文章信息

标题：Anti-Müllerian hormone signalling sustains circadian homeostasis in zebrafish（抗缪勒管激素信号维持斑马鱼昼夜节律稳态）
期刊：Nature Communications
发表信息：2025;16:4359（2024 年 7 月 16 日收稿，2025 年 4 月 28 日接收）
DOI：10.1038/s41467-025-59528-1
最新影响因子：18.1（2025 年度 JCR）
分区：JCR Q1；中科院综合性期刊 1 区（Top）
通讯作者：肖锐（武汉大学中南医院）、桂建芳（中科院水生生物研究所）、梅洁（华中农业大学）
第一作者：林巧红、杜贤、任凡（共同第一作者）
开放获取：CC BY 开放获取，© The Author(s) 2025

导读

生物钟如何与内分泌系统"对话"是节律生物学的核心谜题。抗缪勒管激素（AMH）是临床评估卵巢储备的经典指标，与多囊卵巢综合征（PCOS）等生殖内分泌疾病密切相关。中科院水生所桂建芳院士与华中农业大学梅洁团队合作发现：Amh 信号是维持斑马鱼昼夜节律稳态的关键激素通路——amh 或其受体 bmpr2a 敲除后，垂体分子钟振荡减弱、行为与激素节律紊乱；Amh 靶向垂体的生长激素细胞与促性腺激素细胞；机制上，Amh 结合受体 Bmpr2a/Bmpr1bb，磷酸化激活 Smad1/5/9，直接结合 E/E'-box、RRE、CRE 等经典钟控顺式元件驱动生物钟基因转录。这项工作首次将 AMH 从生殖生物学带入昼夜节律领域，为轮班、高脂饮食等现代生活方式引发的节律紊乱疾病提供了全新的机制线索。

摘要

生物钟以自主维持的 24 小时昼夜节律，时间性地编排着行为与生理节律。建立生物钟的核心分子已经清楚，但引发或维系稳态的关键信号通路仍知之甚少。本研究报告：抗缪勒管激素（Amh）介导的信号在维持斑马鱼昼夜节律稳态中发挥重要作用。值得注意的是，amh 敲除会削弱分子钟振荡，扰乱行为与激素的昼夜节律——bmpr2a 缺失突变体中也重现了同样的表型。生长激素细胞（somatotropes）与促性腺激素细胞（gonadotropes）被鉴定为 Amh 靶向的垂体细胞群。单细胞转录组分析进一步揭示 Amh 对垂体生物钟的谱系特异性调控。此外，阻断 Smad1/5/9 磷酸化或敲除 bmpr2a 均可消除 Amh 对生物钟基因表达的诱导效应。机制上，Amh 与其受体 Bmpr2a/Bmpr1bb 结合，后者通过磷酸化激活 Smad1/5/9，促进昼夜节律基因表达。这些发现揭示了一条维系斑马鱼昼夜节律稳态的关键激素信号通路，对节律性器官功能与昼夜节律健康具有重要意义。

昼夜节律由自主维持的生物振荡器驱动，具有内在的 24 小时日/夜节律，由涉及多个生物钟基因的转录自反馈环路控制。内分泌与神经信号作为生物钟振荡器的内源性导引线索，节律性分泌因子与大脑神经元活动作用于垂体内分泌中枢，协调 24 小时的全身稳态。垂体在连接下丘脑与外周靶组织的过程中，产生多种携带"时刻"信号的节律性激素；机体"内分泌中枢腺体"昼夜振荡的长期紊乱可能对生理与行为产生级联影响。在细胞类型特异水平解析调控复杂垂体生物钟的分子线路，将为昼夜节律输出的精准调节与长期稳态提供关键洞见。生物节律与内分泌系统的平衡容易受轮班、高脂饮食等现代生活方式影响；生物钟基因突变或环境刺激异常导致的节律紊乱参与女性生殖系统内分泌疾病（如多囊卵巢综合征 PCOS、早发性卵巢功能不全 POI）的发生。临床前研究提示，循环 AMH 水平异常可能是多种生殖疾病核心病理生理的参与因素，并已被用作卵巢储备评估和 PCOS、POI、卵巢颗粒细胞瘤（GCT）诊断的生物标记。有趣的是，血清休克可在体外诱导昼夜节律基因表达并模拟光诱导的即刻早期基因表达，提示血源性信号因子可能刺激调控分子钟的信号转导通路。由此，研究团队设想 AMH、生物钟调控与内分泌疾病三者相互关联。

生物钟的自持特性使单个细胞成为细胞自主振荡器；而在组织与系统水平，单个细胞振荡器必须相互同步以维持连贯的组织节律。垂体是高度异质性的器官，由产生不同日/季节节律激素的特化细胞群组成，但不同细胞群内在生物钟调控的分子机制尚不清楚。本研究表明，Amh 信号对维持分子钟的稳健振荡及激素与行为节律必不可少。结合荧光激活细胞分选（FACS）与成年垂体单细胞 RNA 测序（scRNA-seq），研究鉴定并验证了 Amh 信号对垂体分子钟的细胞类型特异性调控——主要发生在生长激素细胞与促性腺激素细胞；并揭示 Amh–Bmpr2a–Smad1/5/9 信号通过多个保守的钟控元件在体内激活生物钟基因转录。因此，Amh–Bmpr2a 是生物钟输出内分泌信号与昼夜稳态的"中央守门人"。

结果

Amh 是维持斑马鱼生物钟所必需

在 14 小时光照:10 小时黑暗（LD）循环下持续监测野生型（WT）与 amh 突变成年斑马鱼的运动活性：WT 鱼表现出稳健的昼行节律——活动集中于光期，熄灯后出现类睡眠行为；而 amh⁻/⁻ 突变体在多个 ZT0–14 时段活动持续偏低、在多个 ZT14–24 时段活动升高，运动节律幅度相对下降。amh⁻/⁻ 突变体在 LD 条件下总活动量显著减少，光期与暗期的平均活动差异也较 WT 减弱；光期移动距离与活动显著减少、暗期显著增加。在恒定黑暗（DD）条件下重新评估行为获得类似结果；主观暗期的移动距离在 amh⁻/⁻ 中呈增加趋势，且突变体在主观暗期的大部分时间比 WT 更活跃。这些结果共同证实 amh⁻/⁻ 突变体运动节律强度下降、昼夜行为节律紊乱。

垂体作为生理与行为调控系统的关键组分，且已被报道为 Amh 信号的靶组织。在 DD 条件下，WT 垂体核心生物钟基因的表达振荡与主观昼夜同步；而 amh⁻/⁻ 斑马鱼垂体生物钟基因表达节律幅度明显减弱——per1b、per3、clocka 与 rev-erbβ2 在 24 小时周期内多个时间点显著下调。在肾脏、肝脏与心脏等外周组织中，amh⁻/⁻ 鱼的生物钟基因表达节律幅度同样减弱，rev-erbβ2 与 clocka 在多个时间点（尤其峰值表达期）显著下调。综上，Amh 在生物钟调控中发挥不可或缺的作用。

图 1｜Amh 是生物钟调控所必需。在 LD（A–E）与 DD（F–J）条件下监测并分析 WT 与 amh⁻/⁻ 雌性斑马鱼的运动活性：72 小时总活动量（B、G）、平均活动定量（C、H），以及光期（D）、暗期（E）、主观昼（I）、主观夜（J）的移动距离与活动量。活动波形图中每个点由 3 天内 5 分钟分箱数据计算；小提琴图中圆点与三角形对应个体斑马鱼，黑色与灰色横线为中位数及 25/75 分位数；箱线图展示四分位距，中线为中位数，须线延伸至最小/最大值。B–E：n=12（WT）、n=8（amh⁻/⁻）；G–J：n=8（WT）、n=24（amh⁻/⁻）。双侧非配对 t 检验。K：DD 条件下 7 个时间点取样的垂体核心生物钟基因 qPCR，以 actb2 为参照、WT CT2 归一化，均值±SD，n=3，双侧非配对 t 检验。ZT 为 zeitgeber time（ZT0 对应开灯）；CT 为 circadian time

Amh 蛋白分布于特定垂体细胞群，维持内分泌昼夜稳态

鉴于 amh 突变对垂体生物钟的强烈影响，研究聚焦垂体解析机制。用特异性抗 Amh 抗血清对成年雌鱼垂体进行免疫荧光检测：WT 鱼腺垂体的近端远端部（PPD）与嘴侧远端部（RPD）广泛分布 Amh 免疫反应细胞，与 Amh 在 PPD（促性腺激素细胞、生长激素细胞与促甲状腺激素细胞所在区域）的特异性表达一致；而 amh⁻/⁻ 鱼检测不到 Amh 免疫荧光信号。为进一步鉴定 Amh 蛋白分布的细胞谱系，研究用抗 Amh 抗体经免疫荧光染色后 FACS 分选 Amh 阳性垂体细胞：约 8.54% 的垂体细胞为 Amh 阳性。虽然 PPD 与 RPD 各经典内分泌细胞的标记基因都在 Amh 阳性细胞中表达，但 gh1（生长激素细胞）、lhb 与 fshb（促性腺激素细胞）的转录水平明显高于 tshba（促甲状腺激素细胞）、pomca（促皮质激素/促黑激素细胞）和 prl（催乳素细胞），提示生长激素细胞可能是 Amh 蛋白表达的主要位点。垂体切片的 RNA 荧光原位杂交（RNA-FISH）联合 Amh 免疫荧光共染进一步验证：大多数 Amh 免疫反应细胞与 PPD 中的 gh1 mRNA 共定位，仅少数 Amh 阳性细胞表达 tshba mRNA。

由于每日内分泌振荡由生物钟编排，研究进一步检测 amh 突变对内分泌系统的影响：与 WT 相比，amh 缺失垂体中 Amh 阳性细胞谱系表达的激素基因（gh1、lhb、fshb、tshba）表达节律均被扰乱。因此，Amh 是维持内分泌昼夜稳态所必需。

图 2｜垂体中 Amh 蛋白分布及 Amh 阳性细胞的鉴定。A：成年 WT 与 amh⁻/⁻ 雌鱼垂体切片以抗 Amh 抗血清免疫标记的代表性图像（三次重复）。B：FACS 分选成年 WT 雌鱼 Amh 免疫标记垂体细胞的示意图。C：垂体细胞以抗 Amh 抗体及其同型对照染色的代表性散点图。D：分选的 Amh 阳性垂体细胞中内分泌细胞标记基因的相对 mRNA 表达（以 lhb 归一化，均值±SD，n=3，散点为 individual data）。E：WT 垂体切片 Amh 免疫荧光（绿色）与 gh1（生长激素细胞标记，红色）RNA-FISH 双染的代表性图像（三次重复）。PN 神经部，PI 中间部，PPD 近端远端部，RPD 嘴侧远端部。比例尺 50 μm

单细胞转录组揭示 Amh 对垂体生物钟的谱系特异性调控

垂体通过特定细胞谱系以 24 小时节律协调激素合成与释放，驱动多种保守的生理过程。为解析 Amh 在不同垂体细胞群中的作用，研究对 WT 与 amh⁻/⁻ 雌鱼垂体进行 10X Genomics 单细胞 RNA 测序（各 30 个垂体）。质检后共鉴定 10 个细胞群，包括 6 类经典垂体内分泌细胞（促性腺激素、促皮质激素、促黑激素、生长激素、催乳素与促甲状腺激素细胞）、1 类鱼类特有的内分泌细胞（促生长乳泌细胞 somatolactotropes），以及 3 类非激素细胞群（isl1⁺ 前体样细胞群、垂体细胞与免疫细胞）。细胞构成比较显示：amh⁻/⁻ 中促性腺激素细胞与生长激素细胞比例分别从 30.11% 降至 23.41%、从 20.67% 降至 15.00%，促甲状腺激素细胞比例从 6.11% 升至 18.42%；RNA-FISH 检测相应标记基因 mRNA 的组织学验证与 scRNA-seq 趋势高度一致。

差异表达分析显示：amh⁻/⁻ 的促性腺激素细胞、生长激素细胞与促甲状腺激素细胞分别有 193、273、568 个差异基因（以下调为主）。GO 分析表明，下调基因主要富集于昼夜节律调控与温度刺激应答（促性腺激素细胞与生长激素细胞），以及温度刺激应答、蛋白折叠与昼夜节律（促甲状腺激素细胞）；上调基因显著关联 JAK-STAT 级联通路——该通路已被证明是受生物钟基因负调控的节律调控通路，其上调可能是核心生物钟基因整体下调的结果。核心生物钟基因在三类细胞中均明显下调；全局生物钟基因差异分析表明下调主要发生在促性腺激素、生长激素、促甲状腺与促皮质激素细胞。综上，Amh 在垂体细胞群发育及生物钟的谱系特异性调控（尤其 Amh 阳性细胞群）中发挥关键作用。

图 3｜单细胞转录组分析揭示 Amh 对垂体分子钟的细胞类型特异性调控。A：基于 10X Genomics 平台的斑马鱼垂体细胞分离与单细胞 RNA-seq 分析流程示意（WT 与 amh⁻/⁻ 各 30 个垂体）。B：UMAP 可视化两个 scRNA-seq 实验聚合结果的无监督聚类，揭示斑马鱼垂体 10 个主要细胞群，每点代表一个细胞，颜色对应细胞群。C：细胞群标记基因的 UMAP 可视化。D：WT 与 amh⁻/⁻ 垂体中各细胞群百分比的柱状图。E：amh⁻/⁻ 主要受影响垂体细胞群下调基因的 GO 富集（展示生物过程前 8 条目；超几何检验，Benjamini-Hochberg 多重比较校正）。F：火山图显示 amh⁻/⁻ 与 WT 垂体主要受影响细胞谱系间生物钟基因的差异表达。G：点图显示 WT 与 amh⁻/⁻ 雌鱼垂体各细胞群生物钟基因的表达变化。F、G：双侧非配对 Wilcoxon 检验并多重比较校正

Amh 通过 Bmpr2a/Bmpr1bb 信号通路在垂体中发挥作用

在哺乳动物中，AMH 与特异性 II 型受体 AMHR2 结合，并与 I 型受体（Acvr1/Alk2、Bmpr1a/Alk3 或 Bmpr1b/Alk6）异源二聚调控靶基因表达。但斑马鱼及鲤形目、软骨鱼类等一些有基因组的脊椎动物中找不到 amhr2 基因——尽管它们能产生相应的 Amh 配体。对鱼类 Amhr2 与 Bmpr2 氨基酸序列的系统发生分析显示两者同源，且 Bmpr2a 是各 II 型受体中与 Amhr2 关系最近者，提示在这些演化中丢失 amhr2 的鱼类中，Bmpr2a 可能被"招募"为 Amh 受体。bmpr2a 与 bmpr2b 的基因组共线性比较表明 bmpr2a 区段的共线性更保守（尤其斑马鱼与鲫）；bmpr2a 的转录水平也明显高于 bmpr2b、alk6b 与 alk2，而 FACS 分选的 Amh 阳性垂体细胞中未检测到 alk3a/b 与 alk6a 表达。垂体 scRNA-seq 显示 bmpr2a 主要表达于 Amh 阳性细胞谱系（促性腺激素、生长激素与促甲状腺激素细胞）。

为确定 Amh 与 Bmpr2a 的相互作用，研究进行共免疫沉淀（co-IP）：将 Amh-HA 与 Bmpr2a-Flag 质粒共转 293T 细胞（GFP-HA 为对照），抗 HA 磁珠免疫沉淀后只有 Amh-HA 能拉下 Bmpr2a-Flag。Bmpr1b（Alk6）是唯一与 AMHR2 以配体依赖方式互作的 I 型受体，且 bmpr1bb（alk6b）突变斑马鱼表型与 amh 突变体相似（纯合子性腺发育受损）；由于 bmpr1ba（alk6a）不在 Amh 阳性垂体细胞中表达，co-IP 实验进一步证实只有 Amh-HA 能拉下 Bmpr1bb-Flag。FISH 组织学双标记也确认 bmpr2a mRNA 在体内表达于 Amh 阳性细胞谱系（如 WT 垂体中表达 lh 的促性腺激素细胞）。酵母双杂交（Y2H）与双分子荧光互补（BiFC）实验独立证实 Amh 与 Bmpr2a 的直接相互作用。Amh 蛋白由较长的 N 端结构域（无内在生物活性但增强 C 端活性）与携带生物活性的短 C 端结构域组成；Bmpr2a 主要含蛋白激酶结构域。分子对接显示 Amh C 端结构域与 Bmpr2a 蛋白激酶结构域相互作用；表面等离子共振（SPR）测得两者解离常数 KD=1.394 μM，而全长 Amh 与 Bmpr2a 结构域的亲和力提高约 10 倍（KD=0.1161 μM），说明 N 端结构域增强了 C 端与激酶结构域的相互作用。这些结果有力证明了 Amh 与 Bmpr2a 的配体–受体关系。

图 4｜Amh 与其受体 Bmpr2a/Bmpr1bb 在斑马鱼中结合。A：qPCR 测定分选的 Amh 阳性垂体细胞中 Amh 候选受体的相对 mRNA 表达（以 bmpr2a 归一化，均值±SEM，n=3）。B：候选 II 型受体基因表达水平在 WT 垂体各细胞群中的分布（小提琴图；双侧非配对 Wilcoxon 检验）。C、D：Amh-HA 或 GFP-HA 分别与 Bmpr2a-Flag、Bmpr1bb-Flag 共转 293T 细胞，抗 HA 磁珠免疫沉淀后 Western blot 分析。E：WT 垂体切片 bmpr2a（红）与 lhb（绿）荧光原位杂交双标记的代表性图像（三次重复）。比例尺 25 μm。F：酵母双杂交实验显示 Amh 与 Bmpr2a 的相互作用。G：BiFC 实验证实 Amh 与 Bmpr2a 相互作用（三次重复）。比例尺 10 μm。H：Amh（a）与 Bmpr2a（b）的 3D 结构及（c）分子对接分析。I、J：SPR 分析 Bmpr2a 结构域与 Amh C 端结构域（I）或全长 Amh（J）的结合动力学。ka 结合速率常数，kd 解离速率常数，KD 解离常数

敲除 bmpr2a 扰乱斑马鱼生物钟与内分泌稳态

为在体内探究 bmpr2a 的功能，研究用 CRISPR/Cas9 构建 bmpr2a 突变斑马鱼（第二外显子靶向位点，获得 13 bp 与 5 bp 缺失的移码突变品系，蛋白截断、全部功能结构域缺失）。持续行为监测显示：LD 条件下 WT 雌鱼呈典型昼行模式，而 bmpr2a⁻/⁻ 突变体在多个 ZT0–14 时段活动持续偏低、在多个 ZT14–24 时段升高，行为节律严重紊乱；总活动量显著下降、光/暗期活动差异减弱、光期移动距离与活动显著减少而暗期增加；DD 条件下表型相同。通过 amh 与 bmpr2a 单缺失个体杂交建立双敲除（amh⁻/⁻;bmpr2a⁻/⁻）：其主观昼活动降低、主观夜活动升高的严重程度与单突变体相当，凸显表型对 Bmpr2a 介导的 Amh 信号的依赖。

分子钟表达振荡检测显示：DD 条件下 WT 垂体核心转录激活因子与负反馈通路基因同步振荡；bmpr2a⁻/⁻ 垂体生物钟基因节律幅度明显减弱，per1b、per3、clocka 与 rev-erbβ2 在多个时间点（尤其峰值）显著下调；肾脏、肝脏与心脏中也观察到类似减弱。Amh 靶向垂体细胞谱系表达的激素基因（gh1、lhb、fshb、tshba）在 bmpr2a⁻/⁻ 垂体中表达节律全部严重紊乱。此外，24、54、106 hpf 多阶段胚胎学检查显示 amh⁻/⁻ 与 bmpr2a⁻/⁻ 突变体形态与 WT 无法区分，说明缺失不造成明显的胚胎发育形态异常。综上，Amh 在体内通过受体 Bmpr2a 调控斑马鱼生物钟。

图 5｜敲除 bmpr2a 导致与 amh 突变体相似的生物钟与行为节律紊乱。在 LD（A–E）与 DD（F–J）条件下监测分析 bmpr2a⁻/⁻ 突变体及对应 WT 雌鱼的运动活性：72 小时总活动量（B、G）、平均活动定量（C、H），光期（D）、暗期（E）、主观昼（I）、主观夜（J）的移动距离与活动量（活动波形与小提琴图/箱线图表示同图 1）。B–E：n=12（WT）、n=20（bmpr2a⁻/⁻）；G–J：n=12（WT）、n=24（bmpr2a⁻/⁻）。双侧非配对 t 检验。K：amh⁻/⁻、bmpr2a⁻/⁻、amh⁻/⁻;bmpr2a⁻/⁻ 突变体相对各自 WT 的活动方差定量。L：DD 条件下 7 个时间点取样的 WT 与 bmpr2a⁻/⁻ 雌鱼垂体核心生物钟基因的周期性表达（以 actb2 为参照、WT CT22 归一化，均值±SD，n=3，双侧非配对 t 检验）

Amh/Bmpr2a–Smad 信号通路对生物钟的转录调控

Amh 属于 TGF-β 家族，招募 Smad 蛋白作为活性转录因子调控靶基因表达。磷酸化 Smad1/5/9 在 WT 垂体 PPD 中与 Amh 共定位；amh⁻/⁻ 与 bmpr2a⁻/⁻ 斑马鱼垂体中 P-Smad1/5/9 阳性细胞平均数量显著减少，提示 Smad1/5/9 信号激活受损。为进一步界定 Smad1/5/9 调控的转录程序，研究在 WT、amh⁻/⁻ 与 bmpr2a⁻/⁻ 垂体中进行 P-Smad1/5/9 抗体的 CUT&Tag 实验：WT 垂体中 P-Smad1/5/9 结合大多数生物钟基因（信号富集于转录起始位点 TSS），而 amh⁻/⁻ 与 bmpr2a⁻/⁻ 突变体中这种结合明显减少——rev-erbβ2、per1b、cry2 等特定生物钟基因 TSS 处的 P-Smad1/5/9 信号显著降低，并延伸至众多其他生物钟基因 TSS。这些发现强烈提示 Amh–Bmpr2a 轴是 P-Smad1/5/9 结合生物钟基因启动子所必需。

进一步分析发现，WT 垂体中大量 P-Smad1/5/9 结合位点携带典型的生物钟基因顺式调控元件：E/E'-box（CACGT[G/T]）、REV-ERB/ROR 结合元件（RRE）、cAMP 反应元件（CRE）以及 DBP/E4BP4 结合元件（D-box）。这提示 P-Smad1/5/9 可能通过这些元件调控分子钟的多条转录环路。值得注意的是，作为斑马鱼光调控增强子元件的 D-box，其上 P-Smad1/5/9 的结合明显少于 E/E'-box；且在 amh⁻/⁻ 与 bmpr2a⁻/⁻ 垂体中，E/E'-box、RRE 与 CRE 处的结合减少更为显著，D-box 仅轻微减少。此外，纯光诱导基因 cry5（6-4 光裂合酶）的 TSS 处无明显的 P-Smad1/5/9 信号，提示生物钟的光输入通路可能并不实质性地参与 Amh/Bmpr2a–Smad1/5/9 信号介导的节律调控。综合来看，Amh–Bmpr2a–Smad1/5/9 轴通过特异性靶向一组典型的生物钟基因顺式调控元件，传导生物钟基因表达的信号。

图 6｜Amh/Bmpr2a–Smad1/5/9 信号对生物钟基因的广泛转录调控。A：CUT&Tag 实验显示 WT、amh⁻/⁻ 与 bmpr2a⁻/⁻ 垂体中被 P-Smad1/5/9 结合的生物钟基因百分比柱状图。B：UCSC 基因组浏览器展示 rev-erbβ2 等生物钟基因座位的 CUT&Tag 信号轨迹。C：Metagene 分析显示 P-Smad1/5/9 在 WT、amh⁻/⁻ 与 bmpr2a⁻/⁻ 垂体生物钟基因启动子处的 CUT&Tag 信号（双侧非配对 t 检验，***p=1.568e-08 [WT vs amh⁻/⁻]、***p=5.546e-05 [WT vs bmpr2a⁻/⁻]）。TSS 转录起始位点。D：被 P-Smad1/5/9 结合的典型生物钟基因顺式调控元件数量。E：P-Smad1/5/9 在生物钟基因典型顺式调控元件处的全局分布谱

Amh 信号经 Bmpr2a–Smad1/5/9 通路调控昼夜节律

检测 WT 鱼血液中 Amh 蛋白水平发现：无论在光暗循环还是恒定黑暗条件下，Amh 蛋白都存在稳健的昼夜节律，与生物钟基因振荡相关。给予重组 Amh 蛋白可剂量依赖性显著上调生物钟基因表达；而这一效应在 bmpr2a⁻/⁻ 突变体中消失，阻断 P-Smad1/5/9 磷酸化后同样消失。抑制 P-Smad1/5/9 或敲除 bmpr2a 都会扰乱垂体生物钟基因的昼夜振荡。这些发现证实：节律性的 Amh 信号通过 Bmpr2a–Smad1/5/9 通路维持昼夜节律。综上，Amh–Bmpr2a 通过 Smad1/5/9 介导的转录调控生物钟基因表达与振荡，从而维持内部计时系统与内分泌系统的稳态。

图 7｜Amh 信号经 Bmpr2a–Smad1/5/9 通路调控昼夜节律。A：WT 斑马鱼 Amh 的表达节律。B：不同浓度重组 Amh 或生理盐水处理垂体后核心生物钟基因的 qPCR（以对照组归一化）。C：重组 Amh 处理后 WT 与 bmpr2a⁻/⁻ 垂体生物钟基因表达（以 WT+生理盐水组归一化）。D：重组 Amh、Amh+P-Smad1/5/9 抑制剂或生理盐水处理后垂体核心生物钟基因表达。E：抑制 P-Smad1/5/9 时 WT 垂体生物钟基因表达振荡（以 WT ZT2 归一化）。所有数据为均值±SD（n=3，C 部分为 n=6），双侧非配对 t 检验。F：Amh/Bmpr2a–Smad1/5/9 信号通路调控昼夜节律的模型示意：Amh 信号以细胞类型特异方式调控垂体分子钟振荡，精准地把守昼夜信息的主要输出通路；Amh 信号缺失导致相应的昼夜内分泌与行为节律紊乱

讨论

生物钟是由输入通路、产生节律信号的内源振荡器和输出通路组成的内部计时系统；时钟输出经下丘脑–垂体轴与自主神经系统传递。内分泌与神经信号作为导引线索被认为参与全身稳态及组织振荡器之间的相互作用，但其介导与整合机制仍不清楚。本研究鉴定 Amh 激素为脊椎动物生物钟的重要调控因子。研究提出：Amh 信号维持垂体多种细胞类型（生长激素细胞、促性腺激素细胞、促甲状腺激素细胞）分子钟的振荡，确保昼夜信息主要输出通路的精准把守，从而在组织与系统水平维持节律连贯性与昼夜稳态。具体而言，垂体生物钟通过 E/E'-box 调控 gh1、fshb、lhb、tshba 等激素编码基因的节律性表达，这些内分泌信号再将外周组织的生理过程与振荡器同步。amh 或 bmpr2a 功能缺失会削弱分子钟振荡、扰乱激素与行为的昼夜节律，并影响多个外周组织的昼夜节律。机制上，Amh 结合受体 Bmpr2a/Bmpr1bb，招募 Smad1/5/9 并使其磷酸化转位入核，经由 E/E'-box、RRE、CRE 等多个钟控元件调控生物钟基因表达——为激素调控生物钟基因表达提供了分子机制。

值得注意的是，鱼类缺乏哺乳动物那样的 SCN（视交叉上核）结构，而是以多个分布式神经核组成的"更原始"的组织形式推测性地共同承担中枢时钟功能；斑马鱼松果体钟也可能是复杂多起搏点系统的一部分。光在鱼类中通过广泛表达的视蛋白光受体直接照射细胞与组织来导引外周生物钟，绕过视网膜与中枢 SCN 的间接信号，因此鱼类与哺乳动物昼夜计时系统的层级组织存在根本差异。此外，结合 D-box 结合转录因子（Tef、Dbp）在鱼类光输入通路中的作用，以及 amh⁻/⁻ 与 bmpr2a⁻/⁻ 在 LD 与 DD 条件下相似的表型、P-Smad1/5/9 在 D-box 无显著结合，本研究提示 Amh/Bmpr2a–Smad1/5/9 信号通路可能是不依赖光输入通路的生物钟调节者。这些结果也表明 Amh 是垂体分子钟振荡以及激素与行为节律维持的重要内源因子，提示垂体钟可能是斑马鱼脑内多组分时钟系统的一部分。

垂体作为大脑输出信号的中继站，拥有能自主振荡的分子钟，且其节律在体内不被 SCN 损毁所消除；垂体内在生物钟广泛影响其转录组与激素基因表达节律，并在外周组织中表现出最强的节律产生能力。然而垂体内在生物钟在体内如何被调控仍不清楚。本研究表明 Amh 激素是垂体核心生物钟基因高幅度昼夜转录以及内分泌与行为昼夜节律把守所必需，揭示了内分泌–生物钟串扰的重要分子机制。结合 FACS 与 scRNA-seq，研究分选并鉴定了 Amh 靶向的垂体细胞群，揭示 Amh 主要调控生长激素细胞、促性腺激素细胞与促甲状腺激素细胞中的生物钟基因表达与细胞数量；并鉴定 Bmpr2a 为斑马鱼 Amh 的受体——bmpr2a 缺失引起与 amh 突变体相似的表型，进一步印证这些结果。这些数据完整阐明了 Amh–Bmpr2a 信号对垂体分子钟的细胞类型特异性调控，为垂体细胞将节律性分泌因子或神经元活动转化为调节激素分泌幅度的信号这一组织与系统水平现象提供了细胞学解释。

生物钟相关转录调控是一个极其复杂的调节环路整合网络。令人信服的证据已揭示生物钟及生物钟相关基因中众多保守的功能性顺式调控元件，尤其是被视为昼夜节律系统结构基石的 E/E'-box。本研究表明大多数生物钟基因在体内受 P-Smad1/5/9 转录共激活因子直接调控、经由多个经典钟控元件实现，提示 Amh–Smad 信号通路在脊椎动物生物钟调控中的保守功能；对不同钟控元件的结合揭示其在多条转录环路中的广泛作用。外周组织中的昼夜振荡器能整合多种时间线索，而这些"授时因子"信号如何传递到细胞核仍不清楚。本研究表明：携带时间信息的内分泌因子通过配体–受体相互作用启动信号转导，信号汇聚导致具转录活性的 Smad 复合物入核——揭示了生物钟转录调控的一个关键网络环路。除神经元外，下丘脑与垂体之外，AMH 与 AMHR2 还在女性的卵巢、乳腺、子宫、胎盘和肺等多种组织中被检测到，因此该信号模型可能具有更广泛的应用——不仅限于 Amh 对靶垂体细胞的即时作用，还包括其他组织中基因高幅昼夜转录的长期维持。

现代社会常见的昼夜节律失调与多种疾病相关。AMH 已被报道与 PCOS、POI、GCT 及先天性低促性腺激素性性腺功能减退症（CHH）等多种人类生殖疾病相关；对 AMH 生理作用的研究已从性腺发育与性别分化的经典角色迅速扩展到生殖健康的临床应用。近期有报道称女性生育力下降部分源于异常生物钟基因或不健康的饮食与睡眠习惯导致的昼夜节律紊乱。因此，阐明 Amh 信号在体内生物钟调控中的作用与机制，不仅对昼夜节律生理学，而且对理解与节律紊乱相关的病理具有重要意义。要在医学层面系统理解昼夜节律机制，还需进一步表征 Amh 介导的生物钟调控与 Amh 相关疾病之间的机制与关联。

方法概要

动物：AB 系斑马鱼购自国家斑马鱼资源中心，饲养于中科院水生所；amh 突变体由 CRISPR/Cas9 构建；实验使用 7–12 月龄成年雌鱼。行为评估：LD（14h:10h）与 DD 条件下用 DanioVision 自动视频追踪系统连续监测 72 小时，EthoVision XT 15 分析，ActogramJ 评估节律性。抗 Amh 抗体与重组蛋白：多肽（aa 441-456）免疫小鼠制备抗血清并亲和纯化；重组 Amh（Cys457-Arg549）经 pET32a/BL21 表达、Ni-NTA 纯化、Bradford 定量。免疫荧光：垂体 4% PFA 固定、石蜡 4 µm 切片，抗 Amh（1:200）与抗 P-Smad1/5/9（1:800）孵育，Leica SP8 共聚焦成像。scRNA-seq：10X Genomics Chromium 平台（各 30 个垂体），Seurat 聚类、UMAP 可视化，DoubletFinder 去除双联体。co-IP/Y2H/BiFC：293T 细胞共转抗 HA 磁珠沉淀加 Western blot；Y2H 与 BiFC 验证相互作用。SPR：Bmpr2a 结构域与 Amh C 端或全长 Amh 的结合动力学。CUT&Tag：P-Smad1/5/9 抗体在 WT、amh⁻/⁻、bmpr2a⁻/⁻ 垂体中进行，分析 TSS 信号与钟控元件结合。参考文献与补充材料详见原文。

编译自 Lin Q, Du X, Ren F, et al. Nat Commun (2025) 16:4359. DOI: 10.1038/s41467-025-59528-1。本文为学术译文，版权归原作者及出版方所有；图片引自原文（CC BY 开放获取），仅用于学术交流。参考文献与补充材料请见原文。

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