编辑：孙惠敏
原文地址：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0378874119330843?via%3Dihub

前言

凉膈散（LGS）是一种传统的中药配方，起源于中国宋朝的《太平惠民合剂局方》，被广泛应用于临床感染的治疗，包括咽炎、扁桃体炎、急性肺炎和急性肺损伤。然而，LGS的抗炎作用及其潜在机制尚未得到充分的研究。脂多糖（LPS），又称内毒素，是革兰氏阴性菌外膜的主要成分。作为最有效的促炎激动剂之一，可引起发热、多器官功能障碍综合征、内毒素休克甚至死亡。

斑马鱼（Danio rerio）近年来已成为研究先天免疫功能的一种强大的动物模型。这种脊椎动物具有体积小、生长快、产量高和胚胎透明性等优点，可以在体内实时可视化荧光蛋白。斑马鱼的先天免疫系统与哺乳动物非常相似，与大多数人类免疫细胞类型都相同。斑马鱼的先天免疫系统早在受精后24小时（hpf）就开始发育，有原始巨噬细胞，在32-48hpf时出现中性粒细胞，这为研究幼虫的先天免疫提供了机会。

在研究中，作者利用显微注射LPS斑马鱼模型和和LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞发现LGS具有显著抗炎作用。LGS介导的抗炎作用可能通过抑制p-JNK（Thr183/Tyr185）和p-Nur77（Ser351）的激活。因此，LGS可能是一种很有前途的治疗急性炎症性疾病的药物。

图1 LGS对LPS刺激下3-dpf斑马鱼幼虫的保护作用

首先检测了LGS对斑马鱼幼鱼的毒性（毒理研究），发现在62.5 μg/mL、125 μg/mL和250 μg/mL剂量下对幼鱼没有任何毒性作用。对3dpf幼鱼随机分为6组，进行0.5 mg/mL LPS 或 PBS卵黄囊显微注射，随后用DEX (5 μg/mL)或LGS(62.5、125、250 μg/mL)处理。结果发现在注射72小时（72 hpi）时，LPS卵黄微注射斑马鱼100%死亡，而PBS卵黄显微注射斑马鱼完全存活。LGS剂量依赖性地增加了LPS感染幼虫的存活率，DEX对脂多糖感染的幼虫也有保护作用。接着对不同处理斑马鱼进行包埋切片，苏木精和伊红（H&E）染色显示LGS/DEX处理显著降低了LPS诱导的炎症细胞的浸润。IL-6和TNF-α是先天免疫反应系统中重要的促炎细胞因子，LPS显著提高了IL-6和TNF-α的mRNA水平，LGS（250 μg/ mL）可显著抑制了LPS诱导的IL-6和TNF-α的上调，DEX对IL-6和TNF-α的表达也有抑制作用。综上所述，这些结果表明LGS对LPS卵黄囊显微注射斑马鱼具有保护作用，并抑制LPS诱导的炎症。

图2 LGS抑制LPS卵黄显微注射斑马鱼中中性粒细胞和巨噬细胞的募集

采用双转基因斑马鱼Tg（coro1a:GFP；lyz:Dsred）系研究LPS感染后中性粒细胞和巨噬细胞在卵黄囊中的募集。苏丹黑（SB）染色可以用于检测嗜中性粒细胞的存在，因此采用SB染色法观察斑马鱼体内的中性粒细胞。在12 hpi时，卵黄囊中出现大而清晰的细胞淋巴脂滴，使用LGS处理导致中性粒细胞招募减少。中性红（NR）可被巨噬细胞溶酶体内吞，形成一个大的红色空泡聚集物。我们通过NR染色检测巨噬细胞的募集，在12 hpi时，注射LPS的幼鱼NR标记的巨噬细胞显著增加，而LGS以剂量依赖的方式显著减少了巨噬细胞的募集。DEX处理组也有类似的现象。这些结果表明，中性粒细胞和巨噬细胞都参与LPS诱导的急性炎症，LGS显著减少了斑马鱼中性粒细胞和巨噬细胞的募集。

图3 LGS通过抑制抑制p-JNK和p-Nur77激活抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞的炎症反应

接下来测定了LPS和LGS对RAW 264.7细胞影响。结果显示，LPS处理显著增加了TNF-α和IL-6的表达水平，而LGS显著恢复LPS诱导的TNF-α和IL-6增加。蛋白印记（WB）实验发现，LGS通过剂量依赖方式抑制了LPS诱导的Nur77磷酸化，上调了细胞中Nur77的表达。LGS也抑制了LPS诱导的JNK磷酸化，而不影响JNK的表达。这些结果表明，LGS在LPS诱导的RAW264.7细胞中具有抗炎作用，并通过抑制Nur77和JNK的激活来减轻LPS诱导的炎症反应。

图4 LGS抑制CuSO₄和斑马鱼剪尾诱导的中性粒细胞和巨噬细胞募集

CuSO₄可通过诱导氧化应激和细胞死亡，迅速破坏侧线系统的毛细细胞。斑马鱼尾鳍损伤模型是一种身体创伤模型，通常也用于抗炎研究。CuSO₄暴露和尾鳍损伤分别代表化学损伤和物理损伤，接着用这两种方式验证LGS对炎症的作用。结果显示，暴露在CuSO₄中后，大量的中性粒细胞和巨噬细胞聚集在神经丘周围，而LGS则显著抑制了CuSO₄对中性粒细胞和巨噬细胞的迁移。在剪尾4 h后，中性粒细胞和巨噬细胞在剪尾部位明显积累，LGS以剂量依赖的方式显著抑制中性粒细胞和巨噬细胞的募集，和DEX表现出相同效果。这些结果证实了LGS的抗炎活性。

结语：综上所述，我们首次证明了著名的中药配方LGS在三种斑马鱼炎症模型中具有显著的抗炎特性。我们探讨了LGS可能抑制JNK和Nur77激活的潜在机制。这些发现为应用LGS成为一种治疗急性炎症疾病的有效药物提供了基础。