杂志：International Journal of Molecular Sciences
通讯作者单位：复旦大学附属儿科医院儿童保健科，国家儿童医学中心，上海市万源路 399号，中国，201102
摘要
对感觉输入的过度反应是自闭症谱系障碍(ASD)的一种常见且使人衰弱的症状，但潜在的神经异常尚不清楚。在我们的临床队列筛查中，3例携带新发SHANK2突变的患者中有2例也表现出对视觉、听觉和触觉刺激的高敏感性，因此我们通过生成稳定的shank2b缺陷斑马鱼模型(shank2b−/−)来研究SHANK2缺陷是否会导致感觉异常和其他ASD样表型。成年shank2b−/−斑马鱼表现出社会偏好和亲属偏好降低，行为刻板印象增强，而幼鱼在黑暗到光明的过渡过程中表现出对听觉噪音的超敏感和异常多动。因此，该模型概括了以往许多遗传ASD模型的核心发育和行为表型。γ-氨基丁酸(GABA)受体亚基mRNA和蛋白的表达水平也在shank2b−/−斑马鱼中降低，这些动物对药物诱导的癫痫发作表现出更大的敏感性。我们的研究结果表明，GABAergic功能障碍是ASD感觉超反应的主要原因，并强调了在早期神经发育过程中针对感觉处理中断进行干预的必要性，以防止疾病进展。关键词：斑马鱼；自闭症谱系障碍；shank2；行为；GABAR。
介绍
自闭症谱系障碍(ASD)是神经发育综合征的总称，其特征是社交互动和沟通缺陷、刻板重复行为、兴趣限制和各种感觉异常。ASD的非典型感觉处理可能表现为对环境的特定感官方面的超敏、低敏或异常兴趣，这种异常在高达90%的自闭症个体中都存在。此外，这些异常影响每一种感觉形态(视觉、嗅觉、味觉、听觉、本体感觉、触觉和平衡)。非典型的视觉处理已经在人类婴儿中被观察到，这些婴儿早在6个月大的时候就患上了自闭症，这比核心自闭症表型(如联合注意力障碍)(14-18个月)要早得多。此外，先前的研究已经报道了自闭症儿童关节注意力较低与缺乏对社会和非社会感官刺激的定向之间的联系。婴儿的感觉症状不仅先于而且预示着儿童时期的社交缺陷、重复行为和最终的ASD诊断。因此，感知症状可以作为ASD的早期诊断生物标志物，为潜在的病理生物学提供线索，并为治疗干预提供新的靶点。许多基因都与自闭症有关，包括那些调节突触传递的基因。其中包括SHANK2，它在谷氨酸能突触上编码一种主要的支架蛋白(SHANK2/ProSAP1)，这对突触后密度(PSD)的组装和完整性至关重要。先前的研究已经发现了18例神经发育障碍患者携带人类SHANK2基因的新生变异，我们在临床筛查队列中发现了另外3名患者存在SHANK2基因的新变异体。此外，其中2例患者表现出智力缺陷和对感官刺激的高度敏感性，如对突然声音的过度反射反应和对外部视觉刺激的被动寻求。与临床观察一致，Shank2基因敲除小鼠也表现出对疼痛刺激的低敏感性。因此，我们推测自闭症患者的SHANK2功能丧失可能与异常的感觉加工有关，特别是听觉和视觉通路。然而，确切的分子机制仍有待阐明。这些ASD相关的感觉缺陷和核心症状行为归因于抑制性γ-氨基丁酸(GABA)信号缺乏导致兴奋性和抑制性神经传递不平衡。自闭症患者GABAergic功能障碍的证据包括:自闭症患者死后脑组织GABA受体亚单位表达不足，自闭症与GABAergic基因等位变异之间的联系，以及在许多其他不同的自闭症动物模型中GABAergic传播缺陷。此外，最近的一项人类研究发现，自闭症患者缺乏双眼竞争，这依赖于皮质GABAergic信号。也有证据表明自闭症的触觉和听觉处理缺陷与GABAergic功能障碍有关。总的来说，这些发现表明，GABAergic信号的改变可能导致自闭症患者的异常感觉知觉。斑马鱼是研究包括ASD在内的神经系统疾病在遗传、发育和行为水平上的有力工具。在这里，我们报道了一个shank2突变斑马鱼系的产生，这为shank2缺陷在ASD的感觉处理和行为异常中的作用提供了强有力的支持。此外，我们报道这些动物表现出GABA受体在大脑中的表达减少，对药物引起的癫痫发作的敏感性增强，表明GABAergic信号传导不足。
养鱼及饲养
Tubingen(Tu)株斑马鱼饲养在中国上海复旦大学儿童医院斑马鱼研究所。幼鱼和成鱼都在28.5℃的再循环系统中保持在14小时/10小时的昼夜节律周期下。所有动物实验均按照《实验动物护理与使用指导原则》进行，并获得复旦大学儿童医院机构动物护理委员会的批准。
利用CRISPR-Cas9系统培养shank2b缺陷斑马鱼
通过搜索NCBI数据库(基因ID: shank2b NC_007136.7)确定斑马鱼shank2b基因和外显子/内含子边界，并使用先前报道的CRISPR/Cas9编辑产生shank2b突变。shank2b的位点特异性单导RNA (sgRNA)被设计为针对第10外显子序列5'-GGATCGGAGCAGCACTCGCG-3'，并使用MAXIscript™T7试剂盒(AM1314M, Invitrogen, Waltham, MA, USA)通过体外转录合成。然后用微型注射器将150:600 pg的sgRNA: cas9核酸酶(En Gen™spy cas9 NLS #M0646, New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)注射到单细胞期受精的WT斑马鱼胚胎(F0)中。注射后的胚胎培养72 h，然后制备基因组DNA，使用补充表S1和Sanger测序中列出的引物检查诱变效率。然后分析鉴定出的突变，寻找可用于基因分型的独特限制性内切酶消化位点。通过与WT斑马鱼的一系列异交繁殖后代，并对每一代进行基因分型。最终，将这些动物进行杂交以获得纯合子缺陷shank2b−/−突变体。
RT-qPCR
通过RT-qPCR分析胚胎在24hpf、48hpf、3dpf和5dpf时基因表达的变化。所有的分析包括三个或四个独立的胚胎池，每个胚胎池25个胚胎。采集受精后3周的幼鱼和受精后2个月的成鱼脑(3个独立脑池，每池10尾)。采集成年雄性斑马鱼的大脑、心脏、肝-胆-脾、皮肤-肌肉和精索组织，以及成年雌性斑马鱼的卵巢组织(每种组织类型3个池，每个池5条鱼)，并在干冰上速冻。使用MiniBEST通用RNA提取试剂盒(编号9767,Takara, Japan)按照制造商的方案从采集的组织和整个胚胎中提取总RNA，并按照制造商的说明使用带有gDNA橡皮(Perfect Real Time) (RR047A, Takara, Japan)的primer - script™RT试剂试剂盒逆转录为cDNA。采用Applied Biosystems™7500系统(Bio-Rad，美国)和TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (RR820A, Takara，日本)进行RT-qPCR，根据制造商的方案估计shank2b, shank2a和GABA受体亚基的mRNA表达水平。采用delta CT法将表达水平归一化为Rpl13α作为内控。RT-qPCR引物序列见补充表S1。所有的测量都是在至少三个独立采集的组织池或整个胚胎上进行的。
WB
HUABIO利用两种蛋白共享的肽抗原(CRSLSMPDTSEDIPP-amide，对应shank2的860 ~ 873个氨基酸)生成了一种定制抗体识别斑马鱼shank2a和shank2b (RB1661)。对于Western blotting，从4.5 mpf WT和shank2b−/−斑马鱼的大脑中分离总蛋白，通过SDS-PAGE(每凝胶道50µg)分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%牛血清白蛋白或7%脱脂奶粉在室温下封闭膜2小时，用抗GABARα亲和纯化的一抗(Abcam, ab211131, 1:1000)在4℃下孵育过夜，用含有0.1% tbn -20 (TBST)的TBS洗涤，用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(1:5000)在室温下孵育1小时。在TBST中洗涤三次后，用ECL试剂(BeyoECL Plus, P0018M)孵育，并暴露于柯达x射线胶片(Tanon 5200)。通过ImageJ软件(NIH, Bethesda, MD, USA)分析蛋白质的灰度值，并归一化为GAPDH(1:5000)作为上胶对照。
幼鱼对光和黑暗的反应
使用Zebrabox系统(ViewPoint Life Sciences, Lyons,France)将7英尺高的斑马鱼幼鱼单独放置在24孔板的孔中，对活动进行视频记录。采集视频前，给每只幼鱼45 min适应光照环境。随后，将幼虫暴露在5分钟的连续照明下，然后进行一个暗/光循环(5分钟暗和5分钟明，图2K)。光照期光照强度为100%，暗期光照强度为0%。使用视点跟踪系统和定制软件每30秒记录一次行驶的时间和距离。为了进行分析，我们在每口井的中心画一个圆圈，将井划分为等面积的内、外区域(图2K)，并将其定义为：幼鱼趋触性=在中心区域移动的距离/在整个区域移动的距离在13 dpf时收集野生型和shank2b−/−幼鱼，按照先前发表的方法评估ASR。简单地说，将幼虫单独放置在24孔板的孔中，并在配备红外照明器的斑马箱内暴露于宽带噪声中，以便在黑暗中成像。宽带噪声是由计算机产生的，并通过放置在室内但没有物理连接的两个商用扬声器播放。视频片段以每秒25帧(fps)的速度拍摄，并分成1-s的时间窗来评估ASR。经过60分钟的适应期后，斑马鱼在三个单独的ASR实验中进行监测，其中包括5分钟的环境声音调节和15秒的突然大声噪音刺激(图3I)。将各组在每次突然声音暴露前1分钟和15秒内的活动计数量化，并根据以下公式计算ASR:ASR测试中的活动变化=15s噪音阶段的平均活动(后)- 60s噪音前(前)的平均活动
视觉运动行为测验
将13 dpf的幼鱼单独移栽到24孔板的孔中，分析从光到暗和从暗到光的转换过程中的视觉运动行为。简而言之，视频采集和跟踪的规格与ASR试验中的规格相同。为了分析明暗转换期间的行为变化，将鱼在连续最大白光照射下适应观察室1小时(适应阶段)。然后，进行3次熄灯周期(5分钟照明，随后是黑暗)(补充图S3A)。为了分析暗光转换过程中的行为变化，我们将鱼在黑暗的观察室中驯化了1小时(适应期)。然后，进行3次光照循环(黑暗5分钟，光照15秒)(图3A)。根据以下公式分析WT和shank2b突变体的活性变化:活性变化(从亮到暗的转变)=暗后15 s检测到的活性−光照前60 s检测到的活性活动变化(暗转亮)=光照后15 s检测到的活动−光照前60 s检测到的活动为了评估行为改变和癫痫易感性作为E/I失衡的指标，我们测量了9只dpf幼鱼对GABAA受体拮抗剂PTZ的剂量反应。野生型和shank2b−/−幼鱼分别放置在24孔板的孔中，其中含有标准胚水和不同浓度的PTZ (P6500, Sigma-Aldrich, Zwijndrecht，荷兰)预溶解于蒸馏水中。简单地说，建立了四个处理组:wt-标准水、WT-PTZ、shank2b-/-标准水和shank2b-/- PTZ。将PTZ先用蒸馏水溶解，再用亚甲基蓝稀释体系水(0.15 mg/L亚甲基蓝、8.01 mg/L NaCl、5.04 mg/L KCl、5.50 mg/L Na2HPO4、0.44 mg/L KH2PO4、1.30 mg/L CaCl2、1.00 mg/L MgSO4和4.20 mg/L NaHCO3)溶解，得到工作溶液。随后，将500µL PTZ工作溶液快速加入每孔500µL标准蛋水中，使最终体积达到1 mL/孔，含有1,2.5,5或7.5 mM PTZ。然后将盘子放在一个定制改造的斑马鱼箱中，以记录斑马鱼幼鱼活动的视频。经过5分钟的光照适应期后，记录45分钟的自发活动。然后将动物暴露在一个10分钟的光-暗循环中(5分钟光照后5分钟黑暗)，以检查PTZ影响下对光照条件变化的反应。通过比较从亮到暗转换前后一分钟内所走的距离来分析反应。包括驯化期在内，每次试验共60 min(补充图S4A)。我们使用了一种新的行为测试来确定7.5 mM PTZ是否在WT和9 dpf突变鱼中引起了最大的差异反应，因为它在shank2b突变体中引起了异常活性。简而言之，将9 dpf的shank2b−/−和WT幼鱼分别移栽到含有1ml标准胚水的24孔板的孔中，并使用上述范例记录活性。随后，去除500µL蛋水，将500µL蛋水中的PTZ加入到孔中，得到最终的PTZ浓度为7.5 mM。我们使用重复的光暗激发实验来诱导PTZ诱导的反应(图4C)。通过将每个WT和shank2b突变鱼的ptz后活性归一化到基线来分析反应。
旷场试验
成年斑马鱼的运动活动在2-4 mpf下进行了适应性开阔场范式测试(图2H)。视频是在一个30 × 30 × 30厘米的不透明水箱中拍摄的，水箱中装满了系统水。每只雄性斑马鱼在30分钟的记录期前在水箱中习惯5分钟。每隔30秒使用Zebralab软件(ViewPoint Life Sciences, Lissieu, Calvados, Lower Normandy Region, Lyons, France)分析一次运动时间和行进距离。对于刻板行为的分析，不考虑基因型和治疗史的实验者每分钟从鱼轨迹的转换视觉路线中对游泳模式进行评分，并统计小圈圈和绕墙两种刻板游泳模式的频率(图2F)。成年斑马鱼的运动活动在2-4 mpf条件下在开放场模式下进行测试(图2H)。视频是在一个30 × 30 × 30厘米的不透明水箱中拍摄的，水箱中装满了系统水，使用悬挂在上方的摄像机。在30分钟的测试之前，每只雄斑马鱼在水箱中习惯5分钟。利用Zebralab软件，每隔30秒采集30分钟录像中的时间和距离进行分析。对于刻板行为，要求实验者在双盲控制下，对斑马鱼轨迹视觉路线每分钟内的游泳模式进行评分，并分别统计四种刻板游泳模式片段的次数，即小圈圈和围墙(图2F)。趋近性(Thigmotaxis)是成年斑马鱼的一种经过充分验证的焦虑症状，其评分为:趋近性=周边区域移动的距离/整个区域移动的距离
三腔社会偏好测验
社会偏好测试在一个透明的交配池(尺寸为21 × 11 × 7.5 cm)中进行，该交配池由两个透明隔板分成三个腔室。将6只大小相似的雄性同种野鼠放入一个外室，而另一个外室不被占用(图2A)。然后，受试者雄性斑马鱼(WT或突变体)在3.5 mpf下被放置在中间的腔室中，并给予5分钟自由进入整个装置的时间。录制30分钟的视频。社会偏好行为被量化为与同类群体相邻的距离或时间。距离比为在与同形腔室相邻的同形扇区内走过的距离除以走过的总距离，时间比为在与同形腔室相邻的同形扇区内度过的时间除以总试验时间。为了进一步分析shank2b−/−斑马鱼的社会性，我们在同一水箱中进行了亲缘偏好测试。简单地说，三只成年近亲斑马鱼被放置在左外室，三只成年非近亲斑马鱼被放置在右外室(图2C)。然后，将被试雄性斑马鱼(WT或突变体)置于3.5 mpf的中间室中。社会偏好是通过社会偏好指数(SPI)来评估的，其中:SPI=在特定区域的距离或时间-在空区域或非亲属区域的距离或时间/两段距离或时间
统计分析
所有数据均使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)进行处理。采用单侧t检验、Mann-Whitney检验或配对t检验确定差异的显著性。
结果
斑马鱼有两个shank2类似物，在发育过程中表达，并在成熟的中枢神经系统中继续丰富(补充图S1A,B)。Shank2a和shank2b蛋白与人类蛋白的同源性分别为46.63%和60.58%(补充表S2)，并且包含相同的主要功能域(图1A，补充表S3和S4)。此外，来自多个物种的蛋白质序列比较显示，脊椎动物中SHANK2具有高度的进化保守性(补充图S1C)。为了检验shank2的功能，我们使用CRISPR/Cas9靶向shank2b基因的第10个外显子，产生了一个shank2b缺陷的斑马鱼品系，产生了一个14bp的缺失(图1A，补充图S1D)。由此产生的帧移位在外显子13上产生一个过早的停止密码子，破坏下游PSD-95/Discs large/ZO-1 (PDZ)和无菌α基序(SAM)结构域的氨基酸序列(图1A)。为了评估突变的shank2转录本是否受到无义介导的衰变的影响，我们检测了斑马鱼大脑中shank2b mRNA的表达。定量RT-PCR (RT-qPCR)显示，与野生型(WT)相比，纯合突变体中shank2b mRNA的表达总体减少(图1B)，而shank2a mRNA的表达在基因型之间没有差异(图1C)。与WTs相比，心脏、肝-胆-脾、皮肤肌肉和性腺中shank2b mRNA的相对丰度也显著降低，表明通过无义介导的衰变丢失了突变转录本(补充图S1E)。我们观察到WT和纯合子shank2b−/−成鱼的大体形态没有差异(补充表S6和S7)。与WTs相比，受精后58 h (hpf)的shank2b−/−斑马鱼幼鱼显示出较小的头部表型和较短的体长(补充图S2A-D)，但几个头部测量参数与体长的比率是正常的(补充图S2E,F)，并且成年突变鱼的所有大脑区域都保存完好(补充图S2G)。
图1 利用CRISPR/Cas9技术生成斑马鱼shank2b突变体。(A)斑马鱼shank2b基因及蛋白结构。蛋白结构域(ANK，锚蛋白重复结构域;SH3, Src同源3域;PDZ、PSD-95/光盘大/ZO-1域;SAM(无菌α基序结构域)与相应的外显子对齐。CRISPR/Cas9基因编辑的斑马鱼shank2b基因组DNA第10外显子靶位图和14bp缺失突变斑马鱼野生型(WT)和shank2b突变蛋白的结构预测。14 bp的缺失导致在第13外显子上出现一个终止密码子，并在PDZ和SAM结构域前过早终止。(B)与WT鱼相比，在受精后4.5个月(mpf)， shank2b−/−成年雄性斑马鱼大脑中shank2b mRNA的表达减少(WT n = 4, shank2b−/− n = 4， **** p < 0.0001，学生t检验)。数据以平均值±SEM表示。(C) WT和shank2b−/−成年(4.5 mpf)雄斑马鱼脑内shank2a mRNA的表达不受影响(WT n = 3, shank2b−/− n = 4, ns, p = 0.1957, 学生t检验)。数据以平均值±SEM表示。
成年和幼体shank2b−/−斑马鱼的自闭症样行为
人类遗传学研究表明SHANK2与自闭症有关，之前的啮齿动物实验已经报道了两种不同的Shank2突变小鼠的自闭症样行为，以及Shank2∆e24小鼠的社交和认知行为受损。我们进行了一系列行为测试，以评估shank2b−/−斑马鱼是否也表现出类似于人类SHANK2突变相关的ASD样表型。我们首先使用三室测试来测试社会偏好行为。如图2B所示，与WTs相比，中央室的成年shank2b−/−突变体在同一扇区中花费的时间更短，游的距离更短。此外，相对于另一个外腔的非亲缘鱼，突变体对一个外腔中的亲缘鱼没有表现出偏好(即，它们不会花更多的时间在毗邻腔的区域游泳)，这与WTs的显著亲缘鱼偏好形成鲜明对比(图2D)。此外，shank2b−/−斑马鱼比WT斑马鱼花更少的时间和更短的距离平行于同种鱼(图2E)。这些结果表明，shank2b缺乏导致斑马鱼的社会偏好低。同样与ASD样表型一致的是，成年shank2b−/−斑马鱼在开阔的环境中花更多的时间从事重复和刻板的游泳行为，尤其是刻板的墙壁游泳(墙壁)(图2G)。突变体也表现出更大的小圈游动频率，尽管与WTs的差异没有达到统计学意义(图2G)。成年shank2b−/−斑马鱼在开阔区域的整体运动活动也明显大于WTs(图2I)。此外，成年shank2b−/−斑马鱼在新鱼缸外围区域行走的总距离比例(百分比)(thigmotaxis)显著低于成年shank2b−/−斑马鱼(图2J)，表明它们有更高的特质焦虑。同样，与年龄匹配的WTs相比，受精后7天(dpf)的斑马鱼幼虫在水箱外围相对于中心的游泳距离比例更大(图2L,M)。与WT相比，shank2b−/−幼鱼在暗光周期的第一个黑暗期(D1)的中心距离比显著降低，在第一个光明期(L1)的中心距离比也显著降低。在连续光照下，7 dpf时，shank2b−/−幼鱼的趋动性也更强(L0)。总的来说，这些发现表明shank2b缺陷会导致焦虑样行为表型的增强。
图2 shank2b−/−缺陷斑马鱼表现出自闭症样行为。(A)成年雄性斑马鱼社会偏好测试示意图。(B)与WT相比，shank2b−/−斑马鱼对同种特异性的偏好显著降低(时间比，** p = 0.0063;距离比，** p = 0.0057;WT, n = 12, shank2b−/−，n = 18，学生t检验)。数据以平均值±SEM表示。(C)成年雄性斑马鱼亲缘偏好测试示意图。(D) shank2b−/−斑马鱼明显倾向于花时间探索非亲缘部分以与红鱼互动(n = 15， * p = 0.0278，配对t检验)，而WT斑马鱼更倾向于同种鱼(n = 11， * p = 0.0498，配对t检验)。(E)此外，与WT斑马鱼相比，突变体亲缘偏好指数显著降低(时间比，** p = 0.0018;距离比，*** p = 0.007;学生t检验)。数据以平均值±SEM表示。(F)斑马鱼的刻板游泳模式表现为“小圈子”和“壁式”。(G)经Mann-Whitney检验，4强条件下，shank2b−/−斑马鱼的“小圆”刻板行为频次增加(p = 0.0941)，“墙”刻板行为频次显著增加(* p = 0.0284)。(H)露天试验示意图。(I)与WT斑马鱼相比，shank2b突变体在2mpf下的速度(以本试验30 min内每秒移动的平均距离来量化)有所增加(WT n = 20, shank2b−/−= 22，**** p < 0.0001, Student’s t检验)。数据以平均值±SEM表示。(J)在thigmotaxis测试中，个体WT和shank2b−/−斑马鱼在2 mpf下的代表性痕迹。shank2b−/−斑马鱼倾向于停留在中心区域，从而使thmomotaxis的距离比显著降低(WT n = 18, shank2b−/−= 22，* p = 0.0104, Student’s t检验)。数据以平均值±SEM表示。(K)光暗实验设置，用于分析受精后7天(dpf)幼鱼。(L)横轴表示明暗交替的时间段。纵轴表示在中心环中移动的距离的比率。(M)光照条件下，7 dpf下的shank2b−/−幼鱼在L0期显著减少，在L1期有减少的趋势。结果表明，与WT幼鱼相比，黑暗条件下(D1)也显著降低。L0(左)，** p = 0.0036;D1(中)，** p = 0.0033;L1, p = 0.0663。WT幼鱼n = 36, shank2b−/−幼鱼n = 34。学生t检验。数据以平均值±SEM表示。
shank2b−/−幼鱼对视觉和听觉刺激的异常反应
据报道，SHANK2缺乏的人有不典型的感觉处理能力。为了确定shank2b幼鱼是否表现出类似的感觉加工异常，我们比较了突变体和WT幼鱼对光-暗或暗-光转换的视觉运动反应(VMRs)和对高强度声音刺激的惊吓反应。斑马鱼幼体通常在突然的光-暗过渡(黑暗刺激)下表现出显著增强的活动(补充图S3B-D)，而在突然的暗-光过渡(光刺激)下表现出短暂的活动减弱(图3B-D)。然而，当暴露于突然的光刺激时，13dpf shank2b−/−幼鱼的活性没有显着变化，而不是预期的活性降低，一些动物在第二次或第三次黑暗到光明的转变中表现出活性增加(图3E-G)。总体而言，WT和shank2b−/−突变体幼鱼在从暗到光的转变过程中存在显著的活性差异(图3H)。相比之下，两种基因型都表现出对光-暗过渡的响应活性增加(补充图S3E-G)，并且在三个光-暗过渡周期中，基因型之间的这种变化幅度没有显著差异(补充图S3H)。斑马鱼幼体通常会对突然的宽带噪声做出反应，其运动活动会急剧增加(图3J,K)，这类似于在啮齿动物和人类中观察到的声惊吓反应(ASR)。此外，与其他动物的ASR一致，13 dpf的WT幼鱼对重复的刺激表现出一定程度的习惯。然而，与WTs相比，突变体在第一次刺激下表现出明显增强的活性，表明基线ASR敏感性更高，与WTs相比，突变体对第二次刺激的反应更大(图3M,N)，表明习惯化程度降低。突变体对第三种刺激的ASR在数值上也大于WTs，但差异没有达到统计学意义(图3P)。
图3 shank2b幼鱼对视觉和听觉刺激的异常反应。(A) 13 dpf光刺激下斑马鱼幼体VMR运动活动跟踪方案和行为设置。实验包括连续黑暗条件下60 min的适应期和20 min 45 s的三次VMR测试期。VMR实验包括5分钟的黑暗适应和15秒的突然光刺激。(B-D) 13 dpf时WT幼鱼对突然光刺激的反应正常下降(第一次光刺激，*** p = 0.0006;第二次光刺激，**** p < 0.0001;第三光刺激，**** p < 0.0001。n = 23，配对t检验)，(E-G)，而shank2b−/−模型在暗-光过渡期间表现出完全不同的反应，其特征是活动动态轻微增加，但无统计学意义(第一次光刺激，ns p = 0.3395;第二次光刺激，ns p = 0.7621;第三光刺激，ns p = 0.3446。N = 24，配对t检验)。(H)柱状图比较WT和shank2b突变体在每次光刺激前1分钟和后15秒检测到的活性。WT和shank2b幼鱼从黑暗到光明的每一次转变都诱导了活性变化的显著差异(第一次光刺激，** p = 0.0029;第二次光刺激，**** p < 0.0001;第三光刺激，**** p < 0.0001。WT, n = 23, shank2b−/−n = 24, Student’s t检验)。数据以平均值±SEM表示。(1) 13 dpf条件下斑马鱼幼体AMR对大噪声刺激的运动活动跟踪方案和行为设置。试验包括60 min的预试期和20 min 45 s的正试期，由3个AMR试验组成。AMR实验包括5分钟的环境声调节和15秒的突然噪音刺激。(J-L) WT幼鱼在13 dpf时，在两次ASR试验后，第三次噪声刺激诱导的活性显著增强(第一次噪声刺激，ns p = 0.8148;第二噪声刺激，ns p = 0.8905;第三噪声刺激，** p = 0.0028。N = 20，配对t检验)。(M-O)第一次和第二次噪声刺激诱导shank2b−/−幼鱼活性显著增加(第一次噪声刺激，**** p < 0.0001;第二噪声刺激，*** p = 0.0003;第三噪声刺激，ns, p = 0.1257。N = 20，配对t检验)。(P)柱状图比较了WT和shank2b突变体每次大噪声刺激前1分钟和后15秒检测到的活动。同样，在前两次突然噪声刺激下，shank2b幼鱼在13 dpf时的速度变化比WT幼鱼更剧烈(第一次噪声刺激，p = 0.0638;第二噪声刺激，* p = 0.0369;第三个暗噪声，ns p = 0.1645。WT n = 20, shank2b−/− n = 20, 学生t检验)。数据以平均值±SEM表示。
shank2b−/−斑马鱼的GABAergic缺陷
ASD小鼠模型中的非典型感觉反应与GABAergic中间神经元发育的改变有关。为了研究GABAergic神经元发育或信号传导的改变是否也发生在shank2b突变体中，我们比较了成年WT和shank2b−/−突变体之间GABA受体亚基的mRNA水平。事实上，RT-qPCR显示，与WTs相比，shank2b−/−斑马鱼中gabra1、gabra2a、gabra4、gabra5、gabra6b、gabrb2a、gabrg1和gabard的mRNA表达水平显著降低(图4A)。此外，突变体中GABAA受体α1蛋白的表达也显著降低，提示GABAergic系统功能障碍，并伴随兴奋/抑制平衡的兴奋性转移(图4B)。为了进一步证明这种转变，我们检测了WT和突变体幼虫对GABAA受体拮抗剂戊四唑(PTZ)诱导的癫痫发作的易感性，PTZ广泛用于啮齿动物模型和斑马鱼的癫痫发作。ptz诱发的癫痫发作表现为预期运动活动的抑制，随着从亮到暗的突然转变而增加。shank2b突变体对ptz诱导的行为改变表现出更大的敏感性，这与GABA受体信号缺陷导致的兴奋/抑制平衡的兴奋性转变相一致(补充图S4B-D,H,I)。此外，与年龄匹配的WT幼鱼相比，PTZ处理在9 dpf时诱导shank2b−/−幼虫在明暗过渡期间的活性变化明显更多(图4D-G)。总的来说，我们的研究结果提供了强有力的证据，表明神经发育GABAergic信号缺陷是shank2b突变的ASD样行为异常的基础。
图4 shank2b突变体显示GABAergic缺陷。(A) RT‐qPCR显示GABAR亚基在成鱼shank2b−/−脑组织中的表达水平发生改变。Gabra1， ** p = 0.003;Gabra2a， * p = 0.0394;Gabra3 ns p = 0.0993;Gabra3 ns p = 0.0660;Gabra4， * p = 0.0341;Gabra5， * p = 0.0371;Gabrg2 ns p = 0.0730;Gabra6a ns p = 0.3488;Gabra6b， * p = 0.0138;Gabrb1 ns p = 0.1258;Gabrb2a， ** p = 0.0083;Gabrg1， ** p = 0.005;gabard， * p = 0.0318;每组N = 3-4。学生t检验。数据以平均值±SEM表示。(B)成鱼shank2b−/−脑组织中GABAA受体α1蛋白的Western blot分析。* p = 0.0313, WT n = 3,shank2b−/−n = 4, 学生t检验。数据以平均值±SEM表示。(C)戊四唑(PTZ)处理行为实验程序。(D)实验由光暗转换期间的基础活性变化和7.5 mM ptz诱导的基础活性变化组成。(E) 9 dpf时WT幼鱼在光暗转换过程中表现出活力的动态增加(WT + v (vector) light vs. WT + v dark， ** p = 0.0022，;N = 17，配对t检验)。值得注意的是，PTZ浓度为7.5 mM的WT幼鱼在9 dpf时没有导致活性下降(WT + PTZ光vs WT + PTZ暗，ns, p = 0.3869, n = 17，配对t检验)。(F)然而，7.5 mM PTZ诱导shank2b突变体活性下降(shank2b−/−+ V光vs. shank2b−/−+ V暗，*** p = 0.0005;shank2b−/−+ PTZ光vs. shank2b−/−+ PTZ暗，* p = 0.0157;N = 16，配对t检验)。(G)有趣的是,活动改变shank2b幼鱼9 dpf 7.5毫米PTZ治疗后多活动改变PTZ治疗前(shank2b−/−−基线与shank2b−/−+ PTZ, * * * p = 0.0006, n = 16,配对t检验),甚至大于WT幼虫后的活动改变对待PTZ (WT + PTZ与shank2b−/−+ PTZ, * * p = 0.0096 WT + PTZ n = 17日shank2b−/−+ PTZ / n = 16 t测试)。值得注意的是，9 dpf的WT幼鱼在7.5 mM PTZ处理前后明暗转换期间的活性变化无显著差异(WT-baseline vs. WT + PTZ, ns p = 0.0961, n = 17，配对t检验)。
人类遗传学研究表明，SHANK2与广泛的神经发育状况有关，包括自闭症症状、智力残疾、多动和焦虑。在我们的临床队列筛选中，三分之二携带SHANK2突变的患者也表现出对视觉、听觉和触觉刺激的超敏感性，但很少有SHANK2缺陷感觉表型的描述。异常的感觉反应性现在被认为是ASD的一个诊断特征，但在之前已知的18例携带从头SHANK2变异的患者中，只有1例接受了非典型感觉处理的详细检查。目前的研究扩大了shank2缺陷动物模型所表现出的潜在行为表型的范围。此外，这种表型特征与人类SHANK2相关疾病的临床特征谱大致一致。这些shank2b突变斑马鱼在野外过度活跃，在连续光照下表现出焦虑样表型，社会偏好和亲属偏好降低，刻板印象增强。此外，shank2b突变体显示GABA受体亚基mrna和α1亚基蛋白的表达水平降低，对药物性癫痫发作的敏感性增加。有趣的是，一些参与GABAergic信号的分子已经被认为与自闭症的感觉症状有关。综上所述，我们的数据表明，shank2b−/−斑马鱼是一个有价值的模型，用于解剖人类ASD的病理生理，ASD的感觉异常可能至少部分源于GABA受体活性降低。研究表明，改变该蛋白不同区域的两系Shank2敲除小鼠表现出相似的自闭症行为表型，这与第三系Shank2∆ex24敲除小鼠表现出的双相相关躁狂样行为不同。一般来说，所有三种常规和其他条件Shank2缺陷小鼠模型都显示出明显的神经精神样表型，除了对疼痛刺激不敏感外，没有感觉异常。在这里，我们在斑马鱼中创建了shank2b−/−模型来测试自闭症和感觉处理问题的共同相关性。通过两个基于光刺激的任务和一个基于噪声刺激的任务，详细检查了与shank2b缺陷相关的潜在感觉加工缺陷，所有这些任务都表明，与WT幼鱼相比，突变幼虫的刺激敏感性增强。突变体表现出夸张的声惊吓反应和减少的ASR习惯，以及对从黑暗到光明的突然转变的相对过度活跃的反应。我们目前的行为研究表明，这种视觉反应过度活跃有助于减少亲属偏好。同样，在ASD和相关神经发育障碍的几种小鼠模型中也观察到视觉过敏，包括Mecp2、Fmr1、Shank3、Gabrb3和Cntnap2突变/缺陷的系。这些异常的感觉行为支持斑马鱼模型在研究人类SHANK2相关ASD中的面部有效性。这些与ASD相关的感觉异常和其他症状行为可能是由于抑制性GABA神经传递不足导致突触兴奋和抑制之间的不平衡。反过来，GABAergic功能障碍可能是突触形成、信号传导和分子组织所必需的基因突变的下游后果，因为一些携带ASD突变的小鼠系显示出抑制信号被破坏。例如，缺失自闭症风险基因接触蛋白相关蛋白2 (Cntnap2)会减少小鼠皮质中GABAergic中间神经元的数量，包括快速尖峰的小蛋白免疫阳性中间神经元。斑马鱼cnnap2ab突变体也表现出GABAergic神经元数量的减少，特别是小白蛋白阳性(PV+)中间神经元。在缺乏Shank3的小鼠中，体感觉皮层(S1)和杏仁核基底外侧(BLA)的PV+中间神经元减少。虽然Shank家族蛋白在兴奋性突触后密度中富集，但大量研究也表明其广泛表达于GABAergic神经元，包括pv阳性中间神经元。例如，Shank1基因敲除小鼠的PV免疫反应性也降低，Shank2基因敲除小鼠的GABAergic神经传递受损。中间神经元在感觉加工过程中起着至关重要的作用，上述shank基因缺失与中枢神经系统GABAergic功能障碍之间的关联表明，shank2和其他家族成员在多个感觉系统中作为调节GABAergic信号传导的生物网络的一部分，导致ASD中观察到的感觉加工异常。在我们的研究中，这些突变鱼不仅表现出与人类一致的感觉表型，而且GABA受体的表达水平降低，对ptz诱导的癫痫发作的敏感性增加。RT-qPCR分析显示，gabra1、gabra2a、gabra4、gabra5、gabra6b、gabrb2a、gabrg1和gabard等亚基基因mRNA表达水平降低，GABAA受体亚基包括gabrg1、GABRA2、gabra4和gabra5与自闭症有关。GABAA受体α1蛋白的表达水平在shank2b−/−斑马鱼中也显著降低，而GABAA受体α1蛋白在啮齿动物视觉皮层发育的可塑性关键期起着关键作用。这些GABAA受体基因和蛋白质缺陷与光照下的多动症以及对ptz诱发的癫痫发作的敏感性增加有关，表明突变斑马鱼大脑中抑制驱动的丧失。GABAA受体活性通过刺激神经祖细胞增殖、迁移和分化、神经突生长和突触发生，对神经发育至关重要。此外，GABAergic中间神经元帮助建立感觉皮层的感受野组织。此外，目前有强有力的证据表明，GABAA受体基因和GABA中间神经元中其他相对高水平表达的基因在特发性ASD中的异常表达模式。因此，我们认为shank2有助于斑马鱼GABAergic网络的发育，而在发育过程中shank2表达的缺失会导致一生中感觉系统组织和感觉加工的异常，进而导致其他类似ASD的行为表型。重复和保守的shank2a和shank2b相似，在整个蛋白质结构上具有很高的序列同一性(补充表S5)，而shank2a的进化保守结构域的缺失可以被检测到(补充图S5和S6)。相比之下，人类SHANK2的几个重要蛋白——ANK、PDZ和SAMC末端区域在shank2b中比shank2a保守度更高(补充表S3和S4)。因此，shank2b更适合作为人类SHANK2的模型。然而，基于shank2a和shank2b转录本在斑马鱼大脑中的表达，我们也推测这两个相似物可能对斑马鱼神经系统的形成很重要。比较shank2a−/−、shank2b−/−和shank3&b双纯合模型的表型将是一件有趣的事情。本研究的另一个局限性是，我们没有直接分析GABAergic的中间神经元发育，也没有检查GABA激动剂是否减轻了shank2b突变体的行为异常。此外，shank3&b缺陷斑马鱼模型更适合全面揭示shank2调控斑马鱼GABAergic网络发育和行为的分子机制。总之，我们在一种新的shank2b缺陷斑马鱼模型中揭示了与GABAergic系统功能障碍相关的ASD样行为和感觉缺陷(图5)。该模型是解剖人类SHANK2相关疾病的病理生理学的有价值的工具，可能有助于开发新的治疗伴有异常感觉加工的ASD的方法。
图5 shank2缺失斑马鱼模型中GABAergic系统调控的潜在机制
基金：这项研究得到了国家自然科学基金(2021NSFC: 82171540 和 82101945)、上海卫健委重点学科建设项目(No.82171540 和 82101945)；shslczdzk02903)和国家自然科学基金(2017NSFC: 61733011)的支持。
原文：Wang Y, Liu C, Deng J, et al. Behavioral and Sensory Deficits Associated with Dysfunction of GABAergic System in a Novel shank2-Deficient Zebrafish Model[J]. International journal of molecular sciences, 2023, 24(3): 2208.
原文地址：https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2208
注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充图、表可以点击至原文查阅。
