anxa4抗体染色结果显示，foxa3、hhex和sox9b的表达以及管状形态的改变均受到显著抑制（图4B），提示胆管上皮细胞（BEC）的去分化过程存在缺陷。此外，抑制VEGFR2会降低BPPCs的增殖（图4C），与AV-951处理后观察到的效应相似。WISH、qPCR和抗体染色实验证实，在SU5416处理的幼虫中，肝细胞标志物gc、cp、tfa、bhmt和hnf4a在48小时（R48h）几乎不表达（图4D-4F），而谱系示踪实验显示SU5416处理后BEC向肝细胞的转分化过程被破坏（图S2B）。这些数据表明，VEGFR2抑制会阻断肝细胞再生。考虑到SU5416和AV-951处理后出现相似的再生表型，且BPPCs中VEGFR1和VEGFR3的表达水平更低，我们得出结论，VEGFR2是BEC到肝细胞transdifferentiation期间VEGFA的主要信号受体。

图4. SU5416对VEGFR2的抑制作用与AV-951处理导致相似的再生缺陷(A)展示SU5416处理时间线的实验方案。共聚焦投影图像显示R24h和R48h时lfabp:DenNTR的表达情况。比例尺：50毫米。明场图像显示R48h时的体表型。比例尺：500毫米。(B) 荧光原位杂交（FISH）和Anxa4抗体染色显示R0h时Anxa4+细胞中foxa3、hhex和sox9b的表达。比例尺：50毫米。qPCR数据显示相对表达水平。(n=3)次技术重复。采用非配对双尾Student's t检验。(^{*} p<0.01)、(^{* *} p<0.001)。误差棒代表均值标准误（SEM）。对Anxa4+细胞的直径进行定量分析。n=16。采用非配对双尾Student's t检验。(^{* *} p<0.001)。误差棒代表均值标准误（SEM）。(C) 共聚焦投影图像显示R24h时EdU染色和Anxa4抗体染色结果。比例尺：50毫米。对EdU+/Anxa4+细胞的比例进行定量分析。(n=5)。采用非配对双尾Student's t检验。(^{* *} p<0.001)。误差棒代表均值标准误（SEM）。(D) 整体原位杂交（WISH）图像显示R48h时gc、cp和tfa的表达。比例尺：100微米。qPCR数据显示相对表达水平。(n=3)次技术重复。采用非配对双尾Student's t检验。(^{++} p<0.001)。误差棒代表均值标准误（SEM）。(E) 单光学切片图像显示R48h时Bhmt和Dendra2的表达。比例尺：50毫米。对肝脏区域Bhmt表达的相对荧光强度进行定量分析。(n=5)。采用非配对双尾Student's t检验。(^{* *} p<0.001)。误差棒代表均值标准误（SEM）(F) 单光学切片图像显示R48h时Hnf4a和Dendra2的表达。比例尺：50毫米。对肝脏区域Hnf4a表达的相对荧光强度进行定量分析。(n=5)。采用非配对双尾Student's t检验。(^{* *} p<0.001)。误差棒代表均值标准误（SEM）。另见图S2。

vegfaa和kdrl的遗传失活导致类似于VEGF拮抗剂治疗的肝脏再生缺陷

vegfaa的表达在极端肝细胞损伤后的HSC中显著诱导（图1），这意味着Vegfaa是VEGFR激活的主要配体。斑马鱼vegfaa突变体在早期阶段显示出严重的血管缺陷。因此，为了破坏vegfaa刺激的VEGF信号，我们设计了一个热休克诱导的转基因系，表达显性阴性vegfaa亚型（dnvegfaa），它可以有效地阻断VEGFA信号。肝损伤后，诱导dnvegfaa表达导致R24h和R48h肝再生缺陷（图5A）。BEC去分化在dnvegfaa过表达时也受到损害，这反映在foxa3、hhex和sox9b的低表达上（图5B）。同样，dnvegfaa-overexpressed组中BPPCs的增殖明显减少（图5C）。WISH和抗体染色结果证实肝标志物gc、cp和bhmt显著降低（图5D和5E），表明VEGFA失活后肝细胞再生中断。一般dnvegfaa过表达可以诱导更多冗余的抑制性VEGF蛋白，并可能影响其他细胞类型，因此我们构建了转基因系Tg（krt18：Tet3G；Tre3G：dnvegfaa-P2A-DsRed），以基于Tet-On系统在BECs中特异性过表达dnvegfaa。15 BEC特异性dnvegfaa过表达导致与一般dnvegfaa过表达相似的肝再生表型（图S3A），证实BECs中VEGF信号的激活对于BEC-to-hepatcell tetransdifferentiation至关重要。

图5. vegfaa的遗传失活抑制胆道介导的肝脏再生（A）展示肝细胞消融和热休克时间线的实验方案。共聚焦投影图像显示lfabp:DenNTR的表达。比例尺：50微米。（B）荧光原位杂交（FISH）和Anxa4抗体染色显示R0小时时Anxa4+细胞中foxa3、hhex和sox9b的表达。比例尺：50微米。qPCR数据显示相对表达水平。(n=3)为技术重复。采用非配对双尾Student's t检验。(^{*} p<0.01)。(cdots p<0.001)。误差线代表均值标准误（SEM）。（C）共聚焦投影图像显示R24小时时EdU染色和Anxa4抗体染色结果。比例尺：50微米。EdU+/Anxa4+细胞比例的定量分析。(n=5)（dnvegfaa-）和6（dnvegfaa+）。采用非配对双尾Student's t检验。(^{* *} p<0.001)。误差线代表均值标准误（SEM）。（D）整体原位杂交（WISH）图像显示R48小时时gc和cp的表达。比例尺：100微米。qPCR数据显示相对表达水平。(n=3)为技术重复。采用非配对双尾Student's t检验。(^{* *} p<0.001)。误差线代表均值标准误（SEM）。（E）单光学切片图像显示R48小时时Bhmt和Dendra2的表达。比例尺：50微米。肝脏区域Bhmt表达相对荧光强度的定量分析。(n=5)。采用非配对双尾Student's t检验。(^{* *} p<0.001)。误差线代表均值标准误（SEM）。另见图S3。

尽管VEGFR2的作用已经被拮抗剂处理充分证明，我们生成了kdrl突变体以遗传方式确认它（图S3B和S3C）。与由于严重的血管发育缺陷而在子宫内死亡的Kdr突变小鼠不同，斑马鱼kdrl突变体可以存活到受精后7天（dpf）并表现出较轻的血管缺陷。与之前的研究一致，30个肝脏发育在kdrl突变体中相对正常（图6A）。为了检测后期的再生表型，我们从4个dpf消融了kdrl突变体的肝细胞。与化学处理的效果类似，kdrl突变体表现出较小的再生肝脏（图6A）。进一步的实验显示9b在R0h时foxa3、hhex和sox的表达显著降低（图6B），在R24h时BPPC增殖中断（图6C），以及在kdrl突变体中R48h时肝细胞再生的显著抑制（图6D和6E）。为了排除kdrl突变的非特异性影响，我们还生成了基于Tet-On的转基因系Tg（krt18：Tet3G；Tre3G：dnkdrl-P2A-DsRed），它在BECs中特异性表达显性-阴性kdrl亚型（dnkdrl）。这种亚型能够定向到膜，但缺乏细胞内蛋白激酶活性（图S3C）。

图6. 敲除kdrl基因会破坏胆管上皮细胞向肝细胞的转分化过程(A)展示肝细胞消融各阶段的实验方案。荧光图像显示4天胚胎期（4 dpf）发育中的肝脏。共聚焦投影图像显示24小时（R24h）和48小时（R48h）时lfabp:DenNTR的表达情况。比例尺：1毫米（4 dpf）和50微米（R24h和R48h）。(B) 荧光原位杂交（FISH）和Anxa4抗体染色显示R0h时Anxa4+细胞中foxa3、hhex和sox9b的表达。比例尺：50微米。qPCR数据显示相对表达水平。(n=3) 为技术重复。采用非配对双尾Student's t检验。(^{*} p<0.01)、(^{+++} p<0.001) 为实验编号。误差线代表均值标准误（SEM）。(C) 共聚焦投影图像显示R24h时EdU染色和Anxa4抗体染色结果。比例尺：50微米。EdU+/Anxa4+细胞比例的定量分析。(n=6) 为实验编号。采用非配对双尾Student's t检验。(^{* *} p<0.001) 为实验编号。误差线代表均值标准误（SEM）。

VEGF信号通过PI3K-mTORC1轴调控胆道介导的肝再生

在VEGF结合和受体二聚化时，VEGFR2经历自磷酸化，从而激活下游信号通路，如PI3K-mTOR16磷酸化核糖体S6蛋白（p-RS6）是mTORC1,31的众所周知的下游效应物，其表达水平反映了mTORC1信号的激活。10与之前的研究一致，10我们验证了mTORC1信号在R0h和R8h高度激活（图S4A），并且雷帕霉素治疗的mTORC1抑制会破坏BEC到肝细胞transdifferentiation（图S4B和S4C）。因此，我们假设VEGF通过激活PI3KmTORC1轴来调节胆道介导的肝脏再生。为了确认PI3K信号是否作用于mTORC1的上游并且是肝脏再生所必需的，我们首先分析了PI3K抑制剂LY294002治疗后p-RS6的表达。PI3K抑制确实可以完全阻断p-RS6的表达（图S4D），表明RS6的磷酸化是PI3K-mTORC1轴激活的良好指标。此外，LY294002治疗引起了与VEGF或mTORC1抑制相似的再生缺陷，包括破坏BEC去分化、损害BPPC增殖和减少肝细胞再生（图S5A-S5F）。这些数据表明PI3K-mTORC1轴调节BEC去分化，它对肝脏再生至关重要。

为了证明PI3K-mTORC1轴通过VEGF信号调节的假设，我们进行了p-RS6抗体染色，发现p-RS6在对照组的BPPCs中高度表达，而在VEGF药理学抑制、dnvegfaa过表达和kdrl突变时显著降低（图7A、S4E和S4F），这表明PI3K-mTORC1轴激活中需要VEGF信号。为了验证调节轴，我们应用了潜在的PI3K激动剂1,3-二咖啡酰奎宁酸（DQA）。DQA治疗可以部分挽救VEGF抑制时p-RS6表达降低（图7A），证实PI3K-mTORC1轴在VEGF信号下游起作用。此外，PI3K激活显著改善R0h BPPC标志物和R48h肝脏标志物的表达（图7B、7C和7E），并部分挽救有缺陷的BPPC增殖为了进一步确认调节轴，我们应用了另一种PI3K激动剂740 Y-P，它也可以改善由VEGF抑制引起的再生表型缺陷（图S6A-S6D）。总之，这些数据表明VEGF信号通过PI3K-mTORC1轴控制胆道介导的肝脏再生的启动（图7F）。

图7. PI3K激活可部分挽救VEGF抑制导致的肝脏再生缺陷（A）单光学切片图像显示p-RS6和GFP在Tg下R0h的表达（lFabp：DenNTR；tp1：GFP）背景。比例尺：50毫米。DQA处理的时间线与AV-951一致。p-RS6在肝内(GFP+)细胞中表达的相对荧光强度的量化。(n=5)（DMSO/DQA）、6（AV-951）和5（AV-951+DQA）。未配对的双尾学生ttest。(^{* * *} p<0.001)。误差条表示SEM。（B）FISH和Anxa4抗体染色显示foxa3、hhex和sox9b在R0h Anxa4+细胞中的表达。比例尺：50毫米。（C）gPCR数据显示foxa3、hhex和sox在ROh9b的相对表达水平。(n=3)技术重复。未配对的双尾学生ttest。(^{*} p<0.01)(^{* *} p<0.001)。误差条表示SEM。（D）显示EdU ste的共聚焦投影图像。EdU+/Anxa4+细胞比率的定量。(n=6)（DMSO/DQA）、4（AV-951）和5（AV-951+DQA）。未成对的双尾学生t检验。(^{* * *} p<0.001)。Eror条代表SEM。（E）共聚焦投影图像，显示R48h时lFabp： DenNTR的表达。比例尺：50毫米。WISH图像显示R48h时gc和cp的表达。比例尺：100毫米。（F）概述VEGF信号在斑马鱼肝脏再生中的作用的插图。另见图S4-S7。

VEGF信号转导调控小鼠卵圆细胞活化和BECto肝细胞分化

VEGF信号在斑马鱼BEC去分化和BPPC增殖中的关键作用促使我们研究其在哺乳动物卵圆细胞激活中的作用。胆碱缺乏、ethionine-supplemented（CDE）饮食诱导的小鼠肝损伤模型，其中椭圆形细胞主要来自BEC，用于这项调查。2月龄的小鼠喂食CDE饮食14天，并从第8天到第13天每天腹腔内注射AV-951或PBS对照（图S7A）。为了检查VEGF抑制时的椭圆形激活，我们进行了抗体对卵圆细胞标志物 Sox9 以及胆管上皮细胞标志物 CK19 进行染色。在对照组中，大量 (Sox9+) 和 (CK19+) 细胞向肝小叶内扩增（图 S7B 和图 S7C），表明表明卵圆细胞被激活。然而，与对照组相比，AV-951 处理组中的这些卵圆细胞显著减少（图 S7B 和 S7C），这表明VEGF 抑制会破坏卵圆细胞的激活。此外，在对照组中，围绕门脉区的大多数小细胞核细胞（这是胆管上皮细胞/卵圆细胞的特征）呈现出 (Ki67+) 的特征（图 S7D）。然而，在 AV-951 处理组中，这些 (Ki67+) 细胞的数量大幅减少（图 S7D）。这些数据表明，与斑马鱼中的情况一致，VEGF 信号通路在小鼠肝损伤时调控胆管上皮细胞来源的卵圆细胞的激活与增殖。

为探究VEGF信号通路在小鼠胆管上皮细胞来源肝细胞再生中的作用，我们构建了基于肝细胞特异性P21过表达的成熟小鼠模型。通过结合使用(OPN ^{CreER } tdTomato ^{L S L})谱系示踪小鼠与他莫昔芬注射，胆管上皮细胞来源的肝细胞将被tdTomato标记。在甲硫氨酸/胆碱缺乏（MCD）饮食诱导的肝损伤后恢复15天，我们观察到，在AV-951和雷帕霉素处理组中，同时表达Hnf4a的胆管上皮细胞来源tdTomato阳性肝细胞样细胞数量减少（图S7E和S7F），这表明VEGF和mTORC1抑制会破坏胆管上皮细胞向肝细胞的分化。为进一步验证研究结果，我们采用了另一种小鼠模型，在严重肝损伤时，肝特异性β-连环蛋白/Ctnnb1缺失会促进胆管上皮细胞分化为肝细胞36。通过使用Ctnnb1flox/floxtdTomatoLSL小鼠，AAV8-TBG-Cre注射可诱导肝细胞中Ctnnb1的条件性敲除，并使预先存在的肝细胞表达tdTomato。在CDE诱导的肝损伤后，新生成的胆管上皮细胞来源肝细胞被标记为Ctnnb1阳性和tdTomato阳性。与P21过表达模型类似，VEGF抑制显著减少了胆管上皮细胞来源的Ctnnb1阳性/tdTomato阳性肝细胞的生成（图S7G），证实VEGF信号通路是小鼠胆管介导的肝再生所必需的。

讨论

鉴于严重肝损伤时肝细胞增殖能力受损，胆管介导的肝再生过程对慢性肝病患者，尤其是终末期肝病患者，具有重要的科学和临床研究价值。本研究揭示了VEGF信号通路在启动胆管介导的肝再生过程中的关键作用。研究数据显示，斑马鱼肝细胞发生严重损伤后，肝星状细胞（HSCs）中vegfaa的表达以及胆管上皮细胞（BECs）中kdrl的表达会被诱导上调。通过药物抑制和基因敲除的方式阻断VEGF信号通路，会同时损害胆管上皮细胞的去分化过程和肝祖样细胞（BPPC）的增殖。此外，在胆碱缺乏-乙硫氨酸（CDE）诱导的小鼠肝损伤模型中，抑制VEGF会破坏卵圆细胞的活化，这表明斑马鱼中的这一发现同样适用于哺乳动物。

在肝细胞介导的肝再生过程中，血管内皮生长因子（VEGF）信号通路调控内皮细胞的增殖，内皮细胞会分泌对肝再生至关重要的促再生因子。令人意外的是，抑制血管内皮生长因子（VEGF）并不会影响其数量在肝细胞发生重度损伤后，内皮细胞的形态发生与增殖（图S2C），这表明VEGF信号通路可能直接调控胆管上皮细胞的转分化，这一作用与其在肝细胞介导的肝再生中的功能有所不同。这种差异可由内皮细胞所受损伤程度不同来解释。在肝细胞来源的肝再生过程中，内皮细胞会大量增殖以重建受损的血管网络；而在肝细胞重度损伤模型中，内皮细胞几乎未受损伤（图S2C）。不过，内皮细胞是否会分泌某些促再生因子并促进胆管上皮细胞的转分化，仍有待进一步研究。

尽管已有研究报道VEGF信号通路可调控胆管上皮细胞的增殖在大鼠胆管结扎（BDL）模型中的作用，我们的研究发现本研究揭示了VEGF信号通路不同于以往研究的新作用。在胆管结扎（BDL）模型中，肝内胆管上皮细胞（BECs）快速增殖以代偿肝内胆管系统的结构和功能紊乱，且这一过程不改变细胞命运，VEGF信号通路仅调控BECs的增殖。然而，在胆管介导的肝再生过程中，BECs首先去分化为祖细胞，随后进行增殖。因此，VEGF信号通路的调控作用针对的是祖细胞的增殖，这一点也得到了小鼠卵圆细胞增殖过程中VEGF需求的验证（图S7）。但本研究与以往研究¹⁰均发现，BEC去分化缺陷会伴随肝祖细胞（BPPCs）增殖能力受损，这表明VEGF信号通路主要调控BEC的去分化过程。事实上，祖细胞具有更强的再生能力⁶，而BECs向BPPCs转化过程的缺陷，从逻辑上也会导致细胞增殖能力下降。

与肝纤维化密切相关的肝星状细胞在激活过程中会高表达血管内皮生长因子配体tion.尽管早期在小鼠身上的研究已通过多种机制揭示了血管内皮生长因子（VEGF）的致纤维化作用，但血管内皮生长因子（VEGF）据报道，这对肝脏修复和纤维化消退也至关重要，这表明活化的肝星状细胞（HSCs）可能在肝脏再生过程中通过分泌血管内皮生长因子（VEGF）发挥积极作用。在斑马鱼肝脏受损时，肝星状细胞的数量显著增加，且其形态变得更细长（图1F），这是活化肝星状细胞的特征。同样，在肝细胞严重受损时，肝星状细胞中血管内皮生长因子AA（vegfaa）的表达被诱导，这表明在哺乳动物和斑马鱼中，活化的肝星状细胞都是血管内皮生长因子配体的潜在来源。尽管血管内皮生长因子AA是肝脏受损时上调的主要血管内皮生长因子配体，但其他三种配体——血管内皮生长因子AB（ve gfab）、血管内皮生长因子BA（vegfba）和血管内皮生长因子C（vegfc）——在肝星状细胞和胆管源性肝祖细胞（BPPCs）中均有一定程度的表达（图S1A）。因此，无法排除其他血管内皮生长因子配体参与血管内皮生长因子信号通路的激活，因为这些配体或许也能与其受体结合并激活下游信号通路。

与内皮细胞的研究结果一致，血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）是肝窦内皮细胞向肝细胞转分化过程中血管内皮生长因子（VEGF）信号的主要转导子。我们仅检测到肝损伤后肝窦内皮细胞中的VEGFR2/Kdrl，使用VEGFR2特异性抑制剂SU5416处理或敲除kdrl会出现与使用广谱抑制剂处理相似的缺陷表型。这一现象可由VEGFR2在PI3K-mTOR激活中的特异性作用解释，这在血管生成过程中也同样存在。VEGFA与VEGFR2的结合会激活受体的激酶活性，并刺激PI3K-mTOR等下游信号通路。同样，重度肝细胞损伤诱导的VEGFA表达通过与VEGFR2结合激活肝窦内皮细胞中的VEGF信号通路，进而刺激PI3K-mTORC1轴，从而启动胆管介导的肝再生（图7F）。尽管在重度肝细胞损伤后大多数肝窦内皮细胞中kdrl的表达被诱导，但仍有一小部分肝窦内皮细胞的kdrl表达水平相对较低（图1G和图S1C）。不同类型肝窦内皮细胞中kdrl表达的差异可归因于肝窦内皮细胞的异质性。表达kdrl的肝窦内皮细胞可能具有更高的祖细胞潜能，而整个肝细胞的再生过程主要可由这些细胞的转分化所介导。这一假说可通过一项针对人和小鼠肝脏发育的研究得到证实，该研究中KDR可鉴定出一组具有潜在分化能力的肝祖细胞分化为肝细胞和胆管细胞。

总之，在胆管介导的肝再生过程中，VEGF信号通路通过激活PI3K-mTORC1轴来调控胆管上皮细胞去分化的早期阶段。鉴于VEGF抑制剂对肝细胞再生存在不良影响，且其已广泛应用于包括肝细胞癌在内的多种癌症的临床治疗，因此需对用药剂量与疗程进行充分把控。

本研究的局限性

单细胞RNA测序和原位杂交数据均显示，肝损伤后造血干细胞中vegfaa基因表达上调；然而，vegfaa表达的诱导机制目前仍不明确，有待进一步研究。此外，基于kdrl-CreER的谱系示踪实验可为表达kdrl的胆管细胞对整个肝脏再生的潜在贡献提供证据。最后，VEGF过度激活是否能促进胆管来源肝细胞的生成，进而加速肝脏修复，仍是一个具有关键意义的研究问题，对终末期肝病患者的治疗具有重要临床价值。

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