Bower NI, Vogrin AJ, Le Guen L, Chen H, Stacker SA, Achen MG, Hogan BM

澳大利亚昆士兰大学 ｜ 彼得·麦克卡尔姆癌症中心 ｜ 墨尔本大学

Development, 2017, 144: 507–518　doi:10.1242/dev.146969
收稿：2016-11-14　接受：2016-12-19

摘要

血管内皮生长因子（VEGFs）在发育过程中和病理条件下调控血管生成与淋巴管生成。在斑马鱼躯干部，Vegfa 通过初级血管生成调控节间动脉的形成，而 Vegfc 对次级血管生成至关重要，产生静脉和淋巴管。Vegfd 此前一直被认为在脊椎动物血管发育中是可有可无的。本研究中，我们通过基因组编辑构建了斑马鱼 vegfd 突变体。vegfd 突变体在面部淋巴管生成方面表现出显著缺陷，且这一缺陷独立于 vegfc 功能。引人注目的是，我们发现 vegfc 和 vegfd 在整个胚胎中协同调控淋巴管生成。有趣的是，我们还发现 vegfd 和 vegfc 也冗余地驱动在 Flt1 或 Dll4 缺失时观察到的动脉过度分支表型。上位性和生化结合实验提示，在初级血管生成过程中，Vegfd 是通过 Kdr（Vegfr2）而非 Flt4（Vegfr3）影响这些表型的。这些数据证明，Vegfd 并非在发育过程中可有可无，而是在血管生成和淋巴管生成中扮演情境特异性的不可或缺角色，同时也承担补偿性角色。

导言：一个被判定为"可有可无"的家族成员

VEGF 家族里有个"老三"叫 VEGFD。相比它的两个兄弟 VEGF-A（管血管生成）和 VEGF-C（管淋巴管生成），VEGFD 在发育领域一直没什么存在感——敲除小鼠活着，血淋巴内皮没毛病，双敲表型还跟单敲一样。领域里普遍的结论是：它在胚胎发育中是可有可无的。

这篇2017 年发表在 Development 的研究说：这个结论需要修正。研究者用 TALEN 在斑马鱼里敲出 vegfd 突变体，结论是——它在面部淋巴管生成中不可或缺，在躯干则是 Vegfc 的 indispensable 备份。

更有意思的是，它在动脉生成里也不是"闲人"：当 Flt1 或 Dll4 缺失导致血管过度分支时，Vegfd 和 Vegfc 会一起上场补位。

一、淋巴管是怎么长出来的？

要理解这篇论文，先要分清血管发育的三个阶段。作者在图 7 里画了一张工作模型图，非常清晰：

1. 初级血管生成（约 22 hpf）——动脉芽从背主动脉（DA）萌出形成节间动脉（aISV），由 Vegfa 主导，依赖 Kdr、Kdrl。

2. 次级血管生成（约 32 hpf）——从主静脉（PCV）萌出的芽，要么与已有 aISV 吻合形成静脉（vISV），要么不吻合、向背侧迁移形成旁索淋巴内皮细胞（PL），进而发育成躯干主要淋巴管（胸导管 TD 等）。这一阶段依赖 Ccbe1/Vegfc/Flt4 通路。

3. 面部淋巴管生成（至 5 dpf）——从总主静脉（CCV）出发，形成外侧面部淋巴管（LFL）、内侧面部淋巴管（MFL）和耳石淋巴管（OLV）。这里就是 Vegfd 登场的地方。

图 7 ｜ 工作模型：斑马鱼中 Vegf 信号介导血管生成和淋巴管生成的主要贡献因素方括号内标注的因子发挥冗余或补偿作用；不在方括号内的因子则是不可或缺的。躯干淋巴管生成（上排左、中）：旁索 LEC 形成与 TD 发育需要 Vegfc（Vegfd）、Ccbe1、Flt4。Vegfd 可补偿减少的、但不能补偿完全缺失的 Vegfc。面部淋巴管生成（上排右）：LFL 与 MFL 的形成中 Vegfd 不可或缺，而 OLV 不是（后者仅依赖 Vegfc）。vegfc 与 vegfd 的 combined 基因剂量对完整面部淋巴管网络是必不可少的。初级血管生成（下排）：野生型中发育正常需要 Vegfa（Vegfc、Vegfd 为冗余）；而 flt1 MO 或 dll4 MO 条件下的过度分支表型，则由 Vegfa、Vegfc、Vegfd 共同驱动。缩写：DLAV 背侧纵行吻合血管；DA 背主动脉；PCV 后主静脉；TD 胸导管。

二、造一个"真的没有 Vegfd"的斑马鱼

要证明一个基因重要，得先有一个可靠的"把它彻底删掉"的模型。作者用TALEN 在 vegfd 编码区第 162 位造了一个 7 bp 缺失，在第 65 个氨基酸处引入终止密码子——位置恰好在 VEGF 同源域（VHD）之前，功能域被整个切掉。

三项验证确认这是个可靠的无功能等位基因：

1. 纯合突变体躯干的 aISV、vISV 数量和 TD 延伸范围与野生型毫无差异；成体可存活、可育。

2. 突变胚胎 vegfd mRNA 不足野生型的 50%——存在无义介导降解（NMD），符合无功能突变特征。

3. 最关键的一步：反向验证。此前只知道"敲低 Vegfd 能救回 vegfc 突变体的面部淋巴管缺陷"，作者做了镜像实验——往 vegfd 突变胚胎里注入 vegfc MO。结果 vegfd 突变体明显富集在"MFL 和 LFL 完全缺失"的严重类别中，确证这些突变体确实不表达有功能的 Vegfd。

图 1 ｜ vegfd 调控面部淋巴管生成。A 用于靶向 vegfd 的正向（红）与反向（蓝）TALEN 诱导了 7 bp 缺失，命名为 uq9bh 等位基因。B 该等位基因在第 65 个氨基酸处产生提前终止密码子，位于 VEGF 同源域之前。C, D 5 dpf 野生型（C）与 vegfd 突变胚胎（D）的躯干共聚焦图像，血管（绿）、淋巴管（红）、神经元（蓝）。关键读法：两者躯干表型无明显差异——这正是"vegfd 在躯干可有可无"的证据。E–H vegfd 成年突变体（G、H）与同窝（E、F）相比无明显缺陷。J–N′ 5 dpf 胚胎的面部区域共聚焦图像（negfp 标所有细胞核，绿；lyve1b:dsRed 标淋巴管，红）。从左到右 vegfc 基因剂量递减：J 为双野生型，K 中 LFL/MFL 已见星号（LEC 减少），L、M 星号更多，N（双突变）中面部淋巴管发育完全失败。箭头标示正常的 MFL、LFL 和 OLV。O–Q 各面部淋巴管的 LEC 数量定量。O（LFL）与 P（MFL）在各基因型组合间均有显著差异；Q（OLV）则完全无差异——OVL 纯由 vegfc 决定。数据为均值 ± s.e.m.；P<0.001，P<0.01，P<0.05，单因素 ANOVA，三个独立胚胎批次。

三、发现一：面部淋巴管缺 Vegfd 不行

把 vegfd 突变体和已有的 vegfcu5055 亚功能突变体杂交，逐一计数面部各条淋巴管里的内皮细胞核数量，得到两个很清晰的结论：

1. 即使 vegfc 基因剂量完全正常，vegfd 突变体的 LFL 和 MFL 细胞核数量也显著少于野生型。这是 Vegfd 独立于 Vegfc 的功能——面部淋巴管的 LFL 和 MFL 真的离不开它。

2. vegfcu5055 杂合背景下，vegfd 纯合或杂合突变体的 LFL 和 MFL 细胞核都明显更少。但耳石淋巴管（OLV）完全不受 vegfd 影响——它纯由 vegfc 决定。

四、发现二：躯干里 Vegfd 是 Vegfc 的"备份"

躯干的情况正相反：vegfd 纯合突变体的胸导管（TD）完全正常。那它是不是真没用了？

作者把问题变成：如果先削弱 Vegfc，再看 Vegfd 还有没有用？在 vegfcu5055 杂合背景下，答案立刻出现：

1. vegfcu5055 野生型背景下——删掉一份或两份 vegfd，毫无淋巴管表型。

2. vegfcu5055 杂合背景下——vegfd 突变体的旁索 LEC 数量显著减少，胸导管 TD 的延伸范围也显著缩短。

Vegfd 能补偿"减少的 Vegfc"，但补偿不了"完全没有的 Vegfc"——这是备份该有的逻辑。

图 2 ｜ Vegfd 参与旁索淋巴内皮细胞的发育。A–C 54 hpf 时 vegfcu5055、vegfd 突变胚胎中旁索 LEC（PL）存在（箭头）或缺失（星号）的代表性共聚焦图像。三列分别为 vegfc+/− vegfd+/+、vegfc+/− vegfd+/−、vegfc+/− vegfd−/−。D–F PL 形成的定量。D（vegfc 野生型背景）中三组无差异——印证 Vegfd 在此可有可无；E（vegfc 杂合背景）中 vegfd 纯合（n=42）和杂合（n=112）突变体形成的 PL 显著少于野生型（n=63）（P<0.001）；F（vegfc 突变背景）不再有额外互作。误差线为均值 ± s.e.m.，单因素 ANOVA，三个独立胚胎批次。

图 3 ｜ Vegfd 参与斑马鱼躯干胸导管的发育。A–F 5 dpf 时胸导管（TD，箭头）形成的共聚焦图像。A、B：vegfd 突变体中 TD 形成正常；C–F：vegfc 突变体中 TD 表型可变，从完全缺失（C）到很轻微（D）不等，而叠加 vegfd 突变后 TD 形成进一步减少（星号）。G–I 9 个体节中 TD 延伸范围的定量。G（vegfc 野生型）中三组无差异；H（vegfc 杂合）与 I（vegfc 突变）中 vegfd 突变体形成的 TD 均显著少于杂合和野生型。数据为均值 ± s.e.m.；P<0.05，Kruskal–Wallis 检验，三个独立胚胎批次。J–K′ 5 dpf 双荧光胚胎中 TD 形成的共聚焦图像：vegfc 突变/vegfd 野生型形成 TD 碎片（J、J′），而双突变体（K、K′）中碎片消失。比例尺，50 µm。L J–K′ 的定量。在 vegfc 突变背景下，vegfd 突变胚胎（n=14）TD 中的细胞核数量显著少于杂合（n=21）和野生型（n=13）。数据为均值 ± s.e.m.；P<0.01，单因素 ANOVA。M–O 与 flt4 的互作。在 flt4^hu4602 杂合背景下，vegfd 突变体的 TD 形成也显著减少——说明 flt4 突变与本身不产生 TD 表型的 vegfd 突变发生显性互作。P<0.01，P<0.05，Kruskal–Wallis 检验。

五、发现三：走的是 Kdr，不是 Flt4

在躯干动脉发育中，Vegfa 独占主导，Vegfc 也能插手。但 Vegfd 此前从没被牵涉进来。这里作者用了一个很干净的策略：把受体逐一敲掉，看谁能让 vegfd 的表型消失。

往斑马鱼里注入 vegfd mRNA 会导致 28–32 hpf 时节间动脉发生"双侧转向"——血管长歪了。结果：

1. 敲 kdr（Vegfr2）→ 表型被挽救。

2. 敲 kdrl（另一个 Vegfr2 旁系同源基因）→ 挽救失败。

3. 敲 flt4（Vegfr3）→ 挽救失败。

而同样的实验换成 vegfc mRNA，敲 kdr 救不回来，必须敲 flt4 才行。两个配体都导致血管长歪，但走的是两条完全不同的受体通路。

图 4 ｜ vegfd mRNA 注射以 Kdr 依赖方式诱导动脉缺陷。A–F 向 Tg(fli1a:egfp) 胚胎注入 vegfd RNA 导致 28–32 hpf 时 aISV 双侧转向（箭头）（A、B）。C、D：该表型被共同注射 kdr 形态olino挽救；E、F：flt4 形态olino无法挽救。G, H flt1 形态olino与 vegfd RNA 共同注射使 aISV 双侧转向进一步增加（n=20），多于仅注射 vegfd RNA（n=31）或仅注射 flt1 MO（n=29）。I, J 上述实验的定量。数据为均值 ± s.e.m.；P<0.0001，P<0.001，单因素 ANOVA，数据来自三次独立注射。K 未注射与 vegfd mRNA 注射胚胎的 qPCR 分析。关键读法：fli1a、kdr、kdrl、flt4、flt1、dll4、vegfaa、vegfab 的 mRNA 水平均无显著变化——排除了"受体表达量改变"这一替代解释。

遗传学证据指向 Kdr，作者接着用生化实验直接验证：斑马鱼 Vegfd 能不能结合 Kdr？

1. 先确认斑马鱼 Vegfd 能被蛋白酶切割加工——在人 HEK293T 细胞中表达全长蛋白，Western blot 检出约 47、36、15 kDa 三条带，分别对应全长、含 N 端前肽+VHD 的部分加工形式、以及仅剩 N 端前肽的形式。

2. 沉淀实验给出决定性答案：成熟 Vegfd 能结合 Kdr 的胞外结构域，不能结合 Kdrl。与上位性数据完全吻合。

图 5 ｜ 斑马鱼 Vegfd 被蛋白水解加工并结合 Kdr。A 斑马鱼 Vegfd 及其衍生物的结构域示意图。SS 为分泌信号序列；N-pro、C-pro 为 N 端和 C 端前肽；VHD 为 VEGF 同源域；圈起的 F 为 FLAG 标签。zVegf-d-FULL-N-FLAG 为全长（N 端带 FLAG），zVegf-dΔNΔC-FLAG 为仅保留 VHD 的成熟形式。B Western blot 检测 HEK293T 细胞条件培养基中的产物。左：全长蛋白检出约 49、38、15 kDa 三条带，分别对应「FLAG-N-pro+VHD+C-pro」「FLAG-N-pro+VHD」「FLAG-N-pro」——证明斑马鱼 Vegfd 能被蛋白水解加工。右：成熟形式检出约 21–28 kDa 条带（FLAG-VHD），与成熟人/小鼠 Vegfd 大小预期相符。C 受体结合分析。左panel：用 zKdr-Fc 沉淀可检出 FLAG-VHD 条带，而用 zKdrl-Fc 沉淀则无——证明成熟 Vegfd 结合 Kdr 而不结合 Kdrl。中panel 为阴性对照（无 Vegfd）。右panel 用抗 Fc 抗体确认各沉淀中 Ig 融合蛋白量相当（约 150 kDa），排除技术差异。

六、发现四：Dll4 和 Flt1 双重压制它

动脉发育里有两套刹车系统：Notch 配体 Dll4 和受体 Flt1。两者缺失都会导致节间动脉过度分支——以前认为这是 Vegfc 单独驱动的事件。

作者分别敲低 Dll4 和 Flt1，再叠加 vegfc／vegfd 突变，结果很有意思：

1. 单独 vegfd 突变体的过度分支没有减少——说明 Vegfd 平时并不能独自驱动过度分支。

2. 但 vegfc、vegfd 双突变体中，无论敲 Dll4 还是敲 Flt1，过度分支都显著少于单突变。

结论：Dll4 和 Flt1 同时压制 Vegfc 和 Vegfd 的信号，而 Vegfc 才是主要驱动力，Vegfd 起补偿作用。

图 6 ｜ Dll4 和 Flt1 抑制发育中节间动脉内的 Vegfc 和 Vegfd 信号。A–D 3 dpf 未注射野生型（A）、dll4 MO 注射对照（B）、dll4 MO 注射的 vegfcu5055 突变体（C）、dll4 MO 注射的 vegfcu5055、vegfd 双突变体（D）。箭头标示过度分支（多支血管）。E 定量。双突变体（n=20）过度分支的 aISV 显著少于 vegfcu5055 单突变体（n=15）——说明 Vegfd 在此起补偿作用。F–J 与 flt1 MO 的同类实验。J：flt1 MO 注射的 vegfcu5055、vegfd 双突变体（n=34）过度分支显著少于 vegfc 杂合背景下的 vegfd 杂合（n=75）和野生型（n=23）；在 vegfc 突变背景下 vegfd 突变体（n=14）同样显著更少。K–N dll4 突变体与 flt1 MO 的互作：未注射野生型（K，n=21）、未注射 dll4^uq10bh 杂合（K 右，L，n=22）、flt1 MO 注射野生型（M，n=37）、flt1 MO 注射 dll4 杂合（N，n=29）。O 定量。dll4 杂合本身不表现过度分支，但显著增强了 flt1 MO 诱导的过度分支——证明 Flt1 与 Dll4 通路在遗传上相互关联。数据为均值 ± s.e.m.；P<0.0001，P<0.01，P<0.05，单因素 ANOVA，三次独立 MO 注射。

七、机制总结

把 Vegfd 在不同情境下的角色理一遍，可以归成四条：

1. 面部淋巴管生成：Vegfd 不可省略——LFL 和 MFL 的形成绝对依赖它，与 Vegfc 剂量无关；OLV 则只认 Vegfc。

2. 躯干淋巴管生成：Vegfd 是 Vegfc 的备份——Vegfc 充足时无所谓，Vegfc 减少时顶上，Vegfc 完全缺失时无能为力。

3. 躯干动脉过度分支：Vegfc 主导，Vegfd 补偿；两者同时被 Dll4 和 Flt1 压制。

4. 受体选择：在动脉中 Vegfd 走 Kdr（且能生化结合），Vegfc 走 Flt4——两个配体表型相似，机制却不同。

八、这项研究的意义

1. 修正了一个教科书级结论。"VEGFD 在发育中可有可无"是基于敲除小鼠得出的。而斑马鱼的结论是：它在面部淋巴管生成中不可替代。跨物种的表型差异提示，物种间可能存在我们尚未察觉的机制差别——作者也呼吁在双敲小鼠模型中重新仔细定量。

2. 直接的临床关联。已知约 30% 的遗传性淋巴水肿由 Ccbe1/Vegfc/Vegfr3（Flt4）通路突变引起。如果 Vegfd 的变异能修饰这条通路表型，就意味着它可能影响患者的预后——这是一个可以直接用于遗传咨询的方向。

3. 一个物种差异的线索。人 VEGFD 能结合 VEGFR2，小鼠的不能，但斑马鱼 Vegfd 能结合 Kdr（Vegfr2）。这让斑马鱼成为研究 VEGFD/VEGFR2 信号的一个特别有用的替代模型——而且已有独立证据显示斑马鱼 Vegfd 能挽救 Vegfaa 突变体。

4. 一个悬而未决的问题。Shin 等发现斑马鱼面部淋巴管的 Prox1 诱导可以不依赖 Flt4，而躯干则必须依赖 Vegfc/Flt4。结合本文发现，"面部与躯干的淋巴管生成可能走不同机制"这一线索越来越强，Vegfd 在其中的角色值得继续挖。

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