Laura Waldmann, Jake Leyhr, Hanqing Zhang 等

瑞典乌普萨拉大学

PLOS ONE, 2021, 16(8): e0255953　doi:10.1371/journal.pone.0255953
原题：The broad role of Nkx3.2 in the development of the zebrafish axial skeleton
通讯作者：Tatjana Haitina　|　编辑：Michael Schubert　|　收稿 2021-01-05，接受 2021-07-27，发表 2021-08-19

导读

Nkx3.2 过去被认为只管一件事：长出下颌关节。这项研究用 CRISPR/Cas9 造出斑马鱼敲除株，结果发现它管得远不止于此——枕骨、韦伯氏装置、带肋椎节，凡是骨头都要经过那几块腹侧软骨的地方，它都插一脚。

一句话看懂这篇论文

1. 此前关于 Nkx3.2 的研究几乎都集中在下颌关节上，这项工作首次系统地回答了它在轴向骨骼（脊椎）中扮演什么角色。

2. 作者用 CRISPR/Cas9 建立 nkx3.2 敲除株，并综合共聚焦活体成像、光学投影断层扫描（OPT）、骨骼染色与微米 CT 四种技术，从 5 天幼鱼一路追踪到 90 天成鱼。

3. 核心发现：Nkx3.2 的功能范围远超下颌关节，在枕骨、带肋椎节、韦伯氏装置中都有作用，且这些表型与哺乳动物敲除表型高度相似——说明它的这项功能可追溯到硬骨脊椎动物的共同祖先。

这项工作的价值

这项工作的价值不只在于"又发现了一个表型"。它把一个被当成小众的下颌关节基因，重新定位为一个控制脊椎骨发育全局的关键转录因子——而这恰好连接了神经生物学与骨骼发育研究之间的一道鸿沟。

一、研究背景：一个被低估的转录因子

NK3 同源异型盒 2（Nkx3.2，又名 Bapx1）是一个进化上高度保守的基因，编码含同源结构域的转录因子，参与有颌类动物的软骨生长与分化。它最早在果蝇中被发现（bagpipe, bap），在那里主要作用于内脏中胚层、参与中肠肌肉的形成。

在脊椎动物演化过程中，Nkx3.2 的表达被纳入了第一咽弓的中间区。这一事件被认为对从无颌到有颌的转变中下颌关节的形成至关重要。斑马鱼、青蛙和鸡等有颌脊椎动物，都能在第一咽弓骨架的麦克尔氏软骨（Meckel's cartilage）与腭方软骨（palatoquadrate）之间看到 Nkx3.2 的聚焦表达。

相比之下，无颌的七鳃鳗中，Nkx3.2 的表达并不局限于第一咽弓，而是在前部咽部外胚层与内胚层中呈更广泛的分布。此外，通过内皮素-1 及其受体信号通路，迁移中的神经嵴细胞的背腹轴模式（即第一咽弓骨架的形成）也受到精确调控。

从下颌关节到中耳：哺乳动物里的同源结构

在哺乳动物早期演化中，关节骨（articular）与方骨（quadrate）之间的初级下颌关节被并入中耳，形成砧锤关节（incudomalleolar joint），同时在齿骨（dentary）与鳞骨（squamosal）之间形成新的下颌关节。结果是，哺乳动物的 Nkx3.2 表达在鼓膜环（tympanic ring）与隅骨（gonium）等中耳相关骨骼中，以及砧锤关节处。

小鼠胚胎中进一步的分析显示，Nkx3.2 在发育中的椎骨和四肢的软骨性凝集区也有表达。Nkx3.2 缺失的小鼠胚胎表现为：鼓膜环发育不全、隅骨缺失、枕骨（如基枕骨、基蝶骨）体积缩小，以及上枕骨与椎体骨化中心丧失。

多项研究把 Nkx3.2 描述为软骨细胞成熟抑制因子：在鸡和小鼠的长骨发育中，Nkx3.2 能在软骨内骨化过程中压制软骨细胞成熟因子 Runx2 的表达，从而把软骨细胞维持在未成熟状态。

人类疾病模型

在人类中，NKX3.2 的隐性突变会导致一种罕见骨病——脊椎-巨骺-干骺端发育不良（spondylo-megaepiphyseal-metaphyseal dysplasia, SMMD）。患者表现为身材矮小、颈项与躯干僵硬，以及椎体骨化缺陷，与小鼠敲除模型的表型高度相似。

然而，Nkx3.2 在非哺乳类轴向骨骼中的功能此前只被非常简短地研究过。在斑马鱼胚胎与幼鱼中，能检测到 nkx3.2 表达于下颌关节、脊索前端周围与椎骨、以及正中鳍的近端辐射鳍条。

本研究的目的是通过建立 CRISPR/Cas9 诱导的突变品系，全面刻画幼鱼、幼体与成鱼各阶段的骨骼表型，并把 Nkx3.2 轴向功能的起源推回到硬骨脊椎动物的干群。

二、研究策略：从 5 天幼鱼到 90 天成鱼

研究团队设计了一条"多技术交叉验证"的路线：

表 1　多技术交叉验证的路线

表 2　关键量化结果

图 1 ｜ CRISPR/Cas9 敲除株的建立与固定张口表型。（A）斑马鱼 nkx3.2 基因座（第 14 号染色体，两外显子）的等比例示意图。灰框代表编码序列，标注 "HD" 的黑框标示位于第二外显子的同源结构域编码序列，白框标示 1,226 bp 的 3′ UTR（为示意目的已截断）。gRNA 靶位点以青色背景标示。外显子 1 放大区域的序列显示野生型与突变型（uu2803）等位基因的比对；突变等位基因有 7 个碱基对的缺失，导致移码并在缺失位点后立即产生提前终止密码子（红色标示）。（B）通过片段长度分析对野生型、杂合 nkx3.2^uu2803/+ 与纯合 nkx3.2^{uu2803/uu2803} 鱼进行基因分型：野生型显示一个峰（297,15），nkx3.2^uu2803/+ 鱼显示一个野生型峰（297,12）与一个突变峰（290,86），nkx3.2^{uu2803/uu2803} 鱼显示一个突变峰（290,53）。（C）90 dpf 的 nkx3.2^{uu2803/uu2803} 鱼显示出显著的固定张口表型，与 90 dpf 的野生型相比。比例尺：1 cm。

OPT 分析的发现

OPT 分析中特别值得注意的一点：5 dpf 幼鱼头部后部（听觉囊区域）的软骨染色信号显著降低。这个差异如果只是逐张肉眼比对幼鱼照片，几乎不可能被发现——它说明了群体统计方法在捕捉细微表型上的价值。

三、结果一：下颌关节消失，嘴巴永远合不上

两个 sgRNA 活性相近，研究者通过基因分型筛选出携带移码突变的创始鱼，建立了 nkx3.2^uu2803 品系。杂合个体与野生型无肉眼可见差异，纯合突变体可以存活到成体（这一点与小鼠形成鲜明对比）。

纯合突变鱼表现出显著的固定张口表型（n = 6/6）；90 dpf 时体长与野生型无显著差异，但体长分布较宽（作者推测 30 dpf 时偏大是因为张着嘴不停游过食物而"吃得多"，60 dpf 时偏小则可能是分池前的食物竞争——但也坦承无法排除养殖密度等混杂因素）。

共聚焦活体成像显示，从 3 dpf 起下颌关节区域就出现明显差异：麦克尔氏软骨与腭方软骨发生融合（n = 4/4），麦克尔氏软骨后腹侧的后关节突（retroarticular process, RAP）完全缺失（n = 4/4）。

有意思的是，融合区后方的细胞命运是分阶段的：3–5 dpf 时腭方软骨前部是一团无组织的小圆形软骨细胞；到 7 dpf，这些细胞变得细长并开始排列成叠；14 dpf 时，整个融合元件内的软骨细胞都已延长并整齐对齐。

图 2A ｜ 野生型与突变体下颌弓的发育对比（上半部分）。野生型与 nkx3.2uu2803/uu2803 下颌关节的幼鱼发育。（A–H′）Tg(sox10:egfp) 背景下，自腹侧获取的共聚焦活体成像 Z 栈最大投影，分别为野生型头部 3 dpf（A, A′）、5 dpf（B, B′）、7 dpf（C, C′）、14 dpf（D, D′），以及 nkx3.2uu2803/uu2803 头部同批次（E, E′）、（F, F′）、（G, G′）、（H, H′）；A″–H″ 为对应的单一 Z 平面。（A–D″）野生型下颌关节（虚线框）在 A′–D″ 中放大；白色箭头标示自 3 dpf 起可见的后关节突；麦克尔氏软骨前部与腭方软骨后部的软骨细胞排列成叠，而后部麦克尔氏软骨与前部腭方软骨构成下颌关节。（E–H″）突变体中构成下颌关节的元件发生融合，融合位点在（E′–H″）中放大并以星号标示；（E′–F′、E″–F″）3 dpf 与 5 dpf 突变体在融合位点后方的腭方软骨前部可见无序的圆形细胞；（G′, G″）7 dpf 突变体的软骨细胞延长并开始排列成叠；（H′, H″）14 dpf 时整个融合的麦克尔氏-腭方软骨元件内软骨细胞均延长并对齐。m—麦克尔氏软骨，pq—腭方软骨。比例尺：100 μm（A–H），25 μm（A′–H′、A″–H″）。

图 2B ｜ 下颌关节形态的发育演变（放大对照）。图 2 的后半部分，对应 7 dpf 与 14 dpf 时期的放大对照，显示突变体中软骨细胞由无序圆形逐步转变为延长并整齐排列的成叠结构。比例尺：100 μm（A–H），25 μm（A′–H′、A″–H″）。

组织学分析进一步说明：野生型 14 dpf 时关节腔由关节软骨细胞衬里，而构成关节的元件则由肥大软骨细胞构成。突变体中麦克尔氏软骨与腭方软骨不再分离，融合元件内的软骨细胞同样呈现肥大并排列整齐的形态；在推测的融合位点，该元件宽度反而增大，原因是排列整齐的软骨细胞成排堆积。

到 90 dpf，融合的关节骨与方骨的骨化已完成——骨内可见脂肪组织，具备典型的软骨内骨化松质骨特征。值得注意的是，除了融合本身及其后果，骨化过程似乎并未受影响。这与此前报道"关节骨与方骨之间仍有清晰边界"的结果不同；不过作者也承认，无法排除存在极淡的边界只是未被核快红染液凸显。

因此这项研究给出一个重要的机制解读：Nkx3.2 的功能是"抑制软骨细胞成熟"，而不是"促进分化"。融合的软骨依然能正常排列、正常肥大、正常骨化——只是因为该区域"不该有的关节"没有被切开。

图 3A ｜ 14 dpf 组织学：关节腔消失。组织学分析显示 nkx3.2uu2803/uu2803 斑马鱼第一咽弓中下颌关节丧失，但软骨细胞肥大未受影响。野生型 14 dpf（A, A′）、30 dpf（C, C′）、90 dpf（E, E′）与 nkx3.2 突变体 14 dpf（B, B′）、30 dpf（D, D′）、90 dpf（F, F′）的矢状切片，核快红染色。（A, A′, C, C′, E, E′）野生型在麦克尔氏软骨（m）与腭方软骨（pq）之间显示正常的下颌关节发育，分别对应关节骨（art）与方骨（q）。（B, B′, D, D′, F, F′）nkx3.2 突变体不显示下颌关节；除构成关节的元件上缺少关节特征细胞外，软骨细胞成熟与骨化似乎未受影响。（A–F）中虚线框标示（A′–F′）的放大区域；星号标示融合元件。m—麦克尔氏软骨，pq—腭方软骨，art—关节骨，q—方骨。比例尺：200 μm（A–F），100 μm（A′–F′）。

图 3B ｜ 30 dpf 与 90 dpf：融合持续但骨化正常。30 dpf（C, C′, D, D′）与 90 dpf（E, E′, F, F′）时期的组织学对照。30 dpf 突变体中，衬在关节骨与方骨关节端的关节软骨细胞消失，而融合元件内部的软骨细胞呈现与野生型相似的肥大形态；90 dpf 时融合的关节骨-方骨骨化完成，骨内可见脂肪组织。比例尺同上。

四、结果二：微观成像里的"隐藏"变化

为了在更细致的三维层面刻画幼鱼表型，研究者用光学投影断层扫描（OPT）对 5 dpf 软骨染色的幼鱼做三维重建：野生型 n = 10，突变体 n = 11。

方法上有个巧妙的处理：先把野生型的 10 个模型配准叠加成一个"平均参照鱼"，再把突变体的 11 个模型都对齐到这个参照上；随后用体素级的 Mann-Whitney U 检验找出两组间显著差异的体素，并用置换检验设定 FDR 阈值（p < 2.5×10⁻⁴，FDR = 0.045）。

结果揭示了四类差异：

• 下颌关节区软骨标记强度显著更高（品红色）——与野生型存在关节间隙、突变体发生融合的事实一致。

• 下颌关节腹侧的 RAP 位置信号缺失（青色）——直接对应 RAP 的丧失。

• 腭方软骨整体强度显著升高，说明该元件变厚。

• 麦克尔氏软骨前部后侧强度增加、前侧强度降低，提示其形状改变并增厚。

最出人意料的是第四条之外的一项：头部后部、听觉囊周围的软骨染色信号显著降低，并伴随脊索插入区形状改变。

图 4 ｜ OPT 三维重建揭示细微的表型变化。软骨染色的野生型与 nkx3.2uu2803/uu2803 幼鱼的光学投影断层扫描，揭示细微的表型变化。（A, D, G）5 dpf 野生型组（n = 10）的最大投影。（B, E, H）5 dpf nkx3.2 突变组（n = 11）的最大投影。（C, F, I）两组的叠加，彩色体素代表强度存在统计学显著差异（p < 2.5×10⁻⁴）的体素；品红色表示在 nkx3.2 突变组中强度更高的体素，青色表示强度更低的体素。星号标示融合位点。ch—角舌骨，m—麦克尔氏软骨，ac—听觉囊，pq—腭方软骨，rap—后关节突。比例尺：150 μm。

五、结果三：成鱼的面部被"捏"住了

研究者对 90 dpf 成鱼做了 μCT 扫描与三维重建。为了能公平比较，还额外扫描了人为撑开嘴的野生型，作为"张开嘴的头骨"的合理近似参照。

结果：正面看，突变体的脸在"下颌关节本该形成的位置"出现明显夹窄（pinched），导致口裂面积缩小（n = 5/5）。上颌的前颌骨与上颌骨也被向后压缩进入颅腔，并沿夹窄方向横向受压。

由于下颌在发育早期就固定张开，连接各骨的肌肉在幼体发育期持续对基舌骨（basihyal）与角舌骨（ceratohyal）施力，导致这些结构的位置高度可变：有的个体中基舌骨被推向后腹侧，角舌骨前端的指向前与基舌骨后端形成锐角；另一些个体中基舌骨位置相对正常，反而部分挡住了张开的嘴（其前端位于整个下颌的背侧）；还有 2/5 的个体基舌骨从中段弯折并呈 L 形骨化。

另一个发现是下颌联合（symphysis）增厚并变形（n = 5/5）。在野生鱼中，成对的齿骨之间的软骨联合会随摄食张颌而屈曲，配合悬器的外张来增加口部张开度；而突变体的联合"变硬"了——作者认为这可能导致下颌活动受限。

有一处与此前报道不同：此前有文献称该突变系缺失鳃盖骨（kinethmoid），但本研究的个体在 60 dpf 与 90 dpf 都能观察到该骨，且形态相对野生型无明显变化（n = 9/9）。

图 6A ｜ μCT 全身重建：野生型 vs 突变体。μCT 揭示成年野生型与 nkx3.2uu2803/uu2803 斑马鱼的头面表型。（A, B）90 dpf 野生型与 nkx3.2 突变体的侧视图。（C, D, E）分别为闭嘴野生型（CM）、人工张口的野生型（AOM）与 nkx3.2 突变体头部的侧视图。（F, G, H）分别为 CM 野生型、AOM 野生型与 nkx3.2 突变体的正视图。（I, J, K）分别为分离的野生型齿骨（CM）、野生型齿骨（AOM）与 nkx3.2 突变体齿骨的腹视图。（L, M, N）分别通过 I、J、K 中齿骨联合处的虚拟薄切片（60 μm 厚，平均）。以 mm 为单位的测量值指标准体长（SL）。（B, E）中星号标示由下颌关节融合导致的固定张口表型；（E）中箭头标示相对（D）出现下转的角舌骨表型；（I, J）中角度显示野生型联合的活动性，（K, N）中箭头标示 nkx3.2 突变体增厚变形的联合表型。配色：红—下颌；深蓝—眶下骨；深绿—角舌骨与臀鳍；蓝—基舌骨；淡紫—咽弓；深紫—上枕骨；亮绿—外枕骨与基枕骨；黄—其余全部头面骨骼；青—锁骨与胸鳍；极蓝—韦伯氏装置；蓝紫—椎骨；绿—腹鳍；青铜—背鳍；橙—尾鳍椎骨与下尾骨；品红—尾鳍鳍条。比例尺：5 mm（A, B），1 mm（C–N）。

图 6B ｜ 头部侧视与正视图：面部"夹窄"。（C, D, E）头部侧视图：（C）闭嘴野生型，（D）人工张口野生型，（E）nkx3.2 突变体——可见突变体在原下颌关节位置出现明显夹窄。（F, G, H）正视图：突变体（H）的口裂面积显著小于两种野生型参照（F, G），上颌的前颌骨与上颌骨被向后压缩。比例尺：1 mm。

图 6C ｜ 正视图对比：口裂面积缩小。正视图（F, G, H）显示突变体（H）相对闭嘴野生型（F）与人工张口野生型（G），面部在原下颌关节形成处呈"夹 pinched"状收窄，口部开口面积明显减小。比例尺：1 mm。

图 6D ｜ 下颌联合：变厚、变形、活动受限。（I, J, K）齿骨腹视图：（I）闭嘴野生型，显示联合的活动性；（J）人工张口野生型，角度标注张颌时的联合张开；（K）nkx3.2 突变体，箭头标示增厚并变形的联合。（L, M, N）通过联合处的虚拟薄切片（60 μm 厚，平均）：突变体（N）的联合明显增厚（箭头）。比例尺：1 mm。

六、结果四：带肋椎节失去了副突

接下来研究转向轴向骨骼。8.7 mm SL 的突变体在尾前带肋椎节中失去了腹侧软骨，而 8.8 mm SL 的野生型仍然保有。

野生型在 10.5 mm SL 时这些软骨也消失了——因为它们已通过软骨内骨化被副突（parapophyses）完全取代。副突是连接肋骨与椎体的小型关节骨。

但在 30–35 dpf 的突变体（8.7–9.4 mm SL）中，这一软骨内骨化过程根本没有发生：副突缺失（n = 4/4）。取而代之的是，肋骨直接融合到椎体上，没有任何关节突起；另一些（更靠后的）肋骨则与椎体完全断开，中间留出一段本应由副突占据的空隙。

这一表型在 90 dpf 的突变体中依然存在（μCT 分割模型与虚拟组织切片均可见）。相比之下，神经弓、关节突与血弓发育正常（n = 4/4）。

这个发现的意义

腹侧软骨在突变体中不是"变小了"，而是"根本没形成或迅速丢失"。作者推测，Nkx3.2 在这里的作用是启动或维持软骨的发育，而在下颌区域它的作用是抑制软骨细胞成熟——同一个转录因子，在不同位置扮演着看似相反的角色。

这种表型与小鼠突变体中"椎体腹内侧骨化中心无法形成"高度相似，也与人类 SMMD 患者的椎体骨化缺陷相呼应。

图 7 ｜ 突变体带肋椎节的副突完全缺失。nkx3.2uu2803/uu2803 斑马鱼带肋椎节中副突缺失。（A–F）30–35 dpf 与 90 dpf 野生型及 nkx3.2 突变体带肋椎节的背外侧视图。（A–D）幼体的软骨与骨双染标本；（E, F）μCT 模型。（G, H）90 dpf 野生型与 nkx3.2 突变体带肋椎节的 μCT 虚拟横截面。以 mm 为单位的测量值指标准体长（SL）。（B, D, F）中箭头标示带肋椎节上副突的缺失。（E）中以绿色高亮显示副突（pop）。c—椎体，r—肋骨。比例尺：200 μm（A–D），500 μm（E–H）。

七、结果五：枕骨融合与韦伯氏装置的损伤

骨骼染色在 30 dpf 就已显示枕骨区域与颈椎的变化：突变体的外侧枕骨孔（lateral occipital fenestrae）更小，原因是外枕骨与上枕骨形状改变，且与形成韦伯氏装置相关的软骨减少。

图 5 ｜ 幼鱼至成鱼的软骨与骨双染全景。野生型与 nkx3.2uu2803/uu2803 斑马鱼的骨骼染色。（A–F）软骨染色的野生型与 nkx3.2 突变体在 5、9、14 dpf 的侧视图。（G–H）软骨与骨双染的野生型与 nkx3.2 突变体在 30 dpf 的侧视图。（A–H）中的方框标示插图或放大面板（G′, G″, H′, H″）所对应的放大区域。以 mm 为单位的测量值指标准体长（SL）。星号标示麦克尔氏软骨与腭方软骨在下颌关节处的融合。jj—下颌关节，O—枕骨区域，bvc—腹侧软骨，WA—韦伯氏装置。比例尺：2 mm（A–H），200 μm（A′–H′、G″–H″）。

μCT 分割揭示了更剧烈的改变：基枕骨与外枕骨之间发生剧烈融合（n = 5/5），两者在突变体中已无法清晰区分（图 8 中因此用同一颜色标注）；成对外枕骨之间的中线间隙也部分或完全融合。

结果是：奇腔窦（cavum sinus impar）的后背侧开口消失或严重变形；与副蝶骨和前耳骨相接的基枕骨腹前表面在突变体中高度凸起（野生型仅轻微凸起）；颈椎撞击了外枕骨的后背侧支柱，使外侧枕骨孔面积缩小并向后内侧旋转。

颈椎部分的变化同样明显：野生型有 4 个明确的颈椎，而多数突变体（n = 4/5）完全缺失最前端的 CV1，其中一例还额外缺失 CV2。野生型 CV1 背侧的舟骨（scaphium）与锁骨（claustrum）在所有缺失 CV1 的突变体中完全丧失或严重退化；CV2 上的外侧突（lp2）缩小约 50% 甚至接近完全消失；CV3 的三突（tripus）变形，前支与关节突缺失。

韦伯氏装置的腹侧元件全部受损：外侧突 2、三突、以及第 4 肋／悬器骨。尤其值得注意的是，三突与第 4 肋中很可能来源于腹侧软骨的部分（三突的前支、两者各自的关节突）缺失或畸形，结果三突与第 4 肋分别直接融合到 CV3 与 CV4——这与带肋椎节因副突缺失而表现出的表型如出一辙。

相比之下，韦伯氏装置的背侧元件（supraneurals 与神经弓）相对不受影响。作者由此得出一个重要推论：Nkx3.2 的作用范围明确局限于腹侧软骨，而非背侧软骨。

一个开放问题

由于奇腔窦与韦伯氏装置都严重受损，作者推测这些突变鱼应该有严重的听力障碍——尽管本研究并未直接测试听觉。这是论文明确指出的一个开放问题，也是最值得后续跟进的方向。

图 8A ｜ 枕骨与韦伯氏装置的 μCT 四视图对比（上）。μCT 揭示 nkx3.2uu2803/uu2803 斑马鱼枕骨与韦伯氏装置的表型。野生型（A, C, E, G）与纯合突变体（B, D, F, H）枕骨与韦伯氏装置的侧视、腹视、正视与后视图。为清晰起见，（G, H）中已移除颈椎 CV2–4。（B, D）中星号标示 CV2 外侧突 2 的缺失或严重退化；（B, D）中箭头标示 CV3 三突前支的缺失；（D）中箭头标示基枕骨的 V 形腹前缘；（F）中星号标示成对外枕骨中线间隙的后部融合；（G）中虚线标示奇腔窦（csi），（H）中星号标示其缺失。以 mm 为单位的测量值指标准体长（SL）。AO—星状耳石，BO—基枕骨，csi—奇腔窦，cl—锁骨，EO—外枕骨，lof—外侧枕骨孔，lp—外侧突，na—神经弓，os—悬器骨，r4—第 4 肋，sc—舟骨，sn2—上神经弓 2，SO—上枕骨，tr—三突。比例尺：500 μm。

图 8B ｜ 枕骨与颈椎区域的三维分割（放大）。枕骨与颈椎区域的三维分割放大视图，显示基枕骨与外枕骨之间的融合、成对外枕骨中线间隙的闭合、以及 CV1 缺失后颈椎向后撞击枕骨区域的情况。AO—星状耳石，BO—基枕骨，csi—奇腔窦，cl—锁骨，EO—外枕骨，lof—外侧枕骨孔，lp—外侧突，na—神经弓，os—悬器骨，r4—第 4 肋，sc—舟骨，sn2—上神经弓 2，SO—上枕骨，tr—三突。比例尺：500 μm。

图 8C ｜ 后视图：外枕骨中线融合与奇腔窦消失。（E, F）正视图与（G, H）后视图：（F）中星号标示成对外枕骨之间的中线间隙在后部发生融合；（G）中虚线圈出野生型清晰的奇腔窦（csi）开口，（H）中星号标示突变体中该结构完全缺失。比例尺：500 μm。

八、讨论：一个远比哺乳动物古老的功能

本研究最值得注意的结论是跨物种的一致性：斑马鱼、小鼠与人类 SMMD 患者在颈椎缺陷上共享同一种表型。

• 人类 SMMD 患者：颈椎骨化减少可导致颈部弯折（kyknodysostosis），以及与颈椎损伤相关的继发神经问题。

• Nkx3.2 敲除小鼠胚胎：颈椎体缺乏软骨形成（chondrogenesis）。

• 本研究的斑马鱼：多数个体缺失 CV1，CV2 外侧突退化，CV3 三突变形。

在韦伯氏装置上，这一功能被推到了更古老的层级。韦伯氏装置是硬骨鱼中特有的一套复杂结构，负责把鱼鳔的声音通过一串由韧带连接的骨元件传递到内耳，其中许多骨是高度特化的颈椎肋骨与第 1–4 椎骨的神经弓。

一个更深的演化问题由此浮现：腹侧软骨（basiventral）曾被认为是有颌类的特有特征，直到发现盲鳗（现存两大无颌类群之一）也拥有腹侧元件，而七鳃鳗只有背侧元件。由此提出假说：七鳃鳗是次生丢失了腹侧元件，而祖先脊椎动物同时拥有腹侧与背侧元件（当然也存在独立多次演化的可能）。

作者指出，研究 Nkx3.2 是否参与盲鳗腹侧元件的发育，可能揭示这一脊椎动物重要创新的潜在关键角色——它是在早期脊椎动物中就至关重要，还是在有颌类谱系中才被征用，抑或是多次独立地被招募进腹侧软骨发育？

为什么是腹侧，而不是背侧？

这个"只影响腹侧"的规律在小鼠中也能对上：哺乳动物的椎体（centrum）通过软骨内骨化形成，而硬骨鱼类的椎体直接骨化成骨，没有软骨前体；四足类椎体的软骨前体来源于生骨节（sclerotome），而斑马鱼的脊索鞘矿化形成脊索体（chordacentra），随后由生骨节来源的膜内骨形成自椎体（autocentra）。软骨鱼与其他非四足硬骨鱼类同样形成椎体的软骨原基，说明硬骨鱼类的脊椎是衍生状态。

因此作者的结论相当克制却有力：斑马鱼、小鼠与人类的"与椎骨相关的软骨"确实都受 Nkx3.2 影响，只是由于脊椎发育方式的根本差异，在硬骨鱼类与哺乳动物中导致了不同的具体缺陷。类似表型也见于其他已知参与生骨节模式的转录因子敲除模型，如 Pax1 与 Gli2。

关于四肢／正中鳍，研究者坦承本研究并非为此设计，在现有数据中未能检出正中鳍骨骼的显著且一致的变化，此前研究的其他 nkx3.2 突变系也未描述过正中鳍表型。他们提出的假说是：在四肢芽重新启用正中鳍中演化出来的发育机制之后，Nkx3.2 的功能在鳍与肢之间发生了分化。

九、结论与意义

Nkx3.2 的功能远不止下颌关节。这项研究首次系统刻画了该基因在斑马鱼轴向骨骼发育中的广泛作用：枕骨、韦伯氏装置、带肋椎节，都是它的势力范围。

同一个基因，两种作用方式。在下颌区域，Nkx3.2 抑制软骨细胞成熟，因此一旦失活，关节被"焊死"；而在腹侧软骨区域，它似乎是启动或维持软骨发育所必需的，因此失活后软骨根本长不出来。

把 Nkx3.2 的轴向功能起源推回到硬骨脊椎动物干群。斑马鱼的表型与小鼠敲除、人类 SMMD 高度一致，说明这一功能比哺乳动物与鱼类的分化更古老；同时，腹侧软骨这一脊椎动物关键创新，很可能正是 Nkx3.2 在脊椎动物演化中最早的用武之地之一。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。