题目：Loss of αBa-crystallin, but not αA-crystallin, increases agerelated cataract in the zebrafish lens

原文链接:https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10802301/

期刊:Experimental Eye Research

摘要 

脊椎动物的晶状体是一种特殊的器官，其大部分细胞缺乏细胞核，也无法更新老化的蛋白质。小分子热休克蛋白α-晶状体蛋白进化成为晶状体的关键组成部分，这可能是因为它们能够阻止老化蛋白质的聚集，否则这些蛋白质会导致晶状体混浊。大多数脊椎动物表达两种α-晶状体蛋白，即αA-和αB-晶状体蛋白，且这两种蛋白的突变均与人类白内障相关。在小鼠敲除模型中，仅αA-晶状体蛋白的缺失会导致早期晶状体白内障。我们以斑马鱼为模型系统，探究α-晶状体蛋白在晶状体发育过程中的作用。有趣的是，斑马鱼虽表达一个晶状体特异性的αA-晶状体蛋白基因（cryaa），却拥有两个αB-晶状体蛋白基因：其中一个进化出晶状体特异性（cryaba），另一个则保留了其哺乳动物直系同源基因广泛的表达模式（cryabb）。本研究中，我们利用针对三个α-晶状体蛋白基因的单个斑马鱼突变品系，确定了这些基因缺失对年龄相关性白内障的影响。出乎意料的是，与小鼠敲除模型不同，我们发现24月龄时，与cryaa缺失型斑马鱼相比，αBa-晶状体蛋白基因cryaba的缺失会导致晶状体混浊程度加剧。而αA-晶状体蛋白的缺失并未增加白内障的患病率。我们还通过单细胞RNA测序和RT-qPCR数据发现，斑马鱼α-晶状体蛋白在晶状体中的表达模式在受精后5至10天发生了转变：5和6天龄的晶状体几乎仅表达cryaa，而10天龄后cryaba和cryabb的表达则变得更为显著。这些数据表明，cryaa是晶状体早期发育过程中的主要α-晶状体蛋白，而cryaba在晶状体老化阶段的保护作用则更为重要。本研究首次对野生型衰老斑马鱼的白内障患病率进行了量化，结果显示到18月龄时，约25%的斑马鱼会出现晶状体混浊。三个α-晶状体蛋白突变体均未出现代偿性表达增加在另外两种晶体蛋白的表达中，或是在丰富的βB1-晶体蛋白中。总体而言，这些发现表明斑马鱼晶状体发育过程中，单个α-晶体蛋白功能重要性发生了个体发育转变。我们发现斑马鱼晶状体特异性αBa-晶体蛋白在预防年龄相关性白内障中起主导作用，这为我们理解脊椎动物晶状体进化增添了新的见解。

关键词：晶状体；白内障；斑马鱼；单细胞RNA测序；分子伴侣；衰老；晶状体蛋白

引言

视觉的实现依赖于形状合适且透明的晶状体——这是一种高度保守的结构，在头足类动物和脊椎动物等差异极大的类群的“相机眼”中均有发现。脊椎动物的晶状体主要由三类蛋白质构成：α、β和γ-晶状体蛋白，这些蛋白为光线聚焦到视网膜提供了透明度和屈光力（Bloemendal & Cate, 1959; Harding & Dilley, 1976; Wistow & Piatigorsky, 1988; Bloemendal & Jong, 1991; Andley, 2007）。各类脊椎动物还含有所谓的类群特异性晶状体蛋白，例如鸟类和其他爬行动物体内的δ-晶状体蛋白（Zwaan, 1968; Jong, Stapel & Zweers, 1981）。令人意外的是，研究发现α-晶状体蛋白的基因序列与果蝇中的小型热休克蛋白基因相似，这表明这些丰富的晶状体物质是从应激诱导的保护蛋白在进化过程中被共募集而来的（Ingolia & Craig, 1982）。脊椎动物的晶状体包含两种不同的细胞类型：纤维细胞和上皮细胞。在纤维细胞中，哺乳动物的α-晶状体蛋白已被证实可作为分子伴侣发挥作用，防止变性蛋白聚集——若蛋白聚集则可能导致晶状体混浊（Horwitz, 1992）。由于晶状体纤维细胞在发育过程中会失去细胞核，无法替换老化的蛋白质，因此这种伴侣功能对晶状体的稳态维持至关重要（Kuwabara & Imaizumi, 1974; PIATIGORSKY, 1981; Bassnett, 2002）。

哺乳动物和鸟类会产生两种α-晶体蛋白，这源于脊椎动物进化早期的一次基因复制事件（威斯托与皮亚蒂戈尔斯基，1988）。其中一种αA-晶体蛋白主要在晶状体中表达，而其旁系同源物αB-晶体蛋白则广泛表达于晶状体、神经组织和肌肉组织（巴特与纳吉内尼，1989；杜宾、瓦夫鲁塞克与皮亚蒂戈尔斯基，1989）。编码αA-晶体蛋白的cryaa基因发生突变可导致先天性白内障，而编码αB-晶体蛋白的cryab基因突变则会同时引发白内障和心肌病（利特等人，1998；维卡尔等人，1998；贝里等人，2001）。研究人员已利用多种α-晶体蛋白突变体和基因修饰手段探究这些蛋白的结构与功能关系（希尔与海特曼西克，2021）。在小鼠敲除模型中，αA-晶体蛋白的缺失会导致晶状体白内障，而αB-晶体蛋白的缺失则不会，这表明至少在小鼠这一物种中，αA-晶体蛋白对维持晶状体透明度的保护作用更强（布雷迪等人，1997，2001）。不过，将与人类白内障相关的αB-晶体蛋白突变体——R120G突变体——在小鼠晶状体中表达时，也会引发白内障，这凸显了其对晶状体功能的重要性（安德利等人，2011）。

斑马鱼晶状体蛋白质组与哺乳动物存在诸多相似之处（波斯纳等人，2008年；格雷林、霍克与克拉克，2009年）。然而，硬骨鱼进化基础上发生的基因组复制导致了两种αB-晶体蛋白旁系同源物的出现（波斯特莱思韦特等人，1998年；史密斯等人，2006年）。有趣的是，其中一种旁系同源物αBa-晶体蛋白进化出了晶状体特异性表达模式，而另一种αBb-晶体蛋白则保留了单拷贝哺乳动物蛋白所具有的广泛表达特征（波斯纳、坎托罗与霍维茨，1999年；史密斯等人，2006年）。在体外实验中，这两种αB-晶体蛋白旁系同源物的保护性分子伴侣活性也出现了分化，不过关于哪种分子伴侣活性更强，目前的研究数据存在矛盾（史密斯等人，2006年；科泰切等人，2015年）。

斑马鱼是研究指导晶状体发育的遗传和分子过程的优秀模型系统（Vihtelic, 2008）。其体外发育特性以及我们开展突变分析的能力，使斑马鱼胚胎和幼体非常适合研究晶状体细胞类型特化的早期事件。研究人员已利用三个αB-晶体蛋白基因的突变体来探究它们对晶状体早期发育的影响。不表达αA-晶体蛋白的斑马鱼突变体表现出细微缺陷，例如纤维细胞间的表面粗糙和边界不规则，这些缺陷可通过微分干涉相差显微镜观察到（Zou et al., 2015; Posner et al., 2023）。αB-晶体蛋白突变体的研究结果则存在分歧，一项研究发现其会导致晶状体发育缺陷，另一项研究则未观察到任何影响（Mishra et al., 2018; Posner et al., 2023）。目前尚不清楚α-晶体蛋白的缺失会如何随鱼类年龄增长影响白内障的发生。事实上，关于实验室饲养的斑马鱼中晶状体白内障的患病率，人们知之甚少。鱼类晶状体白内障的相关研究大多集中在水产养殖品种，如鲑鱼和圆鳍鱼（Richardson et al., 1985; Jonassen et al., 2017）。鉴于斑马鱼中存在两个晶状体偏好性表达的α-晶体蛋白，目前尚不清楚其中哪种蛋白承担着哺乳动物晶状体中αA-晶体蛋白的保护功能。

本研究的目的是探究α-晶状体蛋白在晶状体老化过程中的作用。实验室饲养的斑马鱼寿命可达3至4年。本研究对6至24月龄的斑马鱼进行了每6个月一次的检测。我们假设斑马鱼体内两种晶状体偏好型αB-晶状体蛋白的存在，可能使其在抵抗白内障形成的保护作用方面发生了进化改变。研究获得的数据解答了关于一类蛋白质所发挥作用的基础问题，而这类蛋白质是脊椎动物晶状体在进化中取得成功的关键因素。

材料与方法

斑马鱼的饲养与繁育、突变体构建、研究设计及数据可用性

本研究中突变型和野生型斑马鱼的饲养与使用已获得阿什兰大学动物使用与护理委员会批准（批准号：MP 2019–1），但用于单细胞RNA测序的斑马鱼除外，相关内容详见下文2.4节。麻醉和安乐死方法遵循《美国国立卫生研究院院内研究项目斑马鱼使用指南》，并符合美国兽医医学协会（AVMA）指南。ZDR品系野生型和α-晶体蛋白突变型斑马鱼饲养于循环水族系统中，温度约为28℃，光暗周期为14:10，每日换水。成鱼每日投喂两次，混合喂食干燥薄片饲料和活体卤虫培养物。成鱼在假底鱼缸中繁殖以收集受精卵在培养皿中用系统水于28摄氏度下进行孵育。待培育至成体的幼虫以研磨后的浮游动物和绿藻制成的液态糊状物为食，直至体型足够大以食用薄片饲料和卤虫。突变菌株的构建详细方法可参见波斯纳等人（2023年）的研究。简而言之，CRISPR技术构建的cryaa突变体通过两个向导RNA实现了近端启动子和起始密码子的缺失，而cryaba突变体则通过一个向导RNA引入了提前终止密码子。质谱分析证实了这两个基因的蛋白产物均已缺失（波斯纳等人，2023年）。

研究设计与报告遵循ARRIVE指南的建议（基尔肯尼等人，2010年）。任何例外情况均在下文的方法部分予以说明。所有定量数据均以补充表格形式呈现，所有用于分析衰老晶状体的图像均可在Dryad.org网站获取。

晶状体晶体蛋白表达的逆转录定量聚合酶链式反应分析

该方法的设计符合MIQE指南（巴斯顿等人，2009年）。研究人员在斑马鱼的四个不同年龄阶段摘除其晶状体，通过实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）测定α-晶状体蛋白基因cryaa、cryaba和cryabb的mRNA水平的个体发育变化。实验选取了受精后10天和19天的幼体、受精后15周的幼鱼以及不同年龄的成鱼。实验鱼的选取不基于任何明显的差异或表型，但会避开并实施安乐死患病个体。先对实验鱼进行麻醉，通过解剖摘除双侧晶状体。晶状体先临时置于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，随后保存于RNA保存液（Thermo公司）中。在使用 Monarch 总RNA微量制备试剂盒（NEB公司）纯化总RNA前，保存的晶状体可在4℃条件下存放最长一周，或在−20℃条件下存放最长一个月。本实验选取10天龄的晶状体约30个、19天龄的约10个、5周龄的约6个，成鱼的约4个，样本量经确定可提供足够的RNA用于互补脱氧核糖核酸（cDNA）合成。每个年龄阶段均进行三次取样，以获得三个生物学重复样本。使用玻璃匀浆器将晶状体在DNA/RNA保护缓冲液中匀浆，随后按照制造商的操作流程，加入蛋白酶K并在55℃条件下孵育5分钟。经柱纯化和柱上脱氧核糖核酸酶（DNase）处理后，RNA样本用50微升无核酸酶水洗脱，并通过Nanodrop One分光光度计（Thermo公司）进行定量检测。

另一组实验中，我们从成年野生型斑马鱼以及本研究中cryaa和cryaba基因敲除突变体品系的成年个体身上摘除了晶状体。同样，实验个体的选择并未依据不同品系间的任何表观差异。野生型和cryaa突变体斑马鱼在麻醉并采集晶状体时约为18月龄，而cryaba突变体斑马鱼此时为15月龄。我们采用上述方法从这些晶状体中提取了总RNA。每个生物学重复使用两条个体斑马鱼的共四个晶状体，每种基因型共设置三个生物学重复。

我们使用 ProtoScript II 第一链 cDNA 合成（NEB）试剂盒，按照标准方案，以 d(T)23 引物将纯化的晶状体 RNA 逆转录为 cDNA。每个 cDNA 合成反应使用 50 纳克总 RNA，总体积为 20 微升。同时设置不含逆转录酶的阴性对照反应。合成的 cDNA 于 -20 °C 保存直至使用。使用 Luna 通用 qPCR 预混液（NEB），在总体积 20 微升的反应体系中，对每个 cDNA 样本的 2.0 微升进行扩增，采用赛默飞世尔科技Applied Biosystems StepOne实时荧光定量PCR系统的标准方案进行实验。每个cDNA样本设置三次技术重复，每个-RT对照设置两次重复，无模板对照仅设置一次反应。使用两种内参引物（rpl13a和eef1a1l1，亦称ef1a），这两个基因在斑马鱼不同发育阶段的各组织中表达水平相近（Lang、Wang & Zhang, 2016）。本实验所用的所有引物序列详见补充表1。所有引物的终浓度均为250纳摩尔，反应程序设置如下：95℃预变性1分钟；40个循环，95℃变性15秒、60℃退火延伸45秒；采用快速升温模式。通过熔解曲线分析确认扩增产物为单一条带，且所有引物扩增的产物至少各测序一次以验证其特异性。OneStep软件采用默认参数计算每个反应的Cq值。我们预先设定：若某一技术重复的Cq值与另外两个重复的差值超过0.5，则将该重复数据剔除。采用Excel软件，以两种内参基因的平均Cq值为基准计算ΔCq值；再通过RStudio中的ggplot2包（R团队, 2023b,a）绘制图表。所有样本均进行三次生物学重复，样本间的统计学差异通过R软件中的anova和Tukey HSD函数计算得出。

晶状体成像与分析

我们在6、12、18和24个月时摘除成年野生型斑马鱼以及三种α-晶体蛋白突变体品系的晶状体，以评估是否存在异常。将各年龄点前后一个月内的斑马鱼合并为该年龄组样本。每个养殖缸中随机选取一条斑马鱼进行基因型鉴定以确认其品系，选取样本时不依据个体间的任何表型差异。每个年龄点至少采集10条斑马鱼的晶状体，24个月年龄组则至少采集15条。用直尺测量每条斑马鱼的标准体长，并记录完整眼球中晶状体或角膜的浑浊情况。对麻醉后的斑马鱼进行晶状体解剖，将其置于磷酸盐缓冲液（PBS）中，在体视显微镜下以总放大40倍的倍数，配合台尺进行成像。晶状体在摘除并放入PBS后的15分钟内完成成像，因为我们发现，晶状体在PBS中长时间孵育后，晶状体核与皮质层之间常出现肉眼可见的光学分离现象。通过观察晶状体图像来初步判定潜在的突变表型。所有晶状体图像均在评分前隐去年龄和基因型信息，以盲法进行评分。由两名实验人员分别对所有晶状体完成盲评。采用“N-1”卡方检验（https://www.medcalc.org/calc/comparison_of_proportions.php）计算各年龄点下不同基因型间晶状体异常比例的统计学差异。使用ImageJ软件测量摘除晶状体的直径，以每张图像中的台尺刻度进行校准。晶状体大小的数据分析在RStudio软件的R环境中完成，运用了方差分析（anova）和图基诚实显著差异（Tukey HSD）函数。

单细胞RNA测序

俄勒冈大学斑马鱼设施采用标准饲养技术对斑马鱼进行饲养（韦斯特菲尔德，2007年）。从自然交配中收集外观正常的胚胎，对其进行分期并合并（每个重复组15个）。本研究使用的动物为野生型（ABC品系）。

胚胎解离：如先前报道（Farnsworth、Saunders & Miller, 2020），将胶原酶P在汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中配制成100毫克/毫升的储备液。采用0.25%胰蛋白酶、2毫克/毫升胶原酶P、1毫摩尔/升乙二胺四乙酸（pH 8.0）和磷酸盐缓冲液（PBS）进行化学解离，在28℃下处理15分钟，每5分钟轻轻吹打一次。用5%胎牛血清、1毫摩尔/升氯化钙和磷酸盐缓冲液终止解离反应。将细胞洗涤后重悬于预冷（4℃）的培养基中，该培养基含1%胎牛血清、0.8毫摩尔/升氯化钙、50单位/毫升青霉素、0.05毫克/毫升链霉素和杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）；随后将细胞悬液通过40微米细胞筛（Falcon），并稀释至含0.04%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液中以减少细胞聚集。经伯乐TC20细胞计数器测定，将细胞最终浓度调整为每微升2000个细胞，重悬于含0.04%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，用于互补脱氧核糖核酸（cDNA）文库构建。本分析所用样本汇总于补充表2。

单细胞cDNA文库制备：样本制备由俄勒冈大学基因组学与细胞表征核心设施完成（https://gc3f.uoregon.edu/）。解离后的细胞通过10X Chromium平台，采用10x v3化学试剂进行处理，目标捕获10000个细胞。本研究中各时间点（受精后3、4、6和7天）的解离样本均以重复样本形式提交，以检测技术重复性。所得cDNA文库经15个循环的PCR扩增后，在Illumina Hi-seq平台上进行测序。

计算分析：所得测序数据采用10X Cell-ranger流程（6.1.2版，Zheng等人，2017年）以及适用于R语言（4.1.2版，R团队，2023b）的Seurat软件包（4.0.6版，Satija等人，2015年）进行分析，分析过程采用标准的质量控制、标准化和分析步骤。简要来说，我们将测序读段比对至斑马鱼基因组GRCz11_93，并对蛋白编码读段的表达量进行计数。所得表达矩阵被导入Seurat中，与此前获得的1、2和5天龄期幼虫的相关数据合并（Farnsworth、Saunders & Miller，2020年）。对合并后的数据集进行SC变换，并利用115个主成分进行主成分分析（PCA）。随后对该数据集进行UMAP分析，设置115个维度，分辨率为24.0。基于晶状体标记基因（cryaa、cryaba、cryabb、foxe3、mipa）的表达情况，以及此前鉴定出的晶状体纤维细胞和上皮细胞的存在（Farnsworth、Posner & Miller，2021年），我们选取394、411、197、347号聚类进行进一步分析。对该晶状体亚群中的细胞重新进行聚类分析，设置15个维度，分辨率为0.2。由于7天龄期样本中的细胞数量极少，因此将其排除在后续分析之外。为便于获取本研究中的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，相关数据已上传至UCSC细胞浏览器（https://cells-test.gi.ucsc.edu/?ds=zebrafish-lens-aging）。本研究中使用的序列已提交至美国国家生物技术信息中心（NCBI）的序列读型档案（SRA），可通过以下标识检索：待公布。与本文相关的其他数据和代码可在以下网址获取：https://www.farnsworthlab.com/。

结果

α-晶状体蛋白基因表达的个体发育变化

我们此前的研究表明，受精后2天（dpf）即可在斑马鱼晶状体纤维细胞中检测到αA-晶状体蛋白基因cryaa的表达，而两种αB-晶状体蛋白基因（cryaba和cryabb）的mRNA在受精后5天内几乎检测不到（Farnsworth、Posner和Miller，2021）。为了更精确地确定基因的时间动态为探究晶状体发育过程中的基因表达情况，我们分析了受精后1至6天（dpf）内发育中晶状体在24小时间隔下的单细胞转录组变化。我们通过mipa的表达鉴定纤维细胞，借助foxe3的表达鉴定上皮细胞（图1A）。值得注意的是，1 dpf的上皮细胞与后期阶段的上皮细胞之间存在明显的分离，这一结果与我们之前的数据集一致（Farnsworth、Posner和Miller，2021）。部分已报道在晶状体上皮中发挥功能的基因在1至2 dpf期间表达无明显变化（foxe3、mab21l1、pitx3），但另一些基因表达下调（lim2.1、rbm24a、sox1a），仅有少数基因表达上调（sparcl1）。纤维细胞在1至2 dpf期间的细胞间分离程度较小，且在3至6 dpf期间转录组特征更为稳定。

接下来，我们探究了三种α-晶体蛋白基因的时间表达是否是晶状体早期发育中年龄相关变化的组成部分（图1B）。我们此前观察到cryaa基因在2天龄斑马鱼胚胎的纤维细胞中表达。本研究中的分析显示，从2到6天龄斑马鱼胚胎阶段，cryaa基因在不断扩增的纤维细胞群体中的表达水平逐渐升高。相比之下，直到6天龄斑马鱼胚胎阶段，上皮细胞中几乎检测不到cryaa信使RNA（mRNA）。我们再次发现，晶状体纤维细胞和上皮细胞中cryaba和cryabb基因的表达水平均极低。4天龄斑马鱼胚胎的上皮细胞中，cryaba信使RNA（mRNA）水平略有升高；6天龄斑马鱼胚胎中，cryabb信使RNA（mRNA）水平也略有升高，但二者的表达水平远低于cryaa基因（图1B）。

我们使用公开的单细胞RNA测序（scRNA-Seq）数据集，绘制了5天和10天胚胎期（dpf）每个α-晶体蛋白基因的表达水平与晶状体纤维细胞标志物mipa及上皮细胞标志物foxe3表达的对应关系（图2）（https://zebrahub.ds.czbiohub.org/；Lange等人，2023）。该分析显示，在5 dpf时cryaa与mipa共表达，这与预期一致，因为在我们的单细胞RNA测序数据中cryaa也表现出纤维细胞偏好的表达（图1）。在同一阶段，我们未发现同时表达mipa和cryaba的细胞，仅发现5个同时表达mipa和cryabb的细胞。在5 dpf时，几乎没有或不存在任何α-晶体蛋白基因与上皮细胞标志物foxe3的共表达。这些表达模式在10 dpf时发生了显著变化。值得注意的是，cryaa的表达扩散到了表达foxe3的上皮细胞，这一表达上调也出现在我们新的6 dpf单细胞RNA测序数据中（图1B）。两个αB-晶体蛋白基因在10 dpf时也在晶状体细胞中表达范围更广，在表达mipa的纤维细胞中丰度更高（图2）。在5至10 dpf期间，表达cryaba和cryabb的晶状体细胞数量似乎有所增加，尽管该数量仍低于表达cryaa的细胞数量。

我们对斑马鱼幼鱼、稚鱼至成年阶段不同日龄（10天龄及以上）摘除的晶状体RNA进行RT-qPCR分析，以探究α-晶状体蛋白表达随鱼类生长发育的阶段性变化（图3）。这些数据显示，cryaa晶状体mRNA在10天龄时已达到最高水平，19天时有所下降，随后在成年阶段再次升高。相比之下，cryaba mRNA在10天龄时的水平低于cryaa，且随年龄增长呈稳步上升趋势。cryabb晶状体mRNA在10天龄时为三者中最低，19天时仍维持低水平，但在5周龄至成年阶段大幅上升（图3）。

衰老斑马鱼的白内障及其他晶状体异常

我们量化了衰老斑马鱼晶状体中的多种异常类型，并在24个月的时间内比较了野生型斑马鱼与我们培育的三种α-晶体蛋白突变体之间这些异常的丰度差异受精后（MPF）。大多数晶状体透明，置于测微尺上时可形成清晰图像（图4A）。其他晶状体出现不同程度的轻度白内障（图4B），这是由晶状体特定区域整体均匀的浑浊或不透明导致的。我们主观上进一步将部分晶状体判定为患有重度白内障（图4C）。另一种明显的晶状体缺陷是晶状体前极出现的暗区（图4D），可通过角膜观察到（图4E）。最不常见的是晶状体核与皮质的分离以及晶状体内的裂隙（图4F）。

通过盲评所有晶状体图像，对每种晶状体缺陷的野生型和突变型斑马鱼比例进行了定量分析（图5）。在6和12月龄（mpf）时，晶状体缺陷并不常见，但到18月龄时变得更为普遍，此时各基因型间的晶状体缺陷发生率已相当均匀。我们发现，18月龄时约27%的野生型斑马鱼出现白内障，24月龄时这一比例相近（19%）。然而，在24月龄时，cryaba突变体的白内障患病率高于野生型或另外两种α-晶体蛋白突变体。cryaba突变体中白内障的比例虽未显著高于野生型斑马鱼(p- value =0.102)，但显著高于cryaa无效突变体(p- value =0.031)。所有cryaa无效突变体均未出现严重的白内障表型，而野生型、cryaba和cryabb突变体中均观察到了严重白内障。部分斑马鱼仅单侧晶状体出现白内障，另一些则为双侧患病。总计196尾受检斑马鱼中，29尾出现晶状体白内障，其中9尾为双侧患病。各基因型均出现前晶状体缺陷，但仅在cryaba和cryabb突变体中，该缺陷出现在更早的年龄（6和12月龄）。样本中雄性斑马鱼占64%，雌性占32%，3.5%的个体性别未被鉴定。各基因型间雄性比例从野生型的60%到cryaba突变体的83%不等。所有雄性斑马鱼中17.4%出现白内障，雌性中则为11%，这一差异无统计学意义（p值0.2501；“N-1”卡方检验）。样本中雄性比例较高并非因死亡率差异，而是饲养缸内性别决定机制不同导致。本分析所用的所有晶状体图像均公开于Dryad.org网站，盲评结果详见补充表3。我们还在补充表4中按基因型、年龄和饲养缸对这些盲评数据进行了汇总，结果显示各基因型的多个批次/饲养缸中均广泛存在晶状体缺陷。

α-晶体蛋白缺失与晶状体生长

我们绘制了晶状体直径与鱼标准体长的关系图，以观察突变型晶状体的大小是否与野生型存在差异（图6A）。结果显示，cryaba突变体的晶状体似乎比其他基因型的更大。为了量化这一可能存在的差异，我们将每个时间点各基因型的晶状体直径绘制为标准体长的比例。我们发现，在6和12月龄时，各组间无统计学显著差异；但在18月龄时，cryaba突变体的晶状体显著大于其他基因型（p值=0.020；图6B），而在24月龄时，cryaa和cryaba突变体的晶状体均更大（p值分别为0.006和0.002；图6C）。标准体长和晶状体直径随年龄变化的单独图表见补充图1。这些分析涵盖了用于晶状体白内障盲法评分的所有切除的晶状体。

成年突变体晶状体的晶状体蛋白表达

我们采用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR），对比了成年野生型鱼分离晶状体与cryaa、cryaba基因敲除突变体中三种α-晶状体蛋白基因以及丰度最高的晶状体蛋白基因crybb1的转录水平。由于此前我们发现cryabb基因突变体会产生截短的αB-晶状体蛋白（波斯纳等人，2023年），因此本分析未纳入该突变体。我们观察到αA-晶状体蛋白基因敲除突变体中cryaa信使核糖核酸（mRNA）水平出现预期的大幅下降（图7A），因为该突变体缺失了其近端启动子和起始密码子（波斯纳等人，2023年）。尽管cryaba突变体中cryaba转录本水平略有降低，但该差异无统计学显著性（图7B）。cryaba突变体仍保留其启动子和起始密码子，且我们此前已证实，尽管该基因编码的蛋白缺失，但幼体整体中该基因的mRNA水平并未降低（波斯纳等人，2023年）。野生型与突变体鱼晶状体中cryabb和crybb1的mRNA水平也相近（图7C、D）。总体而言，这些RT-qPCR数据表明，αA-或αBa-晶状体蛋白的缺失均未导致其他α-晶状体蛋白或高丰度表达的βB1-晶状体蛋白的表达发生变化。

讨论

脊椎动物晶状体由两种α-晶体蛋白演化而来，一种是晶状体特异性的αA-晶体蛋白，另一种是普遍表达的αB-晶体蛋白。这两种小热休克蛋白家族成员均能维持防止蛋白质聚集的能力，但晶状体特异性的αA-晶体蛋白在哺乳动物晶状体中的含量更高，且在预防晶状体白内障方面可能发挥着更重要的作用（Brady 等人，1997）。这一情况在硬骨斑马鱼中似乎发生了改变。由于硬骨鱼进化基础上的基因组复制，斑马鱼出现了第二种晶状体特异性的αBa-晶体蛋白，其晶状体中拥有两种晶状体偏好表达的α-晶体蛋白。我们的研究表明，随着晶状体老化，αBa-晶体蛋白在预防白内障方面发挥着更重要的作用。这些数据表明，斑马鱼（或许还有其他硬骨鱼类）演化出了第二种αB-晶体蛋白，该蛋白可作为防护剂，抵御年龄诱导的蛋白质聚集和白内障。这一发现为脊椎动物晶状体的形成与功能至关重要的基因和蛋白质演化历程增添了意想不到的新维度。

虽然我们未在缺乏αA-晶体蛋白的鱼类中发现年龄相关性白内障的发生率升高，但在3天和4天龄（dpf）时，缺乏该蛋白的幼体确实出现了明显的晶状体缺陷（邹等人，2015；波斯纳等人，2023）。这些缺陷表现为晶状体中央粗糙、中央纤维细胞排列紊乱以及纤维细胞间边界不规则（波斯纳等人，2023）。成年cryaa基因敲除鱼未出现白内障发生率升高的情况，这表明这些早期发育缺陷要么是暂时性的，要么不会随晶状体生长改变其透明度。水通道蛋白基因aqp0a和aqp0b的敲除斑马鱼在2天和3天龄时出现的缺陷较为明显，但在4天龄时得到缓解（沃龙佐娃等人，2018）。由此可见，早期发育表型与年龄相关性白内障的未来发生之间可能存在脱节。至少在5天龄前，cryaba和cryabb的表达缺失可能会加剧αA-晶体蛋白缺失带来的早期影响。我们的单细胞RNA测序（scRNA-Seq）数据以及斑马鱼基因库（Zebrahub）的研究数据（兰格等人，2023）均表明，在5天龄前的晶状体细胞中几乎检测不到cryaba信使核糖核酸（mRNA），该物质的水平在10天龄时开始升高，且主要存在于纤维细胞中。如果αBa-晶体蛋白已取代αA-晶体蛋白，成为斑马鱼晶状体中对抗蛋白质聚集的主要保护蛋白，那么有可能我们此前的研究表明，成年斑马鱼晶状体以6.4:3.6:1的比例表达αA、αBA和αBb晶状体蛋白，这与人类晶状体中3:2的比例相似（Bloemendal等人，2004；Posner等人，2008）。因此，其保护作用的任何差异并非源于各晶状体蛋白相对表达量的变化，而可能与它们的分子伴侣活性有关。目前尚不清楚斑马鱼晶状体相较于哺乳动物，是否存在不同的抗蛋白聚集保护需求。我们的研究数据显示，圈养在水族箱中的野生型斑马鱼确实会发生晶状体白内障，且αBA晶状体蛋白缺失时，白内障的患病率似乎会升高。但目前仍不清楚，斑马鱼晶状体更高的蛋白质含量及其对应的折射率（1.57），相较于人类晶状体（最高1.44）或大鼠晶状体（1.50），是否意味着蛋白聚集是更需关注的问题（Pierscionek & Regini，2012；Wang等人，2020）。鱼类晶状体的高蛋白质密度伴随着大量富含甲硫氨酸的γ晶状体蛋白，即γM晶状体蛋白（Wistow等人，2005；Kiss & Cheng，2008）。哺乳动物晶状体中缺乏这类蛋白，其存在可能使得在角膜不参与折射的情况下，晶状体能够实现水生折射率所需的紧密堆积。目前也不清楚α晶状体蛋白的缺失会如何影响斑马鱼晶状体的折射率梯度，或是晶状体核从角膜侧向中心逐渐发育移位的过程（Vorontsova等人，2018）。我们研究的老年斑马鱼晶状体出现前部缺陷，这一表型似乎与aqpOa-/-成年斑马鱼晶状体中发现的表型相似，后者被归因于前部缝线稳定性的丧失（Vorontsova等人，2018）。我们发现的12条出现前部缺陷的斑马鱼来自10个不同的饲养缸，这表明该表型并非由少数受影响的鱼卵批次导致，而是在不同基因型和饲养缸中均有广泛分布。

此前针对两种哺乳动物α-晶状体蛋白的小鼠基因敲除模型开展的研究均报道了晶状体大小发生变化，以及转录组和蛋白质组出现改变。例如，缺失αA-晶状体蛋白的小鼠晶状体体积小于野生型晶状体，而αB-晶状体蛋白的缺失则不会导致晶状体大小发生变化（Brady等人，1997、2001年）。与之相反，我们发现24月龄的αA-和αBa-晶状体蛋白纯合突变体小鼠，其晶状体体积出现了小幅但具有统计学显著性的增大。对小鼠αA-/αB-晶状体蛋白双敲除模型的蛋白质组分析并未发现蛋白质表达出现大幅变化（Andley等人，2013年）。相反，蛋白质表达的变化仅表现为多种组蛋白、连环蛋白、波形蛋白以及另一种晶状体蛋白的表达水平升高。值得注意的是，并非所有这些蛋白质水平的变化都体现在mRNA水平的改变上。我们的研究发现，纯合突变体与野生型斑马鱼晶状体中，三种α-晶状体蛋白基因的mRNA，或是高丰度表达的βB1-晶状体蛋白的mRNA水平均无显著差异，这一结果与此前的研究发现相符，也表明当αA-或αBa-晶状体蛋白缺失时，α-晶状体蛋白基因的转录并不会发生相应调控。

我们针对成年斑马鱼晶状体的RT-qPCR数据显示，三种α-晶体蛋白基因的mRNA水平均处于较高水平，同时βB1-晶体蛋白的表达也十分丰富。结合以往的蛋白质组学研究来看，这四种蛋白在成年斑马鱼晶状体中的含量存在差异。我们此前的研究发现，βB1-晶体蛋白占成年晶状体蛋白总量的7.5%，而αBb-晶体蛋白的占比则不足1%（波斯纳等人，2008年）。格雷林等人（2009年）采用基于排名的鸟枪法蛋白质组学方法，却发现αA-晶体蛋白是含量最丰富的蛋白，其占比为6个月，但同样，αB-晶体蛋白在这四种蛋白中含量最低（Greiling、Houck & Clark, 2009）。总体而言，蛋白质水平的这些差异似乎并未体现在mRNA浓度上，这表明最终的蛋白质含量取决于翻译调控。

我们认为，这是首个量化野生型斑马鱼衰老过程中晶状体白内障发生率的研究。在6月龄和12月龄的ZDR品系野生型斑马鱼中未发现白内障，但18月龄和24月龄的斑马鱼中分别有约27%和19%出现白内障。这一比例远低于圆鳍鱼的相关报道，而圆鳍鱼一直被用于水产养殖中白内障发生机制的研究（乔纳森等人，2017；帕拉迪斯等人，2019）。不过，野生型斑马鱼中存在一定基线水平的白内障，这为与突变品系进行对比以确定晶状体混浊度的显著升高提供了条件。我们的实验数据收集在24月龄时结束，早于斑马鱼典型的实验室寿命（最长可达3.5年及以上）。白内障的患病率有可能在24月龄之后进一步上升。需要重点指出的是，我们的年龄相关性白内障分析是在ZDR品系中进行的，其他野生型斑马鱼品系（包括本研究单细胞RNA测序分析所用的ABC品系）的白内障患病率和基因表达情况可能存在差异。近期有研究发现，野生型斑马鱼不同品系在早期发育阶段（4天龄）的晶状体缺陷存在差异（卡蒂瓦达等人，2024）。但我们对ZDR品系幼鱼晶状体蛋白表达的实时荧光定量PCR分析结果，与基于ABC品系斑马鱼获得的单细胞RNA测序数据一致。此外，单细胞RNA测序技术会对mRNA进行富集，而mRNA最有可能在晶状体纤维细胞脱核前存在。由于纤维细胞脱核发生在2天龄至3天龄之间，我们对3天龄及以上斑马鱼幼鱼的分析，大概率针对的是年轻、新生的纤维细胞。尽管mRNA水平是分析基因表达的有效指标，但其并非总能预测蛋白质表达水平。

我们按年龄对标准体长的测量结果与以往一项研究的报道相似，但晶状体直径的测量值更大，且在后续时间点仍持续增大（Wang 等人，2020）。我们按年龄测得的晶状体直径略小于另一项以往研究，该研究显示2岁左右的晶状体最大直径约为1200微米，而我们的测量结果集中在1000微米左右（Collery 等人，2014）。这些差异可能取决于养殖箱的环境条件及其对生长的影响。另一项以往关于斑马鱼体长生长的研究采用了叉长测量方式，因此与我们的新数据较难直接对比（Gómez-Requeni 等人，2010）。

总之，本研究首次量化了衰老斑马鱼中白内障的患病率，并确定了α-晶状体蛋白缺失的影响。与以往针对小鼠基因敲除的研究不同，本研究发现是αBa-晶状体蛋白的缺失，而非αA-晶状体蛋白的缺失，会促进年龄相关性白内障的发生发展。每种α-晶状体蛋白的缺失都不会导致其他α-晶状体蛋白转录水平的代偿性变化。这些研究结果对未来以斑马鱼作为年龄相关性白内障模型的研究具有重要意义，同时表明在斑马鱼以及可能的其他硬骨鱼类中，晶状体特异性的αBa-晶状体蛋白旁系同源物已成为抵御因蛋白质衰老聚集而导致晶状体混浊的关键蛋白。

图 1 受精后 6 天内斑马鱼晶状体细胞基因表达的单细胞 RNA 测序分析。利用已知定位于晶状体纤维细胞的基因（mipa）与晶状体上皮细胞的基因（foxe3）的表达情况，识别包含这两种细胞类型的细胞簇（A）。紫色深浅代表各细胞中的相对表达水平，细胞同时按日龄着色；箭头显示上皮细胞在受精后 2 天至 6 天间呈现基因表达梯度变化。（B）展示受精后 1 天至 6 天期间，两种细胞类型中细胞类型标记基因与三种 α- 晶状体蛋白基因的表达情况。（C）展示六种上皮偏好基因的表达，其中部分基因在受精后 1 天细胞与受精后 2–6 天细胞中的表达存在差异。

图2. 基于公开的单细胞RNA测序数据，受精后5天和10天α-晶体蛋白基因与晶状体纤维细胞和上皮细胞标志物的共表达情况。共表达每种标记基因与α-晶状体蛋白基因的细胞数量被用于反映该晶状体蛋白在每种晶状体细胞类型中的表达水平。在受精后5天，cryaa信使核糖核酸在推定的纤维细胞（即表达mipa的细胞）中含量最高。共表达cryabb的受精后5天推定晶状体细胞数量要少得多，而共表达cryaba的细胞则不存在。在受精后10天，共表达全部三种α-晶状体蛋白基因的推定晶状体细胞数量有所增加，其中cryaa的含量仍为最高。所有坐标轴均显示了指定基因的相对转录本计数。数据来源于斑马鱼基因表达数据库（https://zebrahub.ds.czbiohub.org/）。

图3. 幼体（10日龄和19日龄）、幼鱼（5周龄）和成体中各α-晶状体蛋白基因的晶状体mRNA水平。三张RT-qPCR生物学重复的箱线图已展示。Y轴为倒置状态，因其显示的是ΔCq值，该值由两个内参基因（rpl13a和eef1a1l1）计算得出，数值越低代表基因表达水平越高。本分析所用数据详见补充表5。

图4. 切除晶状体的示例图像，展示了野生型和α-晶体蛋白突变体斑马鱼中常见的缺陷。将晶状体置于载物测微计上成像，以评估是否存在混浊或其他缺陷。正常晶状体呈透明状，在晶状体中央区域可见清晰的测微计线条（A）。有混浊的晶状体被盲法评分为轻度白内障或重度白内障（B和C）。部分晶状体存在明显的前部缺陷（D），在摘除晶状体前可通过角膜观察到该缺陷（E）。部分晶状体出现内部断裂（F）。图中标注了每个示例晶状体的年龄和基因型。

图5. 6至24月龄时野生型和α-晶状体蛋白突变体斑马鱼出现晶状体缺陷的比例。研究人员对鱼眼晶状体进行盲法评分，隐去了鱼的遗传身份和年龄，以量化晶状体缺陷的比例。任何具有统计学显著性的差异均以p值标注（采用“N-1”卡方检验）。样本量通常为：6个月、12个月和18个月时各10条鱼，24个月时15条鱼。本分析所用数据见补充表3。

图6. 18月龄和24月龄野生型与α-晶状体蛋白突变型斑马鱼的晶状体直径与标准体长对比。对四种基因型的透镜直径（微米）和标准长度（毫米）进行了测量，数据汇总于一张图（A）中。每种基因型均标注了带标准误的趋势线。该数据以各基因型比值形式呈现的箱线图分别展示于18个月（B）和24个月（24）的时间点。对于与野生型存在统计学显著差异的突变基因型，标注了P值（采用方差分析和图基事后检验）。本分析所用数据见补充表6。

图7. 野生型、cryaa突变体和cryaba突变体成年晶状体中三种α-晶状体蛋白基因及βB1-晶状体蛋白基因的晶状体mRNA水平。每个晶状体蛋白基因均展示了箱线图，三种基因型各有三个RT-qPCR生物学重复。Y轴为倒置的，因为其显示的是ΔCq值，该值以两个内参基因（rpl13a和eef1a1l1）为参照，数值越低代表基因表达量越高。本分析所用数据见补充表7。