前言

内分泌和代谢性疾病的患病率逐年增加，已成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。由于这些疾病是包括遗传和环境因素在内的复杂疾病，并且没有明确的治疗方法，因此医学界一直在寻找新的应对机制。

内分泌和代谢性疾病机制的研究很大程度上依赖于相关动物模型的构建，小鼠是最早开始应用的动物模型。然而利用小鼠进行实验时，往往需要较大样本量且需考虑相关伦理问题，所以寻找一种低等生物替代迫在眉睫，而斑马鱼则更符合动物实验的“3R”原则。随着全基因测序出现，斑马鱼与人类基因相似性较高，斑马鱼替代小鼠成为研究基因功能与内分泌及代谢性疾病的优良模型，如：肥胖、糖尿病、高血压、脂肪肝等。

图1 斑马鱼作为代谢和内分泌疾病的模型

图源|Arjmand B, Tayanloo-Beik A, Foroughi Heravani N, et al. Zebrafish for personalized regenerative medicine; a more predictive humanized model of endocrine disease[J]. Frontiers in Endocrinology, 2020, 11: 396.

斑马鱼模型在内分泌及代谢疾病研究中的应用

斑马鱼模型在糖尿病研究中的应用

糖尿病是一组由多病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，是由于胰岛素分泌和（或）作用缺陷所引起。糖尿病病因复杂，致病机制尚不完全明确，动物模型有助于了解糖尿病疾病进程和研发药物。而斑马鱼模型具有其他动物模型所不具备的诸多优势，非常适合人类疾病研究。目前使用的糖尿病斑马鱼模型主要包括诱发性、自发性和基因修饰性模型等。此外，斑马鱼胰腺的基本结构和功能与成年哺乳动物胰腺高度相似，斑马鱼还能使胰腺再生，目前已被用于研究1型糖尿病（T1DM）和2型糖尿病（T2DM）的发病机制。

T1DM是由于免疫介导或特发性胰岛β细胞破坏，导致胰岛素绝对缺乏。根据诱导β细胞减少的模式不同，可分为药物诱导性和基因修饰诱导性T1DM模型。链脲佐菌素（streptozocin，STZ）和四氧嘧啶（alloxan）可诱导胰腺β细胞凋亡，已应用于多种糖尿病实验动物模型。此外，随着转基因技术的发展，可在一定条件下靶向编辑基因，使斑马鱼达到高血糖状态。有研究人员利用大肠杆菌的硝基还原酶基因（nitroreductase，NTR），构建转基因斑马鱼Tg（T2Kins：nfsB-mCherry），该斑马鱼胰腺β细胞表达NTR和mCherry的融合荧光蛋白，用甲硝唑（metronidazole，MTZ）处理转基因鱼，无毒性的MTZ被NTR还原为细胞毒性的代谢产物，特异性致死胰腺β细胞，最终引起血糖升高。

T2DM的主要特点是胰岛素抵抗和β细胞胰岛素分泌缺陷。T2DM斑马鱼模型可分为诱发性模型和自发性模型。成年斑马鱼的平均空腹血糖水平74±8.5mg/dl，高于三倍正常值被认为是高血糖（＞200mg/dI）。研究人员用2%和0%的葡萄糖溶液交替浸泡28天，通过高糖暴露法建立斑马鱼糖尿病模型，最终斑马鱼血糖呈波动性升高，合并视网膜病变。为了开发胰岛素抵抗转基因模型，使用CRISPR/Cas9特异性地敲低肝脏Tg中的胰岛素受体（actb2：Cas9；(U6x：sgRNA（insra/b））），引起进食后高血糖和禁食时低血糖。最近，除了破坏β细胞并研究其再生外，还提出了另一种策略，即建立胰岛炎症模型（据报道，胰岛炎症参与了糖尿病的发病机制）并了解其保护机制。由于白细胞介素-1β（IL-1β）在炎症中起关键作用，Tg（ins：il1b）斑马鱼被用来鉴定导致β细胞功能障碍及其后续后果（如高血糖）的潜在过程。此外，具有抗炎作用的天然产物wedellactone治疗可以减少β细胞炎症和免疫细胞的浸润。因此，这项研究为研究β细胞功能障碍及其相关疾病的潜在治疗方法打开了一扇新的窗口。

此外，斑马鱼胰腺的结构、功能和糖代谢调控等与哺乳动物高度保守，已经广泛应用于胰腺发育生物学研究、不同类型糖尿病及其并发症研究，以及糖尿病新药筛选、药物毒性等领域。多样化的糖尿病斑马鱼模型仍在不断构建中，将在糖尿病疾病研究中发挥着越来越重要的作用。

斑马鱼模型在肥胖研究中的应用

肥胖（obesity）是糖尿病、心血管疾病、癌症等慢性疾病的重要危险因素，全球现约有20亿人处于肥胖或超重的状态，肥胖率高达39%。全球疾病负担数据表明，到2025年，将有近4亿的儿童和青少年处于超重或肥胖状态。中国超重和肥胖的人数逐年增加，很大程度上解释了慢性病在社会经济负担中所占比例越来越大。目前构建斑马鱼肥胖模型通常有两种方法：（1）喂养诱发斑马鱼肥胖模型；（2）应用转基因技术构建斑马鱼肥胖模型。

人类是由于能量摄入过多导致脂肪堆积进而形成肥胖，因此通过喂养诱发构建斑马鱼肥胖模型与人类更为接近。目前，喂养诱发斑马鱼模型主要有以下4种：正常饲料、高脂肪、高胆固醇和高蛋白，不同喂养诱发模型比较见图2。饮食成功诱导的斑马鱼肥胖模型并没有具体标准，大多数研究认为斑马鱼出现相关表型：体长增长、体重增加、BMI增高、脂肪肝等，则认为造模成功。

图2 饮食诱发斑马鱼肥胖模型

图源|刘露, 杨志康, 杨晓彤, 等. 斑马鱼肥胖模型的构建及在降脂物质中应用进展[J]. 现代预防医学, 2021.

肥胖是一种成因复杂的疾病，越来越多的证据表明肥胖受到基因的调控。锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子效应核酸酶（TALENs）以及成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR/Cas9）等基因编辑技术已被广泛应用于人类疾病研究。CRISPR/Cas9技术为构建斑马鱼突变体提供了更高效的实验手段，进一步为斑马鱼研究肥胖机制及药物筛选提供实验基础。此外，也有将微核糖核酸结构（miR-SP）技术应用于斑马鱼，幼鱼表现出高脂血症，肝脂肪变性和白色脂肪组织明显增多。肥胖是一种复杂代谢性疾病，斑马鱼肥胖相关基因见图3。基因编辑所构建肥胖斑马鱼的测量标准：通常取肝脏组织染色观察、测量生化指标(甘油三酯、总胆固醇）以及肥胖基因表达水平，实验组与对照组比较后，如出现明显差异时，则认为该模型构建具有意义。

图3 斑马鱼转基因肥胖模型

图源|刘露, 杨志康, 杨晓彤, 等. 斑马鱼肥胖模型的构建及在降脂物质中应用进展[J]. 现代预防医学, 2021.

斑马鱼模型在脂肪肝研究中的应用

非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是肝脏中脂质过度积累的结果，可导致 NASH、肝硬化和癌症。已证实 nafld 与肥胖和胰岛素抵抗有关，但其进展机制仍不清楚。为了进一步研究，有一些斑马鱼突变体被使用，例如导管系，s-腺苷同型半胱氨酸水解酶（AHCY）的突变，这是一种参与甲基化反应的基本代谢酶，显示肝脏变性和肝脏脂肪变性。AHCY 缺乏 症（一种罕见的遗传疾病）患者不仅有肝功能障碍，而且在脑功能方面也有一些损伤，因此，该模型有助于为患者确定新的治疗方案。此外，各种转基因工具可用于研究肝细胞类型，甚至脂肪细胞，以更好地了解 NAFLD 的发病机制。因此，斑马鱼作为一个强大的模型和系统来探索导致 NAFLD 的途径，并揭示关键部分。

此外，斑马鱼的垂体与人类相似，分为神经垂体和腺垂体，腺垂体可以分辨出 ９ 种细胞类型，并可释放相应的激素。另外斑马鱼中叶存在下丘脑-垂体-甲状腺轴、下丘脑-垂体-肾上腺轴的反馈调节。说明斑马鱼模式生物在内分泌调节系统中将有着巨大的科研应用前景，随着各项技术的不断更新和完善，相信有关内分泌系统的发育和疾病的发生机制将得到更好的阐述。

结语

得益于斑马鱼模型，近年来人类疾病领域的研究有了显著的进展。如今，利用斑马鱼进行精准医学研究，特别是在内分泌疾病方面，正在迅速兴起。同时，斑马鱼模型在可视化方法、基因靶向和化学药物筛选方面的优势可以助力未来临床医学的研究发展。