杂志：Cells

影响因子：6（2022-2023）

年份：2023

通讯作者：Erwin van Wijk

摘要

在全球范围内，约有40,000人因ADGRV1基因致病性变异引起的视网膜色素变性(RP)而逐渐丧失视力，目前尚无治疗方案。模拟人类表型的模式生物对于揭示ADGRV1相关RP的确切病理生理机制以及评估未来的治疗策略至关重要。基于CRISPR/Cas的基因组编辑技术的引入，显著提高了以时间和成本效益的方式生成突变模型的可能性。斑马鱼被认为是研究Usher综合征相关视网膜功能障碍的合适模型。利用CRISPR/Cas9技术，我们在adgrv1外显子9 (adgrv1^rmc22)上引入了一个4bp的缺失。免疫组化分析显示，Adgrv1在adgrv1^rmc22斑马鱼视网膜连接纤毛的光感受器区域缺失。在这里，Adgrv1的缺失也导致USH2复合体成员usher和Whrnb的水平降低，这表明Adgrv1与斑马鱼光感受器中的usher和Whrnb相互作用。将adgrv1^rmc22斑马鱼与野生型对照进行比较时，我们进一步观察到光感受器细胞体中异常定位的视紫红质水平升高，视网膜电图(ERG) b波振幅下降，这表明缺乏Adgrv1会导致视网膜功能受损。基于这些发现，我们将adgrv1^rmc22斑马鱼作为第一个显示早期视网膜功能障碍的ADGRV1突变模型。此外，在评估未来ADGRV1相关RP的新治疗策略的疗效时，观察到的表型变化可作为可量化的结果指标。

关键词:ADGRV1；Usher综合征；CRISPR/Cas9；斑马鱼；视网膜功能障碍；色素性视网膜炎。

介绍

Usher综合征是一种常染色体隐性遗传疾病，以色素性视网膜炎(RP)引起的听力损伤和视觉功能进行性丧失为特征。根据不同的临床类型，患者也可能因前庭功能障碍而出现平衡问题。目前，Usher综合征(USH1-4)根据发病、严重程度和临床特征的进展情况可分为四种类型。ADGRV1基因的致病变异，以前被称为MASS1、VLGR1或GPR98，已被确定为Usher综合征2C型(USH2C)的潜在原因。这类Usher综合征的特征是先天性听力障碍和在没有前庭功能障碍的情况下进行性视力丧失。在全球范围内，约有40,000人患有USH2C，这些患者可能受益于助听器或人工耳蜗来减轻他们的听力损失。然而，目前还没有治疗方案可用于补偿ADGRV1相关的视力丧失。

ADGRV1基因编码人类已知的最大的细胞表面蛋白:粘附G-protein-coupled受体v1 (ADGRV1)。该蛋白由包含信号肽的非常大的细胞外尾部，多个calx-β结构域，癫痫相关重复(EAR)结构域，血栓反应蛋白/戊氧嘧啶/层粘连蛋白G样结构域和GPCR蛋白水解位点(GPS)组成。一个7跨膜区域将蛋白质固定在细胞膜上，随后是一个含有C端I类PDZ结合基序的短细胞质区域。

在视网膜中，ADGRV1与usherin (USH2A)和whirlin (USH2D)共定位，这些蛋白共同形成光感受器细胞睫状膜上的USH2复合物。视细胞分为视杆细胞和视锥细胞两种，它们都是由外段(OS)、内段(IS)、细胞体和突触末端组成的。OS包含负责光转导的蛋白质，并通过连接的纤毛与IS分开。睫状体周围区域的膜，即USH2复合物所在的位置，形成环绕连接纤毛的IS的项圈状延伸。研究表明，USH2复合物在纤毛周膜和连接纤毛的膜之间形成分子连接。此外，有研究表明，USH2复合物参与了反式高尔基衍生囊泡的运输和对接，这些囊泡含有从IS到OS的功能和维护所必需的成分。此外，对于ADGRV1，有假设认为该蛋白参与线粒体相关内质网膜钙稳态的调节，并通过局灶黏附的机械感应参与细胞的扩散和迁移。然而，ADGRV1相关RP的确切病理生理机制尚不清楚。

为了进一步揭示ADGRV1相关RP的病理生理机制，并帮助未来治疗策略的发展，模拟人类表型的合适细胞或动物模型是必不可少的。患者来源的细胞模型(如成纤维细胞或诱导多能干细胞(iPSC)来源的类器官)为我们提供了在患者自身遗传和分子背景下进行研究的机会。然而，视觉是一个复杂的过程，它既依赖于光在视网膜上转化为电刺激，也依赖于中枢神经系统对这些信号的整合和解读。因此，动物模型对于评估视觉功能水平的治疗效果仍然是必不可少的。多种Adgrv1小鼠模型，无论是自然发生的还是转基因的，已经被报道。然而，这些模型仅部分类似于人类表型，因为它们确实存在听力损失，但不能概括在患者中观察到的视网膜表型。这可能是由于在表达Adgrv1的光感受器睫状体周围区域的种间解剖差异所致。先前有报道称，与人类相比，啮齿动物的光感受器睫状体周围区域在很大程度上是不发达的，这使得啮齿动物不太适合研究ADGRV1相关的RP。作为替代方案，斑马鱼已被认为是研究视网膜功能障碍的一个有吸引力的模型。斑马鱼具有与人类相当的视网膜结构，并且光感受器睫状体周围区域高度保守。此外，斑马鱼的繁殖力高、体外受精、发育快、胚胎透明等优点使其易于进行基因操作和实验。

基于CRISPR/cas的基因组编辑技术的引入大大提高了以时间和成本效益的方式生成突变斑马鱼模型的可能性。近年来，一些基于CRISPR/cas9的斑马鱼突变体被生成，以研究USH2A基因致病变异引起的视网膜功能障碍。与小鼠模型相比，这些突变斑马鱼模型(ush2armc1、ush2ab1245、ush2ahzu6和ush2au507)在幼虫期就已经观察到视网膜功能障碍，尽管没有明显的听力学表型。

由于需要动物模型来研究ADGRV1相关的RP，并且斑马鱼被认为是研究视网膜功能障碍的一个有吸引力的模型，我们在这里生成并表征了adgrv1^rmc22斑马鱼模型。在斑马鱼的基因组中，adgrv1基因以单一拷贝的形式存在，与人类ADGRV1基因一样，由90个外显子组成。我们利用基于CRISPR/cas9的基因组编辑技术，在adgrv1中引入蛋白截断病变，导致Adgrv1缺失，adgrv1^rmc22光感受器睫状体周围区域USH2复合物成员表达减少。功能分析显示，敲除adgrv1会导致早发性视网膜表型。因此，我们提出adgrv1^rmc22突变体作为第一个动物模型，可用于进一步揭示ADGRV1在视网膜中的分子功能，并评估ADGRV1相关RP的未来治疗策略。

材料和方法

野生型AB系斑马鱼和adgrv1^rmc22突变型斑马鱼在奈梅亨Radboud斑马鱼设施按标准方法繁殖和养护。从野生型和突变型斑马鱼的成对交配中获得斑马鱼卵。实验程序按照国际和机构指南进行(协议#RU-DEC, AVD10300202215892)。

CRISPR/Cas9基因组编辑设计与显微注射

为了生成adgrv1^rmc22突变型斑马鱼，我们鉴定了CRISPR靶点，并使用网络工具CRISPRscan设计了带有Cas9设置的引导rna。对于潜在的脱靶区，使用至少4个错配的临界值来选择sgRNA。基于CRISPRscan的预测，我们从Integrated DNA Technologies (IDT)订购了一个Alt-RTM CRISPR/Cas9 sgRNA，用于adgrv1外显子9:5’-GGGTATTCAGAGTCAGCCAG-3’上的20bp基因组靶序列。

sgRNA和商业化的Alt-R®S.p Cas9核酸酶V3 (IDT, Coralville, IA, USA， #1081059)在单细胞期的野生型斑马鱼胚胎中共同注射。为此，制备了100 ng/μL sgRNA、800 ng/μL Cas9核酸酶、300 mM KCl和20% (v/v)酚红溶液(#P0290, Sigma Aldrich, Amsterdam, The Netherlands)的注射混合物，并在37[数学处理误差]下孵育5分钟，以使sgRNA-Cas9核糖核蛋白复合物形成。使用气动PicoPump pv280 (World Precision Instruments, Friedberg, Germany)将1nl的混合物注射到单细胞期的斑马鱼胚胎中。注射后，胚胎在由5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4和0.1% (v/v)亚甲基蓝组成的E3胚培养基中于28.5°C培养。在受精后1天(dpf)，使用高分辨率熔化分析(HRM)分析200个注射胚胎中的16个是否存在基因组编辑事件。在检测到基因组编辑的HRM特征后，将其余的注射胚胎饲养到成年(F0条鱼)。传播种系突变的创始鱼与野生型斑马鱼进行了两次异种杂交，以进一步减少可能存在的不可预见的CRISPR/cas9诱导的脱靶修饰。在第二轮异交后，将杂合子鱼内交产生后代，将纯合子鱼及其野生型兄弟姐妹用于后续育种和表型分析。

高分辨率熔融分析

在1 dpf下，注射和未注射的斑马鱼胚胎分别在25 μL热裂解缓冲液(25 mM NaOH, 0.2 mM EDTA)中取样，在95°C下孵育20分钟。裂解物用2.5 μL 1 M Tris pH8中和，稀释5 - 10倍，作为高分辨率熔融(HRM) PCR分析的输入，在QuantStudio™3 Real-Time PCR系统(Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)使用Q5®高保真DNA聚合酶(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)进行分析。#M0491L)和1x evgreen Dye (Biotium, Fremont, CA, USA， #31000)。用于PCR扩增的引物列于表S1。PCR扩增后，通过快速冷却(4°C/s)至10°C和熔化曲线程序(0.1°C/s)启动HRM程序，在此过程中收集数据。当超过25%的注射胚胎(n = 16)出现典型的HRM异工峰时，其余的注射胚胎将被饲养至成年。我们使用Sanger测序在显示异源双链HRM峰的样本中验证基因组编辑事件。

基因分型

用25 μL(胚胎)或75 μL(成年尾鳍)裂解缓冲液(25 mM NaOH, 0.2 mM EDTA)裂解斑马鱼标本，95°C孵育20 min，裂解液分别用2.5 μL或7.5 μL 1 M Tris pH 8中和，稀释5 - 10倍，作为PCR输入。采用标准PCR循环条件扩增引入病变周围adgrv1外显子9的基因组区域。用于PCR扩增的引物列于表S1。扩增子和基因型用Sanger测序确认。

记录分析

从3个相同基因型的幼鱼头部(液氮速冻)中分离到总RNA。裂解前将幼鱼头部均质，根据制造商的说明(Qiagen, Hilden, Germany)，使用RNeasy Micro试剂盒进行RNA分离。随后，使用SuperscriptTM IV逆转录酶试剂盒(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA， #18090200)，以100 μg的总RNA为模板进行cDNA合成。使用Q5®高保真DNA聚合酶试剂盒(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA， #M0491L)扩增adgrv1片段，片段长度为外显子7至外显子11 (1500 bp)。rpl13扩增子作为参考。循环条件为:98°C 1 min，循环35次，98°C 10 s, 68°C 20 s, 72°C 2 min，最后72°C 5 min。随后，扩增子在2%琼脂糖凝胶上分离，使用Sanger测序进行分析。表S1列出了用于转录分析的所有引物。

基因表达分析

按照“记录分析”所述的相同程序，从每个基因型的5条幼鱼(5 dpf)和2条幼鱼视网膜(受精后3个月(3 mpf))中分离总RNA并生成cDNA。采用GoTaq qPCR Master Mix (Promega)进行定量PCR。转录特异性引物针对adgrv1从外显子84到外显子85,ush2a外显子55到外显子56,whrnb外显子2到外显子4。还包括一个针对内参基因rpl13的靶标。扩增使用QuantStudioTM 3 Real-Time PCR系统(Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)。采用双链PCR反应，用2−∆Ct法测定与参比基因rpl13相比的相对基因表达量。所使用的引物列于表S1。

抗体，免疫组织化学和组织学

斑马鱼幼鱼(5dpf)和斑马鱼幼鱼的眼睛(3mpf) (adgrv1^rmc22突变体和品系匹配的野生型)在PBS中用10%蔗糖冷冻保护5分钟，然后嵌入到OCT化合物中(Sakura, Alphen aan den Rijn，荷兰，Tissue-Tek， #4583)。包埋后，使用液氮冷却异戊烷缓慢冷冻样品，并按照标准程序制备7 μm的冷冻切片。未固定的冷冻切片用0.01% Tween-20在PBS中渗透20分钟，并用封闭缓冲液(10%正常山羊血清和2%牛血清白蛋白在PBS中)封闭30分钟。在封闭缓冲液中稀释一抗和二抗，切片与一抗在4℃孵育过夜，随后用PBS冲洗3次10 min，二抗与DAPI (1:800;D1306;Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)。第二轮冲洗后(用PBS冲洗3次，10 min)，用4%多聚甲醛后固定冷冻切片10 min，然后用PBS冲洗3次，5 min。最后，用延长黄金抗褪色剂(P36930;Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)。使用以下一抗及其稀释度:兔抗引产(1:1000;#DZ01481, Boster Bio, Pleasanton, CA, USA)，兔抗adgrv1抗体(1:100;# DZ41032;Boster Bio)，兔anti-Whrnb (1:750;# 42690002, Cip98a;Novus Biologicals, Centennial, CO, USA)和小鼠抗中心蛋白(1:500;# 04 - 1624;密理博，达姆施塔特，德国)。以1∶800稀释度使用二抗(Alexa Fluor 568山羊抗兔(Thermo Fisher, Waltham, MA, USA， # a -11011)和Alexa Fluor 488山羊抗小鼠(Thermo Fisher, Waltham, MA, USA， # a -11029))。使用配备AxioCam MCR5相机(蔡司，耶拿，德国)的Zeiss Axio Imager荧光显微镜对载玻片进行成像。使用Fiji (v.1.51n)检测引导强度和Whrnb免疫荧光。基于centrin免疫染色，分离外节层。接下来，使用“Find Maxima”选项(噪声= 25)根据中心染色生成一个掩膜，并扩张5次。然后，将中心罩和引导层/Whrnb层组合，确定引导层或Whrnb染色的确切位置。随后，使用“Find Maxima”(噪声= 10)识别中心区面具内的引导符/Whrnb染色，并使用分水岭选项分离触摸物体。将得到的面罩扩张6次，测量引导周围面积和Whrnb免疫荧光信号。随后，当识别区域的最大和最小灰度值在引入器/Whrnb免疫荧光的原始图像上测量时，这可以校正背景噪声(Analyze Particles选项:大小= 0-180，像素圆度= 0.00-1.00)。

为了进行视紫红质标记，在正常光照条件下(300 lux白光，14/10 h昼夜节律)，将adgrv1^rmc22斑马鱼和品系匹配的野生型幼鱼饲养在透明的10 cm培养皿中，并在6 dpf早上光照后100分钟采样。按照先前发表的方法对4% PFA固定的幼虫冷冻切片(7 μm)进行染色和成像。作为小鼠抗视紫红质一抗(1:4000，克隆4D2;NBP2-59690, Novus biicals, Centennial, CO, USA)与次级Alexa Fluor 488山羊抗鼠剂(Thermo Fisher, Waltham, MA, USA， #A-11029)联合DAPI (1:800;D1306;赛默飞世尔，马萨诸塞州沃尔瑟姆，美国)。使用配有AxioCam MCR5相机(蔡司，耶拿，德国)的Zeiss Axio Imager荧光显微镜对载玻片进行成像。随后，对图像进行盲法和随机化处理，由两名研究人员独立量化视紫红质错位，方法是手动对每个视网膜切片中视紫红质胞体中具有清晰视紫红质信号的感光细胞数量进行评分。

为了评估斑马鱼幼鱼(3 mpf)和成鱼(6 mpf)视网膜的形态，我们对adgrv1^rmc22突变体和品系匹配的野生型斑马鱼眼睛进行了解剖。在PBS中加入4%多聚甲醛(PFA)，在4°C下固定眼睛过夜，在上升的甲醇系列中脱水，在100%甲醇中孵育过夜。然后用甲醇系列降水至0.1% PBS-Tween-20，再用0.1% PBS-Tween-20中10%的蔗糖冷冻15分钟，在室温下用0.1% PBS-Tween-20中30%的蔗糖冷冻1小时。接下来，将眼睛包埋在OCT复合物(Sakura, Alphen aan den Rijn, the Netherlands, Tissue-Tek， #4583)中，用液氮冷却的异丁烷缓慢冷冻，并制备冷冻切片(7 μm)，用苏木精和伊红染色，使用蔡司Axioscope光学显微镜(蔡司，Oberkochen，德国)进行分析。

视网膜电图(ERG)记录

对adgrv1^rmc22斑马鱼幼鱼(受精后6-8周(wpf))和野生型斑马鱼进行ERG记录。在进行ERG测量前，先将鱼暗适应至少30 min。用0.016%三卡因甲烷磺酸溶液麻醉鱼并切断脊髓停止心跳。培养皿中充满琼脂糖凝胶，并将参比电极放入凝胶中。接下来，将斑马鱼放在这个培养皿中，右眼面向光源。使用25号注射器针头，在右眼角膜边缘做一个小切口，置入充满E3介质(5 mM NaCL, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)的记录电极。连续两次100ms白光刺激，强度约为550勒克斯，间隔8 s。随后，响应以700-0.1 Hz的带通放大10,000倍，并用Signal6.03软件(剑桥电子设计有限公司，剑桥，英国)记录。对记录进行基线校正，在50毫秒的时间范围内确定基线信号，作为给予刺激前的平均信号。取对两种光刺激的平均反应后计算最大B波振幅。所有的步骤都在昏暗的红灯下进行。

统计分析

所有统计分析均使用PRISM软件(v9.0.0)进行。该软件用于检查正态性，计算平均分，并进行双尾非配对Student 's t检验(用于usher和Whrnb定量，视紫红质定位和ERG记录)。

结果

分析人类和斑马鱼Adgrv1蛋白结构域和基因结构的保守性，以确定适合生成adgrv1突变斑马鱼的CRISPR靶区。人类和斑马鱼Adgrv1具有相似的蛋白结构域(图1A)，多序列比对显示氨基酸高度保守(52.6%的一致性)。随后，我们制作了人类ADGRV1中所有蛋白质截短的致病性变异体的清单(GPR98 LOVD突变数据库，https://databases.lovd.nl/shared/genes/GPR98;2021年1月4日)。基于存在多种蛋白质截短变异体(4种独特的功能缺失变异体)，外显子9被选择为目标区域。利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，我们在adgrv1第9外显子中引入了一个4bp的缺失(c.1571-1574delCAGA;p.Pro524fsTer (ENSDART00000008043.9))。预测该移码突变会导致翻译提前终止，由此产生的斑马鱼系命名为adgrv1^rmc22。纯合的adgrv1^rmc22突变体是可行的，其发育、形态和游泳行为均未观察到异常。此外，没有观察到明显的行为差异表明听觉功能减弱。对纯合幼鱼进行转录分析，以观察4bp缺失对adgrv1 pre-mRNA剪接的影响。对幼虫mRNA上从adgrv1外显子7到外显子11的扩增子进行扩增，没有发现任何可选的剪接事件(图1B)，而对adgrv1^rmc22扩增子进行Sanger测序证实了转录水平上的4bp缺失(图1C)。adgrv1^rmc22样品的PCR产物强度较低，可能表明突变adgrv1转录本的无义介导衰变。随后的qRT-PCR分析证实，在突变样本中，adgrv1的相对表达量显著降低(p = 0.0001，双尾非配对Student 's t检验)(图1D)。

图1 人类和斑马鱼ADGRV1结构域的构建及纯合adgrv1rmc22突变斑马鱼的转录分析。(A):人和斑马鱼ADGRV1蛋白结构域结构示意图。这两种蛋白质具有相似的重复蛋白质结构域结构。Calx-β: Ca2+结合钙交换器β结构域;Lam G-like:凝血反应蛋白/戊氧嘧啶/层粘连蛋白G-like结构域;EAR:癫痫相关重复序列;GPCR: G蛋白偶联受体;PDZ:突触后密度95，椎间盘大，封闭带-1结合基序。(B):对纯合adgrv1rmc22斑马鱼幼鱼(5 dpf)和野生型斑马鱼的adgrv1转录本进行RT-PCR分析显示，与野生型adgrv1转录本相比，突变adgrv1转录本减少。(C): Sanger测序证实纯合adgrv1rmc22幼鱼扩增子中存在4个碱基对缺失。(D):野生型和adgrv1rmc22斑马鱼幼鱼(5 dpf)中adgrv1转录本的qRT-PCR分析。采用qRT-PCR技术对每个基因型5只幼鱼进行分析。***表示p = 0.0001(双尾非配对Student 's t检验)。

adgrv1^rmc22光感受器睫状体周围区域缺乏Adgrv1

为了评估在adgrv1外显子9中引入的基因组损伤对adgrv1表达和亚细胞定位的影响，我们使用针对adgrv1蛋白N末端区域的抗体，对5 dpf adgrv1^rmc22斑马鱼和野生型幼鱼的视网膜冷冻切片进行了免疫组织化学分析。由于Adgrv1先前被证明定位于连接纤毛附近的睫状体周围区域，anti-centrin被用作连接纤毛的标记物。在野生型幼鱼中，Adgrv1确实定位于连接纤毛的光感受器附近，然而，在adgrv1^rmc22斑马鱼幼鱼的视网膜切片中，未能在该位置检测到Adgrv1蛋白(图2)。对adgrv1^rmc22和野生型幼鱼视网膜(3 mpf)进行的免疫组织化学分析证实了这些结果(图S1A)。

图2 Adgrv1在野生型和adgrv1rmc22斑马鱼视网膜冷冻切片中的定位。野生型和adgrv1rmc22斑马鱼幼鱼(5 dpf)的视网膜冷冻切片，标记有针对Adgrv1(红色)和centrin(绿色)的抗体(如图所示)。细胞核用DAPI反染(蓝色)。在野生型斑马鱼中，Adgrv1在连接纤毛标记中心附近检测到，而在adgrv1rmc22斑马鱼中，该位置未检测到Adgrv1信号。比例尺:10[数学处理误差]。操作系统:外段;CC:连接纤毛;IS:内段;ONL:外核层。

Adgrv1的缺失影响USH2复合物成员usher和Whrnb的定位

由于有人提出Adgrv1与斑马鱼视网膜中的其他USH2复合物成员相互作用，因此通过免疫组织化学分析来评估Adgrv1缺失对USH2复合物成员组成和定位的影响。先前的研究假设Adgrv1的细胞外区与usher的细胞外区相关，而Adgrv1的细胞内区主要与Whrnb相互作用。免疫组织化学分析了5dpf adgrv1^rmc22斑马鱼和野生型斑马鱼的视网膜冷冻切片，使用了针对usherin和Whrnb的抗体(图3)。这两种蛋白在野生型幼虫视网膜的光感受器睫周区域检测到，靠近连接的纤毛标记中心。然而，在5 dpf adgrv1^rmc22斑马鱼的视网膜中，观察到usher和Whrnb的荧光信号强烈减弱。信号强度的量化证实了这一点(p < 0.0001，双尾非配对Student 's t检验)。对adgrv1^rmc22斑马鱼幼鱼视网膜(3mpf)的免疫组织化学分析证实，在较晚的年龄阶段，usher和Whrnb的定位也有所减少(图S1B,C)。在幼虫和幼体中，光感受器的其他部位没有明显的usherin和Whrnb免疫反应。这就提出了一个问题，即免疫反应性降低是USH2复合物分解的结果，还是由基因表达水平改变引起的。因此，我们通过qRT-PCR分析研究了幼虫和幼体中ush2a和whrnb基因的相对表达水平(图S2)。与野生型相比，突变体adgrv1^rmc22幼虫的ush2a转录本减少了34%，whrnb转录本减少了26%，而在adgrv1^rmc22幼体中，ush2a和whrnb的转录本数量分别减少了9%和39%。

图3 adgrv1rmc22斑马鱼幼鱼光感受器睫周区usher和Whrnb的表达降低。野生型和adgrv1rmc22斑马鱼幼鱼(5 dpf)的视网膜冷冻切片，染色的抗体针对促素(红色)(A)或Whrnb(红色)(B)和中心化蛋白(绿色)。细胞核用DAPI反染(蓝色)。(A):在野生型幼虫中，usherin存在于靠近连接纤毛标记中心的光感受器睫状体周围区域。与野生型(n = 7 adgrv1rmc22突变体幼鱼和n = 4野生型幼鱼)相比，adgrv1rmc22视网膜切片的引导信号强度显著降低。(B):在野生型幼鱼中，Whrnb存在于靠近连接纤毛标记中心的光感受器睫状体周围区域。与野生型(n = 7 adgrv1rmc22突变体幼鱼和n = 6野生型幼鱼)相比，adgrv1rmc22视网膜切片中Whrnb信号的强度显著降低。对荧光信号的强度进行量化(mean [Math Processing Error] SD)，并在相应图片旁边绘制散点图。****表示p < 0.0001(双尾非配对Student 's t检验)。比例尺:10[数学处理误差]。

adgrv1^rmc22感光细胞中的视紫红质运输缺陷

在不同的动物模型中，USH2复合物蛋白的缺失与视紫红质在光感受器中的运输受损有关。因此，我们开始研究视紫红质在野生型(n = 21只眼)和adgrv1^rmc22 (n = 29只眼)幼鱼(6 dpf)的光感受器细胞中的定位。使用抗视紫红质抗体进行的免疫组化分析显示，视紫红质位于野生型幼鱼视网膜的光感受器外段。偶尔在野生型光感受器细胞的胞体中也可以观察到视紫红质，这与之前的研究一致。然而，与野生型相比，adgrv1^rmc22幼鱼视网膜部分视紫红质异常定位的光感受器数量显著增加(p < 0.0001，双尾非配对Student 's t检验)(图4)。这一结果表明，Adgrv1的缺失导致视紫红质的异常纤毛运输。

图4 adgrv1rmc22斑马鱼光感受器细胞体中视紫红质的异常定位。(A):在adgrv1rmc22突变体中观察到的光感受器外段(OS)的视紫红质定位与光感受器细胞体中视紫红质异常定位的示意图。(B):野生型和adgrv1rmc22斑马鱼幼鱼(6 dpf)的视网膜冷冻切片，标记有针对视紫红质的抗体(绿色)。细胞核用DAPI反染(蓝色)。与野生型相比，adgrv1rmc22幼鱼(用白色箭头表示)的视紫红质定位异常的光感受器数量明显增加。(C):绘制每张视网膜切片中视紫红质定位异常的细胞总数，用平均SD (n = 29 adgrv1rmc22突变体幼鱼和n = 21野生型幼鱼)。双尾非配对Student 's t检验显示adgrv1rmc22突变型与野生型之间存在显著差异。****表示p < 0.0001，比例尺:10[数学处理错误]。CC:连接纤毛;IS:内段;ONL:外核层;INL:内核层。

adgrv1^rmc22斑马鱼显示视觉功能下降

最后，我们记录了adgrv1^rmc22幼鱼(6-8 wpf, n = 35)和年龄和品系匹配的野生型幼鱼(n = 31)的视网膜电图(ERG)痕迹，以评估光感受器包膜区Adgrv1的缺失是否对视觉功能有影响。与野生型相比，adgrv1^rmc22突变体的最大B波振幅显著降低(16%)(p = 0.011，双尾非配对Student 's t检验)(图5)，这表明adgrv1^rmc22幼鱼的视觉功能受损。

图5 视网膜电图记录显示adgrv1rmc22幼鱼视网膜功能受损。(A): adgrv1rmc22和野生型斑马鱼的代表性ERG痕迹。(B): adgrv1rmc22与野生型斑马鱼相比，最大B波振幅显著降低(* p < 0.01，双尾非配对Student 's t检验)。在受精后6-8周的幼鱼(n = 35 adgrv1rmc22突变型和n = 31野生型)的眼睛上记录了ERG的痕迹。野生型B波平均振幅归一化为1。平均B波振幅[数学处理误差]SD在柱状图中绘制。

讨论

由于ADGRV1基因突变，Usher综合征2C型患者表现为先天性听力障碍和RP导致的进行性视力丧失。在缺乏预防ADGRV1相关RP的治疗策略的情况下，一个类似于人类视网膜表型的合适模型对于揭示确切的病理生理机制和评估未来的治疗策略至关重要。在这项研究中，我们生成并鉴定了adgrv1^rmc22斑马鱼作为ADGRV1相关视网膜功能障碍的模型。利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，我们在斑马鱼adgrv1外显子9中引入了一个4bp的缺失。我们已经证明，adgrv1^rmc22等位基因导致光感受器睫状体周围区域Adgrv1缺失，其缺失导致USH2蛋白复合物解体。此外，在adgrv1^rmc22突变体的幼鱼中观察到视紫红质异常定位的增加，ERG记录表明adgrv1^rmc22斑马鱼幼鱼的视网膜功能下降。基于这些发现，我们提出adgrv1^rmc22斑马鱼作为研究adgrv1相关视网膜功能障碍的合适模型。

到目前为止，仅报道了Adgrv1突变小鼠模型，与本文报道的adgrv1^rmc22突变斑马鱼不同，该模型在视网膜表型不明确的情况下表现出了听觉表型。然而，近年来斑马鱼被认为是研究ush2a相关视网膜功能障碍的合适模型。由于在体外受精，斑马鱼很容易受到基因操作，与基于ZFN和TALEN的基因组编辑相比，CRISPR/Cas9技术的引入从根本上减少了生成靶向敲除模型的工作量。为了填补动物模型研究adgrv1相关视网膜功能障碍的空白，我们制作了CRISPR/cas9诱导的adgrv1^rmc22突变斑马鱼。

免疫组化分析证实野生型斑马鱼视网膜连接纤毛区域存在USH2蛋白Adgrv1、usherin和Whrnb，这与前人研究一致。我们发现，在adgrv1的N端区域引入蛋白质截断突变导致光感受器细胞的睫状体周围区域缺乏蛋白质。迄今为止，只研究了morpholino反义寡核苷酸诱导的敲除后Adgrv1缺失对斑马鱼视网膜的影响。然而，Ebermann等在他们的研究中并没有报道adgrv1被敲除后出现视网膜缺陷。当我们将adgrv1^rmc22斑马鱼与adgrv1敲除幼鱼进行比较时，观察到的视网膜表型差异可能归因于morpholino反义寡核苷酸诱导的短暂和部分敲除，而不是CRISPR/Cas9诱导的永久性蛋白质截断突变。另外，免疫组织化学分析显示，Adgrv1在adgrv1^rmc22斑马鱼视网膜中的缺失也导致了usherin和Whrnb荧光信号的强烈减少。这些结果证实了我们之前基于在ush2armc1和ush2ab1245斑马鱼中的类似结果而提出的这些蛋白在正确形成睫状周USH2蛋白复合体中的相互依赖性。因此，我们的研究结果证实了Adgrv1在斑马鱼光感受器睫状体周围区域与其他USH2蛋白介导蛋白和Whrnb蛋白复合物相互作用的模型。为了揭示该区域的usherin和Whrnb的免疫反应性降低是由于USH2复合物的分解，还是由于基因表达水平的改变，我们分析了ush2a和Whrnb的基因表达水平。在adgrv1^rmc22突变体幼鱼中，ush2a和whrnb的相对基因表达量分别下降了34%和26%，具有统计学意义。据报道，仅20%的功能性ush2a转录本就足以导致斑马鱼光感受器睫状体周围区域的引导定位。因此，adgrv1^rmc22斑马鱼视网膜中usherin和Whrnb定位减少可能是Adgrv1缺失导致USH2复合物解体的结果。

据推测，USH2蛋白网络有助于向光感受器外段运送诸如视紫红质的纤毛。人们也普遍认为，由于纤毛运输功能障碍而导致的内节蛋白质的积累可能是通过激活细胞应激途径导致光感受器变性的基础。此外，有报道视紫红质定位错误导致异位光转导，这一过程已被发现加速光感受器细胞死亡。adgrv1^rmc22幼鱼视网膜部分中视紫红质异常定位的光感受器数量的显著增加确实支持了纤毛蛋白运输缺陷可能是adgrv1相关视网膜变性起源的观点。有趣的是，对幼年(3 mpf)和成年(6 mpf) adgrv1^rmc22斑马鱼视网膜进行的组织学检查未显示进行性视网膜变性的任何迹象(图S3)，因为adgrv1^rmc22斑马鱼视网膜各层在形态学上与野生型视网膜难以区分。然而，与之前发表的ush2a突变型斑马鱼模型相一致，在ush2a突变型斑马鱼模型中，与野生型相比，也没有观察到形态学差异。光感受器细胞无进行性变性的一个合理解释是斑马鱼视网膜的再生能力，因为与人类视网膜不同，斑马鱼视网膜能够替代失去的视网膜神经元。错误定位的视紫红质导致光感受器细胞死亡的光毒性作用可能因此被持续的光感受器再生所掩盖。在adgrv1^rmc22斑马鱼中，缺乏进展型表型，纤毛周围区域USH2蛋白复合体的恢复和正常的视紫红质运输提供了有价值的生物标志物，可用于评估adgrv1相关视网膜变性的未来治疗策略。

在本研究中，我们评估了定位于光感受器睫状体周围膜的Adgrv1的功能。有趣的是，最近的一篇论文在来自Vlgr1缺陷小鼠模型的细胞中发现了内质网膜和线粒体相关内质网膜(MAMs)上的ADGRV1，这表明ADGRV1具有一种新的功能。这些细胞膜上缺乏ADGRV1会导致内质网和线粒体之间的距离增加，并减少内质网Ca2+的释放，从而破坏细胞的生物能量学。由于光感受器细胞的高能量需求，很容易推测这些机制也可能是光感受器细胞功能障碍的基础。然而，根据我们的免疫组织化学分析，我们没有发现Adgrv1存在于光感受器细胞的内质网膜和MAMs上的迹象，因为这需要高分辨率显微镜技术。

最后，我们对adgrv1^rmc22 (6-8 wpf)突变体幼鱼和野生型幼鱼的眼部进行了ERGs记录。在这个年龄，斑马鱼的杆状和锥状光感受器被认为是成熟的，两者都有助于视觉功能。当检查ERG痕迹时，首先观察到一个小的初始A波，代表光感受器细胞的超极化。A波在很大程度上被随后的代表ON双极细胞去极化的B波所掩盖。ERG记录显示，与野生型相比，adgrv1^rmc22斑马鱼的B波振幅显著下降。B波振幅的下降可能是光导或向ON双极细胞的信号传导缺陷的结果。无论如何，adgrv1^rmc22斑马鱼B波振幅的显著下降可以被认为是视网膜功能受损的一个指示。这些结果与之前发表的关于ush2a突变斑马鱼幼鱼眼睛的ERGs记录一致，其中记录了类似的B波振幅降低。

结论

综上所述，我们建立了一个adgrv1^rmc22突变斑马鱼模型，值得注意的是，这是第一个表现出早期视网膜功能障碍的ADGRV1突变动物模型。先前的研究已经证明了斑马鱼作为研究视网膜营养不良的模型的转化价值。此外，Schellens等人和Dulla等人的研究已经证明斑马鱼在评估治疗策略时的相关性，如USH2A相关性RP的单外显子或双外显子跳跃治疗。具体来说，我们在adgrv1^rmc22幼鱼的光感受器细胞中观察到的早期分子表型为评估和优化adgrv1相关RP的潜在治疗策略提供了一个绝佳的机会。因此，本研究的斑马鱼模型使我们朝着adgrv1相关RP的未来治疗又迈进了一步。

原文：Stemerdink M, Broekman S, Peters T, et al. Generation and Characterization of a Zebrafish Model for ADGRV1-Associated Retinal Dysfunction Using CRISPR/Cas9 Genome Editing Technology[J]. Cells, 2023, 12(12): 1598.

原文地址：https://doi.org/10.3390/cells12121598

注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充图、表可以点击至原文查阅。