标题：Anti-Neuroinflammatory Naphtho-γ-Pyrones from a Deep-Sea-Derived Fungus Aspergillus niger 3A00562

期刊：Marine Drugs 

原文链接：https://doi.org/10.3390/md24040125

摘要

抑制炎症和氧化应激被越来越多地认为是治疗神经退行性疾病的一种有前景的策略。本研究从深海来源的黑曲霉3A00562中分离出两种新的二聚萘并-γ-吡喃酮(aS)-方西酮B和D（化合物1和2）以及14种已知化合物（3-16）。通过综合的理化性质和波谱分析，明确确定了它们的结构。利用BV2小胶质细胞模型进行神经炎症抑制剂筛选，发现TMC 256 A1（化合物10）是活性最强的候选物。化合物10可在无细胞毒性的情况下显著抑制脂多糖诱导的BV2细胞炎症反应，同时还能抑制斑马鱼体内脂多糖触发的活性氧过量产生和中性粒细胞浸润。后续蛋白质组学研究表明，化合物10通过靶向一氧化氮合酶2（NOS2）调控阿尔茨海默病相关通路及KEAP1-NRF2轴。分子对接和动力学模拟证实，化合物10可占据NOS2的血红素结合口袋，从而阻止其二聚化并抑制酶活性。最终，化合物10改善了阿尔茨海默病斑马鱼模型的运动功能缺陷。综上，这些研究结果表明化合物10有望成为治疗神经退行性疾病（尤其是阿尔茨海默病）过程中预防炎症和氧化应激损伤的候选化合物。

关键词：海洋天然产物；蛋白质组学；神经保护；抗神经炎症；诱导型一氧化氮合酶

引言

神经退行性疾病是一类主要的神经系统疾病，其特征为具有多样的临床和病理特征，会影响中枢神经系统不同区域内的特定神经元亚群。尽管这些疾病的发病机制具有异质性，例如存在不同的蛋白质聚集和遗传变异，但它们均以慢性神经炎症为共同特征。小胶质细胞介导的神经炎症可能在神经退行性疾病的进展中发挥核心作。阿尔茨海默病（AD）是一种不可逆且进行性的神经退行性疾病，全球患者超5500万。目前，尚无可靠的治疗或预防AD的方法。这一关键的治疗缺口凸显了开发有效AD治疗方案的紧迫性。

一氧化氮（NO）是神经炎症过程的核心，是一种由一氧化氮合酶（NOS）从L-精氨酸合成的关键信号分子。在NOS同工酶中，诱导型一氧化氮合酶（NOS2）的特点是其表达受炎症调控，并能持续大量产生NO。在活化的小胶质细胞中，这种由NOS2产生的长时间NO通量会显著放大神经炎症级联反应，进而加速神经退行性病变的病理进程。基于这一机制作用，NOS2抑制剂在NOS2介导的疾病中具有广泛的治疗潜力。

近年来，海洋来源真菌作为发现抗炎神经药物的关键资源，已获得广泛关。研究人员从海洋来源真菌菌株中分离出多种具有强效抗炎活性的新型次生代谢产物。这些化合物不仅展现出良好的药理特性，还具有持续较低的细胞毒性和更高的生物利用度，使其成为治疗神经退行性疾病的潜在药物先导物。

本研究从深海来源真菌黑曲霉 3A00562 中分离出两个新的二聚萘并吡喃酮类化合物（1和2）以及14个已知化合物（3-16）（图1）。值得注意的是，TMC 256 A1（10）可通过抑制脂多糖（LPS）诱导的小胶质细胞活化来减轻神经炎症。本研究详细阐述了这些代谢物的分离、结构表征及生物活性评价。此外，本研究整合网络药理学与蛋白质组学技术，阐明了TMC 256 A1（10）发挥神经保护作用的靶点与机制，并通过斑马鱼模型验证了其功效。该研究为TMC 256 A1（10）的抗炎机制提供了新的分子见解，也为其靶向一氧化氮合酶2（NOS2）用于神经退行性疾病治疗的潜在应用提供了依据。

图1. 从黑曲霉3A00562中分离得到的化合物1-16的化学结构

结果

黑曲霉的化学成分及结构解析

通过将核磁共振（NMR）和质谱（MS）数据与参考文献进行比对，鉴定出14个已知化合物，分别为（aS）-脱水-金雀花酮C（3）、（aS）-金雀花酮A（4）]、（aS）-丰塞奇诺酮A（5）、考塔宁（6）、奥兰丁（7）、去斑曲霉素B（8）、黑曲霉醇A（9）、TMC 256 A1（10）、TMC-256C1（11）、吡喃黑曲菌素A（12）、曲霉酮（13）、碳喃酮A（14）、黑曲菌素A（15）、环（丙氨酸-亮氨酸）（16）。

化合物1为黄色粉末状固体。通过高分辨电喷雾电离质谱（正离子模式）测得其分子式对应的准分子离子峰为m/z 611.1527（计算值为611.1529），不饱和度为19。化合物1的核磁共振氢谱数据（表1）显示存在两个甲基信号[δ 1.48 (3H, s, 2′-Me)、2.41 (3H, s, 2-Me)]；四个甲氧基信号[δ 3.42 (3H, s, 6-OMe)、3.62 (3H, s, 7-OMe)、3.81 (3H, s, 8-OMe)、3.98 (3H, s, 9-OMe)]；一个亚甲基[δ 2.90 (1H, d, J=7.5 Hz, H-3b′)、2.92 (1H, d, J=7.5 Hz, H-3a′)]；四个芳香氢信号[δ 6.10 (1H, d, J=2.5 Hz, H-7)、6.34 (1H, d, J=2.5 Hz, H-9)、6.96 (1H, s, H-9)、7.14 (1H, s, H-10)]；一个烯氢质子[δ 6.05 (1H, s, H-3)]；以及两个因氢键缔合的酚羟基单峰[δ 14.56 (1H, s, 5′-OH)、14.89 (1H, s, 5-OH)]。  碳核磁共振谱数据显示化合物1共含32个碳原子，包括2个甲基碳（δ 20.8、28.4）、4个甲氧基碳（δ 55.1、55.9、56.1、61.8）、1个亚甲基碳（δ 47.1）、5个次甲基碳（δ 96.0、97.2、101.3、101.6、107.3）以及20个季碳（δ 100.2、103.7、104.7、106.1、107.5、111.2、118.8、140.2、142.6、151.5、153.1、157.2、160.3、161.5、161.8、162.0、164.8、167.8、184.5、197.7）。在δ 197.7和184.5处出现两个羰基信号，表明化合物1是两个线性萘并-γ-吡喃酮单体形成的不对称二聚体，其中一个单体在C2′–C3′位发生水合。  通过关键的异核多键相关谱（HMBC）相关关系，如H-2-Me与C-2/C-3、H-3与C-4、H-10与C-4a/C-5a/C-9、H-9与C-5a/C-7、H-9′与C-10′/C-8′/C-5a′、H-7′与C-5a′/C-6′/C-9′、H-2′-Me与C-2′/C-3′、H-3′与C-2′/C-4′、5-OH与C-4a/C-5/C-5a、5′-OH与C-4a′/C-5′/C-5a′等，确定了化合物1的平面骨架结构（图2）。将化合物1的核磁共振数据与fonsecinone B[22]进行对比，除C-5、C-8、C-9、C-10、C-4′、C-5′、C-5a′和C-8′位外，其余碳信号均高度相似（碳化学位移差值分别为+0.8、−2.6、−1.3、−0.8、+1、+5.1、−2.6、−2.5）。综上，化合物1为一种新的萘并-γ-吡喃酮类衍生物。

图2. 化合物1的关键HMBC（）核磁共振相关信号以及化合物1和2的实验电子圆二色谱（ECD）谱图

通过CD激发手性法确定了化合物1的绝对构型。萘并-γ-吡喃类化合物由于连接各芳香体系的键旋转能垒较高，通常表现出轴向手性。化合物1的CD光谱（图2）在286 nm（((Delta varepsilon+21.5))）和230 nm（((Delta varepsilon+8.3))）处呈现正科顿效应，在270 nm（((Delta varepsilon-22.8))，22.8）处呈现负科顿效应，表明化合物1为(aS)绝对构型。因此，确定了化合物1的结构并将其命名为(aS)-丰西诺酮B。与已报道的2,3-水合萘并-γ-吡喃类化合物类似，化合物1在手性中心(C-2')处的构型仍未确定。

化合物2为黄色粉末状固体。通过高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）分析，确定其分子式对应的标识为(C_{32} H_{28} O_{11})（不饱和度为19），质谱显示存在m/z 611.1519处的钠加合离子，计算值对应标识(C_{32} H_{28} O_{11} Na)为611.1529，离子标识为([M+Na]^{+})。化合物2与丰西酮D的一维核磁共振（1D NMR）谱图（表1）高度相似，表明二者具有相同的平面结构。化合物2的绝对构型也通过圆二色性（CD）数据推导得出。化合物2的圆二色性谱图（图2）与化合物1的谱图几乎完全一致，说明二者具有相同的绝对构型。因此，化合物2的结构得以阐明，并被命名为(aS)-丰西酮D。

化合物抑制脂多糖诱导的小胶质细胞神经炎症能力的筛选

为评估化合物1–16的神经保护潜力，本研究采用BV2小胶质细胞系（一种成熟的神经炎症抑制剂筛选模型）探究了它们的作用。如图3A所示，TMC 256 A1（10）成为一种具有潜力的抑制剂，在10微摩尔浓度下表现出显著的抑制活性。研究进一步对化合物10的活性进行了定量分析，得出其(IC_{50})值为9.3微摩尔（图3B）。此外，为评估潜在的细胞毒性，本研究采用CCK-8法，在实验所用的浓度范围内对化合物10进行了检测。值得注意的是，实验结果显示，化合物10在所有测试浓度下均未表现出细胞毒性（图3C、D）。

图3. 通过抗炎特性筛选神经保护化合物。(A) 评估海洋来源化合物1-16在BV2细胞中的抗炎潜力，重点考察其对一氧化氮（NO）生成的抑制作用。(B) 测定TMC 256 A1（10）的(IC 50)值，证明其在抑制NO生成方面的效力，其中化合物10的(IC 50)为9.3微摩尔。(C) 分析化合物10在不同浓度下的细胞毒性特征，结果显示在测试浓度范围内无显著细胞毒性。(D) 化合物10的细胞毒性可视化结果。数据以平均值±标准误表示。(^{* * *} p<0.001)与脂多糖（LPS）组相比

TMC 256 A1（10）挽救脂多糖诱导的斑马鱼幼鱼炎症损伤

基于此前观察到的化合物10在体外的神经保护作用，我们采用野生型AB品系和转基因斑马鱼模型，评估其在脂多糖（LPS）刺激后的体内治疗效果（图4A）。斑马鱼因其实验操作便捷且成本效益高，是评估神经保护作用的理想模型。与神经炎症病理一致，脂多糖暴露显著提高了斑马鱼幼鱼的细胞内活性氧（ROS）水平（图4B、C）。地塞米松（Dex）和化合物10处理均能有效缓解这种脂多糖诱导的氧化应激。作为炎症免疫激活的生理标志，脂多糖刺激后中性粒细胞的聚集显著增加（图4B、D）。化合物10的给药大幅逆转了这种促炎性中性粒细胞反应。综上，这些结果证实了化合物10在减轻体内炎症关键病理特征方面的治疗潜力。

图4. TMC 256 A1（10）可减轻脂多糖（LPS）诱导的斑马鱼炎症损伤。（A）斑马鱼（野生型AB品系和转基因Tg(Lyz-Egfp)品系）的饲养及脂多糖（LPS，50 µg/mL）、地塞米松（Dex，10 µM）和化合物10（10 µM）处理的时间线。（B）LPS诱导的斑马鱼体内系统中活性氧（ROS，使用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）标记）和中性粒细胞的荧光图像。（C、D）各组活性氧荧光强度及Lyz:Egfp阳性细胞数的定量分析（((n=6))）。数据以平均值±(* * * p<0.001)表示，与LPS组相比

定量蛋白质组学分析及NOS2作为关键靶点的预测

为阐明化合物10神经保护作用的药理学基础，本研究对单独用脂多糖（LPS）处理或用化合物10联合LPS处理的BV2细胞进行了定量蛋白质组学分析。对比分析发现，与LPS对照组相比，化合物10+LPS组有193种蛋白显著上调、90种蛋白显著下调（(p<0.05)、(|log _{2} FC|>0.5)；图5A）。值得注意的是，KEGG通路富集分析显示，差异表达蛋白显著富集于阿尔茨海默病信号通路中（图5B）。后续利用ClueGO进行的多簇功能分析进一步证实，差异丰度蛋白在阿尔茨海默病和KEAP1-NRF2轴相关通路中均存在富集（图5C），相关蛋白的差异热图也验证了这一结果（图5D）。为筛选介导化合物10抗炎作用的潜在直接靶点，本研究通过SwissTargetPrediction数据库预测了化合物10的结合靶点，并将这些预测靶点与从GeneCards数据库获取的、与小胶质细胞活化、炎症及阿尔茨海默病发病机制相关的2040个蛋白取交集。随后利用jvenn对该交集集与质谱鉴定的蛋白质组学靶点进行对比分析。整合分析确定，诱导型一氧化氮合酶（NOS2）是这一重叠关系中的高可信度核心候选靶点，也是化合物10在阿尔茨海默病治疗中最可能的直接结合靶点（图5E）。综上，这些结果有力表明，化合物10可能通过直接靶向NOS2，调控包括KEAP1-NRF2通路在内的关键信号级联反应，从而发挥抗LPS诱导神经炎症的保护作用。

图5. 定量蛋白质组学分析与关键靶点预测。(A) 相较于脂多糖（LPS）诱导组，TMC 256 A1（10）处理后BV2细胞中差异表达蛋白的火山图。(B) 排名前10的富集通路气泡图。(C) 用于可视化多簇功能通路与蛋白间关联的通路-蛋白相互作用网络。(D) 京都基因与基因组百科全书（KEGG）二级分类注释；阿尔茨海默病及KEAP1-NRF2轴相关显著差异蛋白丰度热图。(E) 多元韦恩图中交集数大于2和3的靶点蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络

TMC 256 A1（10）与NOS2的结合分析

本研究采用分子对接技术探究化合物10与一氧化氮合酶2（NOS2，PDB: 4JS9）之间的相互作用及其结合模式。研究确定了最佳结合构象，该构象具有高结合亲和力，结合自由能为-9.5千卡/摩尔（图6A、B）。在潜在结合位点中（图6C），化合物10位于由酪氨酸（Tyr）483、苯丙氨酸（Phe）363、半胱氨酸（Cys）194、精氨酸（Arg）193、丙氨酸（Ala）191和色氨酸（Trp）188等氨基酸残基构成的疏水口袋内（图6B）。对接结果显示，NOS2相关氨基酸残基与化合物10之间存在常规氢键、疏水相互作用和π-烷基相互作用，其中氢键发挥关键作用。具体而言，化合物10的酮基和羟基分别与NOS2蛋白的酪氨酸（Tyr）483和半胱氨酸（Cys）194形成两个氢键（图6D），这些氢键表现出较强的相互作用，供体-受体距离分别为2.7埃和(3.5 AA)。此外，化合物10与色氨酸（Trp）188、苯丙氨酸（Phe）363形成π-π堆积作用，并通过与周围疏水性和亲水性残基的相互作用，稳定在NOS2蛋白的疏水空腔中。

图6. TMC 256 A1（10）与NOS2的分子对接构型。（A）10与NOS2的分子对接结果，整体视图。（B）复合物对称二聚体的侧视图。（C）10与NOS2相关氨基酸残基的详细相互作用视图；氢键：蓝线；疏水相互作用：红线；π-烷基相互作用：绿线。（D）晶体结构中化合物10的结合位点。（E）10-NOS2复合物的均方根偏差值。（F）10-NOS2复合物的均方根涨落值。（G）10-NOS2复合物的回旋半径值。（H）10-NOS2复合物中的氢键数目。

10- NOS2复合物的均方根偏差（RMSD）在0.1纳米范围内波动（图6E），结合口袋中大多数残基的均方根波动（RMSF）值低于0.2纳米（图6F）。旋转半径（Rg）稳定在约2.3纳米（图6G），整体表明复合物构象稳定且紧密。10-NOS2复合物系统的氢键数量在0至3之间，且在大多数情况下，复合物约存在一至两个氢键（图6H），这意味着持续的极性相互作用使复合物保持稳定。

TMC 256 A1（10 (AlCl_{3})）诱导的阿尔茨海默病斑马鱼幼虫的运动障碍康复效果

在受精后5天（5 dpf；图7A）对斑马鱼幼鱼进行行为学评估。与先前研究结果一致，氯化铝（((AlCl_{3}))）暴露导致幼鱼运动活性显著降低（图7B）。该结果证实了斑马鱼模型中阿尔茨海默病（AD）样病理的成功诱导。值得注意的是，用多奈哌齐（阳性对照）或化合物10处理AD模型斑马鱼，均能缓解(AlCl_{3})诱导的运动功能障碍。具体而言，与未处理的AD模型组相比，这两种化合物均增加了总移动距离、总活动时间和游泳速度（图7D-F）。斑马鱼幼鱼对明暗交替表现出独特且可量化的游泳模式，这一行为与社交互动、焦虑水平、学习/记忆功能及防御机制密切相关。值得注意的是，在暗期条件下，经多奈哌齐或化合物10处理的斑马鱼，其游动距离显著长于AD模型组（图7C）。综合来看，这些结果有力表明，化合物10能够提升斑马鱼的运动能力，并对(AlCl_{3})诱导的AD样行为症状发挥保护作用。

图7. TMC 256 A1（10）可减轻(AlCl_{3})诱导的斑马鱼行为损伤。(A) 斑马鱼（野生型AB品系）的饲养及用(AlCl_{3})（100 µM）、多奈哌齐（4 µM）和10（10 µM）处理的时间线。(B) 记录斑马鱼幼鱼20分钟的代表性运动轨迹。(C) 斑马鱼在2至5日龄暴露于(AlCl_{3})并经药物处理后，暗-光刺激下的运动模式和平均游动距离。(D–F) 在第5天测量各组斑马鱼20分钟内的总游动距离、持续时间和平均游动速度（每组((n=18)只）。数据以均值±标准误表示。*与(AlCl_{3})组相比，(^{*} p<0.05)、(* * p<0.01)和(* * * p<0.001)存在显著差异。

讨论

本研究从深海来源真菌黑曲霉3A00562中分离得到16种化合物，包括5个二聚萘并-γ-吡喃酮类化合物（1-5）和3个双香豆素类化合物（6-7）。二聚萘并-γ-吡喃酮类化合物的绝对构型由两个萘并吡喃酮基团之间的手性轴（阻转异构）主导，其绝对构型已通过圆二色谱（CD）确定。根据文献，(aS)构型的二聚萘并-γ-吡喃酮类化合物在长波区呈现第一正科顿效应，中波区呈现负科顿效应，短波区则呈现正科顿效应。将化合物1-5的一维核磁共振（NMR）和质谱（MS）数据与文献数据比对后发现，这些化合物的平面结构分别与丰西星酮B（1）、丰西星酮D（2）、双脱水-金孢霉吡喃酮C（3）、金孢霉吡喃酮A（4）、丰西星酮A（5）一致；化合物1-5的实验圆二色谱显示出与(aS)构型类似物相似的科顿效应（图S42），表明其构型均为(aS)，其中(aS)-双脱水-金孢霉吡喃酮C（3）、(aS)-金孢霉吡喃酮A（4）和(aS)-丰西星酮A（5）已在前期文献[10]中报道，而化合物1和2为本文首次报道，分别为(aS)-丰西星酮B（1）和(aS)-丰西星酮D（2）。通过手性柱对化合物1的进一步分析证实，化合物1-5均以(aS)构型被分离得到（图S47）。此外，通过将已知化合物6-7的波谱数据与文献报道的数据比对，确定了其结构；所有双香豆素类化合物均具有光学活性，其绝对构型被确定为(aS)。

阿尔茨海默病（AD）是临床实践中最常见的神经退行性疾病，但其复杂的发病机制阻碍了有效治疗药物的研发。近年来越来越多的研究表明，神经炎症和氧化应激与AD的进展相关，其中抑制神经炎症级联反应已成为一种可行的治疗策略。在从深海来源真菌中分离出的16种天然产物中，TMC 256 A1（10）（一种萘并吡喃类化合物）被证实兼具抗炎和抗氧化活性。尽管此前有研究报道化合物10能抑制巨噬细胞中IL-4的信号传导[16]，但其生物学活性在很大程度上仍未被探索。本文首次报道，化合物10通过直接靶向NOS2减少一氧化氮（NO）的生成，从而发挥协同的抗炎和抗氧化作用，缓解AD症状。

在神经退行性相关研究背景下，已有大量证据表明过量的活性氧（ROS）会导致细胞损伤与死亡。值得注意的是，炎症介质一氧化氮（NO）的病理性过量生成可引发氧化应激，在机制上与活性氧的积累相互关联。本研究结果显示，化合物10能在脂多糖（LPS）诱导的神经炎症模型中显著抑制一氧化氮的产生，且在斑马鱼炎症实验中可降低活性氧的含量。这一功能特性与海洋天然产物已被证实的抗炎及抗氧化特性相符。综上，这些研究结果表明化合物10有望成为具备抗炎功效的神经保护剂。

本研究整合蛋白质组学与基于网络的药理学分析，解析了化合物10的抗炎神经炎症机制。功能富集聚类分析显示，差异表达蛋白与阿尔茨海默病、KEAP1-NRF2信号通路、神经元凋亡调控等关键炎症通路存在显著关联，提示化合物10可通过双重抗炎/抗氧化作用维持神经元存活。从多数据库挖掘和蛋白质组学分析中鉴定出的47个重叠靶点中，蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络将NOS2、LPL、LRP1、NRF2和HMOX1列为潜在的神经功能相关靶点调节剂。关键的是，NOS2 被预测为化合物 10 的直接靶点。从结构上看，NOS2 单体包含一个还原酶结构域和一个加氧酶结构域，后者含有 L-精氨酸、血红素和四氢生物蝶呤（H4B）的结合位点。血红素依赖性二聚化——需要在加氧酶结构域内结合配位的 H4B、底物和血红素——是实现完全偶联酶活性的关键。分子对接验证了 NOS2 在调节神经炎症中的作用，表明化合物 10 通过氢键和π-π堆积与加氧酶结构域的疏水腔紧密结合，从而抑制血红素依赖性二聚体的形成并抑制其催化功能。

斑马鱼因其与人类广泛的遗传同源性、快速的生长特性以及体型较小的特点，是用于人类疾病建模和药物研发的优质体内研究系统[37]。氯化铝诱导的斑马鱼阿尔茨海默病模型能够再现行为缺陷，这一点在以往的研究中已有记载[29]。在该模型中，化合物10显著提升了斑马鱼的运动能力。此外，在明/暗转换实验中，经处理的斑马鱼在黑暗阶段的游动距离长于疾病模型组。

总体而言，本研究表明化合物10通过靶向神经元型一氧化氮合酶（NOS2）来抑制一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）的产生，从而减轻神经炎症和氧化应激，发挥神经保护作用。该化合物还能调控多种信号通路，包括阿尔茨海默病相关的级联反应以及KEAP1-NRF2轴的调节。这些发现为化合物10的抗神经炎症机制提供了可靠的分子层面见解，凸显了其在神经退行性疾病治疗领域的转化潜力。

材料与方法

通用实验步骤

旋光在安东帕 MCP 100 旋光仪（安东帕贸易有限公司，MCP100，中国上海）上记录。紫外光谱在 UV-8000 紫外-可见分光光度计（上海元析仪器有限公司，中国上海）上记录。圆二色谱在 Chirascan 圆二色谱仪（Applied Photophysics，英国莱瑟黑德）上记录。核磁共振（NMR）光谱在布鲁克 AVANCE III 400 MHz 核磁共振波谱仪（Bruker，瑞士费尔登）上记录。化学位移以 δ 值表示，以溶剂信号（二甲基亚砜- d6：δH 2.50 和 δC 39.5；氘代甲醇：δH 3.31 和 δC 49.0；氯仿- d：δH 7.26 和 δC 77.0）为参考。高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）在赛默飞 Q-Exactive Focus 串联质谱仪（Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）上记录。制备型和半制备型高效液相色谱（HPLC）在配备二极管阵列检测器（DAD）的安捷伦 1260 无限系列仪器（Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣地亚哥）上进行。柱色谱（CC）使用硅胶、十八烷基硅烷键合硅胶（ODS）和 Sephadex LH-20 进行。薄层色谱（TLC）板在紫外光下或喷洒 10% 硫酸乙醇溶液后显色

真菌材料

黑曲霉菌株3A00562分离自南大西洋深海沉积物，采集深度为-3059米。经ITS DNA基因序列比对分析，该菌株与黑曲霉ATCC 16888（GenBank登录号NR_111348.1，相似度100.00%）高度相似，被鉴定为黑曲霉（GenBank登录号KP003820）。该凭证菌株保存在中国海口的海南医科大学，登录号为MCCC 3A00562。

发酵、提取与分离

黑曲霉3A00562于25摄氏度的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上培养3天。随后，将新鲜菌丝接种至50个1升锥形烧瓶的液体培养基中，每个烧瓶以1升自来水（pH值7.5）配制，培养基含甘露醇20克、谷氨酸钠5克、麦芽糖用乙酸乙酯萃取三次，得到粗提物。将提取物用甲醇复溶后，再用石油醚萃取三次。将甲醇溶液减压蒸发，得到脱脂提取物（52克），将其通过硅胶柱色谱，用甲醇-水（100%→90%）进行连续梯度洗脱，根据薄层色谱性质得到三个馏分（馏分1-馏分3）。通过十八烷基硅烷键合硅胶柱色谱，用甲醇-水（50%→100%）将馏分1（6.8克）分离为三个亚馏分（亚馏分1-1-亚馏分1-3）。通过葡聚糖凝胶LH-20柱色谱（甲醇洗脱）分离亚馏分1-1（208.2毫克），得到化合物14（15.4毫克）。再通过制备型薄层色谱（甲醇-水，20:1）进一步纯化，得到化合物13（79毫克）。对亚馏分1-2（1400毫克）先进行葡聚糖凝胶LH-20柱色谱（甲醇洗脱）处理，再通过高效液相色谱（甲醇-水，75%→100%）纯化，得到化合物1（8毫克，(t_{R}=22 ~min)）、化合物2（7毫克，(t_{R}=19 ~min)）、化合物3（2毫克，(t_{R}=20 ~min)）、化合物4（7毫克，(t_{R}=26.5 ~min)）和化合物5（9毫克，(t_{R}=24.5 mir)）。对亚馏分1-3（146毫克）进行葡聚糖凝胶LH-20柱色谱（甲醇洗脱）和制备型薄层色谱（甲醇-水，30:1）处理，得到化合物6（4毫克）。再通过制备型高效液相色谱（甲醇-水，55%）最终纯化，得到化合物10（4.3毫克，(t_{R}=26 ~min)）和化合物11（3.4毫克，(t_{R}=30 ~min)）。通过十八烷基硅烷键合硅胶柱色谱，用甲醇-水（5%→100%）梯度洗脱馏分2（8.3克），得到五个亚馏分（亚馏分2-1-亚馏分2-5）。对亚馏分2-1（301.8毫克）和亚馏分2-3（730毫克）分别进行葡聚糖凝胶LH-20柱色谱（甲醇洗脱），再通过高效液相色谱（甲醇-水，30%→60%）纯化，分别得到化合物7（7毫克，(t_{R}=15 ~min)）和化合物9（2.4毫克，(t_{R}=17.5 ~min)）。对亚馏分2-2（786.9毫克）依次进行葡聚糖凝胶LH-20柱色谱（甲醇洗脱）和结晶（甲醇）处理，得到化合物8（20毫克）。通过葡聚糖凝胶LH-20柱色谱（甲醇洗脱）分离亚馏分2-4（477毫克）和亚馏分2-5（600毫克），分别得到化合物15（13毫克）和化合物16（16毫克）。对馏分3（8.8克）进行十八烷基硅烷键合硅胶柱色谱（甲醇-水，10%→60%）处理，再通过葡聚糖凝胶LH-20柱色谱（甲醇洗脱）和高效液相色谱（甲醇-水，30%→60%）纯化，得到化合物12（46毫克，(t_{R}=18.6 ~min)）。

(aS)-丰西诺酮 B（1）：黄色粉末；比旋光度 ([alpha]_{D}^{25}-12)（c 0.10，甲醇）；紫外光谱（甲醇）(lambda_{max })（对数摩尔吸光系数）281（2.52）、242（2.11）、227（2.22）纳米；圆二色谱（甲醇）(lambda_{max }(Delta varepsilon)) 286（+7.66）、270（-8.14）、230（+2.97）纳米；核磁共振数据见 (^{1} H) 和 (^{13} C) 表1；高分辨电喷雾质谱质荷比 611.1527 [M + 钠]+（计算值 (C_{32} H_{28} O_{11} Na)，611.1529）。

(aS)-丰西酮 D（2）：黄色粉末；([alpha]_{D}^{25}-41)（c 0.10，甲醇）；紫外（甲醇）(lambda_{max })（log ε）280（2.97）、260（2.74）、235（2.90）纳米；圆二色谱（甲醇）(lambda_{max }(Delta varepsilon))）288（+6.21）、269（−8.18）、226（+5.51）纳米；(^{1} H)和(^{13} C)的核磁共振数据，表1；高分辨电喷雾质谱质荷比611.1527 ([M+Na]^{+})（计算值(C_{32} H_{28} O_{11} Na)，611.1529）。

材料

杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）、胰蛋白酶和抗生素购自中国上海的Basal Media Technologies公司（货号L120KJ）。胎牛血清和格里斯试剂试剂盒购自美国赛默飞世尔科技公司（中国上海，货号A5669701）。脂多糖（LPS）购自美国西格玛奥德里奇公司（中国上海，货号L4391）。地塞米松（货号D129705）和多奈哌齐（货号D129948）由中国上海的阿拉丁生化科技股份有限公司提供。细胞计数试剂盒-8（CCK8）购自中国上海的拓森生物科技有限公司（货号C0005）。2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA，货号R252）由日本同仁化学科技有限公司（中国上海同仁公司）提供。

细胞与动物

小鼠小胶质细胞系BV2购自美国典型培养物保藏中心（美国马里兰州罗克维尔市）。BV2细胞于含10%胎牛血清和1%抗生素的杜氏改良伊格尔培养基中培养，在37℃、湿度饱和且含5%二氧化碳的培养箱中培养。细胞每3个月传代30-40次，或从原始冻存株重新复苏。

野生型（AB品系）和转基因（Tg: Lyz-Egfp）斑马鱼胚胎购自海南医科大学公共研究中心斑马鱼实验平台（中国海口），并收集于100毫米培养皿中。随后，将斑马鱼胚胎置于28±0.5摄氏度的标准温度下，以14小时光照/10小时黑暗的周期培养。所有实验均按照国际实验动物护理评估与认证协会（AAALAC，001458）以及机构动物护理与使用委员会（IACUC-2023–6463-01）的指导原则开展。

抗炎活性

BV-2 细胞培养和化合物处理按照先前报道的方法进行[34]。将细胞以每孔 (1.5 ×10^{5}) 个细胞的密度接种于 24 孔板中，过夜贴壁。次日，用含特定浓度待测化合物的新鲜培养基处理细胞 1 小时，随后用脂多糖（1 微克/毫升）刺激。对照组用 0.1% 的二甲基亚砜（DMSO）溶液处理。使用格里斯试剂试剂盒检测培养基中亚硝酸盐的浓度。按照制造商的说明书，使用 Infinite 200Pro 微孔板读板机（瑞士曼内多夫的帝肯公司）在 560 纳米波长处记录吸光度。

细胞毒性测试

将BV2细胞以每孔(5 ×10^{3})个细胞的密度接种于96孔板中，加入200微升含10%胎牛血清（FBS）的培养基，孵育24小时。随后，用100微升含10%胎牛血清的培养基配制不同浓度的待测化合物处理细胞，继续孵育48小时。之后使用CCK8试剂盒检测细胞活力。按照试剂制造商的说明书，采用Infinite 200Pro微孔板读仪（瑞士TECAN公司，曼讷多夫）测定450纳米波长处的光密度（OD）值。

炎症斑马鱼模型的建立与处理

在受精后8小时（hpf），AB品系及转基因Tg(Lyz:EGFP)斑马鱼幼虫按照先前描述的方法暴露于脂多糖（LPS，50微克/毫升）中。两天后，用地塞米松（Dex，10微摩尔）和10（10微摩尔）处理斑马鱼。24小时后，利用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）测定体内活性氧（ROS）水平，并计数中性粒细胞数量。使用MVX10立体荧光显微镜（日本东京奥林巴斯株式会社）对荧光标记的中性粒细胞进行成像和计数。

蛋白质组学分析

细胞沉淀重悬于0.5%脱氧胆酸钠中，置于金属浴中95℃孵育5分钟，随后进行冰浴超声处理。在编号为(12,000 ×g)的条件下（20分钟，4℃）离心后，取上清液进行BCA定量分析；取30微克蛋白样品，加入20微升10毫摩尔/升二硫苏糖醇/20毫摩尔/浓度碘乙酰胺进行还原/烷基化处理（95℃，1000转/分钟，5分钟）。之后冷却10分钟后，胰蛋白酶消化在37℃下进行（1000转/分钟，2小时，酶与底物比例为1:50）蛋白比例），用55微升0.1%三氟乙酸终止。样品通过固相萃取进行脱盐：上样至微柱后，在正压下用100微升0.1%三氟乙酸洗涤两次，再用50微升50%乙腈/0.1%三氟乙酸洗脱两次。洗脱液经真空离心浓缩。

色谱分离采用 Vanquish 超高效液相色谱系统，搭配 ReproSil C18 色谱柱（德国 Ammerbuch 市 Dr. Maisch 高效液相色谱有限公司生产，柱长18厘米），流速为300纳升/分钟；流动相A为含0.1%甲酸的水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的80%乙腈溶液，梯度洗脱程序为60分钟内流动相B比例从5%升至35%。质谱分析采用赛默飞 Orbitrap Eclipse 质谱仪，以数据非依赖采集模式运行：一级质谱扫描质荷比范围400至800，分辨率120000；二级质谱在400至800质荷比范围内，采用45个连续的9道尔顿隔离窗口进行扫描，分辨率60000。

化合物与疾病的靶点筛选

本研究借助SwissTargetPrediction数据库“http://swisstargetprediction.ch/（访问于2025年10月12日）”与GeneCard数据库“https://www.genecards.org/（访问于2025年10月12日）”预测化合物10的相关靶点与疾病。以化合物的潜在靶点为基础，与前期筛选出的差异表达蛋白进行交集筛选，以确定化合物与神经退行性疾病的关联靶点，此过程通过韦恩图实现。运用Cytoscape 3.9.1软件构建化合物10的蛋白靶点相互作用网络，并通过GO和KEGG富集分析对关键靶点及相关通路进行深入研究。

分子对接

蛋白质（NOS2：4JS9）的结构从蛋白质数据银行（PDB）下载。小分子的三维结构依托银泰科计算平台“https://cloud.yinfotek.com（2025年10月12日访问）”构建，并在MMFF94力场下进行能量最小化处理。采用AutoDock Vina 1.1.21软件进行分子对接，使用PyMol 2.4.0（美国加利福尼亚州拉霍亚市斯克里普斯研究所）去除蛋白质中的水分子、盐离子和小分子。随后设置对接盒包裹整个蛋白质结构。采用拉马克遗传算法（LGA）进行构象搜索。对接过程中所有参数均保持默认设置。对接分数（单位为千卡/摩尔）反映结合能，数值越负表示结合亲和力越强。蛋白质的对接输出构象被确定为最终构象。利用LigPlot + 2.3.1（欧洲分子生物学实验室-欧洲生物信息研究所）分析相互作用力，最终通过PyMol 2.4.0（美国加利福尼亚州南旧金山德劳诺科学有限责任公司）进行可视化处理。

动力学模拟

基于分子对接得到的10-NOS2复合物被用作全原子分子动力学模拟的初始结构，该模拟通过AMBER 20软件完成。计算建模与动力学模拟均在银丰科技计算平台上进行。

斑马鱼行为学实验

将5天龄的斑马鱼幼鱼以每孔1条的密度转移至新的24孔板中，使其适应新环境20分钟。随后，记录幼鱼的运动状态至少20分钟。通过法国沙西永市Viewpoint生命科学公司的ZebraLab 5.15软件对视频进行分析，统计总移动距离和平均移动速度，同时记录其运动轨迹。

统计分析

数据以均数±标准误表示，采用Prism 8.0软件（美国加利福尼亚州拉霍亚市GraphPad公司）通过单因素方差分析（Turkey检验）进行分析。统计学显著性设定为* (^{*} p<0.05)、(^{* *} p<0.01)和(^{* * *} p<0.001)