Wenyi Yang, Mingjian Peng 等

上海海洋大学 水产种质资源库

Development, 2025, 152: dev204307　doi:10.1242/dev.204307
原题：Deletion of hepcidin disrupts iron homeostasis and hematopoiesis in zebrafish embryogenesis
通讯作者：胡鹏、陈良标　|　处理编辑：Samantha Morris

导读

铁是造血的原料，但身体里管着"铁往哪走"的开关一旦失灵，问题会从肝脏一路传到血液里。这项研究首次把铁调素（hepcidin）缺失与斑马鱼胚胎的造血失败直接联系起来，并回答了一个此前没人讲清楚的问题：母体传下来的铁，如何在胚胎血液里变成致命的铁死亡（ferroptosis）。

一句话看懂这篇论文

1 斑马鱼敲除铁调素基因 hamp 后，胚胎出现母源铁过载，血红蛋白基因被压低、血红蛋白含量骤降 75.4%。

2 单细胞测序锁定了一群本不该存在的血管母细胞——它们是被铁死亡卡住、无法继续分化的血祖细胞。

3 机制层面还挖出两层：母体传下来的铁是起点，hbbe1.1 的异常剪接是让血红蛋白装不好的第二道锁。

研究团队做了什么

研究团队用 CRISPR/Cas9 敲除斑马鱼 hamp 基因，发现胚胎出现母源铁过载、血红蛋白基因被显著压低、血液祖细胞发生铁死亡并发育延迟；单细胞测序进一步锁定了一群"卡住"的血管母细胞（hemangioblast），并发现 hbbe1.1 基因的异常剪接是血红蛋白无法成熟的另一层原因。

一、研究背景：一个"铁调素"，管着全身的铁

铁调素（hepcidin，基因名 hamp）是由肝脏合成的一类富含半胱氨酸的抗菌肽，属于防御素蛋白家族，在哺乳类、两栖类和鱼类中都存在。它的核心作用是调节全身性铁稳态：通过与细胞膜上的铁输出蛋白铁调素受体 ferroportin（slc40a1）结合，在 E3 泛素连接酶 RNF217 的介导下促使其降解，从而把铁"锁"在细胞里。

在小鼠中敲除 hamp 会导致多组织铁沉积、血清铁升高、严重的遗传性血色病（hemochromatosis）以及铁死亡相关的肝损伤。除了铁代谢，hamp 还参与炎症调控、缺氧应答与骨发育，甚至在肠道黏膜修复中通过调节铁代谢影响菌群。

但一个关键问题始终悬而未决：在胚胎发育过程中，母体的铁调素到底如何影响子代的造血分化？

斑马鱼造血的"两波次"

斑马鱼的造血过程与哺乳动物高度相似，分为两波：

• 原始造血（primitive hematopoiesis）：约在受精后 11 小时（11 hpf）启动，源于侧板中胚层（LPM），在 3–5 体节期由后部 LPM 产生原始红系前体，24 hpf 时形成中间细胞团（ICM）与后部血岛（PBI）。这一波产生的红细胞与部分短暂的白细胞仅用于支持胚胎早期氧运输，并不会被长期保留。

• 确定性造血（definitive hematopoiesis）：约 30 hpf 开始，由造血内皮细胞和造血干细胞产生红细胞、髓系细胞和淋巴系细胞；3 天后淋巴细胞出现在胸腺，造血干细胞随后迁移至肾髓（鱼类的骨髓）。

背景补充

在斑马鱼胚胎中，hamp 在脑神经细胞中高度表达，维持脑内铁稳态；星形胶质细胞高表达 hamp 并将其分泌给血脑屏障微血管内皮细胞。抑制 hamp 表达会导致 4 日龄胚胎铁过载、成骨细胞矿化延迟——但系统性敲除对整个发育期铁稳态与造血分化的影响，此前仍是空白。

二、研究策略：三层递进的证据链

研究团队构建了一条从表型到分子机制的完整链条：

表 1　研究策略的五个层次

三、结果一：母源铁过载，是一切的开端

斑马鱼 hamp 基因含 3 个外显子、2 个内含子，编码带有信号肽、前肽和成熟肽的蛋白（前肽与成熟肽之间有一个 furin 酶切位点）。该基因在肝脏和腹部组织高表达，在脑、心脏、肌肉和卵子中表达较低。

突变株 12 hpf 时胚胎内总铁含量已显著高于野生型，但到 24 hpf 和 36 hpf 两者几乎持平。研究者据此判断：胚胎此阶段尚未通过摄食吸收金属，于是去测了亲代组织——突变亲代雌鱼的卵巢铁含量升高了 51.4%，而血清铁反而显著下降。

这指向一个清晰的结论：胚胎早期的铁过载是母源来源的，随着胚胎发育不断被"稀释"。小鼠研究也有类似发现——母体的铁调素水平同样决定胚胎的铁稳态。

表 2　关键量化结果

与此同时，血红蛋白合成被严重阻断：用邻氨基茴香胺（o-Dianisidine）染色检测功能性血红蛋白，36 hpf 的 hamp−/− 胚胎显著着色变少，ImageJ 定量显示血红蛋白含量下降了 75.4%。到成鱼阶段（8 个月龄），外周血红细胞数量减少 28%，血红蛋白含量减少 42%。

图 1 ｜ 敲除 hamp 降低胚胎期血红蛋白合成。（A）hamp 基因打靶位点示意与突变体核苷酸序列。（B）以抗 Hamp 抗体检测野生型与 hamp−/− 胚胎的 Hamp 蛋白水平。（所用抗体针对成熟肽序列，因蛋白成熟前后大小不同，可见两条带。）（C）12、24、36 hpf 野生型与 hamp−/− 胚胎总铁含量（n=6，非配对双尾 t 检验）。（D）野生型与 hamp−/− 卵巢总铁含量（n=3）。（E）野生型与 hamp−/− 外周血血清铁（n=6）。（F）36 hpf 野生型（左）、hamp+/−（中）、hamp−/−（右）成熟原始红细胞中功能性血红蛋白的 o-Dianisidine 染色。（G）36 hpf 胚胎血红蛋白水平（n=6）。（H）8 mpf 时红细胞数量（n=6）。（I）成鱼外周血血红蛋白浓度（n=5）。数据为均值 ± s.e.m.

四、结果二：铁死亡在造血过程中被点燃

7 个时间点的转录组分析显示：表达变异主要由发育时间驱动，而非基因型。整胚原位杂交显示 hamp 在野生型中 12 hpf 开始表达，并持续升高至 72 hpf；而铁输出蛋白 slc40a1 在 12 hpf 后开始升高，且在 hamp−/− 胚胎中显著更高——这是失去铁调素抑制后，细胞拼命向外排铁的补偿反应。

K-means 聚类得到 4 个差异基因簇，富集到剪接体、自噬、脂肪酸生物合成、铁死亡、p53 信号通路和氧化磷酸化等通路。铁死亡相关差异基因在 12 hpf 达到峰值，包括经典铁死亡基因 slc7a11、gpx4a、acsl1a、fth1a、tfr1a。

研究者进一步计算了表达分化指数（EDi）——衡量两个基因型之间表达差异相对组内波动的指标。铁死亡、血红素结合和血红蛋白复合体通路的 EDi 均超过 1.5，其中 hbbe1.1 的 EDi 高达 14.48，提示 hamp 缺失直接压低了胚胎血红蛋白基因的表达。

12 hpf 的免疫印迹进一步印证了蛋白层面的改变：GPX4 升高（GPX4 是抗铁死亡的关键防线），而 Fth1 和 Tfr1 下调——即储铁能力和铁摄取能力双双走弱。

图 2 ｜ hamp−/− 斑马鱼胚胎造血过程中铁死亡升高。（A）采集 4–72 hpf 七个发育阶段胚胎的转录组。（B）4–72 hpf 斑马鱼胚胎中 hamp 的表达谱（n=3）。（C）12 hpf 胚胎整胚原位杂交检测 hamp 表达。（D）野生型与 hamp−/− 中铁输出蛋白 ferroportin 的表达谱（n=3）。（E）野生型与 hamp−/− 的 K-means 聚类分析。（F）四个聚类的 KEGG 富集分析。（G）12、24、36 hpf 差异表达基因的 KEGG 富集分析。（H）12、24、36 hpf 差异表达基因的 GO 富集分析。（I）FTH1、GPX4、TFR1 的蛋白表达水平与灰度分析（n=3）。数据为均值 ± s.e.m.，P<0.05，P<0.01，P<0.0001。

五、结果三：36 hpf 的红细胞，正在被铁杀死

为追踪红系细胞的命运，研究者将 hamp−/− 与 gata1:RFP（标记全部血细胞）杂交，并分选出红系细胞。36 hpf 时，野生型胚胎中红细胞占比约 2.43 ± 0.31%，突变体仅 1.56 ± 0.02%；荧光成像定量显示血细胞总数减少了 52%。

差异表达分析得到 422 个 DEG，KEGG 分析指向铁死亡、脂肪酸代谢、氧化还原酶活性和能量代谢。除 hbbe1.1 下调外，steap3 显著上调——这个基因很关键：铁经转铁蛋白受体 Tfr1 进入细胞后，需要 Steap3 在内体中把它还原成二价铁；过量的二价铁储存在铁蛋白中，可通过铁蛋白自噬释放，并经芬顿反应生成羟自由基、积累脂质 ROS，最终推动铁死亡。

用 CellROX 试剂检测 36 hpf 胚胎的整体 ROS，结果在 hamp−/− 的血细胞中检测到显著 ROS 产生，共聚焦成像显示 gata1:red⁺ 与 CellROX⁺ 信号共定位——铁死亡在红细胞中真实发生，而非仅仅停留在转录组推断层面。

图 3 ｜ 36 hpf 时 hamp−/− 胚胎的红系细胞发生铁死亡。（A）36 hpf 时用荧光探针标记红细胞的工作流程示意。（B）荧光图像与 gata1 阳性红细胞定量，显示 36 hpf 时 hamp−/− 的 gata1a 阳性红细胞显著减少（n=6）。（C）36 hpf 斑马鱼胚胎血细胞的 DEG 数量。（D）36 hpf 血细胞 DEG 的富集分析。（E）36 hpf 血细胞的 DEG。（F）36 hpf 胚胎整体 ROS 的检测与定量；共聚焦成像显示 gata1:red⁺ 与 CellROX⁺ 细胞共定位（n=7）。

六、结果四：单细胞视角下，血液里多了一群"卡住"的细胞

研究者选取了三个关键时间点：12 hpf（hamp 开始表达）、24 hpf（最接近循环启动的转录组采样点）、36 hpf（血红蛋白染色差异最显著）。scRNA-seq 共获得 31,358 个通过质控的细胞，鉴定出 9 大类细胞、28 个细胞簇。

细胞身份通过标志基因确定：血祖细胞簇富集 npm1a、ncl、hmga1a、fbl；红细胞簇特异性表达 hbae1.3、hbbe1.2、hbae1.1、hbbe2；血管内皮簇高表达 egfl7、cdh5；神经干细胞簇表达 elavl3、pou2f2a、ctnna2。

细胞比例统计给出了最关键的线索：12 hpf 时 hamp−/− 胚胎中血祖细胞比例更高，而 36 hpf 时红细胞比例下降。这说明红细胞数量的减少，根源在于血祖细胞在 hamp 被删除后分化受阻，而非成熟红细胞被杀死。

图 4 ｜ 单细胞分辨率解析 hamp−/− 胚胎造血改变。（A）三个时间点采集斑马鱼胚胎的单细胞转录组。（B）UMAP 图展示三个发育阶段的 28 个胚胎细胞簇，按图例编号。（C）细胞簇注释与标志物热图。（D）用于细胞类型鉴定的精选特征基因 UMAP 可视化。（E）与造血相关的三个细胞簇：红系、巨噬细胞和血祖细胞。（F）12、24、36 hpf 斑马鱼胚胎中不同细胞群的比例。

七、结果五：铁死亡造成血祖细胞的"特异性发育延迟"

对红细胞簇做 KEGG 分析，富集到铁死亡与谷胱甘肽代谢通路，胚胎血红蛋白基因 hbbe1.1 和 hbbe1.2 显著下调，与整体转录组结果一致。

Monocle2 拟时序分析绘制了血祖细胞向红细胞和巨噬细胞分化的路径，揭示 hamp−/− 胚胎存在明显的发育延迟，细胞密度低于野生型，且在 12 hpf 最为显著。差异基因中富集了 gpx4a、fundc2、tp53 等铁死亡相关基因；脂肪酸代谢、铁死亡和胆固醇代谢通路上调。

有意思的是，凋亡通路并没有显著富集——虽然 tp53、casp8ap2 等基因上调，提示凋亡可能参与血细胞丢失，但尚需进一步验证。铁死亡依然是更主要的解释。

那个多出来的亚群：血管母细胞

研究者进一步把 12 hpf 的血祖细胞重新聚类，发现 hamp−/− 中出现了一个野生型所没有的特异亚簇 3（血管母细胞，hemangioblast）。拟时序分析显示，在突变体中存在从亚簇 1 走向亚簇 3 的分化趋势。

由此提出一个模型：正常情况下亚簇 1 会继续分化为成熟红系细胞；但 hamp 敲除后，这些细胞发生铁死亡，无法继续分化，堆积成亚簇 3。比较亚簇 1 与亚簇 3 的基因表达，确实识别出 gpx4、acsl3、acsl2 等铁死亡相关 DEG；KEGG 分析显示亚簇 3 的红细胞分化和血红素合成受到严重影响。

为直接验证，研究者用 SO₂/3-PRDX3（过度氧化过氧化物还原酶 3）抗体标记铁死亡——这种蛋白只在铁死亡过程中发生过氧化，而不会在其他细胞死亡途径中被修饰。结果显示，hamp−/− 胚胎在 12 hpf 出现显著铁死亡，与铁死亡诱导剂 erastin 2 处理组表现一致；20 hpf 时在循环系统中可观察到大量 SO₂/3-PRDX3 信号。

图 5 ｜ 铁死亡导致血祖细胞特异性发育延迟。（A–C）斑马鱼血祖细胞、红细胞与巨噬细胞的拟时序分析。（D）血祖细胞中铁代谢相关基因的表达。（E）血祖细胞差异表达基因的 KEGG 富集分析。（F）12 hpf 胚胎的亚群分析。（G）血祖细胞亚簇的拟时序分析。（H）亚簇 3 与亚簇 1 相比，RNA 剪接、mTOR 信号通路和谷胱甘肽代谢相关 DEG。（I）亚簇 3 DEG 的 GO 与 KEGG 富集分析。（J）12 hpf 和 20 hpf 胚胎中铁死亡标志物 SO₂/3-PRDX3 的免疫荧光检测。

八、结果六：另一层机制——剪接异常让血红蛋白"装不好"

单细胞转录组数据给出的一条线索是：亚簇 3 的 DEG 富集到RNA 剪接通路。编码核心剪接体蛋白和辅助剪接调控因子的基因——SF3B1、SRSF2、U2AF1、ZRSR2——在 hamp−/− 胚胎中表达异常。

但由于 3′ 单细胞 RNA-seq 数据固有的 3′ 偏倚，不适合直接做可变剪接分析。于是团队改用 bulk RNA-seq + rMATS-turbo：结果显示大量基因发生可变剪接，其中跳跃外显子（SE）最为普遍。

关键发现在于：hbbe1.1 基因出现了显著的 3′ 位点可变剪接（A3SS）和内含子保留（IR），使其无法翻译出功能完整的血红蛋白；此外，srsf11 和 u2af1 等关键剪接体组分与剪接因子也发生了多种形式的剪接改变。

延伸阅读

这条线索还连接了另一片研究领域：RNA m6A 修饰与可变剪接对造血干细胞稳态已被证明至关重要。例如 Srsf2 通过调控内皮-造血转化（EHT）期间关键基因的剪接模式影响造血干细胞的产生。把"铁死亡"与"异常剪接"这两个层面联系起来，为后续研究提供了一个全新的视角。

九、讨论：与既往认知的差异

过去关于铁调素的认知多来自成年小鼠——敲除后血清铁升高、组织铁沉积、发生血色病。而这项研究的斑马鱼模型给出的是一幅不同的图景：血清铁下降、血红蛋白合成受阻、血细胞减少。研究者指出，这提示 hamp 与造血之间的相互作用比"抑制性"要复杂得多。

另一个有趣的发现是：成鱼的贫血程度反而比胚胎轻。研究者推测，胚胎期无法与外界交换物质，孵化后可以开始从水体和食物中获取铁离子，一定程度上缓解了铁代谢失衡。但这只是可能的解释之一，确切机制仍待深入研究。

此外，GPX4 在 hamp−/− 胚胎中反而升高，研究者认为这是存活细胞在自发进行的"铁死亡救援"尝试——这与骨髓衰竭综合征 4 型中 HSC 因铁死亡而减少、伴高度氧化应激和铁代谢紊乱的报道相吻合。

十、结论与意义

hamp 缺失导致铁死亡与血祖细胞发育延迟，阻碍其成熟为红细胞；hamp 调控早期造血干细胞分化、mRNA 可变剪接与铁死亡，凸显了铁稳态在胚胎发育中的核心作用，并为血液疾病的机制研究提供了新见解。

研究通过 hamp 敲除模型、单细胞 RNA 测序与 gata1 活体标记三重证据，首次系统刻画了铁调素在胚胎造血中的角色，为遗传性血色病、骨髓衰竭与铁死亡相关血液病的潜在治疗靶点提供了理论支撑。

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