Waldron A, Wilcox C, Francklyn C, Ebert A

美国佛蒙特大学 生物学系 ｜ 生物化学系

Frontiers in Cell and Developmental Biology, 2019, 7: 67　doi:10.3389/fcell.2019.00067
收稿：2019-01-11　接受：2019-04-09　发表：2019-04-26

摘要

组氨酰-tRNA 合成酶（HARS）是氨酰-tRNA 合成酶家族的成员，负责将氨基酸连接到其对应的 tRNA 分子上。这一反应是蛋白质合成的关键步骤，必须在生物体的每个细胞中进行。然而，已有若干组织特异的人类遗传疾病与氨酰-tRNA 合成酶基因突变相关联，包括 HARS。这些关联表明，尽管我们对该酶的分子和生化特性已有大量了解，但仍未完全理解这些蛋白在完整生物体背景下如何发挥作用。为此，我们在斑马鱼中敲低 HARS 表达并刻画其发育后果。我们的工作表明，某些组织——特别是神经系统——对 HARS 缺失比其他组织更为敏感，并揭示了 HARS 与发育过程中神经祖细胞的增殖和存活之间的联系。

导言：管家蛋白为何挑神经系统下手

有一类蛋白叫氨酰-tRNA 合成酶（ARS），它们负责把氨基酸装到对应的 tRNA 上——这是每个细胞、每一刻都在跑的"基础工序"，属于典型的"管家蛋白"。

但过去十几年里，一个奇怪的现象反复出现：管家蛋白的突变，却专门导致某些特定组织的疾病。最集中的就是神经系统——CMT 周围神经病、小头畸形、伴耳聋的失明……

这篇 2019 年发表在 Frontiers in Cell and Developmental Biology 的研究以 HARS（组氨酰-tRNA 合成酶）为切口，回答了一个很基础的问题：同一个"管家"缺工了，为什么有的细胞安然无恙，有的细胞却崩溃？

一、线索：管家蛋白为何挑神经系统下手？

作者的第一步很直接：看看 hars 在斑马鱼胚胎里到底在哪儿表达。答案相当集中：

1. 18 hpf 时表达遍及胚胎，但视泡中明显增强。

2. 24、36、48 hpf 时集中在发育中的眼、耳和视顶脑。

3. 横切与矢状切面进一步显示，表达恰好落在与增殖相关的区域——睫状体边缘区这类地方。

有意思的是，小鼠 Hars 的原位杂交数据也显示类似模式——在神经元尚未开始分化的早期视网膜中表达尤其突出。而且斑马鱼其他 ARS 基因的表达也类似，说明这不是 hars 的专利。ARS 家族的共同特点是：越要增殖的地方，越需要它。

图 1 ｜ 斑马鱼 hars 的发育中 mRNA 表达模式。A–E 胚胎在 18、24、36、48、72 hpf 各时期的侧面视图；A′–E′ 对应的背面视图，显示 hars 表达（紫色）。关键读法：18 hpf 表达遍及胚胎但视泡（OpV）明显加深；24–48 hpf 集中于发育中的眼、耳（E）和视顶脑（OpT）；72 hpf 整体减弱但仍见于视网膜（R）、耳和全脑。F–J 通过视网膜的横切面（对应 A–E 中虚线位置）；K hars -sense 探针阴性对照；L–N 视网膜矢状切面。切面显示表达集中于与增殖相关的区域，与图 5 中应激基因的上调位置高度重合。比例尺，25 µm。

二、造模：敲低 HARS 会怎样？

这里有个技术上的巧妙处理。斑马鱼（和其他硬骨鱼）只有一个 hars 基因，通过可变剪接和翻译起始位点同时编码线粒体和胞质两种酶（人类和其他脊椎动物是两个独立基因）。

如果直接把 hars 打垮，线粒体功能也会跟着崩，实验就说不清了。所以作者用了一条只阻断胞质 hars 转录本翻译的形态olino，精确绕开线粒体那一支。

表型：剂量依赖性的"小眼"。注射后胚胎整体看起来健康，但相比同窝，它们的头部和眼睛明显更小，且剂量越高越小。剂量最高时则出现严重的全身缺陷——推测存在一个合成酶水平的临界线。

为排除技术性假象，作者做了三组对照：

1. 标准对照形态不产生任何表型 → 排除脱靶效应。

2. 共同注射 p53 形态表型不变 → 排除 p53 通路的非特异激活。

3. 共同注射人 HARS mRNA 可以部分挽救眼大小 → 反向验证特异性。为何只是部分？因为人和斑马鱼 HARS 虽有 77% 同一性，但 tRNA 识别机制很可能有差异。

图 2 ｜ hars 敲低导致眼变小。A 不同剂量 hars 形态olino下"眼直径/体长"的定量。关键读法：2、4、6 ng 均显著低于未注射组，呈清晰的剂量依赖性下降（****、***、*）。B 对照实验。关键读法：标准对照形态（4 ng Std MO）不产生表型；hars MO + 6 ng p53 MO 与 hars MO 单独相比无差异（n.s.）——说明表型既非脱靶效应，也非 Tp53 依赖。C–F′ 72 hpf 胚胎明场图像：C 未注射；D hars MO；E hars MO + 人 HARS mRNA（挽救）；F 人 HARS mRNA 单独。右侧 D′ 小图直观显示 D 组眼睛明显偏小，E 组恢复至接近正常。比例尺，200 µm。G 挽救实验中"眼直径/体长"的定量；H 挽救实验中眼面积（μm²）的定量。两组指标一致显示 hars KD 显著下降、HARS mRNA 挽救后显著回升。单因素 ANOVA 后接 Tukey 多重比较（n ≥ 30，*=0.05，**=0.01，***=0.001，****<0.001）；误差线为均值和 SEM。

三、拆解：细胞变少，是"生不出来"还是"死得多"？

作者选了视网膜作为观察窗口——中枢神经系统中高度有序、易获取的子集。组织学上，hars KD 胚胎每个年龄的视网膜细胞都更少，而且 24 hpf 就已显现。好消息是 96 hpf 时视网膜的所有层次仍清晰可辨——整体图式没被破坏。

接下来是两个标志物的免疫染色，分别回答"增殖"和"死亡"：pHH3（M 期标志物）和裂解半胱天冬酶 3（凋亡标志物）。结果呈现出非常清晰的时间进程：

表 1　视网膜祖细胞增殖与凋亡随时间的变化

损害发生得比想象中早得多。增殖减少和凋亡增多都集中在 18–24 hpf，之后差距就抹平了。这说明视网膜祖细胞池在最早的窗口期就被"卡了缺口"——等到 72 hpf 差异消失时，能建的细胞已经建不出来了。

图 3 ｜ hars 敲低胚胎的视网膜组织学。A–H 未注射（上排）与 hars KD（下排）胚胎在 24、48、72、96 hpf 的 7 微米视网膜横切面，苏木精-伊红染色（紫红色为细胞核密集的视网膜，粉色为晶状体）。关键读法：下排各时期的视网膜厚度与细胞密度均低于上排同期对照。比例尺，50 µm。I 每个中央视网膜切面的细胞数量定量。关键读法：四个时期 hars KD 组（空心圆）均显著低于未注射组（实心圆），且 24 hpf 即已显现差异；96 hpf 时 hars KD 组细胞数仍明显偏少，但视网膜各层次依然清晰可辨。Student's t 检验（n ≥ 30，*=0.05，**=0.01，***=0.001，****<0.001）；误差线为均值和 SEM。

图 4 ｜ hars KD 胚胎的视网膜祖细胞增殖减少与细胞死亡增加。A–B′ 18 hpf Tg(Rx3:GFP) 胚胎的共聚焦图像，GFP 标记视网膜祖细胞（绿），（A, A′）pHH3 有丝分裂标志物（红）、（B–B″）cCasp3 凋亡标志物（红）。关键读法：A′ 中红色标记点稀疏，A 侧（B）明显密集——18 hpf 时增殖减少与凋增多同时出现。C–H 24 hpf（C–D′）、48 hpf（E–F′）、72 hpf（G–H′）胚胎横切面的单平面共聚焦图像，DAPI 复染（蓝）。红色为 pHH3（上排）或 cCasp3（下排）。A″–H″ 定量。关键读法：18 hpf 增殖细胞数（A″）与凋亡细胞数（B″）双向显著分离；24 hpf 凋亡百分比（D″）仍显著升高；48 hpf（F″）仅略高；72 hpf（H″）两组无差异——损害集中在最早的窗口期。Student's t 检验（n ≥ 30，*=0.05，**=0.01，***=0.001，****<0.001）；误差线为均值和 SEM。

四、机制：AASR 应答被精准激活

接下来是全文机制上最漂亮的一环。逻辑链条很清晰：

HARS 缺失 → 未装载的 tRNA 积累 → 激活 eIF2α 激酶 GCN2 → 翻译停滞 → 触发氨基酸饥饿应答（AASR）

AASR 会驱动一批应激基因转录。作者检测了三个经典标志：asns、gpt2、eif4ebp1。结果全部上调，但上调是组织特异的——asns 显著升高（**），eif4ebp1 升高（*），gpt2 无显著变化（n.s.）。

原位杂交显示的定位更说明问题：这三个基因在神经系统增殖区域表达最强——后视顶脑和眼内晶状体周围（睫状体边缘区），正是图 1 中 hars 高表达的位置。

AASR 的后果之一是抑制 Cyclin D1（CCND1）的积累。而 CCND1 缺乏会让细胞卡在 G1 期，最终走向凋亡。

FACS DNA 含量分析直接验证了这一点：对照胚胎中平均 52.63% 的视网膜祖细胞在 G0/G1 期，而 hars KD 胚胎中这一比例升到 63.87%（p = 0.010）；相应地 G2/M 期从 24.6% 掉到 11.12%（p = 0.004），而 S 期无差异。细胞确实堵在 G1 期了。

图 5 ｜ 氨基酸饥饿应答被激活，并导致视网膜祖细胞 G1 期阻滞。A–F′ 48 hpf 胚胎中三个 AASR 基因的原位杂交：asns（A, A′ 未注射；B, B′ hars KD）、gpt2（C, C′ 未注射；D, D′ hars KD）、eif4ebp1（E, E′ 未注射；F, F′ hars KD）。关键读法：三者在 KD 组染色均加深，且呈组织特异性——集中在视顶脑后部（箭头）和眼内晶状体周围区域（箭头），与图 1 中 hars 高表达位置吻合。比例尺，100 µm。G 半定量 RT-PCR。H 相对于 ef1α 的表达定量（配对设计）。关键读法：asns 升高约 50%（**），eif4ebp1 升高约 25%（*），gpt2 无显著变化（n.s.）——上调程度不一。I 机制示意图：Amino Acid Starvation ⊣（红色抑制）CCND1 ⊣（绿色箭头，提示下游）Cell Cycle Progression——即 AASR 通过压制 CCND1 阻断细胞周期进程。J DNA 含量分析（18 hpf Tg(Rx3:GFP) GFP+ 细胞）的堆叠柱状图与数据表。关键读法：对照 G1/G0 期 52.63% vs KD 63.87%（p = 0.010），G2/M 期 24.6% vs 11.12%（p = 0.004），S 期 10.62% vs 17.2%（p = 0.100，无差异）——细胞在 G1 期堆积、无法进入 S/G2/M，确证G1 阻滞。百分比为三次重复的平均值。Student's t 检验（n = 3，*=0.05，**=0.01）。

五、一个干脆的验证：补回 Cyclin D1 就行

机制链条走到这里，只差一个决定性的验证：如果 AASR→抑制 CCND1→G1 阻滞这条链是真的，那么直接把 CCND1 补回去，表型应该被绕过。

此前在温度敏感的仓鼠细胞系中已有人见过类似现象（Motomura 等，1996）。作者在斑马鱼里重复了这个实验：向 hars KD 胚胎共同注射斑马鱼 ccnd1 mRNA。

结果是完全挽救。过表达 CCND1 把 hars KD 的小眼表型完全恢复了——这既验证了整条机制链，也直接说明：HARS 的功能在细胞周期层面就是通过保证 CCND1 的积累来实现的。

图 6 ｜ hars KD 表型可通过过表达 ccnd1 挽救。A–B′ hars 和 ccnd1 在 24 hpf（A, A′）和 72 hpf（B, B′）的 mRNA 表达。关键读法：两者表达模式高度相似，均集中于眼等增殖区域（箭头所指）——这正是组织特异表型的分子基础。C–F 明场图像：C 未注射；D 注射 hars MO；E 共注射 hars MO + 斑马鱼 ccnd1 mRNA；F 仅注射 ccnd1 mRNA。G 72 hpf 相对眼大小定量。关键读法：D 组（hars KD）眼直径明显偏小；E 组（ccnd1 挽救）回升至与未注射无显著差异（n.s.）；F 组单独 ccnd1 亦无异常——三者对比确证 CCND1 能完全绕过 HARS 缺失。比例尺，200 µm。单因素 ANOVA 与多重比较检验（n ≥ 30，*=0.05，**=0.01，***=0.001，****<0.001）；误差线为均值和 SEM。

六、不止视网膜：其他神经元也受伤

考虑到与人类 HARS 突变相关的两种疾病影响外周神经系统和听觉系统，作者顺带查了其他神经元细胞类型：

1. 感觉毛细胞（Tg(pou4f3:GFP)）：72 hpf 时侧线神经丘数量严重减少。

2. 感觉与运动神经元（Tg(ngn1:GFP);Tg(mnx1:mCherry)）：轴突分支出现明显异常。

所以"细胞数量减少"不是视网膜的专利，其他神经祖细胞群体同样对 HARS 缺失敏感。

图 7 ｜ 其他神经元细胞群体也受 hars KD 影响。A, B Tg(pou4f3:GFP) 胚胎 72 hpf 的明场与荧光复合图像，标记侧线神经丘（感觉毛细胞簇）。A 未注射，B hars KD。关键读法：A 中沿躯干可数到 7 处神经丘（白箭头），B 中仅剩 2–3 处——感觉毛细胞数量严重减少。比例尺，200 µm。C, D [Tg(ngn1:gfp));Tg(mnx1:rfp)] 胚胎 72 hpf 躯干区域的荧光图像。C 未注射，D hars KD。关键读法：红色为运动神经元（mnx1），绿色为感觉神经元（ngn1）。D 中感觉神经元的轴突走行明显紊乱、分支模式异常，与 C 中整齐平行的走向形成对比。比例尺，20 µm。

七、那为什么是神经系统？

这是全文最有意思的推论部分。作者自己提出了一个很合理的疑问：早期发育的很大部分都依赖增殖，如果 HARS 是全局性"管家"，为什么会只看到组织特异的缺陷？

答案是"母源储备会被稀释"。斑马鱼胚胎早期靠母源提供的蛋白或 tRNA 撑过最初阶段——形态olino只阻断新合成的 HARS，母源的那批不受影响。但随着细胞不断分裂，这批储备被不断稀释、不断消耗。

这就产生了一个天然的"时间闸门"：发育早期（母源储备充足）能安然度过；发育后期那些依赖新合成 HARS 的增殖细胞最先撑不住。而视网膜神经祖细胞恰好在这个窗口期同时进行大量增殖——于是成了最先崩溃的地方。

完整因果链

1. 母源储备被多轮细胞分裂逐渐稀释，或被无数蛋白的翻译消耗殆尽。

2. 发育后期、高度增殖的细胞最先出现蛋白质合成能力亏缺。

3. HARS 缺失 → 脱酰化 tRNA 积累 → 激活 eIF2α 激酶 GCN2。

4. eIF2α 磷酸化 → 翻译衰减 + CCND1 蛋白酶体降解。

5. 增殖细胞阻滞于 G1 期（G0/G1 从 52.6% 升至 63.9%）。

6. 反应持续则发生凋亡；两者叠加 → 视网膜祖细胞池被掏空 → 小眼。

7. 组织特异性来自哪里？AASR 应答在神经系统增殖区域最强——恰是 hars 高表达处。

八、这项研究的意义

1. 给"管家蛋白为何挑组织下手"提供了一个机制解释。不是管家蛋白有组织偏好，而是母源储备的稀释速度 + 局部增殖需求的组合决定了谁先崩溃。这解释了一个长期存在的困惑。

2. 建立了可药理干预的节点。AASR → GCN2 → eIF2α → CCND1 这条链上每个环节都是潜在的干预靶点。而"补回 CCND1 就能完全挽救"的结果提示，也许不必去修 HARS 本身，绕过它下游的瓶颈就够了。

3. 一个"细胞类型应激易感性"的普遍框架。作者把它与两个类似案例并列：Treacher-Collins 综合征（神经嵴细胞对 p53 更敏感）、tRNA 剪接蛋白缺陷导致的 p53 依赖神经退行。不同细胞对不同应激因子的易感性本就不同——这个概念比"某个基因管某个器官"要深一层。

4. 一个临床落点。并非所有细胞对应激的反应都相同——这正是同一个 ARS 突变会引起耳聋-失明或小头畸形、却让身体其他部位相对安然无恙的原因。理解这些差异，就有希望对症下药。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。