Zigang Cao、Yunlong Meng、Fanghua Gong、Zhaopeng Xu、Fasheng Liu、Mengjie Fang、Lufang Zou、Xinjun Liao、Xinjuan Wang、Lingfei Luo、Xiaokun Li、Huiqiang Lu

井冈山大学 · 赣南师范大学 · 温州医科大学 · 西南大学发育生物学与再生医学研究所

PNAS (2021) 118(2) e2009539118　doi:10.1073/pnas.2009539118
收稿 2020-05-13　编辑 Alejandro Sánchez Alvarado　批准 2020-12-07　发表 2020-12-29

摘要

在斑马鱼尾鳍上「挖个洞」，再生只会从前切缘（ACE）单向长到后切缘（PCE）——因为后切缘的钙调神经磷酸酶（calcineurin）活性偏高，芽基根本建不起来。用 FK506 一把按住这个酶，后切缘立刻长出芽基、开始再生；反过来，把这个酶人为激活（cav3 突变体），连原本能再生的前切缘也停摆了。也就是说，calcineurin 就是鳍再生「往哪个方向长」的那枚分子开关。

核心要点

1. 作者设计了「鳍挖洞（fin excavation）」手术——在近远端轴上特定位置去掉两段骨鳍条、挖出一个腔洞，从而在同一片鳍上同时造出「前切缘」与「后切缘」。结果：只有 ACE → PCE 方向再生，PCE 侧完全不生（Type I 11/11、Type II 11/12），且每天把 ACE 的再生组织清掉也救不回 PCE。臀鳍、背鳍同样如此。

2. 该极性与神经、血流、免疫均无关：同一骨鳍条两洞之间保留了鳍条与神经，PCE 依旧不生；血流对极性影响很小；雷帕霉素（同样结合 FKBP 的免疫抑制剂）不能诱导 PCE 再生——说明 FK506 靠的是 calcineurin 这个特异性靶点，不是免疫抑制。

3. PCE 不生的原因：芽基（blastema）没建起来。2 dpa 时 PCE 中芽基标志基因 and1/2、raldh2、msxb、runx2b、lef1 全部不表达，组织学只见瘢痕无芽基结构，H3P 增殖细胞显著少于 ACE；qRT-PCR 显示除 cyp26a1 外，再生相关基因表达全面偏低——PCE 缺少「促再生转录程序」。

4. RNA-Seq 锁定线索：fkbp7/9/10b/14 在 PCE 表达低于 ACE——正是 FK506 的「把手」。FK506（3 μM）处理后 PCE 出现芽基、新生骨母细胞与再生；同源物 FK520 效果相同。另一 calcineurin 抑制剂环孢菌素 A（CsA）同样有效。

5. 关键因果：ppp3ca（calcineurin 催化亚基）在 PCE 表达更高，酶活性也更高（2 dpa 差异最大）。遗传学双向验证：lof 长鳍突变体（内源活性低）→ PCE 自发再生；cav3^cq105 突变体（支架蛋白 caveolin-3 减少 → 酶超活化）→ 连ACE 再生都被抑制，但 FK506 能救援。

6. 反向排除：视黄酸（RA / 阿达帕烯 / 13-cis-RA）、Fgf、Wnt、Notch 全部不能诱导 PCE 再生。即 calcineurin 并非通过经典的 RA 或 Fgf/Wnt/Notch 通路起效，而是通过自身特异性靶点控制芽基极性。

一、引言：鳍能不能「往回长」？

再生在动物界广泛存在，但程度因物种而异。扁形动物（涡虫）能在前端伤口再生出头、后端伤口再生出尾——组织身份由 Wnt/β-catenin 信号在前后轴上决定，这一特性被称为「再生极性」。虽然涡虫、水螅能再生整个身体，脊椎动物的再生能力有限，但鱼类与两栖类却能完全再生缺失的肢体。脊椎动物肢体的发育本就主要沿「近端 → 远端」方向进行，因此方向性（极性）在脊椎动物肢体中早有定论。

问题在于：脊椎动物附肢的再生芽基一向只向远端生长，但它能不能反过来向近端生长？此前无人回答。斑马鱼终生保有再生整个鳍的能力，而鳍是包含神经、血管、皮肤、间充质与骨框架的高度有序结构——正因结构如此复杂，它是否也有隐藏的极性，是检验这个问题最理想的模型。此外，斑马鱼自身研究基础扎实：fgf20 及其受体已确立，Lef1、Hs70l 等转录因子也已有数据。

既往研究已表明，斑马鱼鳍的再生依赖局部组织间相互作用与多种信号（如 FGF），且受成体干细胞驱动。作者所在实验室此前工作揭示：视黄酸（RA）与 calcineurin 通路共同划分并维持鳍中关节细胞与骨母细胞的命运，提示 calcineurin 可能在再生中承担更上游的「位置-命运」决策职责。

据此，本研究提出核心问题：鳍再生芽基是否具有近远端（P–D）极性？如果有，是什么决定了这种极性？

二、结果

1. 斑马鱼鳍的再生确实存在近远端极性：只从 ACE 长向 PCE

作者先建立了一种新型损伤模型——鳍挖洞（fin excavation）：用手术刀在斑马鱼尾鳍的近远端轴上，于两根骨鳍条的特定位置去掉 2–3 个骨节、挖出约 0.6 × 0.6 mm 的洞（最大可做到 2.2 × 2 mm），使这个洞同时具备「前切缘（ACE）」与「后切缘（PCE）」。若鳍再生具有 P–D 极性，则 ACE 侧与 PCE 侧的表现应当截然不同。

结果非常明确：再生只从 ACE 侧发生，向 PCE 方向长入腔内；PCE 侧始终不再生。而且即使每天把 ACE 长出来的再生组织清空、以防它把洞填满，PCE 仍然毫无反应——这排除了「空间拥挤竞争」的解释，证明 PCE 是主动失能而非被动受限（Type I：11/11；Type II：11/12）。臀鳍与背鳍重复同样结果，说明该极性是鳍的普遍属性。

图 1　近远端再生极性存在于斑马鱼鳍中。A 两种鳍挖洞方式的设计示意图。B, C Type I（n = 11/11）与 Type II（n = 11/12）两种方案下，斑马鱼鳍均只从 ACE 向 PCE 单向再生（1、3、5 dpa）。黑色虚线标示初始切缘位置。D ACE 与 PCE 再生组织长度（μm）定量（n = 5）——ACE 持续增长，PCE 始终为零。E 同一两根骨鳍条上打「双洞」的示意图，中间保留完整鳍条结构。F, G 双洞术后 1、2、3 dpa 的明场与血管（Tg(fli1:GFP)，绿色）成像。H 双洞术后的再生组织长度定量（n = 5）。P，近端；D，远端。比例尺，500 μm。

为排除「鳍条本身被切断导致差异」这一可能，作者又在同一两根骨鳍条上打两个洞、保留中间的鳍条（lepidotrichia）。此时左侧鳍条只能由右向左（PCE → ACE 方向）生长——结果显示，左鳍条仍然是「从右洞的 ACE 长向左洞的 PCE」，即真正的解剖学极性（ACE → PCE）。同时，血管芽生也表现出同样的定向性。结论：斑马鱼鳍在整条近远端轴上具备单向再生极性，且与位置信息无关。

2. PCE 不再生的直接原因：芽基建不起来

芽基（blastema）是再生起始阶段形成的组织结构，对鳍再生不可或缺。既然 PCE 完全不生，作者的第一个问题是：是不是因为 PCE 压根没建芽基？原位杂交给出了肯定答案——在芽基已经形成的 2 dpa，and1、and2、raldh2、msxb、runx2b、lef1 这 6 个芽基标志基因在 PCE 全部不表达，而 ACE 侧正常表达；双洞实验中 PCE 侧同样阴性。组织学进一步显示，PCE 侧芽基结构缺失，取而代之的是瘢痕组织；H3P（p-H3）染色显示PCE 的增殖细胞数显著少于 ACE。

图 2　PCE 侧无法形成芽基。A 2 dpa 再生鳍中 and1/2、raldh2、msxb、runx2b、lef1 的原位杂交——PCE 未建芽基。B 双洞实验中 PCE 侧 and1 与 lef1 亦不表达（箭头）。C ACE（n = 6/8）与 PCE（n = 5/6）的组织学分析。D H3P 抗体染色（红）检测细胞增殖，DAPI 复染（蓝）；ACE（n = 7/10）与 PCE（n = 7/9）。E qRT-PCR 比较 PCE 相对于 ACE 的再生相关基因相对表达差异（Student t 检验，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）。数据为均值 ± 标准差。比例尺：A、B 为 200 μm；C、D 为 100 μm。

qRT-PCR 进一步证实：除 RA 拮抗基因 cyp26a1 外，PCE 中被检测的所有「再生活跃基因」转录水平均显著低于 ACE。也就是说，PCE 不生并非缺少某个单一因子，而是整体缺失了促再生转录程序。至此因果链指向明确：是什么阻止了 PCE 启动这套程序？

3. FK506 诱导 PCE 建芽基并再生

作者对 ACE 与 PCE 组织做了转录组测序，选取0、24、48、72 hpa 四个关键再生阶段（分别对应间充质解聚、芽基形成、再生外扩）。差异分析中，一个信号跳了出来：FK506 结合蛋白基因 fkbp7、fkbp9、fkbp10b、fkbp14 在 PCE 中的表达低于 ACE。而 FK506 的作用机制正是：FK506 先与 FKBP 结合形成复合物，该复合物再结合 calcineurin 并抑制其活性。

图 3　抑制钙调神经磷酸酶可诱导 PCE 芽基。A ACE 与 PCE 的 RNA-Seq 时序分析及所示基因 FPKM 值的热图。B DMSO（n = 7/8）或 FK506（n = 5/10）处理后 1、3、5 dpa 的再生鳍。C FK506 处理后 PCE 再生组织长度（μm）定量（n = 5）。D 2 dpa 时 FK506 处理组出现再生芽基（箭头，n = 5/12），而 DMSO 组为 9/10 无芽基。E–G FK506 处理后 2 dpa，and1、and2、runx2b 在 PCE 中开始表达。H DMSO（7/8）或 FK506（5/8）处理后 PCE 的组织学分析。I qRT-PCR 比较 FK506 与 DMSO 处理 PCE 的再生相关基因表达（**P < 0.01，***P < 0.001）。比例尺：B–G 为 500 μm；H 为 100 μm。

假设有了，直接验证：对挖洞后的鳍用 3 μM FK506 处理，PCE 侧真的开始再生，并产生新的骨母细胞——解剖学上原本沉默的一侧被「唤醒」了。臀鳍、背鳍的 PCE 同样被诱导再生。原位杂交与组织学显示，2 dpa 时 PCE 已形成完整芽基；qRT-PCR 显示促再生程序基因被上调。为排除「FK506 分子本身的特异性」，作者又用其同源衍生物 FK520（2 μM）处理，得到相同结果。

4. FK506 诱导的芽基是 PCE 持续再生的关键

一个自然的问题是：FK506 究竟在什么时间窗口起关键作用？作者做了一个漂亮的「给药时长」实验，分两组：

· 短处理（0 → 1 dpa）：此时 PCE 芽基尚未形成。结果 2 dpa 时芽基未建立，5 dpa 时 PCE 也未再生。

· 持续处理（0 → 2 dpa）：覆盖了芽基形成窗口。结果 2 dpa 时 PCE 形成芽基，5 dpa 时再生持续进行。

图 4　FK506 诱导形成的芽基是PCE 持续再生的必要条件。A 实验设计：FK506 于 0 至 1 dpa 处理，5 dpa 分析（B, C）。该处理未能诱导芽基形成与 PCE 再生（n = 6/7）。D 实验设计：FK506 于 0 至 2 dpa 处理，5 dpa 分析（E, F）。持续处理至 2 dpa（此时 PCE 已形成芽基，箭头）后，5 dpa 时 PCE 实现持续再生（n = 5/9）。P，近端；D，远端。比例尺，500 μm。

结论：决定 PCE 能否持续再生的，是「有没有把芽基建出来」这一步，而不是药物持续多久。芽基一旦建成，后续再生就能自主推进。

关键排除——不是免疫抑制的作用。FK506 本身是免疫抑制剂，而此前有报道称免疫抑制能促进蝌蚪再生。作者因此测试了同样结合 FKBP、同样作为免疫抑制剂起效的雷帕霉素（1 μM）：雷帕霉素并不能诱导 PCE 再生。因此 FK506 的效应来自 calcineurin 特异性靶点，而非免疫抑制——这一点很关键，否则整个结论都会被推向炎症免疫方向。

5. PCE 的 calcineurin 活性高于 ACE

既然 FK506 经 calcineurin 起效，那么是谁让 PCE「不敢」建芽基？作者回头查 calcineurin 相关基因的表达：qRT-PCR 显示，calcineurin 的主要催化亚基基因 ppp3ca 在 PCE 的表达高于 ACE，且这一差异在 1、2、3 dpa 三个时间点都成立。酶活性测定进一步证实：PCE 的 calcineurin 活性高于 ACE，在芽基形成期（2 dpa）差异尤为显著。

图 5　PCE 与 ACE 之间存在明显的钙调神经磷酸酶活性差异。A qRT-PCR 分析显示 PCE 的 ppp3ca 表达高于 ACE（*P < 0.05，***P < 0.001）。B 0、1、2、3 dpa 时 PCE 与 ACE 之间 calcineurin 活性的差异（*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）。数据为均值 ± 标准差。C CsA 处理诱导 PCE 再生（n = 5/10），对照 DMSO（n = 7/10）。D FK506 或 CsA 处理后 PCE 再生组织长度（μm）定量（n = 5）。E FK506 或 CsA 处理后 PCE 的 calcineurin 活性（n = 7，***P < 0.001）。比例尺，500 μm。

双向药理学验证随即展开：环孢菌素 A（CsA，4 μM）——calcineurin 的另一类抑制剂——同样诱导了 PCE 再生，且 FK506 与 CsA 处理后 PCE 的 calcineurin 活性均被压低。至此，「PCE 不建芽基」的原因被锁定为：PCE 的 calcineurin 活性偏高，把促再生程序压住了。

6. 遗传学证据：内源 calcineurin 活性决定 PCE 芽基命运

作者随后用两个遗传模型从两端夹逼这一结论。

① 长鳍突变体（lof）——内源活性「偏低」的一侧。lof 突变体保留了鳍的异速生长（allometric growth），其表型与 FK506 处理诱导的鱼相似。作者将其鳍挖洞后，观察到 PCE 侧自发再生；酶活测定与 qRT-PCR 证实，lof 突变体 PCE 中 calcineurin 活性与 ppp3ca 表达均低于对照。这说明低内源 calcineurin 活性是诱导 PCE 芽基的充分条件。

② 洞蛋白-3 突变体（cav3^cq105）——内源活性「偏高」的一侧。已知支架蛋白 caveolin-3（cav3）的减少会导致 calcineurin 超活化。作者检测发现，cav3 突变确实上调了 calcineurin 活性，并强烈抑制了鳍再生（正常情况下 calcineurin 活性升高对再生是有利的，此处方向相反——因为 PCE 本就被压得低，PCE 侧的进一步升高便拖累了整片鳍）。更关键的是：FK506 处理能救援 cav3 突变体的鳍再生，并让其 PCE 也恢复再生能力。药理学与遗传学的结论相互印证，构成完整闭环。

图 6　内源钙调神经磷酸酶活性控制斑马鱼鳍的近远端再生。A lof 长鳍突变体的 PCE 发生再生（n = 5/6）。B 2 dpa 时 lof 突变体 PCE 或 ACE 的 calcineurin 活性相对对照鳍的倍数变化（*P < 0.05，***P < 0.001）。C 2 dpa 时 lof 突变体中 ppp3ca 表达低于对照（***P < 0.001）。D 3 dpa 时 cav3 突变体再生鳍中 calcineurin 活性相对对照的倍数变化（n = 7，***P < 0.001）。E cav3cq105 突变体中 ACE 的再生被抑制（n = 8/8），而 FK506 能在 7 dpa 救援 ACE 再生（n = 6/8），对照 WT 为 n = 7/8。白线标示截断面，红线示再生外扩范围，黑线示完整尾鳍长度。F 鳍再生组织面积（mm²）定量（n = 5）。G cav3cq105 突变体的 PCE 再生可被 FK506 救援（n = 5/12），对照为 n = 7/8。比例尺：A、G 为 500 μm；E 为 2 mm。

7. 视黄酸、Fgf、Wnt、Notch 均不能诱导 PCE 芽基

既然 calcineurin 已知可促进视黄酸（RA）信号，而 RA 又能调控附肢发育与再生，作者必须先排除这条路径。结果显示：虽然 cyp26a1（RA 拮抗基因）在 PCE 表达偏高，但RA、adapalene（RA 信号促进剂）以及 RA 抑制剂 13-cis-RA，均不能诱导 PCE 再生。进一步地，已有报道参与鳍再生的经典信号——Fgf、Wnt、Notch——也全部失败。

结论：calcineurin 控制 P–D 轴芽基极性，依靠的是它自身的特异性靶点，而非经典的 RA / Fgf / Wnt / Notch 通路。至于这个「特异性靶点」究竟是什么，论文明确指出仍有待阐明——这既是这篇文章留下的最大悬念，也是后续研究最直接的切入口。

三、机制模型

综上，calcineurin 活性水平是斑马鱼鳍近远端再生极性的核心开关，机制可概括为五个环节：

1. 手术造出双向切缘：鳍挖洞在同一片鳍上同时产生前切缘（ACE）与后切缘（PCE）；

2. 天然活性梯度：PCE 的 calcineurin 活性（及其催化亚基 ppp3ca 表达）天然高于 ACE，差异在2 dpa 芽基形成期达到最大；

3. 高活性压死芽基：活性过高的 PCE 无法启动促再生转录程序（and1/2、raldh2、msxb、runx2b、lef1 全阴性），增殖细胞少、只形成瘢痕，故只从 ACE 单向生长；

4. 抑制即可解锁：FK506 / FK520 / CsA 降低活性，PCE 芽基建成；只要芽基建成（给药覆盖至 2 dpa），再生即可持续；lof 突变体因内源活性本就偏低而自发出现 PCE 再生；

5. 过度活化反向抑制：cav3^cq105 使活性超载，连 ACE 再生一并受抑，FK506 可救援——说明该酶存在「最适窗口」，过高过低都不行。

图 7　calcineurin 活性在斑马鱼鳍近远端轴再生中的功能模型。

鳍挖洞后，PCE 的 calcineurin 活性高于 ACE；当 calcineurin 被抑制（FK506 处理或 lof 突变）时，PCE 侧芽基形成与再生随之被诱导（Increase blastema / Regeneration）。反之，活性的过度升高（如 cav3 突变）则抑制再生。

延伸理解：为什么这条发现值得兴奋？

经典的「再生极性」范式几乎都是形态发生轴向的——涡虫的前后轴决定头尾身份。而本文揭示的是一种独立的、发生在再生过程内部的方向性：同一片组织、同一时间点、同一套细胞，因所处位置略有不同（前后两个切缘仅隔 2 mm）就走上完全不同的命运。更值得注意的是，这个「位置」并非来自位置信息或神经支配，而是来自一个可被药物双向调节的胞内酶活性水平——这让「极性」第一次变成了一个可操作的工程参数。

四、讨论：这项研究告诉了我们什么？

本研究证明斑马鱼鳍沿近远端轴存在芽基再生极性，并确立了 calcineurin 活性在调控该极性上的根本作用。这一单向再生极性模型在其他器官的再生过程中极少被观察到——因为大多数器官（肝、胰、肌肉）的再生并不表现出方向偏好。作者由此提出：「位置信息」本身可能就参与了再生极性的建立，例如鳍条本身也可能起到位置存储器的作用。

与既往结论的差异：作者与既往工作做了对照。此前有报道指出，鳍再生需要神经支配。但本研究中，双洞之间保留了完整的鳍条（含神经），PCE 依然不生——说明在本模型中神经并非极性的依赖项。这一差异很可能源于手术类型的差异：既往报道多基于鳍的整体截断，而本研究的挖洞模型在保留鳍条的同时破坏了神经-组织的对应关系。此外，免疫细胞（巨噬细胞、中性粒细胞）虽已知参与肢体再生调控，但本研究中免疫抑制无法诱导 PCE 再生，提示斑马鱼鳍的再生极性不依赖免疫调节。

与既往研究的异同：在以往斑马鱼鳍模型中，calcineurin 抑制剂提高 fkbp 表达、降低 fgf20a，最终促进鳍的远端生长；而本文聚焦「是否近端再生」这一未有人回答的问题，发现 calcineurin 抑制可将鳍再生从远端生长程序切换到近端程序。作者认为，calcineurin 对鳍再生的调控可能贯穿始终且高度动态——在早期再生中其高表达是必需的，而在后续阶段抑制它才能维持比例性生长，这提示钙调神经磷酸酶系统可能为再生提供一个「时间-剂量」窗口。此外，本文的模型在「激活 calcineurin 反而抑制再生」这一点上与既往结论表面相反，实则一致：在 PCE 本就低活性的背景下，再升高必然损伤；这恰从反面印证了该酶对再生的双向调控作用。

局限与展望：作者坦陈本研究仍有三处空白。其一，斑马鱼体型限制——成年斑马鱼尾鳍最大只能挖到 2.2 × 2 mm，而 Nabrit 在金鱼与 Fundulus 鳍中报道「小伤口（2×2 mm）单向再生、大伤口（4×4 mm）双向再生」。本文虽未能做出 4×4 mm 的伤口以检验尺寸依赖性，但发现即使最大尺寸的伤口仍表现为 ACE → PCE 单向再生，说明斑马鱼鳍的调控特性与金鱼、killifish 存在差异。其二，「位置」如何被 calcineurin 读取仍不清楚——是何种上游信号使 PCE 维持了更高的 calcineurin 活性？其三，calcineurin 的特异性下游靶点未被鉴定（已排除 RA、Fgf、Wnt、Notch）。此外，lof 很可能作用于 calcineurin 上游以抑制其活性，但这一推测尚需实验证实；作者也建议在alf、rap 等其他长鳍突变体中检验 PCE 再生是否同样存在，以巩固结论。

本文核心信息

1. 斑马鱼鳍的再生不是「无方向」的：鳍挖洞模型显示再生只从前切缘向后切缘单向进行，且这一极性在整条近远端轴上普遍存在、与位置信息无关。

2. 极性的分子开关是 calcineurin 活性：PCE 天然高活性 → 不建芽基 → 不再生；抑制（FK506/FK520/CsA）→ 芽基建成 → 再生；超活化（cav3 突变）→ 连 ACE 再生都被抑制。存在最适活性窗口。

3. 芽基建成是分水岭：给药只需覆盖到芽基形成窗口（2 dpa），芽基一旦建立，后续再生即可自主持续——说明极性决定的是「能否起步」，而非「能长多快」。

4. 作用机制不走经典通路：免疫抑制、视黄酸、Fgf、Wnt、Notch 全部被排除，calcineurin 依靠自身特异性靶点重建 PCE 的促再生转录程序——这是后续研究最直接的切入口。

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