杂志：Journal of Bone and Mineral Research
影响因子：6.2（2022-2023）
年份：2018
通讯作者：Björn Busse
通讯作者单位：Department of Osteology and Biomechanics, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Lottestr. 55A, 22529 Hamburg, Germany.
摘要
绝大多数成骨不全(OI)患者的过度骨骼变形和脆性骨折是骨质量大幅下降的结果。由于骨的力学能力依赖于小长度尺度的组织特征，因此评估骨成骨不全在骨的微纳米尺度上的表现是至关重要的。在这种背景下，吉娃娃(Chi/+)斑马鱼在I型胶原蛋白α1链中携带杂合甘氨酸取代，最近被提出作为经典显性成骨不全的合适动物模型，表现出骨骼畸形，矿化模式改变，体型较小。
本研究使用显微计算机断层扫描(micro-CT)、组织形态学测量、定量背散射电子成像、傅里叶变换红外光谱、纳米压痕和x射线显微镜评估了Chi/+在多个长度尺度上的骨质量特性。在骨骼水平上，Chi/+显示出较小的身体尺寸、畸形和肋骨中的骨折愈伤组织。全骨水平形态学变化表明，Chi/+椎体尺寸较小，厚度较小，形状扭曲。在组织水平上，与野生型斑马鱼相比，Chi/+表现出更高的矿化程度、更低的胶原成熟度、更低的矿物质成熟度、改变的成骨细胞形态和更低的骨细胞腔隙密度。Chi/+骨的细胞、组成和结构特性的改变可以解释局部力学特性受损，从而促进Chi/+整体骨脆性的增加。因此，Chi/+骨质量的定量评估进一步验证了该突变体作为反映与人类经典显性成骨不全相关的骨特征的重要模型。
关键词：骨组织形态计量学；遗传动物模型；骨基质；成骨不全症。
介绍
成骨不全症(Osteogenesis imperfecta, OI)是一种骨骼和结缔组织的遗传性疾病，其发病率约为万分之一，对骨骼生长和骨矿化具有多重影响。患病骨的机械完整性经常严重受损，导致骨脆弱性增加。因此，患者遭受过度的骨骼变形和多发脆性骨折。在绝大多数成骨不全患者中，骨折抵抗能力受损是由于负责合成I型胶原蛋白(骨的有机框架)的基因发生显性突变。这导致了有机基质结构的减少，伴随着矿化的延迟，从而延缓了骨骼的生长和成熟。
疾病的严重程度可根据成骨不全的类型而有所不同。在影响I型胶原蛋白基因的显性突变中，I型成骨不全是最轻微和最常见的形式，其表型包括儿童开始走路时发生的自发性骨折、轻微畸形、几乎正常的身材和轻度骨脆性。最严重和致命的形式是II型，胎儿经历子宫内骨折和出生前死亡。中间类型是III型，严重表型包括骨折、脊柱侧凸、严重变形和身材非常小，以及IV型，中度表型包括骨折和身材小。
由于这些类型的成骨不全通常在骨骼和全骨水平表现为低骨量并骨折或畸形，因此最初的诊断方法通常采用x线吸收仪和x线摄影。根据患者的骨活检，在骨的微观和纳米尺度上进一步在组织水平上表征成骨不全，观察到超微结构的改变与成骨不全的临床严重程度密切相关。对于I型至IV型成骨不全的组织，有报道称其在亚微米尺度上的力学行为受损，存在不规则的高矿化区域，以及纳米级骨成分(胶原原纤维和羟基磷灰石晶体)结构的变化。由于骨在小长度尺度上的材料特性决定了骨在全骨和骨骼水平上的力学能力，因此评估成骨不全以何种方式损害骨组织质量至关重要。然而，目前的治疗方案主要是通过增加整体骨量来增加骨强度。因此，包括肌肉骨骼运动在内的常规措施经常与广泛基于抗吸收双磷酸盐治疗的药理学方法相结合。然而，考虑到成骨不全症患者的年龄范围特别大，临床变异性和遗传多样性也很大，这种治疗方法的成功与否往往尚无定论。
因此，为了更好地了解该疾病对所有骨骼长度尺度的影响，并加快寻找脆性骨病的强化治疗方案，已经建立了大量的动物模型并进行了表征。除了研究得很好的哺乳动物模型，包括老鼠和狗，新的小型动物模型正在出现。斑马鱼(Danio rerio)因其发育时间短、与人类遗传相似、体型小、养殖成本低等特点，已成为生物医学研究领域有价值的动物模型。在OI和类似的遗传性骨骼疾病的背景下，迄今为止很少有斑马鱼突变被产生并表征骨骼表型。Fisher等人首先描述了吉娃娃(Chi/+)斑马鱼的显性G574D突变，该突变影响编码I型胶原α1链的col1a1a基因，因此与严重的显性人类OI具有遗传相似性。在α1(I)中携带甘氨酸取代，这些斑马鱼在骨骼生长和成熟方面存在缺陷和迟缓。最近，Gioia等人对Chi/+的骨骼表型进行了更全面的描述，他们通过对固定和体内样本进行特异性骨染色，证实了严重的骨骼畸形和延迟矿化，从而支持Chi/+突变体作为经典显性成骨不全的有希望模型的适用性。
为了扩大Chi/+作为人类OI模型的有效性，我们需要与健康对照相比，关于病变骨骼的组织和生物力学特征的进一步数据。本研究的目的是提供Chi/+斑马鱼在骨骼形态、脆性、结构和成分以及细胞和机械特性方面的变化的定量数据。采用多模态技术阵列从宏观到纳米尺度比较Chi/+和野生型斑马鱼的骨骼，以检验以下假设:Chi/+斑马鱼的骨骼材料特性的损害是导致骨骼脆性增加的原因，如对人类OI的描述。
材料和方法
吉娃娃鱼(Chi/+， col1a1adc124/+)和野生型AB (WT)斑马鱼在意大利帕维亚大学放射生物学研究中心进行室内饲养。突变体Chi/+在col1a1a中携带G2207A突变，导致I型胶原α1链中的G574D杂合替代。Gioia等人详细描述了斑马鱼的饲养、繁殖和饲养条件。幼虫体内骨形成特征已被量化;对成年斑马鱼进行了离体骨组织表征，该斑马鱼在10月龄时被处死，并在-80°C冷冻保存。
幼虫动态骨组织形态测定
在幼虫期进行动态骨组织形态学测定，以量化突变对椎组织骨形成率(BFR)的影响。在受精后8天(dpf)和10天(dpf)，使用0.2%钙黄蛋白作为重要染料对WT和Chi/+斑马鱼的钙化骨进行染色(每组n=6)。简单地说，将幼虫在溶液染料中转移10分钟，并用胚胎水洗涤。显微镜成像根据既定方法确定椎体中心2、3和4的面积。通过测量每个椎体在10 dpf和8 dpf时量化的椎体面积之间的比率来确定BFR。
整体骨架染色
为了表征成人骨骼骨折，按照Gioia等人的描述，对WT (n¼24)和Chi/+ (n¼29)斑马鱼的软骨和骨进行了阿利新蓝和茜素红染色。简单地说，将鱼固定在4%磷酸盐缓冲的多聚甲醛溶液中，去鳞和内脏，用丙酮脱脂，并用0.02%阿利新蓝8GX染色(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)。去除软组织后，用0.01%茜素红S (Sigma Aldrich)染色。图像采集使用徕卡M165 FC显微镜(徕卡，Wetzlar，德国)连接到徕卡DFC425 C数码相机。存在于肋骨中的愈伤组织由三名独立的观察者进行量化，对鱼的基因型不知情。
微型计算机断层扫描(Micro-CT)
使用5μm空间分辨率的微型计算机断层扫描(micro-CT)评估骨骼形态和骨微结构(Skyscan 1272, Bruker, Kontich, Belgium)。每组6条鱼在3.5%福尔马林中固定24小时，扫描时放置在潮湿的箱中。在55kv和166μA下进行全身扫描，不使用x射线滤光片。在NRecon (Bruker, Kontich, Belgium)的重建过程中，所有样品的环形伪影和光束硬化校正保持不变。在对所有样本应用固定阈值后，使用CTAn (Bruker, Kontich, Belgium)进行3D评估。在每只鱼的第一和第二前椎骨上量化Chi/+和WT的骨形态变化。神经弓和血管弓被排除在分析之外。确定的参数为椎体长度(VL, μm)、椎体厚度(V.Th, μm)、偏心率(Ecc, 0-1)和骨体积(BV, mm3)，定义为没有内腔的椎体。
傅里叶变换红外光谱学
利用傅里叶红外光谱分析了矿物相和胶原相的组成。每组6只斑马鱼在3.5%福尔马林中固定24小时，随后在增加浓度的乙醇中逐步脱水，然后包埋在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)中。样品块被抛光共面用于组织成分分析，其中在外侧平面切割的前椎体终板被选择为感兴趣的区域。使用FTIR光谱(Spotlight 400连接到Frontier 400, perkins - elmer, Waltham, MA, USA)以衰减全反射(ATR)模式扫描Chi/+和WT椎骨。获得尺寸为65μm ×130μm的地图，空间分辨率(像素大小)为1.56μm，每像素扫描8次，波数范围为4000 ~ 570 cm-1。使用自定义编写的Matlab脚本(R2016b, MathWorks, Natick, MA,USA)进行后处理和光谱分析，包括PMMA信号的减法，吸光度信号的平滑和线性基线的去除。根据原始光谱的二阶导数识别出感兴趣的峰。磷酸盐峰位于1154 ~ 900 cm-1之间，碳酸盐峰位于870 cm-1中心，酰胺I峰位于1710 ~ 1600 cm-1中心。通过划分各自的峰面积来确定骨组织参数，包括胶原成熟度(酰胺I亚峰1660/1690 cm-1)、碳酸盐-磷酸盐比(碳酸盐/磷酸盐面积)、结晶度(磷酸盐亚峰面积1028/1018 cm-1)和矿物-基质比(磷酸盐/酰胺I面积)。
定量背散射电子成像(qBEI)
为了分析Chi/+和WT斑马鱼的前椎椎骨的骨密度分布，我们对相同的样品和相同的感兴趣区域进行了电子成像，就像之前用FTIR光谱分析的那样。在成像之前，样品被碳涂层。扫描电镜观察每组6个标本(LEO 435 VP;LEO Electron Microscopy Ltd, Cambridge, UK)在20kv和680 pA下工作，恒定工作距离为20mm(疯牛病探测器，202型;K.E.发展有限公司，剑桥，英国)。根据先前描述的方案确定灰度值图像上的骨矿物质密度分布。使用碳铝标准对系统进行校准，便于骨矿物质作为钙重量百分比的定量。测定的参数包括平均钙含量(caamean, wt%)、骨矿物质分布的异质性(CaWidth, △wt%)和高度矿化骨的面积(CaHigh，%B.Ar.)。
纳米压痕
用纳米压痕分析了Chi/+和WT中椎组织的纳米力学性能。每组4个共面PMMA包埋的样品用3μm的金刚石悬浮液抛光，然后用1μm的金刚石悬浮液抛光，最后用0.05 μm的氧化铝悬浮液抛光，以降低表面粗糙度。为了去除表面碎屑，样品在去离子水中进行超声清洗。使用配备Berkovich钻石尖端的纳米压痕器(Nano压痕器G200, Keysight Technologies, Santa Rosa, CA, USA)对每个样品的两个椎骨进行8个压痕。在深度传感连续刚度模式下进行压痕，最终深度为500 nm。在每次测量之前和之后对熔融石英进行校准。凹痕的位置至少间隔20μm。在泊松比为0.3的情况下，使用内部软件(NanoSuite, Keysight Technologies, Santa Rosa, CA, USA)，根据olive - pharr方法获得弹性模量(E)和硬度(H)。此外，计算了弹性模量与硬度的比值，作为断裂韧性的替代指标。
静态骨组织形态测定
通过静态骨组织形态测量法评估成人WT和Chi/+的细胞和组织特征。如上所述，将鱼包埋在PMMA中(n=4/组)。用切片机沿脊柱制作4毫米厚的矢状切片，随后用甲苯胺蓝染色。使用Ostemeasure组织形态测量系统(OsteoMetrics, Atlanta, GA, USA)测定骨细胞和组织指数。提取以下参数:每骨周成骨细胞数(N.Ob/B;Pm, 1/mm)，每骨体积的骨表面积(BS/BV, mm2/mm3)，每骨体积的类骨体积(OV/BV，%)，以及每骨面积的骨细胞腔隙数量(N.Ot/B.Ar,1/mm2)。在20倍放大镜下对每条鱼的两个椎骨进行评估。
三维x射线显微镜
使用x射线显微镜(3D XRM, ZEISS Xradia 520 Versa, Carl ZEISS x射线显微镜，Pleasanton, CA, USA)进一步观察Chi/+和WT椎组织中的骨细胞腔隙网络。从新鲜冷冻动物上解剖椎体，仔细去除周围软组织，将样品脱水并以0.75μm的空间分辨率扫描。重建后，使用3贬值软件对椎体进行分析(Visual SI Advanced, Object Research Systems Inc, Montreal, Canada;ImageJ2 v1.5, https://imagej.nih.gov/ij)。
统计分析
使用SPSS (Version 24, IBM, Armonk, NY, USA)进行统计分析。正态分布检验采用Shapiro-Wilk检验，方差齐性检验采用Levene检验。组间比较采用独立样本t检验，p < 0.05为差异有统计学意义。结果以平均值±SD表示。
幼虫成骨率
为了量化先前描述的Chi/+中骨形成的延迟，在8和10 dpf时对突变体和WT幼虫进行钙黄蛋白生命染色(图1A)。在评估了V2、V3和V4椎体中心矿化面积的比例(10 dpf vs 8 dpf)后，与WT相比，Chi/+中三个椎体的骨形成明显较低(图1B)。在V2和V3中，Chi/+的比值呈较小的趋势，在VB4中达到显著性(0.9±0.1比1.1±0.1,p< 0.05)。
成人骨折特征
对鱼进行茜素红和阿利新蓝全载染色，可以量化成年Chi/+和WT斑马鱼肋骨中愈伤组织的数量(图1C-E)。骨折愈伤组织是根据其圆形/椭圆形形态和深蓝色染色来识别的，这使得它们与染色过程中由制备人工制品引起的骨折区分开来，后者的特征是骨骼清晰切割(图1D)。尽管59%的突变体表现为骨折愈伤组织(25%为单个愈伤组织，34%为两个或更多)，但8%的WT鱼表现为单个愈伤组织(图1E)。值得注意的是，在染色过程中处理的骨折数量Chi/+(96%为多处骨折)比WT(38%单处骨折)高得多。
图1 野生型(WT)斑马鱼和Chi/+斑马鱼在骨骼水平的表型差异。与野生型相比，Chi/+在幼虫期延迟了骨骼生长(A,B)，而在成年Chi/+中增加了骨脆性(C,D)。(A)在WT和用钙黄绿素标记的Chi/+幼虫的三个椎体(V2, V3, V4)上评估骨形成。以受精后10天(dpf)的椎体面积除以受精后8天(dpf)的椎体面积来确定椎体面积比，作为骨形成率的衡量指标。(B)与WT相比，Chi/+斑马鱼的椎体面积比率显著降低。(C)成年Chi/+斑马鱼用阿利新蓝和茜素红进行了整块染色。(D)肋骨骨痂(红色箭头)和染色过程中处理引起的骨折(黑色箭头)的放大。(E) WT和Chi/+鱼的骨折愈伤组织百分比。59%的Chi/+鱼和8%的WT鱼肋骨处有骨折痂。
骨骼形态学和全骨结构
Chi/+和WT斑马鱼的显微ct三维重建显示，两组之间在宏观骨骼形态和矿化方面存在实质性差异(图2A, B)。Chi/+斑马鱼的体型与WT相比显着减小，标准长度为15.9±0.5 mm，而WT为22.5±1.8 mm (p< 0.001)。随着骨折愈伤组织和肋骨的变形，Chi/+斑马鱼的骨骼器官呈现非均匀矿化，这是x射线吸收的差异所表明的。在全骨水平上，特别是在Chi/+斑马鱼的脊柱沿线，观察到高矿化区域与低矿化区域直接相邻:尾前和尾侧区域的高矿化和融合椎骨位于两者之间的低矿化脊柱区域旁边。
与野生型斑马鱼相比，Chi/+斑马鱼的椎体显著较小，椎体长度显著较低，分别为288±44μm和488±52 μm, p < 0.001(图2C);椎体厚度显著较低，分别为13.5±1.0 μm和17.2±0.8μm, p < 0.001(图2D)。值得注意的是，Chi/+的前椎体经常呈现矿化核心(图2B，右)，这被排除在形态计量学评估之外。尽管两组椎体的偏心率(圆度)相似(图2E)， Chi/+斑马鱼的BV显著降低，为0.004±0.001 mm3，而WT对照组为0.008±0.001 mm3, p < 0.001(图2F)。
图2 通过微型计算机断层扫描(micro-CT)观察Chi/+和野生型(WT)斑马鱼椎骨的骨骼形态和结构。(A)成年野生斑马鱼的典型全身扫描(左)和典型双锥几何结构的孤立前椎体(中)。形态测量参数显示在椎体的纵向切割(右)。(B) Chi/+突变体的代表性全身扫描(左)显示颅骨和脊柱内的不均一矿化，肋骨和鳍的畸形，以及融合或塌陷的椎骨。Chi/+突变体的椎体显示出异常的几何形状(中心)，其核心有矿化硬组织的积累(右)。前段椎体的形态测量分析显示(C) Chi/+中椎体长度(VL)显著减小，(D)椎体厚度(V.Th)显著减小，(E)偏心度相似，(F)骨体积(BV)减小。
组织成分和成熟度
通过FTIR光谱分析Chi/+和WT斑马鱼椎骨的骨组织成分，发现大多数胶原蛋白和矿物质相关参数存在显著差异(见图3A-D)。Chi/+组的胶原成熟度比明显低于toWT组，分别为10.1±5.8和24.2±5.7,p < 0.001 3(图3A)。Chi/+斑马鱼的碳酸盐与磷酸盐比率显著高于WT，分别为0.092±0.002和0.089±0.002, p < 0.01(图3B)，参数结晶度(衡量晶体成熟度和大小)显著低于WT对照组，分别为11.5±1.6和20.1±6.3，p=0.005(图3C)。在Chi/+中，矿物与基质的比值略高(图3D)。
图3 利用傅里叶变换红外光谱评估野生型(WT)和Chi/+斑马鱼的前椎体组织成分。感兴趣的区域对应于两个椎体之间的椎终板区域。(A)Chi/+突变体中胶原成熟度显著降低。(B)在Chi/+中，碳酸盐与磷酸盐的比率(晶格中碳酸盐取代的量度)明显更高。(C)结晶度，衡量矿物晶体大小，晶格纯度和晶体年龄，在Chi/+突变体中显着降低。(D)与WT相比，Chi/+的矿物与基质比率呈现出更高的趋势(p = 0.196)。插图显示了整个椎骨的代表性光谱图。请注意，与Chi/+中改变的结构相比，WT中典型的双锥形状，包括Chi/+中的矿化核心，与WT和Chi/+中的皮质壳(红色像素)相比，其矿物与基质的比率较高(黄色像素)。
骨密度分布
定量背散射电镜获得的骨矿物质密度分布显示，Chi/+和WT对照组的矿化模式存在明显差异(图4A-E)。如图4B所示，钙在Chi/+中的分布向高浓度转移。Chi/+的平均钙重量百分比(caman)明显高于WT，分别为27.8±0.8 WT %和26.7±0.9 WT %， p = 0.039(图4C)。在组织水平上，各组间矿化的异质性(CaWidth)相似，如图4D所示。Chi/+和WT高钙区(CaHigh)差异无统计学意义(12.1%±8.1% B.Ar.和5.0±2.9% B.Ar.)(图4E)。
图4 通过定量背散射电子显微镜评估野生型(WT)和Chi/+斑马鱼的骨密度分布。(A)两个相邻椎体的终板区域附近的骨皮质在Chi/+和WT之间的矿化程度有显著差异。在Chi/+椎体的中心，经常出现不均匀的矿化核心(插图，箭头)。(B)椎体终板区域显示，与野生型相比，Chi/+斑马鱼的矿物质含量更高。Chi/+斑马鱼的平均骨密度分布明显向更高的值偏移。(C)与WT相比，Chi/+中的平均钙含量(CaMean)显著升高。(D)与WT相比，Chi/+中的矿化异质性(CaWidth)没有变化，并且(E) Chi/+中含有高度矿化骨的区域(CaHigh)显示出向高度矿化骨区域的趋势(p = 0.092)。
局部力学性能
纳米压痕显示了Chi/+和WT斑马鱼椎骨组织的不同力学特性(图5A-D)。结果显示，与WT斑马鱼椎骨相比，Chi/+的弹性模量明显较低，分别为21.2±0.8 GPa和24.7±1.8 GPa, p=0.02(图5B)。两组之间的硬度无显著差异，分别为0.96±0.03 GPa和0.94±0.08 GPa(图5C)，而Chi/+的弹性模量与硬度之比明显低于WT，分别为22.9±1.1和26.3±0.3,p=0.002(图5D)。
图5 野生型(WT)和Chi/+斑马鱼的局部力学特性。(A)电镜图像显示，在椎体终板附近矿化皮质骨中存在纳米压痕。插页显示缩进的印记(箭头)。(B)椎体的纳米压痕显示了组织局部力学特性的差异。弹性模量(E)，衡量材料的刚度，在Chi/+中显着降低。(C)组织硬度(H)在Chi/+和WT之间没有差异。(D)弹性模量与硬度之比(断裂韧性的替代指标)在Chi/+中明显较低，表明骨折风险较高。
骨形成和骨细胞特征
感兴趣的组织学区域的概述见图6A。在Chi/+和WT的甲苯胺蓝染色切片上进行静态骨组织形态测定，可以测定骨细胞和组织指数(图6B-F)。如图6B所示，组织学切片支持Chi/+中存在结构差异和较小的椎体大小。在细胞指数方面，Chi/+突变体在矢状切片(箭头)表现出较少的骨细胞数量。关于立方体的形状。Chi/+与WT相比，每骨周成骨细胞数量(N.Ob/B.Pmr)有更高的趋势，分别为10.3±2.3细胞/mm和7.6±0.8细胞/mm, p=0.069(图6C)。Chi/+的骨表面积/骨体积(BS/BV)高于WT，分别为103.4±12.0 mm2/mm3和82.5±9.7 mm2/mm3, p = 0.057(图6D)。与WT相比，Chi/+中发现了类骨体积/骨体积(OV/BV)反映的类骨积累趋势(0.49±0.23%比0.24±0.06%，p =0.111)(图6E)。Chi/+组的骨细胞数量(N.Ot/B.Ar)明显低于WT组，分别为496±151细胞/mm2和883±242细胞/mm2, p = 0.034(图6F)。
椎体的三维形状和骨细胞腔隙网络
使用x射线显微镜评估Chi/+和WT椎体中的骨细胞腔隙网络，并允许可视化双锥状椎体中的骨细胞腔隙。如图6G所示，两组骨细胞在椎终板附近呈同心分布，在椎体狭窄的椎体中呈轴向分布。腔隙孔的目视检查在两组之间有明显的差异。与WT相比，Chi/+中骨细胞腔隙密度降低。与Chi/+相比，WT中存在更多体积约为500 μm3的增大腔隙(红色)。
图6 (A)野生型斑马鱼脊椎解剖概述。上图:示意图显示相邻的椎体，包括典型的双锥状矿化骨(深灰色)，椎体内空泡状脊索组织(浅灰色)，以及包括椎间韧带(IVL)在内的椎间生长区域(圈)。图中:von kossa染色切片的组织学概述:矿化骨(黑色)，空泡脊索组织(橙色)，包括骨样缝的椎间盘区域(红粉色)。下图:甲苯胺蓝染色切片的组织学概述图像显示矿化骨(浅紫蓝色)，不同染色强度的空泡脊索组织，以及包括韧带在内的绿松石色椎体生长区域。(B)对于组织形态学，对WT和Chi/+的甲苯胺蓝染色切片的高倍图像进行分析，允许在终板区域(即生长区域)内可视化和测量类骨细胞和成骨细胞。图像显示骨细胞(箭头)嵌入矿化骨基质中，成骨细胞(Ob)位于椎骨表面。虚线表示脊索软组织与矿化骨的边界。Chi/+中椎体终板的形态与WT不同，包括更大的椎间隙，扭曲的几何形状，以及椎间韧带附近深色纤维组织的积累。生长区域的典型特写图(下图)显示成骨细胞位于WT中厚度<1 μm的浅蓝色类骨接缝上(箭头)。与WT相比，Chi/+组织呈现出更厚的类骨层(平均大于1 μm)和更立方体形状的成骨细胞的趋势。(C)每骨周成骨细胞数(N.Ob/B.Pm)显示Chi/+与WT相比有更高数量的趋势(p = 0.069)。(D) Chi/+与WT相比，每骨体积的骨表面积(BS/BV)有更高的趋势(p = 0.057)。(E)与WT相比，每骨体积的类骨体积(OV/BV)显示Chi/+有类骨堆积的趋势(p = 0.111)。(F) Chi/+中每个骨面积的骨细胞数量(N.Ot./B.Ar)明显低于WT。(G) Chi/+和WT椎体的三维x射线显微镜图像，空间分辨率为0.75 μm。双锥体形状在WT和Chi/+中是明显的，而骨细胞腔隙体积及其分布的差异是突出的。腔隙在椎终板附近呈同心分布，在斑马鱼椎体狭窄的椎体中呈轴向分布。与WT相比，Chi/+的骨细胞腔隙网络不太明显。
讨论
通过显微ct、FTIR光谱、qBEI、纳米压痕、组织形态计量学和x射线显微镜等一系列骨质量分析，本研究揭示了在I型胶原蛋白α1链中携带杂合甘氨酸替代的OI斑马鱼模型的骨质量变化。突变引起的骨质量改变在所有研究的骨骼部位都有表现:从全骨到组织水平。
幼年期Chi/+和WT的动态骨组织形态测量显示，Chi/+斑马鱼模型的骨形成延迟，这与之前的观察结果一致。在Chi/+和WT斑马鱼的成年骨骼上进行的三维形态测量进一步验证了最近在Chi/+斑马鱼模型上进行的放射学和组织学调查中描述的骨骼畸形的存在。与人类成骨不全类似，这些异常同时存在于轴骨和尾骨。聚焦于椎体，本研究显示骨体积大幅减少，椎骨皮质壳更薄，这与人类I型至IV型成骨不全症病例的临床观察结果完全一致。有趣的是，椎体的偏心率(它们的圆度)不受突变的影响，这表明Chi/+斑马鱼的横向运动模式不会导致脊柱沿线全骨水平的永久性畸形。然而，Chi/+斑马鱼在第一尾前椎骨和尾中椎骨中表现出明显的椎体特征，其中包含一个非典型的矿化核心。与皮质椎体区域(深色像素)相比，整个前椎体中矿物质与基质的比例分布表明，矿化核心(明亮像素)中磷酸盐与酰胺I的比例较高(图3D，插图)。这表明该区域的矿化程度较高或胶原蛋白含量较低。尾前椎骨相同区域的qBEI图像(图4A，插图)显示，与皮质区域相比，核心区域的矿物质分布高度不均匀，钙含量较低(深色像素)。对这些数据集的综合评估表明，椎体核心的矿化组织似乎是一种异质性的、低矿化的、胶原蛋白含量低的组织。
在人类成骨不全的病例中，已确定多处椎体骨折的积累会导致进行性脊柱畸形。因此，观察到的Chi/+斑马鱼脊柱变形也可能与骨折史有关。在临床环境中，包括骨折和畸形在内的大量宏观异常通常可以根据影像学指征来识别成骨不全。然而，这种方法还不足以作为可靠的骨折风险评估的基础，因为健康和病理骨的力学能力是由组织水平的材料特性决定的。在这种情况下，成骨不全小鼠模型在很大程度上有助于将成骨不全影响骨的力学特性与微观长度尺度上的超微结构缺陷联系起来，从而更好地理解OI相关脆性的起源。
在这项对携带α1-G574D突变的斑马鱼进行的研究中，结构和成分分析显示，有机胶原基质和无机矿物晶体相在Chi/+椎骨中均受到显著影响。正如振动光谱所证明的，胶原基质的分子结构在Chi/+斑马鱼中显著不同。虽然光谱分析中使用的胶原相关亚峰位置和比率还没有通过生化分析(如高效液相色谱)与斑马鱼骨中的胶原I分子相关，但我们发现，已建立的胶原成熟度比率(1660/1690 cm-1)在Chi/+中对较低的胶原成熟度产生了显著差异。这一参数的改变被认为与经典显性OI中异常的胶原纤维形成和结构有关，这被认为包括随后基质中的矿物晶体成核。
事实上，这项研究中评估的矿物相关参数在Chi/+斑马鱼中受到了影响。尽管OI患者表现为骨密度和骨量降低，但OI的矿化模式在整个骨骼中可能具有高度异质性。因此，据报道，在小鼠OI模型和人类OI模型中，组织水平的矿化程度增加。类似地，Chi/+斑马鱼的钙含量升高，而羟基磷灰石颗粒的矿物结晶度显著低于WT。通过振动光谱评估的参数结晶度与骨中羟基磷灰石晶体的成熟度、大小和纯度相关，因此表明Chi/+斑马鱼中的晶体更小、化学计量更少。此外，Chi/+斑马鱼显示出较高的碳酸盐/磷酸盐比率，支持晶体晶格组成中较高的碳酸盐取代，因此晶体成熟度较低。斑马鱼中的这些发现与之前在小鼠OI模型和ⅰ~ⅳ型OI的人类组织中观察到的结果一致，提示受累组织的矿物质与基质比和组织矿物质密度(TMD)增加，晶体较小但更丰富。
关于Chi/+骨组织的力学特性，这项研究支持以下观点:受损的矿物-基质相互作用以及受损的胶原和晶体特性是OI中骨脆性增加的原因。从突变Chi/+斑马鱼骨获得的力学测试数据与Imbert等人对人骨的研究一致，他们检测到与使用纳米压痕的生理骨组织相比，受oi影响的骨组织的弹性模量显著降低，但硬度没有降低。在健康的骨骼中，较高的矿物质密度预计会导致硬度增加。然而，在OI的情况下，基质的结构和成分受损，矿物质密度的增加并不能弥补与疾病相关的其他骨质量因素的减少。此外，Chi/+(断裂韧性的替代指标)中较低的弹性模量/硬度比值表明突变体对断裂的抵抗力较低。
在人类成骨不全症中，骨基质性质的改变可能与骨重塑率增加、破骨细胞和成骨细胞活性增加有关。虽然有证据表明骨重建确实发生在硬骨鱼中，但评估斑马鱼动态骨重建的标准化方案尚未建立。在本研究中，静态骨组织形态计量学显示成骨细胞呈现出特殊的立方体形状，这与之前关于斑马鱼成骨受损突变体的研究一致。与WT相比，Chi/+中的成骨细胞和类骨指数略有升高，表明类骨的积累增加。此外，通过2D的组织形态计量学和3D的x射线显微镜可以证明，与WT相比，Chi/+中的骨细胞网络显著减少(见图6)。这可能是在类骨积累后发生的组织矿化和成熟过程受损的结果，并进一步表明Chi/+中的骨重塑和修复能力受到阻碍。由于OI中成骨细胞矿化类骨的能力受到阻碍，整体骨形成率受到负面影响。虽然Chi/+中骨形成的延迟在幼虫阶段已经被检测到(图1)，但尚不清楚这种骨形成缺陷是否导致了在成年鱼中观察到的骨细胞网络的改变，还是网络的减少是成骨细胞分化受损或突变体肌肉骨骼活性降低的结果。为了更好地理解导致Chi/+斑马鱼骨质量改变的细胞机制，我们需要进一步研究生理和病理斑马鱼骨细胞网络。
对斑马鱼突变体的研究有一些局限性。首先，与小鼠骨骼相比，目前只有有限的标准化方案来评估斑马鱼骨骼的结构和骨细胞特性。在斑马鱼骨骼中，不同年龄的骨形成和骨吸收的动力学尚未完全阐明。随着斑马鱼成为骨骼生物学和疾病研究领域越来越受重视的动物模型，评估该物种的代谢性骨骼特征将变得至关重要。第二，本研究不能提供Chi/+骨的断裂行为的直接测量。虽然斑马鱼的小尺寸在住房和大规模人群研究中具有优势，但进行力学测试具有挑战性。尽管大多数哺乳动物骨可以在经典的全骨力学测试中进行测试，但对斑马鱼骨力学性能的评估仍然局限于纳米压痕，提供局部力学性能的信息。
综上所述，本研究为携带显性胶原突变的斑马鱼骨的形态、结构、成分、力学性能以及组织和细胞指数提供了定量数据。多模态和多尺度的骨骼表征表明Chi/+斑马鱼骨骼中的骨质量显著受损。骨骼水平的具体表型包括身材矮小、骨畸形和骨折；组织水平的分析反映了较高的骨密度分布，但降低了矿物质和基质成熟度。后一种变化的总和导致了吉娃娃斑马鱼机械性能的降低。与人类OI病例类似，骨脆性增加，在Chi/+突变体中观察到的畸形和骨折是骨质量改变的结果。吉娃娃斑马鱼可被认为是一种合适的动物模型，反映了人类经典型显性骨病患者发生的骨改变。对该模型的深入研究将对改善现有的OI治疗策略，特别是新型药物筛选试验和给药，以及包括肌肉骨骼运动在内的常规治疗具有重要价值。
基金：这项研究得到了PIER(No.PIF-2014-28)、德国研究基金会(No.BU 2562/2-1/3-1)、Cariplo基金会(No.2013-0612)、Telethon(No.GGP13098)等的支持。
原文：Fiedler I A K, Schmidt F N, Wölfel E M, et al. Severely impaired bone material quality in chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta[J]. Journal of Bone and Mineral Research, 2018, 33(8): 1489-1499.
原文地址：https://asbmr.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jbmr.3445
