杂志：International Journal of Molecular Sciences

影响因子：5.6（2022-2023）

年份：2023

通讯作者：Zongbin Cui

摘要

糖尿病已逐渐成为威胁人类健康的严重疾病。糖尿病的发病机制相当复杂，目前尚未完全阐明。斑马鱼已被广泛认为是研究糖尿病发病机制和治疗干预的有用模型。然而，过度喂养导致斑马鱼糖尿病的分子基础仍不清楚。本研究通过过度喂养建立斑马鱼糖尿病模型，探讨过度喂养导致斑马鱼糖尿病的分子基础。与对照组相比，过度喂养4周后斑马鱼的体长、体重和状态因子指数均显著增加。空腹血糖水平明显升高，伴有肝内大量脂滴积聚。血清和肝脏中甘油三酯和胆固醇水平均显著升高。转录组测序用于研究过度喂养斑马鱼肝脏的变化。过度喂养斑马鱼肝脏中上调和下调的差异表达基因(DEGs)数量分别为1582和2404个。对差异表达基因进行KEGG和GO富集分析，确定关键信号通路和关键DEGs。结果表明，在与脂肪酸代谢相关的信号通路中，有16个基因被发现显著上调。具体而言，这些基因主要参与脂肪酸转运、脂肪酸氧化和酮体生成。此外，13个在葡萄糖代谢中起关键作用的基因，特别是在糖酵解和糖生成途径中，在过度喂养的斑马鱼的肝脏中显著下调。这些结果表明，在过度喂养的斑马鱼的肝脏中，胰岛素抵抗和葡萄糖进入肝细胞的抑制。这些发现阐明了斑马鱼过度喂养导致糖尿病的潜在分子基础，并为进一步研究糖尿病的发病机制和治疗提供了模型。

关键词：糖尿病；斑马鱼；肝；RNA-seq；信号通路。

前言

糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是全球死亡率的主要原因。预计到2045年，全球糖尿病病例将从目前的约5.37亿增加到7.83亿。据估计，约有670万20-79岁的成年人死于糖尿病或其并发症。2021年中国糖尿病患者人数为1.409亿人。糖尿病是由于胰岛素分泌不足或细胞对胰岛素敏感性下降引起的，导致长时间的高血糖水平，随后对体内许多组织和器官造成损害，如肾衰竭、心血管疾病、神经和脑损伤以及其他微血管并发症。糖尿病主要有三种类型:1型糖尿病(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)和妊娠期糖尿病。

2型糖尿病(T2DM)是最常见的糖尿病类型，占糖尿病病例的95%，其首发症状为胰岛素抵抗。人体获取葡萄糖的主要途径有三个:肠道对食物的吸收、糖原的分解(糖原分解)和糖异生。胰岛素是调节人体大部分细胞(尤其是肝脏、脂肪组织和肌肉)对血液中葡萄糖摄取的主要激素。因此，胰岛素缺乏或其受体不敏感在所有形式的糖尿病中起着核心作用。胰岛素不仅促进葡萄糖的吸收，而且刺激脂肪的合成。高甘油三酯水平和肝脂肪变性与胰岛素抵抗相关。

许多T2DM患者在达到2型糖尿病诊断标准之前已经有糖尿病前期的迹象，如空腹血糖受损和/或糖耐量受损。尤其是糖耐量受损是进展为全面型糖尿病的主要诊断危险因素。血液中胆固醇和甘油三酯水平高，以及收缩压和舒张压升高，也是发展为糖尿病的危险因素。糖尿病患者常出现以胆固醇和甘油三酯代谢异常为特征的血脂异常等代谢综合征。心血管疾病(CVD)是T2DM患者发病和死亡的主要原因。增加糖尿病患者CVD风险的一个重要因素是动脉粥样硬化性脂质异常，而血液中胆固醇和甘油三酯水平的升高是血脂评估的重要标志物。既往研究表明，T2DM患者的肝脏脂代谢也存在明显紊乱。

T2DM主要由生活方式因素和遗传因素引起。目前已知，许多生活方式因素在T2DM的发生中起重要作用，包括肥胖(定义为体重指数大于30)、缺乏体力活动、不良饮食、压力和城市化。含糖饮料等饮食因素与风险增加相关。饮食中的脂肪类型也是重要因素，因为饱和脂肪和反式脂肪会增加风险，而多不饱和脂肪和单不饱和脂肪会降低风险。过量食用精米可能会增加糖尿病的风险，尤其在中国和日本人群中。通过改变生活方式或改善胰岛素敏感性或减少肝脏葡萄糖生成的药物，可以减缓或逆转糖尿病前期向显性T2DM的进展。

然而，糖尿病发生发展的分子机制仍未阐明。斑马鱼已广泛应用于代谢性疾病的研究领域。在糖尿病研究方面，斑马鱼有几个特点。斑马鱼具有与哺乳动物相似的血糖调节机制，几种已获批准的2型糖尿病药物可显著降低斑马鱼高糖模型的血糖。此外，斑马鱼已被用于研究胰岛β细胞再生的机制，并筛选促进胰岛β细胞再生的化合物。在脂肪代谢方面，斑马鱼已被用于研究脂肪代谢和减肥药的开发，以及筛选和评价能够降低体内胆固醇水平的药物。然而，斑马鱼的血容量相对较低，不利于进行大规模、重复的采血实验，如研究血糖代谢调节机制等。考虑到不同物种间脂质代谢的保守性，斑马鱼被认为是研究糖尿病和肥胖等代谢紊乱的良好模型，而利用斑马鱼作为模式生物来研究糖尿病也逐渐得到认可。建立斑马鱼糖尿病模型的方法多种多样，包括化学方法、饮食诱导、葡萄糖浸泡和基因敲除。利用斑马鱼糖尿病模型研究干细胞治疗糖尿病和糖尿病心力衰竭。饮食诱导的糖尿病导致斑马鱼胰腺胰岛素分泌增加。然而，饮食因素引起的斑马鱼糖尿病在分子水平上的改变仍未被揭示。

本研究通过过度喂养建立斑马鱼糖尿病模型。我们发现过度喂食的斑马鱼肝脏中有过多的脂滴积聚。通过高通量RNA-seq的比较分析揭示了在过度喂养的斑马鱼中促进脂滴积累和胰岛素抵抗的新分子因子。这些研究结果为斑马鱼通过过量喂养成功诱导糖尿病提供了支持，为进一步研究糖尿病的病因和治疗提供了模型。

材料和方法

本研究中使用的AB菌株斑马鱼在28℃的标准实验室条件下维持，光/暗循环为12/12小时。

本研究中过度喂养的方法是基于发表的研究。选取4月龄野生型雄性斑马鱼，根据体重和体长随机分为过度喂养组和对照组，每组20条。对照组在常规条件下每天喂养1次(上午9:00)，过度喂养组在常规条件下每天喂养4次(上午9:00、上午11:00、下午15:00、下午17:00)。每次投喂4.08 g/20尾。

冻红鱼主要成分的粗脂肪、粗蛋白质、粗灰分和粗纤维含量分别为4.07%、52.73%、19.2%和9.56%。热量为3.2254 kcal/g。

采血和测定

斑马鱼采血方法与前一篇文章相同。成年斑马鱼禁食18 h后采血。根据制造商的说明，使用Accu-Chek Performa血糖仪测量血糖水平。

油红O染色和组织学

对照组和过度喂养组的肝组织被固定在4%多聚甲醛(PFA, Beyotime Biotechnology，上海，中国)中4℃过夜。固定后，如前所述用油红O染色。组织切片的照片使用来自Leica (Wetzlar，德国)的Aperio VERSA Brightfield荧光和FISH数字病理扫描仪拍摄。采用ImageJ软件进行定量分析。

总胆固醇和甘油三酯的测定

总胆固醇和甘油三酯(TG)水平根据制造商的说明书使用商业试剂盒测定。总胆固醇检测试剂盒(A111-1-1)和甘油三酯检测试剂盒(F001-1-1)购自南京建成生物工程研究所。

RNA测序的样本收集和分析

斑马鱼被禁食一夜，然后在过量喂养4周后被处死。收集3条斑马鱼的肝脏作为一个样本，使用TRIzol Reagent (Invitrogen, Waltham, MA, USA)进行总RNA提取，每组包含3个独立样本。样本质量分析、RNA文库制备和RNA-seq方法如前所述1。构建6个测序文库并测序。文库建设和高通量rna测序由中国科学院水生生物研究所分析检测中心(http://www.ihb.ac.cn/fxcszx/， 2022年11月29日访问)的专家完成。

生物信息学分析

生物信息学分析按照之前的描述进行。简而言之，我们首先使用Trimmomatic(0.38版)过滤原始数据，以去除关节和低质量数据，并获得干净读取。然后使用HISAT2(版本2.1.0)将这些高质量的reads映射到从NCBI组装数据库获得的参考基因组(Danio rerio GRCz11)，以获得对齐文件的BAM形成。然后，使用读取汇总程序featurests对读取计数进行汇总。这些计数使用Bioconductor DESeq2包用于基因差异表达分析。筛选低丰度基因(总reads数< 10)进行差异表达分析。差异倍数≥1.5且p值≤0.05的基因被视为差异表达基因(DEGs)。

利用KOBAS-i对DEGs进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)和基因本体论(GO)富集分析。利用R-studio软件中的ggplot2生成KEGG富集结果的点图和GO富集结果(p值≤0.05)的条形图。使用RStudio (Version 1.4.1717)根据富集分析结果中共享基因的数量计算两条KEGG信号通路之间的Jaccard系数，并使用Cytoscape (Version 3.8.2)软件绘制网络图。利用Cytoscape插件cytoHubba，通过最大集团中心度(MCC)方法分析核心信号通路和基因，并导出可视化结果。使用REVIGO工具根据KOBAS-i获得的p值对GO项进行聚类和修剪。

统计分析

采用Microsoft Excel for Windows软件(Microsoft Office 2013, Microsoft, Redmond, WA, USA)进行统计学分析。采用独立样本t检验对数据进行统计学分析。数据以均数±标准差表示。

雄性斑马鱼过度喂养4周后空腹血糖水平的升高

过度喂养(OF) 4周后，雄性斑马鱼的体长、体重和条件因子指数均显著高于对照组(CK)。其中，CK组斑马鱼平均体长为3.03 cm，而OF组斑马鱼平均体长为3.25 cm。CK组斑马鱼平均重量为0.42 g, of组斑马鱼平均重量为0.58 g。CK组斑马鱼的平均条件因子指数为1.52,OF组斑马鱼的平均条件因子指数为1.69。过度喂养1个月后，与CK组相比，斑马鱼的体长、体重和条件因子指数分别增加了1.1倍、1.4倍和1.1倍(图1A-C)。

图1 雄性斑马鱼过度喂养后体指数、空腹血糖、甘油三酯和总胆固醇的变化。过量喂养组雄性斑马鱼的体长(A)、体重(B)、条件因子指数(C)、空腹血糖(D)以及血清中甘油三酯(E)和总胆固醇(F)水平显著升高(*，p < 0.05;**， p < 0.01;N = 13)。vegfc信号通路促进斑马鱼心脏损伤后冠状动脉内皮细胞(cEC)增殖。

此外，OF组的空腹血糖平均水平为3.25 mmol/L，显著高于CK组的2.03 mmol/L(图1D和图S1A)。然而，与CK组相比，OF组雌性斑马鱼的空腹血糖水平并没有出现显著变化(图S1B)。

CK组和OF组血清甘油三酯平均水平分别为1.44 mmol/L和7.89 mmol/L。与CK组相比，OF组的血清甘油三酯水平增加了5.5倍(图1E)。CK组和of组血清胆固醇平均水平分别为3.67 mmol/L和7.33 mmol/L。与CK组相比，OF组血清中的胆固醇水平显著增加了2倍(图1F)。

综上所述，这些数据表明雄性斑马鱼在过度喂养4周后已经发展出糖尿病的特征。

雄性斑马鱼过度喂养4周后肝脏脂滴的积聚

肝脏在调节血糖水平方面起着重要作用。对CK组和OF组的肝脏切片进行油红0染色，发现OF组的肝脏内脂滴积聚增加(图2A)。ImageJ定量显示，与CK组相比，OF组的油红色区域面积增加了80倍(图2B)。

图2 过量喂养的斑马鱼肝脏中脂滴的积累。对照组和过量摄食组肝脏切片油红O染色图像(A)。通过Image J软件(版本1.50i)对对照组和过量摄食组肝脏脂滴积累的倍数变化进行量化，并以直方图显示(B)。对照组和过量摄食组肝脏甘油三酯(C)和胆固醇(D)水平。(数值为平均值±SEM;*， p < 0.05;**， p < 0.01;CK:对照组，OF:过食组;N = 5。)

斑马鱼肝脏中的甘油三酯和胆固醇水平也受到过度喂养的显著影响。CK组和OF组肝脏甘油三酯平均水平分别为0.78×10−5 mmol/mg和3.47×10−5 mmol/mg。与对照组相比，斑马鱼肝脏中的甘油三酯水平增加了4.5倍(图2C)。

CK组和OF组肝脏胆固醇平均水平分别为1.02×10-5 mmol/mg和1.46×10-5 mmol/mg。与CK组相比，OF斑马鱼肝脏中的胆固醇水平增加了1.4倍(图2D)。

这些结果表明，过度喂养对斑马鱼的脂质代谢产生严重影响，导致脂质在肝脏中蓄积。

RNA-Seq分析鉴定差异表达基因

为了确定OF组肝脏在分子水平的胰岛素抵抗现象，我们对CK和OF组肝脏进行了转录组分析(图S2A)。RNA测序的原始数据范围为19.29 ~ 22.81M。去除适配器和低质量数据后，净读长范围为19.25 ~ 22.77M，各组的净读长比均在99%以上，表明RNA测序数据的质量可靠(图S2B)。各组的clean reads被映射到斑马鱼的参考基因组，映射率在92%以上(图S2B)。

主成分分析(PCA)显示OF组和CK组分别聚类在一起，组间差异明显(图3A)。共获得3986个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)，其中1582个上调，2404个下调(fold change≥1.5且p值≤0.05)(图3B和表S1)。

图3 对照组和过量喂养组肝脏转录组数据分析结果。差异表达基因的基因表达谱主成分分析(PCA) (A)。直方图(B)显示斑马鱼过饲后肝脏中上调和下调的差异表达基因(deg)数量(倍数变化≥1.5,p值≤0.05)。

DEGs的KEGG富集分析

使用在线软件KOBAS(版本3.0)对DEGs进行KEGG富集分析(表S2)。上调DEGs中最富集(p值≤0.05)的KEGG通路为代谢通路、脂肪酸降解、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、过氧化物酶体和β-丙氨酸代谢。下调DEGs中最富集的KEGG通路(p值≤0.05)为紧密连接、凋亡、C型凝集素受体信号通路、NOD样受体信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用(图4A、B)。

图4 过量饲养后肝脏中DEGs的KEGG富集分析结果。上调DEGs (A)和下调DEGs (B)的KEGG富集分析结果点图。上调DEGs (C)和下调DEGs (D)的最大团簇中心性(MCC)最高的前10个枢纽通路网络(节点间的边表示Jaccard相似性系数;节点的颜色和大小分别代表路径的p值和路径中基因的数量。)

由于不同KEGG信号通路可能共享相同的DEGs，因此引入Jaccard相似性系数，根据共享DEGs的比例计算两条信号通路之间的距离(表S3)。获得上调和下调DEGs的KEGG通路网络。然后，使用CytoHubba软件识别网络中的枢纽通路。在表达上调的DEGs富集的信号通路中，排在前5位的hub信号通路是代谢通路、脂肪酸降解、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、色氨酸代谢和赖氨酸降解(图4C和表1)。在表达下调的DEGs富集的信号通路中，排在前5位的枢纽信号通路是C型凝集素受体信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、NOD样受体信号通路、凋亡和toll样受体信号通路(图4D和表2)。此外，22个DEGs被映射到脂肪酸降解的KEGG通路，这是第一个从上调DEGs富集的枢纽信号通路(图4C和表S2)。在从下调的DEGs富集的核心信号通路中，有47个DEGs被映射到MAPK信号通路，这是核心通路中的第一个(图4D和表S2)。

缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、脂肪酸降解、色氨酸代谢和赖氨酸降解等枢纽通路共有11个上调的枢纽DEGs(图5A)。在这些核心DEGs中，有8个上调至少1倍，包括aldh2.1、CABZ01032488.1、acads、aldh2.2、hadh、ehhadh和ehhadh(图5B)。此外，C型凝集素受体信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、NOD样受体信号通路、凋亡和toll样受体信号通路等枢纽通路共有14个枢纽下调的DEGs(图5C)。在这些核心DEGs中，有8个被下调至少1倍，包括il1b、nfkbiaa、tnfa、hrasb、nfkb1、oik3ca、traf2b和rhoab(图5D)。

图5 确定了枢纽通路中的枢纽基因。从上调的DEGs中富集到前4个核心通路的11个核心基因的网络(A)。从下调的DEGs中富集到前5个核心通路的14个核心基因的网络(C)。从下调的核心基因的网络(D)。edge代表(A,C)中路径对应的基因。

DEGs的GO富集分析

利用KOBAS对差异表达基因进行GO富集分析。从上调的DEGs中富集出133个GO项，其中与生物过程相关的GO项58个，与细胞成分相关的GO项15个，与分子功能相关的GO项60个(表S4)。此外，从下调的DEGs中富集出238个GO项，其中与生物过程相关的GO项117个，与细胞成分相关的GO项30个，与分子功能相关的GO项91个(表S4)。

采用在线软件REVIGO (version 1.8.1)进行富集分析，获得具有代表性的GO术语。在生物学过程中，表达上调的DEGs富集的代表GO项包括脂肪酸β-氧化(GO:0006635)、细胞对雌激素刺激的反应(GO:0071391)、胚胎造血(GO:0035162)、脂质转运(GO:0006869)和突触囊泡胞出的调节(GO:2000300)。在分子功能上，由上调的DEGs富集的代表性GO项包括酰基辅酶A脱氢酶活性(GO:0003995)、脂肪-酰基辅酶A结合(GO:0000062)、酰基甘油脂肪酶活性(GO:0047372)、铁离子结合(GO:0005506)、脂质转运活性(GO:0005319)和乙酰辅酶AC-酰基转移酶活性(GO:0003988)(图6A)。

图6 GO富集分析代表性项的条形图。使用REVIGO工具，上调的DEGs (A)和下调的DEGs (B)的GO项被降低，并显示在条形图中。代表性GO术语的不同方面用不同的颜色表示。BP:生物过程;MF:分子功能;CC:细胞成分。

下调DEGs富集的代表性生物学过程包括对细菌的防御反应(GO:0042742)、糖酵解过程(GO:0006096)、氨基酸转运(GO:0006865)、金属离子转运(GO:0030001)和JNK级联的正调控(GO:0046330)。代表性的细胞成分包括中间丝状体(GO:0005882)、NADPH氧化酶复合物(GO:0043020)、顶端质膜(GO:0016324)、双细胞紧密连接(GO:0005923)和自噬体膜(GO:0000421)。代表性分子功能包括l-氨基酸跨膜转运活性(GO:0015179)、蛋白酪氨酸激酶活性(GO:0004713)、肿瘤坏死因子受体结合活性(GO:0005164)、配体门联钙通道活性(GO:0099604)和金属肽酶活性(GO:0008237)(图6B)。

过度喂养上调斑马鱼肝脏脂肪酸代谢基因和下调葡萄糖代谢基因

通过对OF斑马鱼肝脏中DEGs的分析，过度喂养影响的主要信号通路为脂肪酸和葡萄糖代谢(图7)。

图7 过量摄食组肝脏脂肪酸代谢和葡萄糖代谢信号通路上调和下调基因示意图。斜体和红色的字母代表上调基因，斜体和绿色的字母代表下调基因。

在上调的DEGs中，有16个DEGs参与脂肪酸代谢信号通路。其中，plin1上调14倍，编码一种主要附着在脂滴表面的脂滴相关蛋白。其他15个DEGs主要参与脂肪酸跨膜转运(fabp10b、slc27a2a)、脂肪酸β -氧化(hacd2、acaa1、acaa2、acadl、acadm、acads、acadvl、echs1)、酮体生成(hmgcl)、胆固醇转移(scp2a、cetp)、肉碱棕榈酰转移酶(cpt2)和乙酰辅酶a合成酶(acsf2)等过程(图7和图S3，以及表3)。

此外，下调的DEGs中有13个与糖代谢信号通路相关。下调倍数变化最大的两个DEGs是hk2(下调6倍)和gyg1b(下调8倍)。这些下调的DEGs主要参与糖酵解(hk1, hk2, pfkla, pfkpb, aldoaa, aldocb, gapdhs, eno1a, eno1b, pkma)和糖原生成(gys1, gsk3bb, gyg1b)。此外，一个参与糖原分解的DEG (pygl)被上调2.5倍(图7，图S4和表4)。这些结果表明，OF斑马鱼的肝细胞中葡萄糖含量降低，葡萄糖摄取受阻。

综上所述，OF斑马鱼肝脏脂肪酸代谢活性增强，而葡萄糖代谢活性受到抑制，说明OF斑马鱼肝脏的能量供应来源已经从葡萄糖代谢转向脂肪酸代谢，这与T2DM的生理现象是一致的。

讨论

T2DM的主要特征是胰岛素抵抗和代偿性胰岛素分泌不足，导致血糖水平升高。胰岛素抵抗是指肝脏、肌肉和脂肪组织对胰岛素的反应性降低，从而导致高血糖、血脂异常、内脏型肥胖和炎症因子升高等症状。T2DM早期血液中胰岛素水平升高，然而，长期的葡萄糖刺激会对胰岛β细胞产生毒性，导致糖尿病后期的内质网应激和细胞凋亡，导致β细胞合成和分泌胰岛素的能力下降，从而导致血浆中胰岛素水平下降。糖尿病患者常伴有血清胆固醇和甘油三酯升高。因此，可以通过测定血清中的甘油三酯水平、胆固醇含量和葡萄糖耐量来评估胰岛素抵抗。本研究中，雄性斑马鱼经过1个月的过度喂养后，体长、体重、条件因子指数、空腹血糖水平以及血清甘油三酯和胆固醇含量均显著高于对照组，表明我们成功建立了过度喂养的T2DM斑马鱼模型。

T2DM模型的建立主要是通过破坏组织对胰岛素的敏感性，导致葡萄糖吸收受损，从而导致血糖水平升高。将成年斑马鱼交替浸泡在水或2%葡萄糖溶液中28-30天，诱导空腹血糖水平升高、视网膜损伤和骨细胞功能受损。3 hpf(受精后小时)至5 dpf(受精后天数)的斑马鱼幼鱼交替浸泡在4%和5%葡萄糖溶液中可诱发糖尿病样视网膜病变。斑马鱼浸泡在逐渐增加的葡萄糖溶液中——50毫米葡萄糖溶液浸泡4天，100毫米葡萄糖溶液浸泡3天，200毫米葡萄糖溶液浸泡13天——表现出体重增加和血糖水平升高的症状。成年斑马鱼在111 mM的葡萄糖溶液中浸泡14天后，其血糖水平升高，眼部糖化蛋白的数量也增加，但肌肉中胰岛素受体的转录水平下降，对外源胰岛素的反应受损。

超重或肥胖也是T2DM发生发展的重要因素;因此，在斑马鱼中建立糖尿病模型的另一种方法是通过过度喂养或高脂喂养。成年斑马鱼过量食用市售鱼食可表现出糖尿病症状，如葡萄糖耐量降低和胰岛素表达减少。用10%胆固醇喂养斑马鱼并同时将其浸泡在2%葡萄糖溶液中19天，会导致斑马鱼幼鱼出现更多的糖尿病症状，如胰岛素、胰高血糖素、葡萄糖、甘油三酯和胆固醇水平显著升高。在肥胖个体中，脂肪组织释放更多的非酯化脂肪酸、甘油、激素、促炎细胞因子等因子。这些因素可诱发胰岛素抵抗，加速胰腺损伤，最终导致T2DM。此外，脂肪组织中的胰岛素抵抗可导致线粒体功能障碍，导致ROS和炎性细胞因子的产生，以及脂肪因子、细胞因子、趋化因子、过多的脂质和毒性脂质代谢物释放到血流中。这些物质进一步加剧其他组织的胰岛素抵抗。此外，肝组织中的胰岛素抵抗导致脂肪酸在肝脏中的蓄积增加。在之前的研究中，我们分析了过量进食斑马鱼的肝脏和胰腺的基因表达谱，并揭示了人类T2DM的共同通路。在本研究中，我们发现过量喂养的雄性斑马鱼在空腹血糖水平升高的同时，肝脏内大量脂滴聚集。高脂饮食喂养小鼠表现为糖耐量受损、胰岛素抵抗、体质量增加、血浆和肝脏甘油三酯水平升高、肝脏脂肪变性。在本研究中，这些特征在雄性斑马鱼过度喂养4周后被观察到。然而，过度喂养导致糖尿病的分子基础仍不清楚。因此，我们进一步进行了转录组分析，以研究过度喂养斑马鱼肝脏中的新变化。

在过度喂养4周后，雄性斑马鱼的空腹血糖水平显著升高，而雌性斑马鱼即使在过度喂养8周后，空腹血糖水平也没有显著变化。世界范围内的差异性研究也发现糖尿病的发病率存在性别差异，男性发病率高于女性。可以推测，其原因可能是雌激素过多导致女性胰岛素抵抗的可能性更大。

需要进一步的研究来揭示雌激素和睾酮在糖尿病男女性别差异中的作用机制。

肝脏中多余的脂肪酸需要通过β-氧化消耗或转化为胆固醇或甘油三酯，然后通过载脂蛋白转运到身体的其他部位。肝脏中过量的甘油三酯和胆固醇被包装在脂滴中。Perilipin 1由plin1表达，是一种主要附着在脂滴表面的脂滴相关蛋白。其功能包括增加脂滴大小和调节甘油三酯水平。在这项研究中，我们发现这个基因在过度喂养的斑马鱼的肝脏中表达上调了14倍。

此外，我们发现从脂肪酸转运到脂肪酸β氧化的整个代谢过程中的多个其他基因显著上调。例如，基因slc27a2a和fabp10b分别上调2.9倍和2.8倍。slc27a2a基因编码长链脂肪酰基辅酶a合成酶家族的一个成员，参与脂质生物合成和脂肪酸降解。fabp10b编码脂肪酸结合蛋白(FABP)，主要促进脂肪酸的摄取、细胞内转运和代谢。将脂肪酸类从细胞膜转运到其代谢部位以进行β-氧化和甘油三酯类和磷脂类的合成。因此，在过量喂养的雄性斑马鱼中，slc27a2a和fabp10b的上调可以促进脂肪酸从细胞外到细胞内的转运。固醇载体蛋白2a (scp2a)主要调控细胞内脂质转运，促进外源性脂肪酸合成甘油三酯和胆固醇。胆固醇酯转运蛋白(cetp)的主要功能是转运胆固醇酯和甘油三酯，调节胆固醇的反向转运，将外周组织中多余的胆固醇转运到肝脏进行代谢和消化。在本研究中，我们发现这两个基因在过度喂养的斑马鱼肝脏中的表达分别上调了2.3倍和2.1倍。

上调DEGs的KEGG富集分析结果中，有5条与脂肪酸代谢相关的信号通路。KEGG富集结果中最重要的枢纽通路为脂肪酸降解和脂肪酸代谢。与脂肪酸降解和代谢相关的核心基因为hadh、ehhadh、acat1、hadhaa、acads和echs1。其中，上调最多的基因是acads，其编码酰基CoA脱氢酶，参与脂肪酸β-氧化的第一步。这些枢纽基因可作为糖尿病早期诊断的潜在分子标志物。在上调的DEGs的GO富集分析中，代表性的GO项为脂肪酸β-氧化，包含13个原始GO项。进一步分析发现，这些上调的基因主要参与脂肪酸转运、脂肪酸氧化和胆固醇转运。

过量喂养的斑马鱼肝脏中acsf2和cpt2的表达水平分别上调2.5倍和2.7倍。长链脂肪酸首先需要酰基辅酶a合成酶家族成员2 (acsf2)催化成酰基辅酶a，然后通过肉碱棕榈酰基转移酶2 (cpt2)转移到线粒体内膜。经过多次酶催化反应，长链脂肪酸转化为乙酰辅酶a，进入三羧酸循环氧化。此外，过量喂养斑马鱼肝脏中参与脂肪酸β-氧化的多种酶基因显著上调，包括酰基辅酶a脱氢酶(acadvl, acadl, acadm, acads)、烯丙基辅酶a水合酶(echs1)、3-羟基辅酶a脱氢酶(hacd2)和β-酮硫酶(acaa1, acaa2)。脂肪酸β-氧化的产物乙酰辅酶a可进一步转化为酮体，并转运到其他组织，为机体提供能量[58]。由hmgcl编码的HMG-CoA裂解酶在生酮过程中起重要作用，该基因在过量喂养的糖尿病斑马鱼肝脏中上调1.6倍。脂肪酸β-氧化主要受PPARα信号通路调控[59]。我们发现PPARα通路已从上调基因中显著富集，并且过量喂养的斑马鱼肝脏中有15个上调的deg被定位到该信号通路上。以上数据表明，过量摄食可以促进斑马鱼肝脏脂肪酸代谢。这些与脂肪酸代谢相关的基因的上调导致线粒体代谢负担增加，导致ROS的产生和线粒体功能障碍。线粒体功能障碍和氧化应激在很大程度上与T2DM有关。

细胞内葡萄糖的代谢主要通过糖酵解进行。然而，与糖酵解相关的基因在过度喂养的斑马鱼肝脏中的表达水平显著下调。这些酶主要包括己糖激酶(hk1、hk2)、磷酸果糖激酶(pfkla、pfkpb)、果糖二磷酸醛缩酶(aldoaa、aldocb)、甘油醛磷酸脱氢酶(gapdhs)、烯醇化酶(eno1a、eno1b)和丙酮酸激酶(pkma)。编码糖原合成相关蛋白的基因gyg1b、gsk3bb和gys1在过度喂养的斑马鱼的肝脏中显著下调。gyg1b编码一种具有葡萄糖基转移酶活性的糖原蛋白，其表达减少6倍，其催化产物为糖原合成酶的底物。gys1基因编码糖原合酶，在过度喂养的斑马鱼的肝脏中下调1.6倍。激活糖原合成酶的糖原合成酶激酶(gsk3bb)下调2.6倍。然而，催化糖原分解的基因pygl在过度喂养的斑马鱼的肝脏中上调了2.5倍，表明过度喂养导致肝细胞葡萄糖含量降低和葡萄糖摄取受损。

本研究通过转录组鉴定了斑马鱼肝脏中的4个胰岛素受体亚单位(irs1, irs2a, irs2b, irs4a)和2个胰岛素受体(insra, insrb)。其中irs1、insra表达上调，irs2a、irs2b、irs4a、insrb表达下调。然而，这6个基因的倍数变化均小于1.5，并且在统计学上不显著(p值> 0.05)(表S5)。据报道，胰岛素受体磷酸化的降低对胰岛素抵抗细胞中胰岛素信号通路的阻断是重要的。胰岛素受体杂合子缺失的小鼠具有正常的葡萄糖和胰岛素耐受性。这些研究表明胰岛素受体的磷酸化在胰岛素信号转导中比胰岛素受体表达水平的改变起着更重要的作用。此外，过去几年的大量研究表明，肝内脂滴的形成以及胆固醇和甘油三酯含量的增加与胰岛素抵抗相关。在本研究中，过量喂养的斑马鱼肝脏中出现了脂滴的过度积累和甘油三酯和胆固醇水平的升高，在一定程度上说明了胰岛素抵抗的发生。

综上所述，我们利用高通量转录组测序和生物信息学分析技术，揭示了过量饮食斑马鱼肝脏中与脂肪酸和葡萄糖代谢相关的信号分子的变化。过量喂养的雄性斑马鱼表现出脂肪酸代谢增强和葡萄糖代谢抑制，提示胰岛素抵抗和糖尿病的发生。

结论

本研究通过过度喂养建立斑马鱼糖尿病模型。与对照组相比，过度喂养4周后斑马鱼的体长、体重和条件因子指数均显著增加。空腹血糖水平明显升高，肝脏内大量脂滴积聚。血清和肝脏中甘油三酯和胆固醇含量也显著升高。通过对过度喂养斑马鱼肝脏的转录组测序，我们发现16个上调的DEGs在脂肪酸代谢的信号通路中发挥作用，包括脂肪酸转运，脂肪酸氧化和酮生成。此外，13个下调的DEGs参与了糖代谢信号通路中的糖酵解和糖生成，表明过量喂养雄性斑马鱼的胰岛素抵抗和葡萄糖进入肝细胞的抑制。这些发现阐明了过度喂养导致斑马鱼糖尿病的分子基础，为进一步研究斑马鱼糖尿病的发病机制和治疗奠定了基础。

基金：这项研究得到了国家重点研发计划项目(2018YFA0800503)、广东省科学院建设国内一流科研机构项目(2021GDASYL-20210103024)、中国科学院科技发展计划项目(2022gdaszhh -2022010202)、广东省科学院专项基金项目(2021GDASYL-20210102003)、国家自然科学基金项目(31871463和31571504)的支持。

原文：Ge G, Ren J, Song G, et al. Transcriptome Analysis Reveals the Molecular Basis of Overfeeding-Induced Diabetes in Zebrafish[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2023, 24(15): 11994.

原文地址：https://doi.org/10.3390/ijms241511994

注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充图、表可以点击至原文查阅。