Jie Liu、Mingming Zhang、Haojian Dong、Jingwen Liu、Aihua Mao、Guozhu Ning、Yu Cao、Yiyue Zhang、Qiang Wang

中国科学院动物研究所膜生物学国家重点实验室 · 华南理工大学医学院 · 广东省人民医院广东省心血管研究所

Development (2022) 149, dev200754　doi:10.1242/dev.200754
收稿 2022-03-16接收 2022-11-14　（Handling Editor: Steve Wilson）

摘要

咽弓囊内皮细胞分泌的 Cxcl12b 叫醒了正在发育的主动脉弓内皮细胞上的 Cxcr4a，后者点亮PI3K/AKT 信号——AKT 一边把细胞推进细胞周期让它「多分裂」，一边直接给 Etv2 和 Scl 两个转录因子上的丝氨酸「盖戳」（磷酸化），从而阻止它们被泛素-蛋白酶体降解。结果是：细胞数量够多、身份又够明确，血管母细胞才能同步完成增殖与分化，咽弓动脉这才造得出管腔、连得上血流。增殖与分化这两件事，原来是被同一个分子开关「同步」的。

核心要点

1. cxcr4a 在咽弓前体中表达，敲除cxcr4a或配体基因 cxcl12b 均导致咽弓动脉（PAA）5、6 狭窄、血流中断；表型高度集中在后部 PAA。

2. 排除法：cxcr4a 缺失不影响 PAA 细胞的背向迁移（Kaede 示踪）、不影响存活（TUNEL）、也不影响前体→血管母细胞的命运转换（nkx2.5 / scl / etv2 正常），但 BrdU 掺入率显著下降——cxcr4a 管的是「增殖」和「分化」，不管迁移和存活。

3. 下游通路锁定 PI3K/AKT：p-ERK1/2 无变化，p-AKT 在突变体后部 PAA 中被显著抑制；抑制剂（LY294002、MK-2206）表型模拟突变体，激动剂（740Y-P、SC79）可救援。

4. etv2 / scl 的 mRNA 不变、蛋白下降 → 调控发生在翻译后层面。AKT1 及其激酶活性通过 CHX 降解动力学实验被证明能稳定 zEtv2 与 zScl；MG132 能救回，说明走蛋白酶体降解途径。

5. 位点逐一锁定：zEtv2 的 S296、zScl 的 S222——点突变为丙氨酸后 AKT 不再能稳定它们，模拟磷酸化的D 突变体则自身更稳定；体外激酶实验直接证明 AKT1 磷酸化这两个位点。

6. 机制闭环：AKT 在 S296/S222 上的磷酸化抑制 Etv2/Scl 的多聚泛素化；在胚胎中注射抗磷酸化突变体（S296A / S222A）无法救援 cxcr4a−/− 的 tie1 丢失表型，而 WT 或模拟型能部分救援。

一、引言：增殖与分化，为什么必须「同步」？

心脏的大血管在胚胎发育中源自咽弓动脉（pharyngeal arch arteries, PAAs）。当内皮细胞迁移并伸入咽弓，把心脏与背侧主动脉连接起来时，PAAs 便形成了。这些成对的、双侧的动脉由血管发生（vasculogenesis）方式产生，起源于前外侧板中胚层（ALPM）第二心域的 nkx2.5⁺ 前体细胞。在哺乳动物中，PAAs 随后要么退化，要么经历剧烈重塑，成为颈动脉以及心脏大血管（含主动脉与肺动脉）的一部分。PAAs 形成或重塑的缺陷，最终会导致毁灭性的先天性心血管畸形，或眩晕、耳鸣等非致死性疾病——但其病因 largely 未知。

哺乳动物中那套复杂的重塑过程在斑马鱼 PAA 发育中并不发生，但这些动脉的初始形成与图式 patterning 在各脊椎动物类群间高度保守。加之斑马鱼胚胎透明，可以直接观测 PAA 形态发生中的动态细胞行为：中期体节发生时，ALPM 中先被指定出 nkx2.5⁺ 前体细胞，其中一部分迁移到中间成为心室前体，另一部分则留在外侧，按头尾序凝聚成若干咽弓细胞簇。第 2 咽弓的 nkx2.5⁺ 前体簇产生头部肌肉与心室流出道，而第 3–6 咽弓中的则被指定为 PAA 前体，启动 npas4l 表达。随后它们经历血管母细胞转换（etv2、scl 出现，nkx2.5 下降），再分化出表达 tie1 的主动脉弓血管母细胞，最终成熟为建立有序血管结构的内皮细胞。

要获得正常的器官大小、形态与功能，胚胎发育中的细胞增殖与分化必须被协调调控。PAA 细胞增殖伴随其系列命运决定同步进行；增殖受损会导致血管狭窄，而前体或血管母细胞分化异常则导致血管功能异常。然而，究竟是什么分子线索在「同步」支配这两件事，迄今仍不清楚。本研究给出答案：趋化因子信号。

二、结果

1. 敲除 cxcr4a 导致咽弓动脉狭窄

为探究 cxcr4a 在 PAA 发育中的功能，作者首先观察了它在咽弓区域的动态表达。受精后 24 h（24 hpf）即在咽弓细胞簇中检测到高水平的 cxcr4a 转录本；发育后期则在正在形成的 PAAs 位置呈现细线状表达。进一步在 Tg(nkx2.5:ZsYellow) 胚胎中用荧光原位杂交做精细分析——该品系的发育中主动脉弓带荧光标记。结果显示 cxcr4a 转录本在 36–48 hpf 高度局限于 PAA 芽体（sprout），这一时间窗恰好与 PAA 血管母细胞的增殖、分化和背向迁移重叠。

随后分析功能丧失的后果。令人意外的是，多数 cxcr4a 突变胚胎（5/7）在 60 hpf 时 PAA 形态明显变细，伴随 PAA 5、6 血流阻断；少数（1/7）出现更严重的前后 PAA 双重狭窄。关键是，72 hpf 时突变体 PAA 5–6 的血流仍显著少于对照，排除了「发育延迟」这一解释。吗啡啉反义寡核苷酸（MO）敲低同样再现后部 PAA 血管狭窄。原位杂交显示，约 80% 的 cxcr4a−/− 胚胎在 60 hpf 时 PAA 5、6 的两个内皮标志物——tie1 与 flk（kdrl）——表达几乎消失；另有约 10% 的突变体表现为所有 PAA 的广泛下降。

图 1　cxcr4a 的遗传学耗竭诱导 PAA 畸形。A cxcr4a 在 24 hpf（背视图，前端朝上）、36 hpf 与 48 hpf（侧视图，前端朝左）的表达。黑色箭头标示咽弓中的表达。B, C cxcr4a 转录本与 ZsYellow⁺ PAA 血管母细胞的共定位。Tg(nkx2.5:ZsYellow) 胚胎经抗 ZsYellow 抗体（红色）染色，并与 cxcr4a 探针（绿色）进行荧光原位杂交。D, E 野生型（WT）与 cxcr4a 缺陷胚胎中血流的共聚焦图像。PAA 3–6 以相应数字标出，受影响胚胎的比例标注于右下角（D 为 4/4、5/7；E 为 6/6、6/6）。F 野生型与 cxcr4a−/− 突变体中 tie1 与 flk 的表达（60 hpf），比例分数为出现该表型的个体数。比例尺，50 μm。

作为对照，作者此前发现内胚层咽弓囊对邻近咽弓组织（如鳃弓软骨与 PAA）的发育至关重要。但 cxcr4a−/− 突变胚胎的咽弓囊与颅面软骨发育正常，说明 PAA 畸形并非继发于咽弓囊与头骨架发育受损。有文献报道 cxcr4a 也在颅神经嵴细胞（CNCC）中表达、其敲低会致 CNCC 迁移与颅面发育异常——本研究与之的差异，可能源于突变体中的遗传补偿（genetic compensation）。

2. Cxcr4a 同时控制血管母细胞的增殖与分化

为解析细胞层面机制，作者在 Tg(nkx2.5:ZsYellow) 中做延时成像。对照中，PAA 前体在 36 hpf 凝聚成第 5 细胞簇，48 hpf 背向萌发，60 hpf 最终组织成血管管腔；而在 cxcr4a−/− 突变体中，第 5 簇在 36 hpf 正常形成，但对应萌发显著变细，无法形成血管管腔。

已有研究指出 cxcr4a 参与引导侧背主动脉（LDA）形成过程中的内皮迁移，而 LDA 携带的血流对 PAA 发育至关重要。作者确实在 24 hpf 观察到突变体 LDA 形成不完全，但该缺陷在 48 hpf 前或当时已逐渐恢复，且 LDA 内血流看起来正常——因此 48 与 60 hpf 的 PAA 异常不能归因于更早的 LDA 缺陷。

这些结果提示血管狭窄可能与 PAA 细胞数量减少有关。在表达内皮核标记 EGFP 的胚胎中计数证实：前部两个 PAA 轻微下降，后部两个 PAA 显著下降；相应地 cxcr4a 缺失明显缩小了 PAA 5、6 的直径。细胞数减少的可能原因包括背向迁移延迟、凋亡增加和/或增殖率下降。逐一排查的结果非常干净：

迁移无碍——在 Tg(nkx2.5:Kaede) 中于 36 hpf 光转换 PAA 第 5 簇，60 hpf 时红色衍生细胞在野生型与突变体中均遍布 PAA 5 并萌发到相似的背侧位置；72 hpf 时突变体的 PAA 5 与 6 融合并最终连接至 LDA。存活无碍——TUNEL 检测显示 cxcr4a 缺失不影响血管母细胞存活。但增殖受损——BrdU 掺入实验显示 cxcr4a 缺失的 PAA 5、6 细胞增殖能力显著下降。结论：cxcr4a 是血管母细胞增殖所必需，但对迁移与存活并非必需。

管腔形成失败还提示 cxcr4a 可能对细胞命运承诺也至关重要。原位杂交显示 38 hpf 时前体标志基因 nkx2.5 表达无变化；标志 PAA 血管母细胞谱系早期指定的 scl 与 etv2 mRNA 水平也未受影响——前体→血管母细胞的转换正常。但在后部两个芽体中，血管母细胞标志基因 tie1 表达剧烈下降；这些分化不良的细胞也无法成熟为功能内皮细胞，因为极性与管腔形成所必需的细胞黏附分子 Cdh5/VE-cadherin 蛋白缺失。因此 cxcr4a 在促进血管母细胞增殖与分化两方面都起关键作用。

图 2　cxcr4a 缺失同时抑制 PAA 血管母细胞的增殖与分化。A Tg(nkx2.5:ZsYellow) 背景下野生型与 cxcr4a−/− 胚胎咽弓区域 ZsYellow 荧光的延时记录。B–D cxcr4a−/− 突变体后部 PAA 细胞数显著减少。B 为代表性共聚焦切片，C、D 为 PAA 3–6 细胞数定量。误差棒为三个生物学重复的标准差。E, F 增殖性 PAA 血管母细胞的检测。抗 ZsYellow（绿）与抗 BrdU（红）双免疫染色，DAPI 染核（蓝）；F 为各组 PAA 5、6 中 BrdU⁺ 细胞百分比。G, H 48 hpf 野生型与 cxcr4a−/− 胚胎中 tie1 的原位杂交（G）与荧光原位杂交联合免疫染色（H）。I cxcr4a−/− 突变体后部 PAA 中 Cdh5 水平大幅下降（Cdh5 绿、ZsYellow 红）。比例尺，50 μm。

3. Cxcr4a 激活下游 PI3K/AKT 通路

CXCR4 通过激活下游 IP3/钙、PI3K/AKT 与 ERK1/2 信号通路发挥生物学效应；其中 IP3/钙通路主要管存活，而 PI3K/AKT 与 ERK1/2 均参与增殖与命运决定。48 hpf 免疫染色显示：野生型与突变体之间 p-ERK1/2 表达无明显差异；而 p-AKT 在突变体后部 PAA 中被深度抑制，在野生型胚胎经变构 AKT 抑制剂 MK-2206 处理后同样被深度抑制。cxcr4a 吗啡啉胚胎也表现相同变化。

图 3　Cxcr4a 通过 PI3K/AKT 级联调控 PAA 发育。A cxcr4a−/− 突变体 PAA 5、6 中 AKT 磷酸化水平下降（抗 p-AKT绿、抗 ZsYellow 红）。B, C 野生型胚胎自 18 hpf 起分别接受 PI3K 抑制剂 LY294002（B）或 AKT 抑制剂 MK-2206（C）处理，随后做原位杂交。D Tg(nkx2.5:ZsYellow) 胚胎自 18 至 60 hpf 接受 25 μM LY294002 或 10 μM MK-2206 处理的活体共聚焦图。E 同上处理的胚胎做原位杂交。F, G DMSO 或 10 μM MK-2206 处理胚胎的 PAA 细胞数定量。H, I 18–48 hpf 处理胚胎的共聚焦图（ZsYellow 绿、BrdU 红、DAPI 蓝）及 BrdU⁺ 比例定量。J–N cxcr4a−/− 突变体自 18 至 48 hpf 接受 PI3K 激动剂 740 Y-P（1 μM）或 AKT 激动剂 SC79（0.5 μM）处理，细胞数减少可被部分救援（J、K）；18–60 hpf 处理后用 tie1 表达可视化不同 PAA 表型（L），受影响胚胎百分比见 M、N。非配对 Student t 检验；ns，无显著差异。比例尺，50 μm。

PI3K/AKT 位于包括 Vegfα 在内的多种信号下游，而 Vegfα 信号正是引导 PAA 血管生成的（Nicoli et al., 2010）。然而野生型与 cxcr4a−/− 之间 vegfa 表达无显著差异，排除了这一可能。药理学实验随后形成闭环：

· 抑制模拟突变体：野生型胚胎自 18 hpf 起接受 25 μM LY294002 或 10 μM MK-2206，60 hpf 时 PAA 5、6 的 tie1 表达丧失，与 cxcr4a−/− 相仿；且呈剂量依赖——高浓度使所有 PAA 的 tie1 几乎完全消失，说明前后 PAA 对 PI3K/AKT 信号的需求量不同。抑制剂处理胚胎同样出现血管狭窄。

· 时相验证：改自 36 hpf 处理（此时 PAA 3、4 簇前体已分化为血管母细胞），PAA 5、6 的 tie1 仍几乎消失，细胞数与增殖活性下降——说明作用直接发生于后部 PAA。

· 激动剂救援：用 PI3K 激动剂 740Y-P 或 AKT 激动剂 SC79 处理 cxcr4a−/− 突变体，AKT 磷酸化水平、PAA 细胞数与 PAA 形成均被明显恢复。

此外，抑制剂处理并未破坏 PAA 前体向血管母细胞的转换，只造成 5、6 簇的分化不完全。结论：Cxcr4a 通过其下游 PI3K/AKT 信号级联促进 PAA 发育。

4. AKT1 及其激酶活性对稳定 Etv2 与 Scl 至关重要

Etv2 与 Scl 是演化上保守的转录因子，在血管母细胞命运承诺中起关键作用。由于突变胚胎中 etv2 与 scl 的 mRNA 水平未变，作者推测其活性可能在翻译后水平受调控。免疫荧光证实：cxcr4a−/− 突变体中 zEtv2 与 zScl 蛋白水平在全部或后部 PAA 中显著下降；野生型胚胎用 MK-2206 处理后二者表达显著减少；而在 cxcr4a−/− 中用 SC79 重新激活 AKT 可恢复其表达。亚细胞分布不受 SC79 影响。

图 4　AKT 对 zEtv2 与 zScl 的稳定性是必需的。A, B cxcr4a−/− 突变体 PAA 簇中 zEtv2 与 zScl 蛋白水平下降。C, D Tg(nkx2.5:ZsYellow) 背景下，野生型与 cxcr4a−/− 胚胎自 18 至 38 hpf 接受 10 μM MK-2206 或 0.5 μM SC79 处理后 zEtv2 与 zScl 的表达分析。E–H HEK293T 细胞转染相应质粒，24 h 后加入 CHX（20 μg/ml）处理相应时间并免疫印迹（F、H 为以 tubulin 归一化后的定量，均值 ± 标准差，三个独立生物学重复）。比例尺，50 μm。

在 HEK293T 细胞中，AKT1 共表达显著压低 zEtv2 与 zScl 的降解速率；用 SC79 激活 HeLa 与 HEK293T 内源性 AKT 也显著提高二者表达水平。那么 AKT 的激酶活性是否必需？实验给出肯定答案：

· Flag-AKT1 与 Myc-zEtv2/zScl 共表达的 HEK293T 经 MK-2206 处理后，AKT1 带来的蛋白升高被废除。

· 激酶缺陷型 AKT1-T308A/S473A 丧失了增强 zEtv2 与 zScl 表达的能力。

· 野生型 AKT1（而非其激酶缺陷突变体）同样能促进小鼠 Etv2 与 Scl 的表达——说明该机制跨物种保守。

· 降解途径：MG132（蛋白酶体抑制剂）使 zEtv2 与 zScl 剧烈稳定，而 NH₄Cl（溶酶体抑制剂）无效——二者经蛋白酶体途径降解。

图 5　AKT 通过其激酶活性稳定 zEtv2 与 zScl。A, B HEK293T 共转 Flag-AKT1 与 Myc-zEtv2 或 -zScl，并接受 DMSO 或 0.5 μM MK-2206 处理 24 h 后 western blot。C, D 过表达野生型（WT）AKT1 而非其激酶缺陷（KD）突变体可稳定 zEtv2 与 zScl。E, F AKT1 对 mEtv2/mScl 表达的促进作用依赖其激酶活性。G–I zEtv2 与 zScl 经蛋白酶体途径降解：细胞接受溶酶体抑制剂 NH₄Cl（20 mM）或蛋白酶体抑制剂 MG132（20 μM）处理 5 h。B、D、F、I 中免疫反应条带灰度用 ImageJ 定量，相对相应 Tubulin 信号归一化。配对 Student t 检验；ns，无显著差异。

5. AKT1 与 Etv2、Scl 物理互作并直接磷酸化之

AKT 促增殖的经典机制是通过磷酸化并失活 CDK 抑制剂推动 G1 期进展。据此作者猜测 cxcr4a 缺失可能导致血管母细胞堆积在 G1 期。在表达 mKO2-zCdt1 的胚胎中验证果然如此：cxcr4a 遗传失活使 PAA 中G1 期细胞（mKO2⁺）比例显著升高。

令人意外的是，用选择性 CDK2 抑制剂 CYC202 与 CDK4/6 抑制剂 PD0332991 处理野生型 Tg(fli1:nucEGFP) 胚胎，虽然 PAA 细胞数明显下降，血管母细胞分化却完全不受影响（tie1 表达正常）。这提示 CDK 活性对增殖是必要的、但对分化不是——AKT 很可能还通过直接磷酸化 Etv2 与 Scl 来抑制其周转。

图 6　AKT1 与 zEtv2、zScl 直接互作。A, B AKT1 与 zEtv2、zScl 互作。转染相应质粒的 HEK293T 细胞经抗 Flag 抗体免疫沉淀后 western blot。C 过表达的 AKT1 与内源性 zEtv2、zScl 互作。野生型胚胎在单细胞期注射 200 pg Flag-AKT1 mRNA，随后免疫沉淀检测。D, E AKT1 与 zEtv2 或 zScl 在体外的直接结合。GST、GST-AKT1、GST-zEtv2(236-345) 与 GST-zScl 在细菌中表达纯化；GST 标签经凝血酶切除后与 GST-AKT1 孵育/pull-down，SDS-PAGE 后考马斯亮蓝染色。

共免疫沉淀显示 Flag-AKT1 与过表达或内源的 zEtv2、zScl 均结合，体外重组蛋白 pull-down 进一步确认直接结合。随后用特异性识别磷酸丝氨酸/磷酸苏氨酸的抗体从全细胞裂解物中富集 AKT 底物做磷酸化分析：即使不 overexpression AKT1，zEtv2 与 zScl 上的丝氨酸与苏氨酸残基也已被磷酸化；而 AKT1 过表达只显著增强丝氨酸位点的磷酸化。

AKT 通常在 RXRXXS/T 共识识别基序内磷酸化底物，但 zEtv2 与 zScl 中并不存在这样的基序。作者转而跨物种比对同源序列寻找保守位点：zEtv2 有两个保守丝氨酸（142 与 296）；zScl 有十个保守丝氨酸，按位置分为三组，只有 SII 组（192 与 222）被换成丙氨酸后，zScl 才失去对 AKT1 过表达的反应。

图 7　AKT 磷酸化 zEtv2 的 S296 与 zScl 的 S222。A–C AKT 提高 zEtv2 与 zScl 的磷酸丝氨酸水平。HEK293T 转测相应质粒并经 20 μM MG132 处理 5 h，裂解物经抗 p-serine 抗体免疫沉淀、抗 Flag 抗体印迹。D–F 野生型 zEtv2 与 zScl——而非其抗磷酸化突变体——的表达被 AKT1 促进。G, H 体外激酶实验显示 AKT 可磷酸化野生型 zEtv2 与 zScl，但不能磷酸化其抗磷酸化突变体。I–K zEtv2 与 zScl 的磷酸模拟突变体比野生型更稳定，且不再被 AKT1 进一步稳定。灰度用 ImageJ 定量（C 为磷酸化水平，F、K 为蛋白表达水平，均值 ± 标准差，三个独立生物学重复）。配对 Student t 检验；ns，无显著差异。

精炼的结果非常干净：zEtv2 的 S142A 突变在 AKT1 存在时表达仍有明显升高（说明 142 不是主要位点），而 S296A 突变几乎完全废除该升高；zScl 中S192A 仍可被稳定，S222A 则不能。体外激酶实验直接证明纯化的 AKT1 磷酸化 zEtv2 的 S296 与 zScl 的 S222。相应地，磷酸模拟突变体 zEtv2-S296D 与 zScl-S222D 比野生型更稳定、且不再被 AKT1 进一步稳定。即AKT 通过在特定丝氨酸位点直接磷酸化，稳定 Etv2 与 Scl 蛋白。

6. AKT 通过抑制多聚泛素化稳定 Etv2 与 Scl

既然二者经蛋白酶体降解，作者便追问是否被泛素修饰。过表达多聚泛素链形成的功能性显性负效应突变体 Ub K48R/G76A 后，zEtv2 与 zScl 的降解被明显抑制，效率与作为阳性对照的 β-catenin（Wnt 信号缺失时经泛素降解）相当。进一步的 HA-Ub 免疫沉淀显示：无 Flag-AKT1 时 zEtv2 与 zScl 被大量多聚泛素化；过表达野生型 AKT1 后泛素修饰消失，而激酶缺陷型 AKT1 无此能力。

图 8　AKT 抑制 zEtv2 与 zScl 的多聚泛素化。A zEtv2 与 zScl 经泛素-蛋白酶体途径降解。Flag 标记的 β-catenin、zEtv2、zScl 与显性负形式泛素 Ub-K48R/G76A 在 HEK293T 中共表达后免疫印迹。B, C AKT1 在特定丝氨酸位点磷酸化 zEtv2 与 zScl，从而抑制其多聚泛素化。过表达野生型 AKT1 而非其激酶缺陷突变体可减少泛素修饰（B）；而在抗磷酸化突变体 zEtv2-S296A、zScl-S222A 上，AKT1 异位表达对多聚泛素化的影响明显强于对应的野生型蛋白（C）。D–F 在 cxcr4a−/− 突变体中过表达 zEtv2/zScl-WT 或其 S-D 形式可部分救援 PAA 5、6 的 tie1 表达。野生型或突变体胚胎在单细胞期注射 200 pg mRNA 与 AS-Flag-photo-MO，30 hpf 时用 365 nm UV 处理 10 min 解除翻译阻断，48 hpf 收集做原位杂交（D）。E、F 为 tie1 表达缺陷胚胎的百分比。比例尺，50 μm。

最关键的功能验证回到胚胎：使用可光解离的反义吗啡啉 AS-Flag-photo-MO 阻断 Flag-zEtv2/zScl mRNA 的早期翻译，在 cxcr4a−/− 中共注射相应 mRNA，30 hpf 用 365 nm UV 解除阻断，实现时序性异位表达。结果：过表达野生型 zEtv2 或其磷酸模拟体 zEtv2-S296D，使 48 hpf 时 tie1 表达恢复的 cxcr4a−/− 胚胎比例从 10% 提升到 40%；而抗磷酸化的 zEtv2-S296A 毫无救援作用，zScl-S222A 同样丧失了恢复 tie1 表达的能力。这就把「AKT 稳定 Etv2/Scl」与「随后的 PAA 血管母细胞分化」在功能上直接连了起来。

7. 配体 cxcl12b 对 PAA 发育同样重要

Cxcl12b 是斑马鱼中 cxcr4a 的配体。为直接检视咽部血流，向野生型与 cxcl12b 突变体（携带蛋白编码区移码突变）的共同心静脉注射荧光示踪剂 rhodamine-dextran。结果如预期：cxcl12b 失活导致 PAA 5、6 发育异常、血流中断；60 hpf 时后部 PAA 的 tie1 表达丢失。但 cxcl12b 缺失并非完全外显——约 70% 胚胎的 PAA 发育相对正常，仅部分突变体显示后部 PAA 中 p-AKT 明显降低。作者认为这可能源于未知补偿机制的激活（此前已知不到 50% 的 cxcl12b 突变体有 LDA 形成缺陷）。

图 9　cxcl12b 表达于咽弓囊，且为 PAA 形态发生所必需。A 删除 cxcl12b 导致后部 PAA 血流中断。72 hpf 时向野生型与 cxcl12b−/− 突变体共同心静脉注射 rhodamine-dextran，用 Nikon A1R+ 共聚焦显微镜成像。B 野生型与 cxcl12b−/− 突变体中 tie1 表达分析。C Tg(nkx2.5:ZsYellow) 背景下野生型与 cxcl12b−/− 胚胎的 p-AKT（绿）与 ZsYellow（红）免疫染色。D 野生型胚胎中 PAA 发育期间 cxcl12b 的表达分析，黑色箭头标示咽部表达。E cxcl12b 转录本与咽弓囊 GFP 蛋白的共定位分析（Tg(sox17:GFP)，抗 GFP 绿，cxcl12b 探针红）。比例尺，50 μm。

cxcl12b 在 24–48 hpf 的咽部持续表达；在 Tg(sox17:GFP) 胚胎中的荧光原位杂交显示，其表达高度局限于发育中 PAA 相邻的咽弓囊内胚层。由此提出：咽弓囊内胚层来源的 cxcl12b，正是邻近 PAA 血管母细胞中 Cxcr4a 信号的激活来源。

三、机制模型

综上，在咽弓动脉血管发生过程中，咽弓囊内胚层来源的 Cxcl12b 与血管母细胞表面的 Cxcr4a 构成一对配体-受体，其下游的 PI3K/AKT 级联在同一个分子节点上同时驱动了血管母细胞的增殖与分化。完整链条可概括为五个环节：

1. 位置信息确立：咽弓囊内胚层表达 cxcl12b，相邻发育中主动脉弓的血管母细胞表达受体 cxcr4a，形成旁分泌梯度；

2. 信号开启增殖：Cxcr4a 激活 PI3K/AKT，一方面通过磷酸化 CDK 抑制剂 p21/p27 加速 G1→S 进展，另一方面直接磷酸化 Etv2（S296）与 Scl（S222）；

3. 蛋白稳定性提升：这两个位点的磷酸化阻断 Etv2/Scl 的多聚泛素化，使其免于蛋白酶体降解，蛋白量随之升高；

4. 同步分化：稳定的 Etv2 与 Scl 持续输出 tie1、Cdh5 等信号，使血管母细胞完成分化并成熟为具管腔的功能内皮；

5. 形态建成：数量足够、身份明确的后部 PAA（5、6）才能建成管腔、接入血流——该通路失效即导致咽弓动脉狭窄。

机制要点：为什么说这是「同步」而非「先后」？

经典认知里，AKT 通过 CDK 抑制剂推动细胞周期、CDK 通过磷酸化转录因子推动命运决定，是两条各管一摊的通路。本文的关键在于：Etv2/Scl 这两个「命运决定者」本身就是 AKT 的直接磷酸化底物。因此细胞越是要增殖、越是要表达这些转录因子，AKT 就越要把它们稳住——增殖速率与分化深度被同一个磷酸化事件物理性地绑定在一条信号上，任何一环失灵都会同时砸掉两头。

四、讨论：这项研究告诉了我们什么？

器官发生中增殖与分化的相互交织，由微环境外源线索与内在调控因子精密编排。PAA 前体在快速增殖的同时序贯分化，增殖不足与分化受损都会导致 PAA 形态发生失败。本文表明二者在分子水平上被耦合。

关于下游通路：已有报道指出血流触发的 PI3K/AKT 信号对 PAA 细胞的正确迁移是必需的，但 cxcr4a−/− 突变体的 PAA 血管母细胞并无迁移缺陷。作者的解释是：PI3K/AKT 通路可能在不同发育阶段被多样化的上游信号激活，并在 PAA 形态发生中执行不同功能——在 48 hpf 之前/之时主要管迁移，之后则管增殖与分化。AKT 亚型（AKT1/2/3）功能各异，AKT1 似乎是内皮细胞增殖、迁移与存活的主要亚型，但究竟是哪一亚型在 PAA 中下游响应 Cxcl12b-Cxcr4a，仍需进一步研究。

关于磷酸化位点的「非共识」性质：AKT 通常在 RXRXXS/T 共识基序内磷酸化底物，而 zEtv2 与 zScl 中并无此基序，但系统性的丙氨酸突变扫描仍锁定了 S296 与 S222。有意思的对照是：在人 T 淋巴细胞白血病细胞系 Jurkat 中，TGFβ 信号经 AKT 在苏氨酸 90 处磷酸化 SCL、触发其泛素化降解——而人 SCL 的 Thr90 恰好位于共识基序内，而斑马鱼同源蛋白并不含该基序，因此 AKT 也未提升 zScl 的磷酸苏氨酸水平。这提示Etv2 与 SCL 的蛋白稳定性在不同生物学情境下可能被 AKT 以不同方式调控。

一个耐人寻味的「有意思」旁证：AKT 曾在红细胞生成过程中通过磷酸化 GATA1（提高其对 FOG1 的亲和力）来同步增殖与成熟——与本文的机制逻辑高度同构。「用同一个激酶把细胞周期与命运决定绑在一起」似乎是发育编程中一种可复用的策略。

关于信号来源：咽弓前体要经历一连串命运决定才能生成功能动脉，而调控 PAA 形态发生的信号通路已被逐一解析：Gdf3/Alk4 介导 ALPM 中 tbx1 依赖的 nkx2.5⁺ 多能咽弓细胞出现；BMP 信号对 nkx2.5⁺ 咽弓中胚层中 PAA 前体的进一步指定至关重要；TGF-β/Smad3 信号推动前体向血管母细胞谱系分化。本研究把 Cxcl12b-Cxcr4a 定位在「血管母细胞转换之后」的晚期分化环节——因为 cxcr4a 遗传消融在多数胚胎中只影响 PAA 5、6 的血管母细胞分化，暗示前、后部 PAA 对 Cxcr4a 信号的敏感性不同；低浓度抑制剂模拟突变体表型、高浓度则影响所有 PAA，说明除 Cxcr4a 外，可能还有其他尚未鉴定的机制能激活 PI3K/AKT 以促成 PAA 形成。最后，内胚层咽弓囊作为一系列紧邻发育中 PAA 的外突结构，已被证明能表达多种引导信号（BMP、PDGF、TGFβ2a、TGFβ3）；本文把 cxcl12b 加入这一清单，并显示其受体基因正好表达在邻近发育中的主动脉弓里——一个清晰的「囊内胚层 → 血管」信号轴。

本文核心信息

1. 咽弓囊是 PAA 发育的信号中枢：cxcl12b 在囊内胚层表达、受体 cxcr4a 在相邻主动脉弓表达，配体与受体空间上严格配对，构成一条新的「内胚层 → 血管」信号轴。

2. PI3K/AKT 在 PAA 中特异负责增殖与分化：cxcr4a 缺失不影响迁移与存活，只让血管母细胞停在 G1 期并丧失分化能力——这是对「血流-PI3K/AKT-迁移」范式的重要补充与修正。

3. AKT 通过磷酸化 Etv2/Scl 稳定关键转录因子：机制被四重证据锁定——互作（Co-IP + GST pull-down）、位点（丙氨酸扫描 + 体外激酶）、泛素化（Ub K48R/G76A + HA-Ub 免疫沉淀）、功能（胚胎救援实验）。

4. 转化启示：把增殖与分化绑定在同一个可干预节点上，理论上比分别抑制两者更具治疗价值——后部 PAA（5、6）对该信号的依赖性最高，也最可能是干预的优先窗口。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。