前言
化妆品,是指以涂擦、喷洒或者其他类似方法,施用于皮肤、毛发、指甲、口唇等人体表面,以清洁、保护、美化、修饰为目的的日用化学工业产品。化妆品均由复杂的化学成分组成,功效成分良莠不齐,种类日益丰富,其表现的功效性可能是多种活性成分与体内多靶点结合的结果。2021年5月1日正式施行的《化妆品功效宣称评价规范》中第五条明确指出化妆品的功效宣称应有充分的科学依据。基于此,寻求客观、全面、系统的评价化妆品功效技术是时代进步所需要的。
斑马鱼皮肤与人皮肤的比较
图源 | Russo I, Sartor E, Fagotto L, et al. The Zebrafish model in dermatology: an update for clinicians[J]. Discover Oncology, 2022, 13(1): 48.
在化妆品功效评价的体外方法中,斑马鱼模型是一种新型评价方法之一。截至目前,我国公开的团体标准中已有利用斑马鱼模型来进行功效评价的方法,以此证明斑马鱼模型在化妆品行业具有较高的认可度。2021年4月9日国家药监局发布的《化妆品功效宣称评价规范》,使得斑马鱼模型逐渐进入大众视野,成为国内外评价化妆品认可度高的方法之一。与其他模式生物相比,斑马鱼有其特有的评价优势,结合人体试验、消费者使用测试、动物实验、体外实验等多维度评价方法,让化妆品功效宣称更有说服力。
2023年3月27日,《中国实验动物学报》发表了郑丹阳、徐梦漪、李淑敏、朱永闯、龚盛昭、蔡丽华、胡翠萍题为"斑马鱼模型在化妆品功效评价研究中的应用进展"的综述论文,该论文阐述了斑马鱼模型在化妆品美白、抗炎、抗氧化等功效评价中的应用进展。
导读
与其他哺乳动物相比,采用斑马鱼模型评价化妆品功效性,具有独特优势。除个体较小,繁殖能力强,易于饲养;胚胎透明,易于观察;可用于短期大规模的实验,进行高通量筛选等优势外,斑马鱼与人类基因组具有高度同源性,约占87%,能可靠地模拟和预测人类生理,呈现出与人类相似的生理学特征,被科学界公认为是评价化学品最敏感的体内方法。且斑马鱼皮肤与人类皮肤结构相似,包含基底层、棘层、颗粒层、透明层和表皮角质细胞层,皮肤间质结缔组织、胶原及其邻近的纤维母细胞及皮肤基因表达与人类皮肤相似,因此采用斑马鱼评价化妆品功效具有较大的参考价值。
1.斑马鱼模型在化妆品美白功效评价的应用
斑马鱼幼鱼透明,其体表有黑色素沉淀,用光学显微镜可直接观察体表黑色素变化,可直接用于评价化妆品美白功效,简化实验过程。目前,行业通用的斑马鱼模型评价美白类化妆品及原料功效的标准,主要为团体标准(表1),表1中团体标准采用的评价原理均为酪氨酸经过酪氨酸酶作用,氧化生成多巴,多巴经氧化、脱羧等反应转变成吲哚醌,最后吲哚醌聚合为黑色素,在斑马鱼体表呈现。
表1全国现行斑马鱼评价美白化妆品团体标准
胚胎时期的斑马鱼通体透明,便于在肉眼下用体视显微镜直接观察拍照,并用图片分析软件(如Image J)计算黑色素含量,比较处理组与对照组的胚胎体表黑色素变化,计算得出黑色素的抑制效果。该黑色素分布测定法(图像法)可直观快速反映出测试样品的美白效果(如图1)。
通过图像法,简单直观判别受试物的美白功效,成为众多研究者研究原料美白功效的方法之一。Park等通过图像法分析得出,在相同浓度下,与熊果苷(A)相比,金纳米粒子(GNPs)-熊果苷作用于斑马鱼胚胎,其头部和卵黄位置具有较好的美白活性;与熊果苷或苯基β-D-葡萄糖苷(P)相比,GNP-P2表现出更强的美白效果。因此,生物活性糖苷-GNP复合物可能成为美白化妆品的新方向。张文娟等通过图像法研究水仙鳞茎醇提取物对斑马鱼胚胎体表黑色素合成的抑制作用。从斑马鱼侧视和俯视位体表区域比较,在浓度为100、200、500μg/mL的水仙花溶液提取物处理组中,48h和72h斑马鱼胚胎的脊椎及背部黑色素依次递减,尤其是500μg/mL处理组,黑色素沉着点接近于阳性对照组(200μg/mL的熊果苷,Ar)。通过实验得出水仙鳞茎醇提取物能够达到与熊果苷相似的美白效果。
图1斑马鱼胚胎体表黑色素观察部位示意图
(红色区域为色素测量区域)
此外,T/HPCIA 005-2022团体标准中还提到另外两种评价方法,分别是黑色素生成抑制检测法和酪氨酸酶活性抑制检测法。这两种方法的前处理均为将斑马鱼胚胎破碎离心分层,不同之处在于检测分层后的混合液,黑色素生成抑制检测法是取不同浓度受试样的黑色素沉淀物,在波长为405nm下检测吸光度值,计算黑色素含量,进而计算黑色素生成抑制率;酪氨酸酶活性抑制检测法是取不同浓度受试样的上清液,在波长为475nm下检测吸光度,进而计算酪氨酸酶活性抑制率。这两种方法是从黑色素生成抑制和酪氨酸酶活性抑制的靶点来评判化妆品的美白功效,数据呈现更直观,适合于利用黑色素生成抑制和酪氨酸酶抑制机理的美白功效评价。
为进一步探究祛斑美白功效,还可从黑色素形成的信号通路来评价。调节黑色素形成的信号通路与微噬菌体相关转录因子(MITF)有关,下调MITF活性可以降低相关酶的表达,从而抑制黑色素的形成。Ding等发现海洋多酚化合物二氯邻羟基香豆酚(DPHC)能较强地抑制酪氨酸酶活性,其通过减少CAMP依赖蛋白激酶A(PKA)的磷酸化来抑制CAMP响应元素结合蛋白(CREB)的磷酸化表达,导致MITF表达水平下降。在斑马鱼体内研究中,DPHC显著抑制斑马鱼胚胎体表黑色素合成,为DPHC在化妆品行业的应用提供参考依据。根据化妆品原料美白的作用靶点不同,可选择对应的检测方法,评价化妆品美白功效。
2.斑马鱼模型在化妆品抗炎功效评价的应用
当皮肤受到刺激时,炎症细胞(巨噬细胞、中性粒细胞等)增殖,释放出炎症因子,毛细血管扩张,通透性增加,皮肤出现红肿、刺痛、瘙痒等症状,此称为炎症反应。炎症是目前实验室评价抗炎功效的指标之一。斑马鱼免疫细胞类型和形态与人类相似,存在巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等,使其成为研究炎症的理想体系。全国现行斑马鱼评价抗炎化妆品团体标准情况如表2所示。
表2全国现行斑马鱼评价抗炎化妆品团体标准
对斑马鱼尾部进行断尾处理,可以诱发斑马鱼尾部局部损伤,促使斑马鱼免疫细胞发生免疫应答。但成丽等通过切割尾部构建巨噬细胞聚集的转基因斑马鱼(zlyz:EGFP)炎症模型,以此研究血人参提取物的抗炎活性,结果显示:除水层外,血人参提取物不同极性部分——石油醚层和醋酸乙酯层在低浓度下对转基因斑马鱼炎症模型损伤尾部的巨噬细胞聚集具有显著的抑制作用。何林燕等主要从巨噬细胞和中性粒细胞的聚集和清除情况来表征大麻叶提取物对斑马鱼尾鳍损伤部位抗炎功效,结果显示:2.0μg/mL浓度下的大麻叶提取物对斑马鱼尾鳍伤口处的巨噬细胞和中性粒细胞聚集有抑制作用,对巨噬细胞和中性粒细胞的清除有促进作用,且具有显著性差异,说明大麻叶提取物具有良好的抗炎功效。
此外,过高浓度的脂多糖(LPS)也可引起斑马鱼强烈的炎症反应,分泌大量的炎症因子。倪立颖等研究羊栖菜多酚对LPS诱导的斑马鱼的抗炎作用,发现多酚浓度为200μg/mL时,NO生成率和ROS生成率分别由202.48%和353.44%降至75.62%和128.91%,并且显著降低斑马鱼心跳速率和卵黄囊大小。硫酸铜(CuSO4)诱导的急性炎症是由于CuSO4刺激可使斑马鱼免疫细胞迅速迁移至神经丘,而抗炎功效产品可抑制免疫细胞迁移。Chen等利用斑马鱼胚胎和细胞模型研究栀子提取物的抗炎活性。研究发现栀子提取物可有效抑制CuSO4诱导的斑马鱼胚胎中原始巨噬细胞向侧线的迁移;与体外细胞模型结果相似,添加栀子提取物处理组降低了LPS诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α基因的表达,且导致nkap的表达明显下降,抑制促炎症细胞因子上调。
通过以上3种方法(经过断尾诱导的局部炎症、脂多糖(LPS)诱导的全身炎症和硫酸铜(CuSO4)诱导的急性炎症)模拟免疫系统对炎症的应激过程,进而评判抗炎功效化妆品的功效性。此外,T/HPCIA006-2022团体标准中,通过建立斑马鱼刺激模型,也能评估抗炎功效化妆品。实验方法是采用24hpf斑马鱼胚胎,通过行为学——自主运动频率评估抗炎功效化妆品。通过斑马鱼行为学评价,更为直观反映化妆品的抗炎功效,且该方法较传统斑马鱼验证模型操作简单,大大节省化妆品开发的实验成本。
3.斑马鱼模型在化妆品抗氧化功效评价的应用
斑马鱼模型除评价美白和抗炎功效外,还可用于筛选具有抗氧化功效潜力的化妆品。活性氧(reactive oxygen species,ROS)是斑马鱼体内代谢产物之一,是机体正常生理活动的象征。当斑马鱼受到外源物刺激时,体内的ROS含量就会增加,从而导致ROS的自由基代谢异常,诱导脂质过氧化,进而导致细胞发生氧化应激性损伤。正常情况下斑马鱼体内ROS的产生和消除保持动态平衡,当ROS含量发生变化时,斑马鱼可依靠抗氧化物发挥作用清除ROS。ROS可被特异性染料检测,且斑马鱼胚胎透明,使得检测方法更为便捷。斑马鱼氧化应激模型评价化妆品的抗氧化功效,具有可靠、快速、高效等优点。
目前,通常采用2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(AAPH)、LPS等处理诱导斑马鱼产生氧化应激,通过荧光强弱展示ROS产率,进而评价化妆品的抗氧化功效。王杰等将7~9hpf的斑马鱼胚胎暴露于不同浓度马齿苋黄酮水溶液1h后,加入15mmol/L AAPH建立氧化应激诱导模型,暴露至24hpf后,将所有溶液更换为胚胎培养液孵育至72hpf,此时胚胎孵化为仔鱼,对其进行荧光染色1h后,拍照处理计算得出ROS产生率。结果显示,50~300μg/mL的马齿苋黄酮可显著降低AAPH诱导后斑马鱼仔鱼ROS产生率,说明马齿苋黄酮具有较强的体内抗氧化功效,为马齿苋资源的深度开发利用提供数据支撑。万庆家等采用LPS对斑马鱼胚胎进行氧化应激诱导,挑选7~9hpf胚胎于不同浓度大麻叶提取物中孵育1h后,加5μg/mL LPS孵育至72h,荧光染色1h后分析计算荧光强度,得出2.0mg/mL大麻叶提取物显著抑制ROS产生,荧光强度较弱,证明大麻叶提取物具有潜在的抗氧化功效,可应用于化妆品中。
通过建立斑马鱼氧化应激模型,结合胚胎透明优势,利用ROS荧光强度,可直观反映化妆品的抗氧化功效,且能减少实验成本。
4.斑马鱼模型在化妆品其他功效评价的应用
斑马鱼表皮渗透压超过耐受范围时,皮肤将发生脱水现象,且斑马鱼皮肤结构与人体相似。因此,采用高渗透溶液建立斑马鱼补水保湿的诱导模型,能够模拟评价补水保湿功效化妆品性能。周示玉等将2dpf斑马鱼置于不同浓度受试物中,孵育18h后对比斑马鱼尾部面积大小,以此评价甘油葡糖苷补水保湿功效,结果表明甘油葡糖苷具有良好的补水保湿功效。陈金龙等采用72hpf野生型斑马鱼仔鱼置于不同浓度受试物中,孵育15min后对比渗透前后尾部长度变化,计算得出斑马鱼尾部长度收缩率,结果表明1%浓度下的三款面膜均有潜在的保湿功效。采用斑马鱼胚胎评价化妆品补水保湿功效,可大大降低实验成本,且实验操作性强,可广泛推广。
斑马鱼伤口皮肤愈合迅速,尾鳍再生是研究组织修复的一种特别有效的模型,因此,可用斑马鱼尾鳍再生模型评价化妆品修护功效。杨娟等采用3d野生型斑马鱼胚胎,切除尾鳍后暴露于不同浓度受试物中,暴露48h后对胚胎进行拍照分析,结果表明6%浓度下的二裂酵母发酵产物溶胞物(Ferment-DFL)对斑马鱼胚胎尾鳍修护促进率达15%,说明Ferment-DFL具有促进修护功效,可广泛应用于护肤品中。
斑马鱼肥大细胞的结构与功能与人类相似,可参与机体的免疫和过敏反应。N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(BAPNA)是胰蛋白酶(Tryptase)特异性底物,可以检测斑马鱼体内的Tryptase表达水平,定量分析化妆品的抗过敏功效。万庆家等采用3dpf斑马鱼,先后加入相同体积的不同浓度库拉索芦荟花提取物、Compoud48/80、BAPNA溶液中,各孵育1h,使用酶标仪检测吸光值(OD405),以此计算Tryptase表达水平和抑制率。结果表明,0.1%~0.4%的库拉索芦荟花提取物能显著抑制Tryptase分泌量,具有潜在的抗过敏功效,为其在化妆品中的应用提供依据。
除以上评价化妆品功效方法外,仍有其他化妆品功效评价方法有待开发,结合斑马鱼自身优势,评价化妆品不同功效性能,有利于化妆品高质量发展。
结语:在“颜值经济”社会大背景下,消费者对功效化妆品的需求在逐年增加。由此可见,功效化妆品的研发具有巨大的发展潜力。同时,也需规范功效化妆品市场,让功效宣称与实际功效效果相对应,保障消费者权益。斑马鱼模型不仅能用于筛选优化功效成分的组方和配比,还可优化功效产品配方和工艺,从功效成分源头进行评价筛选,为后期成品功效性能奠定基础。目前,化妆品功效宣称种类繁多,而斑马鱼模型评价化妆品功效规范与标准,还在逐步建设和完善。因此,规范斑马鱼模型评价化妆品方法,完善相关标准,是化妆品行业及科学研究迫切所需。将斑马鱼模型与体外实验、人体试验等评价手段相结合,能为深入开展化妆品研究提供更为可靠、快速、有效的方法体系。
广东省绿色日用化工工程技术研究中心郑丹阳为该论文第一作者,广州番禺职业技术学院徐梦漪教授为该论文通讯作者。