Ruth C. Thomas, Ringaile Zaksauskaite 等

英国谢菲尔德大学

Nucleic Acids Research, 2024, 52(18): 11014–11028　doi:10.1093/nar/gkae725
原题：Second generation lethality in RNaseH2a knockout zebrafish
通讯作者：Freek J. van Eeden, Sherif F. El-Khamisy　|　提前在线发表：2024-09-01

导读

生物学的常识是：基因敲除的表型应该从这一代开始显现。但这项研究造出了一个"违反常识"的斑马鱼模型——纯合敲除的个体能长到成年、外表毫无异常，可它们的孩子却全部在胚胎期死亡，而且越补上正常的基因，情况反而越糟。

一句话看懂这篇论文

1 第一个能活到成年的 RNaseH2a 纯合敲除斑马鱼模型——此前所有敲除模型都在胚胎期死亡。

2 真正的杀伤来自下一代：亲代把 rNMP 传给了后代，父源（精子带入）比母源（卵子带入）死得更早。

3 最反直觉的一点：补上一个正常的 RNaseH2 等位基因，会让情况更糟——这被称为核糖核酸生成病（ribodysgenesis）。

核心发现

研究揭示了一个此前只在酵母中描述过的现象——核糖核酸生成病（ribodysgenesis）：当大量被错误掺入 DNA 的核糖核苷酸（rNMP）遇上活跃的 RNaseH2 酶，酶会疯狂切割这些位点，产生海量无法修复的中间产物，最终导致 DNA 碎裂、胚胎致死。补酶不是救命，而是催命。

一、研究背景：DNA 里混进了不该有的核糖核苷酸

维持基因组稳定是生物体生存的前提。而 DNA 中掺入核糖核苷酸单磷酸（rNMP）是数量最多的 DNA 损伤形式之一——原因很简单：真核细胞内核糖核苷三磷酸（rNTP）与脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）的比例本就悬殊，加上 DNA 聚合酶无法完全排斥 rNMP，在非同源末端连接（NHEJ）等过程中甚至会有意掺入 rNTP。

rNMP 带着活跃的2′-羟基基团，比 dNMP 更容易自发水解。若不加清除，DNA 断裂数量会激增，基因组稳定性急剧下降。

RNaseH2：专职的"核糖核苷酸清道夫"

清除 rNMP 主要由核糖核酸酶 H（RNaseH）家族承担。其中 RNaseH1 只能处理连续 4 个以上 rNMP，而 RNaseH2 能从双链 DNA 中切除单个 rNMP：它在核糖核苷酸的 5′ 侧切开 DNA 链，形成 3′-羟基端和 5′-磷酸核糖核苷酸端，随后由 FEN1/Exo1 切除悬垂片段，DNA 连接酶填补并封口。

RNaseH2 是一个异三聚体复合物，由催化亚基 A 和两个辅助亚基 B、C 组成，三者缺一不可。而 Aicardi-Goutières 综合征（AGS）——一种早发型 I 型干扰素病，表现为不受控制的 I 型干扰素反应，类似系统性红斑狼疮和先天性病毒感染——正是由 RNASEH2A/B/C 三个基因之一的突变引起。超过一半的 AGS 患者的突变就落在这三个基因上。

近年研究提示：真正驱动 AGS 严重神经病理表型（小头畸形、癫痫、颅内钙化）的，可能是全身性的 DNA 损伤，而非炎症标志物本身。

问题在于：迄今所有 RNaseH2 各亚基的纯合敲除动物模型，都无法存活过胚胎期（小鼠模型在胚胎早期即致死）。研究者因此想：能否造出一个能活到成年的模型，来研究缺乏 RNaseH2 时的补偿通路？

二、结果一：奇迹般存活的纯合敲除鱼

斑马鱼与人只有一个 RNaseH2A 直系同源基因，蛋白相似度极高（斑马鱼 307 个氨基酸，人 302 个）。WISH 检测显示 rnaseh2a 在 24 hpf 野生型胚胎中全身表达，头部尤为突出，与小鼠的表达谱一致。

研究者用 CRISPR/Cas9 在外显子 6 造成 49 bp 缺失，产生提前终止密码子，截短蛋白仅 205 aa（原蛋白约前 159 aa + 46 个无关氨基酸的 C 端尾巴）。该突变删除了高度保守的序列，包括已被证实对 RNaseH2a 功能必需的氨基酸，以及一个预测与核糖核苷酸游离羟基接触的关键酪氨酸（斑马鱼 Y211）——因此是一个可靠的功能完全丧失（null）突变。

建立稳定纯合系后，结果令人意外：rnaseh2a−/− 鱼在胚胎期和成年期都没有明显外部表型，并以孟德尔比例出生（χ² = 2.66，df = 2，P = 0.529）。这与此前所有 RNaseH2 敲除模型的早期胚胎致死形成鲜明对比。

图 1 ｜ rnaseh2a−/− 敲除斑马鱼的建立与初步表征。（A）斑马鱼（Dr）与人（Hs）RNaseH2a 蛋白比对。灰色标出因突变而丢失的氨基酸，红色标出最后一个同源氨基酸；星号标示人 AGS 突变位点，红色标出关键酪氨酸。（B）WISH 显示野生型 24 hpf 胚胎中 RNaseH2a 广泛表达，下方为正义探针对照。（C）利用 CRISPR/Cas9 在外显子 6（红色）造成 49 bp 缺失，下方列出外显子 6 序列，红色为被删除碱基；该缺失导致提前终止密码子，产生 205 aa 的截短蛋白。（D）rnaseh2a+/− 杂交的子代无可见表型，可发育至成体且无外部表型。注：斑驳的色素沉着源于实验室斑马鱼的背景突变。（E）24 hpf 时 rnaseh2a 突变呈纯合隐性遗传，符合孟德尔分离比（χ² = 2.66，自由度 2，双尾 P = 0.529）。

但真正的故事，藏在这些"看起来一切正常"的成鱼的下一代替代里。

三、结果二：子代胚胎的全面崩溃

rnaseh2a−/− 自交产生的子代（母源-合子型 MZ）是胚胎致死的。受精后数小时看似正常，随后生长放缓，24 hpf 时头尾生长受抑，并出现大量凋亡细胞（吖啶橙染色）。

证据一：酶活没了

由于缺乏能识别斑马鱼 RNaseH2 的抗体，研究者改用酶活检测——用含单个 rNMP 并带荧光标记的双链 DNA 底物与胚胎裂解液孵育，监测 RNaseH2 切割产物。结果：MZ 胚胎切割 rNMP 的效率显著低于野生型。

证据二：DNA 里确实积了更多 rNMP

碱性检测（alkaline assay）：在碱性条件下，rNMP 会因 5′-OH 基团而自发水解，使 DNA 断成小片段。MZ 胚胎处理后出现显著更多的小片段，说明 rNMP 含量更高。

证据三：DNA 真的断了

用双链 DNA 断裂标志物 γH2AX 检测，MZ 胚胎尾部出现显著更多的 γH2AX 焦点，且尾部形态严重发育不良。

证据四：炎症通路被点亮

大量 DNA 断裂与片段化，理论上会让核 DNA 移入细胞质，激活 cGAS-STING 通路，进而上调干扰素刺激基因——这正是 AGS 患者的特征。qPCR 证实：MZ 胚胎的干扰素刺激基因 ISG15、mxa 与衰老标志物 p21 显著升高。

图 2 ｜ rnaseh2a−/− 成鱼的子代出现发育缺陷、DNA 损伤与炎症激活。（A）24 hpf 胚胎的吖啶橙染色检测凋亡细胞（绿色），来自纯合与野生型自交。（B）（A）中吖啶橙阳性细胞定量。非配对 t 检验，P < 0.0001，±SD（n = 12，单个胚胎）。（C）单核糖核苷酸切割实验示意图。（D）24 hpf 胚胎全胚裂解液与含单个核糖核苷酸的双链 DNA 底物孵育，阳性对照为纯化 RNaseH2、阴性对照为裂解液，DNA 以 Cy5 标记。（E）切割活性（%）定量，±SD，单因素方差分析，P < 0.05（n = 3，20 个胚胎混样）。（F）24 hpf 胚胎 DNA 碱处理（NaOH）与对照（NaCl）凝胶电泳。（G）（F）的 R 语言密度曲线。（H）长片段与短片段比值定量，Student t 检验，P < 0.01，±SEM，n = 3。（I）24 hpf rnaseh2a−/− 胚胎尾部的 γH2AX 染色（绿色），细胞核用 DAPI 染（蓝色）。（J）单个胚胎尾尖中每个细胞核的 γH2AX 焦点数定量（每胚胎 >100 个细胞核，每基因型 3–4 例），红线为每胚胎均值与 SEM。非配对 t 检验，Welch 校正，P < 0.001，n ≥ 3。（K）干扰素刺激基因（ISG15、mxa、IFNΦ）、促炎反应标志物（TNFα、IL1β、IL6）与衰老标志物（p21）的 qPCR 结果。P < 0.0001，P < 0.001，P < 0.01，±SD（n = 3，20 个胚胎混样）。

四、结果三：成鱼为什么能活下来？

回到那个问题：rnaseh2a−/− 成鱼究竟靠什么活着？酶活检测给出了第一个答案：成鱼的 RNaseH2 切割能力与野生型完全相同。这意味着要么存在某个特定的早期胚胎需求（正常情况下由卵母细胞中的母源 RNA 或蛋白提供），要么有一条被上调的次级机制接管了 rNMP 的清除。

但碱性检测显示，成鱼脑组织中 rNMP 含量确实更高，而在 5 dpf 胚胎中则没有差异。换言之，rNMP 的掺入是随发育时间逐渐累积的，而非一开始就存在。

更微妙的是：5 dpf 的 rnaseh2a−/− 胚胎没有更多的双链 DNA 断裂（γH2AX 阴性），成鱼脑组织中也没有显著的 γH2AX 升高；脑、肠、睾丸的炎症标志物全部正常。换句话说，虽然 rNMP 在累积，却没有造成可检出的 DNA 损伤，这正是它们躲过早期致死的原因。

图 3 ｜ rnaseh2a−/− 成鱼核糖核苷酸掺入增加，但无明显炎症反应。（A）成鱼脑组织的 RNaseH2 活性实验。（B）5 dpf 胚胎的活性实验。（C）脑组织切割活性定量，±SD，单因素方差分析，P < 0.05，n = 3。（D）d5 胚胎切割活性定量，±SD，单因素方差分析，P < 0.05，n = 3。（E）成鱼脑 DNA 经碱处理后凝胶拖尾，显示纯合成鱼中核糖核苷酸增加。（F）成鱼脑碱处理定量，长短 DNA 片段比值显著降低，Student t 检验，n = 3 ± SEM，P < 0.05。（G）5 dpf 胚胎 DNA 碱处理，纯合胚胎无明显拖尾增加。（H）5 dpf 胚胎碱处理定量，Student t 检验，n = 3 ± SEM。（I）杂合自交来源 5 dpf 胚胎尾部的 γH2AX 染色，每细胞核焦点数在 rnaseh2a−/− 与 +/+ 同胞间无显著差异，Student t 检验，n = 3，P < 0.05。（J）个体成鱼脑样本的 γH2AX 免疫印迹，rnaseh2a−/− 与 +/+ 之间无显著差异，Student t 检验，±SD，P < 0.05，n = 3。（K）19 月龄 rnaseh2a−/− 成鱼的脑、肠、睾丸组织，以及杂合自交的 5 dpf rnaseh2a−/− 胚胎中，干扰素刺激基因（ISG15、mxa、IFNΦ）、炎症反应基因（TNFα、IL1β、IL6）与衰老标志物（p21）的表达水平。多次非配对 t 检验，Welch 校正，P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，P < 0.0001，±SD（n = 3）。

五、结果四：补上正常基因，反而更糟

既然是母源来源的表型，那么把 rnaseh2a−/− 雄鱼与野生型雌鱼杂交，子代应该恢复正常才对。事实完全相反：

表 1　三种杂交组合的子代表型

三种组合的胚胎都强烈上调了 Δ113p53——一种 DNA 损伤特异型的 p53 亚型。注射 p53 吗啉反义寡核苷酸可以显著延缓这些缺陷，证明凋亡信号是胚胎死亡的关键环节。

为什么父源型最严重？

精子向合子只贡献两样东西：一个中心粒和一份基因组 DNA。中心粒对卵裂至关重要，且实验显示未受影响——所以问题只能出在 DNA 上。

当胚胎来自野生型母本时，它已经拥有活跃的母源 RNaseH2a。这个酶遇上父亲精子带来的一大批 rNMP，就会疯狂切割，产生大量 DNA 损伤事件——远超修复系统的处理能力，进而触发 p53 上调与细胞死亡。

母源型（M）的逻辑则稍有不同：卵子带来的 rNMP 已经很多，而父本提供的 DNA 在合子中要等到中囊胚转换（MBT，约受精后 3 小时）才开始转录。也就是说，在 1000 细胞期之前，胚胎内几乎没有 RNaseH2a。但一旦合子来源的 rnaseh2a mRNA 被翻译，酶就会遇上那堆积如山的 rNMP，开始大规模切割——所以母源型胚胎死得比父源型晚一点，但依然致命。

最直接的验证

向 0 dpf 胚胎注射有活性的 rnaseh2a mRNA，24 hpf 时胚胎发育比对照（失活 mRNA 或不注射）显著更差；而把同样的 mRNA 注射进杂合自交的纯合胚胎，却不会出现这一表型——因为它们本来就没有继承到额外的 rNMP。

此外，rnaseh2a−/− 雄鱼的睾丸 DNA 对碱性条件明显更敏感，短片段更多，说明配子中 rNMP 数量更高。一旦生殖细胞中的 rNMP 超过某个阈值，快速分裂的胚胎就再也无力应对。

图 4 ｜ 重新引入 RNaseH2a 无法挽救发育表型。（A）与 rnaseh2a−/− 纯合亲本进行不同杂交组合所得的胚胎。（B）各种纯合亲本组合下胚胎的存活曲线（n = 110）。（C）各亲本杂交导致有害表型的预测机制示意图。（D）DNA 损伤敏感型 p53 报告基因（Δ113p53）的 RT-qPCR 分析，所有含纯合亲本的胚胎均显著上调，±SD，单因素方差分析，P < 0.001（n = 3，20 个胚胎混样）。（E）显微注射 RNaseH2a mRNA 导致 rnaseh2a−/− 自交胚胎表型较对照或未注射胚胎更严重；野生型自交胚胎未注射。（F）胚胎体长定量，±SD，双因素方差分析，P < 0.0001（n = 16）。（G）成鱼睾丸 DNA 碱处理凝胶，显示 rnaseh2a−/− 成年雄鱼中核糖核苷酸增加。（H）成年斑马鱼睾丸碱处理的密度图。（I）碱处理后长片段与短片段比值在 rnaseh2a−/− 睾丸中显著降低，Student t 检验，n = 3 ± SEM，P < 0.05。（J）显微注射 p53 吗啉反义寡核苷酸可明显改善所有含一个或两个纯合亲本胚胎的发育（注射胚胎与（A）中所示为同一批次）。

六、结果五：rNMP 的累积会偷走运动能力

成年 rnaseh2a−/− 鱼虽然外观正常，但运动量已经出现差异：15 月龄个体的 3 小时总移动距离为 59 m，野生型同胞为 82 m。而 5 dpf 胚胎的光运动反应没有差异。

更值得注意的是亲本年龄效应：来自 12 月龄亲本的 MZ 胚胎，发育程度显著差于来自 6 月龄亲本的胚胎，ISG15 表达也更高。这说明 rNMP 在生殖细胞中的累积是一个随年龄持续推进的过程。

图 5 ｜ 年龄更大的 rnaseh2a−/− 成鱼，其后代发育更差。（A）成年斑马鱼运动分析显示 rnaseh2a−/− 的移动距离显著短于 rnaseh2a+/+ 成鱼。非配对 t 检验，n = 10，单个个体，±SD，P < 0.001。（B）rnaseh2a+/− 亲本来源胚胎的光运动反应，rnaseh2a+/+ 与 rnaseh2a−/− 的移动距离无显著差异，±SD，非配对 t 检验。（C）6 月龄与 12 月龄 rnaseh2a−/− 斑马鱼后代的代表性图像。（D）老龄与年轻斑马鱼后代胚胎长度定量，n = 36，单个胚胎，非配对 t 检验，P < 0.0001。（E）RT-qPCR 显示来自老龄 rnaseh2a−/− 成鱼的胚胎中 ISG15 表达升高，n = 3，20 个胚胎混样，非配对 t 检验，P < 0.05。

七、结果六：TOP1 不是那个"救场"的机制

如果 RNaseH2 缺失时存在次级修复通路，最有力的候选者是 DNA 拓扑异构酶 I（TOP1）。TOP1 的主职是缓解 DNA 的扭转应力：切开后它与 DNA 形成共价复合物（TOP1-cc），再通过断裂共价键重新连接。

在缺乏 RNaseH2 时，TOP1 仍能移除 rNMP，但方式错误率高：它切开 rNMP 造成一个无法直接连接的单链缺口，再在上游切第二次，可能导致链重排并形成典型的"ID4 特征"——2–5 bp 的插入缺失大量出现，这是许多癌症的关键突变标志。

研究者用 CRISPR 同时敲除 top1 和 top1l，结果 rnaseh2a−/− 胚胎并不比野生型同胞更受影响。用 TOP1 抑制剂喜树碱（CPT）处理也没有让突变体更敏感；在 MZ 胚胎中敲除 TOP1 也无法挽救其发育缺陷。

全基因组测序也证实了这一点：MZ 胚胎中 2–5 bp 缺失并未显著增加，没有出现预期的 ID4 特征。此外，细胞系中 RNaseH2 缺失与 PARP/ATR 抑制存在合成致死，但在斑马鱼中，ATR 抑制剂与 PARP 抑制剂都没有让 rnaseh2a−/− 胚胎更脆弱；羟基脲（提高 rNMP/dNMP 比值）也未造成敏感化；敲低 rnaseh1 同样没有可检测表型。

结论是：TOP1 不是让这些鱼活下来的原因，一定还有别的机制在起作用。

八、讨论：一个此前只在酵母中出现的名词

此前 RNaseH2 各亚基的动物模型共享同一个表型：早期胚胎致死，源于 rNMP 累积、DNA 损伤增加，进而诱导 I 型干扰素反应。这项研究造出的模型之所以珍贵，正因为它是第一个能活过胚胎期的 RNaseH2a 体内敲除模型，而且同基因型的成体与后代之间存在鲜明反差。

研究者更倾向于这样的解释：RNaseH2a 缺失后确实存在一条次级 rNMP 清除机制，但它远不如 RNaseH2 高效，因而被持续涌入的 rNMP 缓慢压垮。母源贡献虽然可能有一定帮助，但母源 mRNA 在中囊胚转换后同样被主动清除，很难想象细胞在此后经历的大量分裂能在毫无替代机制的情况下安然度过。

至于后代为何全部死亡，答案指向核糖核酸生成病（ribodysgenesis）：这是 2022 年在酿酒酵母中被命名的现象——活跃的 RNaseH2 接触到基因组中大量嵌入的 rNMP 时，会引发大规模切割，产生数量庞大的修复中间体，超出下游修复步骤（FEN1/EXO1 与 DNA 连接酶）的处理能力，最终导致基因组瞬间失稳。

这也解释了为什么"补酶"会让表型恶化：酶不是解药，而是导火索。该模型因此提供了一个"敏化"的遗传背景，有助于未来鉴定这条替代性 rNMP 清除通路的分子本质。

图形摘要 ｜ 核糖核酸生成病（ribodysgenesis）模型。野生型雌鱼的卵母细胞提供 RNaseH2；rnaseh2a−/− 雄鱼的精子携带大量核糖核苷酸（rNMP）。受精后，活跃的 RNaseH2 遇上高丰度 rNMP，触发核糖核酸生成病（ribodysgenesis），DNA 大量碎裂，最终导致胚胎致死。

九、结论

研究建立了一个可存活至成年的 rnaseh2a−/− 斑马鱼系，该品系从胚胎期到成年期持续累积 rNMP。这些 rNMP 会被传递给来自纯合亲本的任何后代，造成基因组不稳定与早期胚胎致死。

研究进一步显示：加入一个正常的 RNaseH2 等位基因会加重表型——因为这等于在高 rNMP 背景中引入了活跃酶，触发核糖核酸生成病。此外，表型的严重程度随亲本年龄增加而上升。研究同时预测：存在一条不依赖 TOP1 的次级 rNMP 清除机制，使纯合个体得以存活。

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