Eski SE, Mi J, Pozo-Morales M, Hovhannisyan BG, Perazzolo C, Manco R, Ez-Zammoury I, Barbhaya D, Lefort A, Libert F, Marini F, Gurzov EN, Andersson O, Pal Singh S

布鲁塞尔自由大学 ｜ 卡罗琳斯卡学院 ｜ 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 ｜ 鲁汶天主教大学

Nature Communications, 2025, 16: 5260　doi:10.1038/s41467-025-60334-y
收稿：2024-07-31　接受：2025-05-21

摘要

肝脏的再生能力取决于损伤程度。轻微损伤由肝细胞的自我复制来修复，而严重损伤则触发胆管细胞参与肝细胞的恢复。这一范式在成年动物中已有充分记载，但在快速生长期研究较少。我们设计并研究了斑马鱼的两种部分肝损伤模型，均在生长高峰期进行：1）部分消融，杀掉一半肝细胞；2）部分肝切除，切除一半肝叶。在两种损伤中，新生肝细胞都出现在原有肝细胞旁边。单细胞转录组和由基因组编辑生成的 Cre 驱动品系谱系追踪确定胆管细胞是新生肝细胞的来源。我们进一步鉴定出，未损伤的生长期肝脏中活跃的 mTORC1 信号是调控胆管细胞增强可塑性的一个因子。本研究提示，胆管细胞向肝细胞的转分化是快速生长期肝脏再生的主要机制。

导言：一条被反复验证的规则，和它的前提

肝脏的再生能力，取决于损伤有多重。这是一条被反复验证的规则：小伤靠肝细胞自己分裂解决，大伤才需要胆管细胞来救场。哪怕手术切掉三分之二的肝脏，剩下的肝细胞也完全应付得来。

但这条规则有个前提没说清楚：它是在成年动物身上建立的。而一只正在快速生长的幼体，肝脏里本来就塞满了正在分裂的细胞——它还有余力再应付一次损伤吗？

这项 2025 年发表在 Nature Communications 的研究回答了这个问题，答案是出人意料的"不"：即使还有大量存留的肝细胞，胆管细胞也会大规模出动。而且真正驱动这种"可塑性"的开关，是 mTORC1 信号通路。

一、两个新工具：让肝细胞"打上不同颜色"

要回答"新肝细胞从哪来"，前提是能把不同来源的肝细胞区分开并追踪。作者为此开发了一套名为 CellCousin 的系统——"细胞表亲"，因为存留细胞与新生细胞在胚胎期本是同源兄弟。

它的巧妙之处在于利用了 Cre 重组的随机性：

1. 肝细胞默认状态下发出蓝色荧光（nls-mTagBFP2）。

2. 施加 4-OHT 脉冲后，每个体细胞被随机、独立地切换成绿色（H2B-mGL）或品红色（mCherry-NTR）。

接下来用甲硝唑（Mtz）消融掉品红色的那批（因为它们带硝基还原酶），于是：

表 1　CellCousin 系统中的两类肝细胞

一眼就能分辨：损伤后如果蓝色肝细胞冒出来，就说明有非肝细胞变成了肝细胞。

图 1 ｜ CellCousin 驱动的肝细胞部分消融及随后对肝细胞再生的追踪。A CellCousin 构建体示意。fabp10a 驱动 creERT2；报告构建体为 fabp10a 驱动的 lox2272-loxp-nls-mTagBFP2-stop-lox2272-H2B-mGL-stop-loxp-mCherry-NTR。4-OHT 诱导重组后，默认蓝色随机转为绿色或品红色。B 消融 mCherry-NTR+ 肝细胞的策略。Mtz 处理前肝细胞随机分为绿色（存留）与品红（将被消融）；处理后仅存留绿色细胞。C 两种再生模式示意图。模式 1（自我复制）产生绿色肝细胞；模式 2（转分化）使非肝细胞直接表达默认的蓝色 nls-mTagBFP2，即 de novo hepatocyte。D 实验时间线：4–5 dpf 用 4-OHT 诱导重组，10–11 dpf 用 Mtz 处理，随后在 0、1、2、5 dppa 活体成像。E 同一肝脏在 0、1、2 dppa 的纵向体内共聚焦成像。0 dppa 主要是存留的绿色肝细胞；1 dppa 出现蓝色新生肝细胞；2 dppa 蓝色细胞进一步增多。标尺，200 µm。F, G 标记细胞百分比与标准化数量的定量（pre-Mtz n=14；0、1、5 dppa 各 n=10），Kruskal-Wallis 检验。mTagBFP2+ 蓝色细胞比例在 1 dppa 后显著上升（p = 0.0022、0.0011、< 0.0001）。

二、第一个反常结果：存留肝细胞"不干活"

用 EdU 掺入实验追踪细胞分裂，结果出乎意料：

1. 存留的肝细胞在损伤后增殖率几乎没有上升——它们既没有加班，也没有恐慌。

2. 胆管细胞在 6–48 小时内增殖率大幅上升，6 小时就有 29.0 ± 5.0% 呈 EdU 阳性。

也就是说，新肝细胞不是老细胞分裂出来的，而是由隔壁的胆管细胞转化过来的。

图 2 ｜ 胆管细胞响应肝细胞部分消融而增殖。A 谱系追踪示意图。肝细胞以 H2B-mGL+（绿）或 mCherry-NTR+（品红）标记；胆管细胞以 Tg(tp1:H2B-mCherry) 标记（核红）。源自胆管细胞的早期 de novo 肝细胞呈核洋红色（nls-mTagBFP2+/H2B-mCherry+），晚期则因标记被稀释仅呈蓝色。B 未损伤与 6 hppa 时的肝脏共聚焦图像，白色箭头标示正在增殖的早期 de novo 肝细胞。6 hppa 时核内同时含蓝色与红色的双阳性细胞明显增多。标尺，200 µm / 50 µm。C 各时间点各类细胞中 EdU+ 比例的柱状图（n = 6）。未损伤时肝细胞增殖率几乎为 0；6 dppa 后胆管细胞与 de novo 肝细胞的 EdU 阳性率显著升高（p = 0.0022；p < 0.05）。

三、换成外科手术，结论一样

遗传消融可能有人为痕迹。作者又建立了部分肝切除（PHx）模型——在 10 dpf 幼体上切掉左叶中央及其后方区域（约 17.3% 的肝细胞），这是更接近临床真实损伤的模型。

结果出现了一个很清晰的"创伤边界区"：

1. 1 dpi 时，EdU+ 细胞严格局限在距切缘 50 µm 以内，区域之外毫无动静。

2. 切缘 50 µm 内，1 dpi 就有 20.9 ± 2.1% 的胆管细胞进入 S 期。

胆管细胞的增殖应答比肝细胞更持久、更强烈——1 dpi 和 2 dpi 都活跃，而肝细胞主要在 1 dpi 有反应。

图 3 ｜ 部分肝切除（PHx）肝脏再生模型的建立。A 10 dpf 幼体左叶 PHx 手术的示意与明场图像。B 未损伤或 PHx 后 0 hpi 左叶与右叶的共聚焦图像，白色虚线标示切除位点。C 肝细胞（核）总数定量（各 n = 10），双尾 Welch t 检验。对照 9901 ± 516，PHx 后 8184 ± 415，减少 17.3%（p = 0.0188）。D 11 dpf 未损伤与 1 dpi 时 EdU 标记肝脏的共聚焦图像。1 dpi 时 EdU+ 信号集中在切缘 50 µm 内的远端区域。标尺，200 µm / 50 µm。E 肝叶划分为远端（50 µm 厚）与近端区域的示意图。F, G 各区域 EdU+ 肝细胞与胆管细胞百分比定量。只有左叶远端区域出现显著升高（肝细胞 1 dpi、胆管细胞 1 与 2 dpi），其余三组无显著变化。

四、确证身份：单细胞转录组的对角线

10x Genomics 单细胞测序共分析 30,856 个细胞。把这批 mTagBFP2+ 新生细胞分别与未损伤的肝细胞、胆管细胞做相关性分析，得到一条非常干净的时间对角线：

表 2　新生肝细胞转录组相似性的时间对角线

基因表达层面完全对应：胆管细胞标志物（anxa4、epcam）逐步消退，肝细胞标志物逐步上升。拟时序分析进一步指向肝内胆管细胞（IHD）和中间胆管细胞是主力，而最成熟的腔面胆管细胞（krt4）没有参与。

还有个漂亮的额外发现：发育早期的新生肝细胞特异性表达 lfng 和 fgf13a。lfng 是 Notch 抑制剂——这立刻引出一个诱人的假设：光抑制 Notch 信号，是不是不用损伤就能直接把胆管细胞推成肝细胞？

答案是可以。用 γ-分泌酶抑制剂 LY411575 处理，在没有做任何损伤的情况下，自发出现了蓝色新生肝细胞。

图 4 ｜ 新生肝细胞对 PHx 后再生的贡献。A 两种再生模式的标记示意：自我复制产生绿色/品红肝细胞，转分化产生的 de novo 肝细胞携带蓝色 nls-mTagBFP2。B 4-OHT 脉冲标记与 PHx 的时间线（4–5 dpf 标记，10 dpf 切除，14 dpf 检测）。C 活体共聚焦图像：PHx 后在再生区外侧出现大量蓝色新生肝细胞。标尺，200 µm。D 4 dpi 时 mTagBFP2+ 细胞标准化数量（未损伤 n=29，PHx n=30），双尾 Mann-Whitney 检验。从 15 ± 5.1 升至 180 ± 53（p < 0.0001）。E FACS 定量蓝色肝细胞百分比。未损伤 1.2 ± 0.09%，PHx 后 18 ± 1.7%（p = 0.0095）。

图 5 ｜ 新生肝细胞在转录组上与未损伤肝细胞趋于一致。A 单细胞测序设计示意（对照 N=2；部分消融 0、1、9 dppa；PHx 4、11 dpi）。B 细胞类型 UMAP，共n = 30,856 个细胞。C 标志基因热图：肝细胞 51.7%、HSC 21.0%、内皮 13.1%、胆管细胞 6.2%、巨噬细胞 4.3% 等。D 聚焦损伤条件的 UMAP，高亮 mTagBFP2+ 细胞与各组肝细胞、胆管细胞。

E 相关性矩阵与层次聚类。关键读法：0 dppa、1 dppa、4 dpi 的蓝色细胞（绿框）与胆管细胞相关性高达 0.85–0.87；9 dppa、11 dpi（红框）则转向肝细胞（9 dppa 达 0.84）；存留肝细胞始终与对照肝细胞高度相关（最高 1.00）。F 标志基因表达热图。从 0 dppa → 1 dppa → 4 dpi，右侧胆管细胞标志物（her2、her9、anxa4、epcam、krt4）逐渐减弱，左侧肝细胞标志物（fabp10a、albumin、tf 等）逐渐增强，分子身份完成转变。

五、最硬的证据：把 Cre 敲进胆管细胞自己的基因里

前面都是相关性。作者做了一个更硬的实验来排除"其他细胞也可能变肝细胞"的可能。

他们不用随机转基因，而是把 CreERT2 直接敲进 her2 和 her9 两个基因的内源性位点——这样就避免了随机插入的位置效应和转基因沉默。验证结果：her2 驱动品系标记了肝脏中80.4% 的胆管细胞，而其谱系细胞中 93.7% 确实是胆管细胞，专一性很高。

追踪结果非常干净：PHx 后，her2 谱系的肝细胞（核 mCherry+/mGL+ 双阳性）在 4 dpi 和 8 dpi 都显著增多——4 dpi 时从 0.04 升到 10.0，8 dpi 时从 0.16 升到 5.8。her9 谱系追踪得到同样结论。

胆管细胞是新生肝细胞的来源，这一点现在没有争议了。

图 6 ｜ her2+ 细胞在 PHx 后产生肝细胞。A 用于追踪 her2+ 细胞的品系结构：her2 基因座为外显子 1-p2A-EGFP-p2A-creERT2-p2A-3'UTR；构建体经 Gateway 重组，Cre 重组使 her2+ 细胞从 CFP 永久切换为 H2B-mCherry。B 追踪示意：若 her2+ 胆管细胞转分化为肝细胞，因其同时受 fabp10a 驱动而携带 H2B-mGL，故呈现核 mCherry+/mGL+ 双阳性（黄色）；未转化则仅红色单阳性。C 时间线：2–3.5 dpf 标记，10 dpf 行 PHx，14 dpf（4 dpi）与 18 dpf（8 dpi）检测。D, F 4 dpi 与 8 dpi 时的活体共聚焦图像，白色箭头标示胆管细胞来源的 de novo 肝细胞。PHx 条件下双阳性细胞明显增多。标尺，100 µm / 50 µm。E, G 单位体积双阳性肝细胞标准化数量定量，双尾 Mann-Whitney 检验。4 dpi：未损伤 0.04 ± 0.04 → PHx 10 ± 2.3（p = 0.0003）；8 dpi：0.16 ± 0.08 → 5.8 ± 2.3（p < 0.0001）。

六、为什么是幼体？开关在 mTORC1

这是全文最有意思的机制部分。既然成年斑马鱼的 PHx 不会诱导胆管细胞转分化，那幼体和成年到底差在哪？

作者把幼体与成年肝脏的单细胞数据整合对比，发现两者的细胞类型构成大体保守——差别不在"有哪些细胞"，而在"这些细胞的开关设在哪"。两个关键差异浮出水面：

1. 成年胆管细胞中 sox9b 表达下调——这是维持胆管细胞可塑性的关键基因。

2. 幼体胆管细胞中 mTORC1 通路相关基因普遍上调——而这条通路已知对胆管细胞转分化至关重要。

pS6 免疫染色证实了这一点：10 dpf 幼体的肝细胞和胆管细胞都呈 pS6 阳性，成年斑马鱼则几乎检测不到。雷帕霉素实验收尾——在损伤之前用雷帕霉素抑制 mTORC1，之后 PHx 产生的新生肝细胞从 28 ± 6.0 降到 10 ± 2.8。

图 7 ｜ 未损伤肝脏中的 mTORC1 活性调控胆管细胞可塑性。A, B 幼体（13 dpf，n=9,384 细胞）与成年（18 mpf，n=13,630 细胞）肝脏细胞整合的 UMAP 与聚类，虚线框标示共有的胆管细胞。C mTORC1 通路基因表达热图（上）与差异表达点图（下）。幼体胆管细胞中 rptor、rragc、akt1s1、mlst8、mTOR 等普遍高于成年（红色，p < 0.05）。D pS6 免疫染色（蓝 DAPI、绿 H2B-mGL 标记肝细胞、红 H2B-mCherry 标记胆管细胞、黄色箭头为 pS6）。10 dpf 幼体肝细胞与胆管细胞均呈 pS6 阳性；成年雌雄均未检出。标尺，10 µm。E pS6 强度定量（来自 10 条鱼的 50 个细胞）：幼体约 500–700，成年雌性约 100–200，成年雄性接近 0（p < 0.0001）。F 全肝 pS6 与 GAPDH Western blot，幼体条带明显，成年很弱。G 抑制 mTORC1 的实验方案（12 dpf 给药，14 dpf 行 PHx，17 dpf 检测）。H, I 3 dpi 时 DMSO 与 10 µM 雷帕霉素组的肝脏共聚焦图像与定量：DMSO 28 ± 6.0，雷帕霉素 10 ± 2.8（p = 0.0042）。标尺，200 µm。

这里有个相当精妙的推论。作者指出：幼体肝脏里 mTORC1 活性这么高，但在没有损伤的情况下并不发生自发转分化。所以 mTORC1 的作用不是"推动转化"，而是把胆管细胞调到"预备好"的状态——一旦损伤到来，升高的 mTORC1 水平让胆管细胞有能力有效下调 Notch 信号，转分化才得以进行。

这也解释了为什么 5 dpf 的幼体不行：那时斑马鱼刚进入禁食状态，胆管细胞的 mTORC1 活性很低，PHx 同样不会诱导转分化。信号通路"开着的"和"关着的"，结果完全不同。

七、机制总结

把全文的因果链串起来，可以得到六步：

1. 幼体快速生长期 → 肝脏组织快速扩张（6–11 dpf 肝细胞数增加 96%–121%）。

2. 生长需求 + 营养供给 → mTORC1 通路在未损伤肝脏中即保持高活性（pS6 阳性）。

3. mTORC1 高活性使胆管细胞处于"可塑预备态"（此时尚未发生转化）。

4. 损伤发生（消融或 PHx）→ 升高的 mTORC1 使胆管细胞能有效下调 Notch 信号。

5. IHD 与中间胆管细胞转分化为肝细胞，增殖并补充损失（表达上呈时序性转变）。

6. 而存留肝细胞增殖几乎不增加——肝细胞增殖应答本身存在瓶颈。

八、这项研究的价值与边界

1. 修正了一个教科书级范式。此前人们认为胆管细胞只在"大面积损伤"或"肝细胞无法增殖"时才出动。本文表明，即使存在大量存留肝细胞、即使损伤只有约 17%，胆管细胞也会大规模转分化。这意味着"兼性再生"这一备用机制，其触发门槛比想象的低得多。

2. 找到了"为什么是幼体"的答案。不是细胞类型不同，而是信号通路的状态不同。这是本文最有价值的机制洞察——它把"发育阶段"这一宏观变量，落到了 mTORC1 这个可干预的具体靶点上。

3. 跨模型保守性。在慢性肝炎和肝硬化患者的肝活检中，也观察到胆管细胞与肝细胞标志基因共表达。斑马鱼的 fgf13a 与人类的 FGF13 似乎是同一过渡细胞阶段的标志物——提示这不是幼体特有的现象，而是哺乳动物肝病修复的普遍中间态。

4. 直接的治疗启示。既然抑制 Notch 就能在无损伤情况下诱发转分化，那么药物调控 mTORC1 与 Notch 平衡，可能成为提升成年肝脏再生能力的切入点——成年肝脏的胆管细胞并非不能转分化，只是被锁在了"未就绪"状态。

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