题目：β-Amyrin Acetate Confers Anti-Epileptic Protection via Suppression of Calcium Overload- Induced Neuroinflammation and Apoptosis

原文链接:https://doi.org/10.2147/DDDT.S566649

期刊:Drug Design, Development and Therapy

摘要

目的：乙酸β-香树酯醇酯（BAA）是一种天然五环三萜类化合物，其亲脂性优于抗癫痫前体β-香树酯醇，这意味着它的血脑屏障（BBB）通透性有所增强。本研究旨在评估BAA的抗癫痫功效，并探究其神经保护机制，重点关注钙信号通路。

研究对象与方法：采用戊四氮（PTZ）构建斑马鱼癫痫模型，评估BAA对癫痫样行为、活性氧（ROS）水平、细胞凋亡及炎症标志物的影响。通过网络药理学和分子对接技术预测潜在作用靶点。此外，利用谷氨酸（Glu）诱导的HT-22神经元损伤模型，验证BAA对细胞内钙稳态及下游信号通路的作用。

结果：BAA 显著减弱了戊四氮诱导的斑马鱼癫痫样行为，具体降低了阵挛性和强直-阵挛性发作的频率，同时也减少了总移动距离和移动速度。同时，BAA 减轻了斑马鱼体内的氧化应激、细胞凋亡和神经炎症。网络药理学和分子对接分析表明，钙信号通路是其潜在作用靶点，且BAA 与Bcl-2、JAK2 等蛋白具有较高的结合亲和力。体外实验显示，BAA 能有效缓解谷氨酸诱导的HT-22 细胞钙超载。它下调了Bax/Bcl-2 比值，抑制了JAK2/STAT3 通路的过度激活，进而减少了神经元凋亡和炎症。BAPTA-AM 联合处理实验进一步证实，BAA 的保护作用依赖于对细胞内钙稳态的调控。

结论：BAA通过抑制神经元钙超载并调控JAK2/STAT3信号通路发挥抗癫痫作用，从而减轻神经炎症和细胞凋亡。这些研究结果为将BAA开发为极具潜力的抗癫痫候选药物提供了坚实的实验基础，并阐明了其多靶点作用机制。

关键词：乙酸β-香树酯醇，癫痫，钙超载，活性氧，神经炎症，细胞凋亡

引言

癫痫是一种以反复且无诱因发作为特征的慢性神经系统疾病。它是一项重大的全球健康挑战，全球有超过7000万人患病，每10万人中的患病率在50.4至81.7例之间。¹尽管遗传学和治疗学领域取得了进展，但在精准诊断、机制理解和有效管理方面仍存在关键空白。²丙戊酸盐（VPA）作为一线抗癫痫药物，虽疗效显著但其使用受到显著不良反应的限制，包括致畸性、肝毒性以及药物相互作用。因此，迫切需要开发出疗效更强、安全性更优的新型治疗剂。

中医药因其多靶点作用机制和良好的安全性，在治疗难治性神经系统疾病方面的潜力已引起关注⁴。β-香树脂醇乙酸酯（BAA）是一种五环三萜类化合物，也是β-香树脂醇的乙酰化衍生物，广泛存在于甘遂、大蓟、蒲公英等药用植物中，据报道具有显著的抗炎活性³。既往研究表明，β-香树脂醇混合物可延长戊四氮（PTZ）诱导癫痫模型的癫痫发作潜伏期和存活时间，其机制可能与调节γ-氨基丁酸能系统及蛋白激酶C（PKC）信号通路有关。此外，β-香树脂醇能增强抗氧化酶活性、减轻氧化应激，并通过抑制白细胞介素-6（IL-6）等促炎细胞因子发挥神经保护作用。白细胞介素-(1 beta)（IL-13）以及肿瘤坏死因子-α（TNF-(a).7.8）。与β-香树脂醇相比，β-香树脂醇乙酸酯（BAA）的极性更低、亲脂性更高，这表明其穿过血脑屏障并增强中枢神经系统作用的潜力更大。9,10然而，BAA 本身的抗癫痫作用及其潜在机制仍完全未被探索。

癫痫发作的起始涉及兴奋性神经递质之间关键平衡的紊乱递质（例如谷氨酸、天冬氨酸）和抑制性神经递质（例如γ-氨基丁酸、甘氨酸）。戊四唑，一种GABA_A受体拮抗剂可抑制抑制性作用，进而导致神经元过度兴奋和同步放电。这种过度兴奋会触发谷氨酸的过度释放以及N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体的过度激活，造成钙离子(Ca{2+})的病理性内流与细胞内钙超载。钙超载随后会激活钙依赖性酶，破坏线粒体功能，并促进活性氧（ROS）的过量生成，最终引发氧化应激和神经元兴奋性毒性。 值得注意的是，过量的活性氧可通过直接氧化和抑制磷酸酶来激活贾纳斯激酶2（JAK2），使其发生磷酸化，并进一步招募并磷酸化下游的信号转导与转录激活因子3（STAT3）。磷酸化的STAT3（p-STAT3）发生二聚化并易位至细胞核，调控与细胞增殖、存活、迁移、炎症及抗凋亡相关基因的转录。关键在于，钙超载是这些下游病理事件的核心驱动因素。然而，针对这一关键节点的特异性高效治疗策略仍然有限。

斑马鱼凭借其保守的神经解剖结构、高通量适用性、可靠的行为学及电生理学癫痫表型，已成为癫痫研究中一种稳定且遗传易操作的脊椎动物模型。其透明的幼体以及快速的药物吸收特性，进一步为抗癫痫化合物的高效体内筛选和机制研究提供了便利¹⁹。斑马鱼幼体的大脑与哺乳动物大脑在结构和功能上具有基本特征，包括保守的神经递质系统等能引发癫痫发作的γ-氨基丁酸能与谷氨酸能信号传导，以及支撑癫痫发作产生的明确神经回路。20斑马鱼的PTZ诱导癫痫模型可复现人类癫痫的关键行为和脑电图特征。这类癫痫的特征是运动增多至阵挛性发作的进展呈剂量依赖性抽搐，最终发展为强直-阵挛性发作。 斑马鱼幼体在体内发育出完整的神经系统受精后7天。此时斑马鱼的血脑屏障尚未完全成熟，这使得药物可通过浸泡方式直接进入中枢神经系统。这降低了药物筛选的成本和操作复杂度。因此，该模型适用于在整体生物水平评估抗癫痫候选药物的疗效。本研究采用戊四氮诱导的斑马鱼癫痫模型，评估了BAA的体内抗癫痫功效，并探究了其对癫痫发作引发的氧化应激、细胞凋亡及神经炎症的影响。

本研究旨在全面评估BAA的抗癫痫作用，探究其是否通过调控神经元钙超载及其下游通路发挥神经保护作用。为评价BAA在体内的治疗效果，本研究构建了戊四氮（PTZ）诱导的癫痫斑马鱼模型。结合网络药理学与分子对接技术，预测了BAA的潜在作用靶点及相关通路。通过谷氨酸（Glu）诱导的HT-22神经元损伤模型，在细胞水平验证了BAA对钙稳态、氧化应激、神经炎症及细胞凋亡的调控作用。本研究为多靶点抗癫痫药物的研发提供了新的思路，也为BAA作为抗癫痫候选化合物的开发奠定了实验基础。

结果

BAA 对戊四氮诱导的斑马鱼幼虫癫痫样运动的抑制作用

除对照组外，其余所有组的斑马鱼幼鱼均在受精后第7天（7 dpf）用戊四氮（PTZ）处理30分钟，以构建PTZ诱导的癫痫模型。通过行为学分析评估了BAA对PTZ诱导的斑马鱼幼鱼癫痫样运动的干预效果。用2.5、5、10和20 μM BAA处理的斑马鱼幼鱼未出现明显的死亡率或形态学异常（补充图S1）。与对照组相比，PTZ组表现出剧烈、穿梭且无定向的快速游动行为（图1A）。在PTZ处理后的0–15分钟内，游动速度从基线水平（1.2 ± 0.2 mm/s）迅速升至峰值（5.5 ± 0.2 mm/s），是同期对照组游动速度的4.58倍。处理30分钟后，速度稳定在4.3 ± 0.2 mm/s（与对照组相比，P<0.0001）（图1B）。同时，PTZ组30分钟内的总游动距离显著增至9073 ± 230.8 mm，较对照组（1835 ± 199.2 mm）增加了394%（与对照组相比，P<0.0001）（图1C）。阵挛性发作的总距离增至3053 ± 119 mm（与对照组相比，P<0.05）（图1D），强直-阵挛性发作的总距离增至2040 ± 90 mm（与对照组相比，P<0.01）（图1E）。结果表明，PTZ处理可显著提高斑马鱼幼鱼的运动活性，并诱导II期阵挛性发作和III期强直-阵挛性发作，提示癫痫模型构建成功。

图1 BAA预处理可减轻7天龄斑马鱼幼鱼由戊四氮（PTZ）诱导的癫痫样运动活动 （A）运动轨迹；（B）平均游泳速度；（C）总游泳距离；（D）II期癫痫发作期间的总距离；（E）III期癫痫发作期间的总距离。 6天龄的幼鱼先用1毫摩尔/升丙戊酸钠（VPA）、2.5微摩尔/升BAA或10微摩尔/升BAA预处理12小时，随后在7天龄时暴露于10毫摩尔/升PTZ。 通过行为分析系统记录30分钟的运动活动。 红色轨迹代表高速运动（>50毫米/秒，对应III期癫痫发作）；绿色轨迹代表中速运动（20–50毫米/秒，对应II期癫痫发作）；黑色轨迹代表低速运动或静止行为(< 20mm/s)。 数据以平均值±标准误（SEM）表示。 每组(n=60)条幼鱼，来自5次独立生物学重复（每次重复12条幼鱼）。 thp<0.001 vs 对照组；****p<0.001 vs PTZ组；88p<0.0 vs VPA组。

与PTZ组相比，VPA和BAA处理组均表现出兴奋性过高现象被抑制，具体表现为30分钟内游泳速度降低（VPA组：3.1±0.3毫米/秒；2.5微摩尔BAA组：2.2±0.1毫米/秒；10微摩尔BAA组：2.5±0.2毫米/秒；所有组均p<0.0001 vs PTZ组），且总移动距离显著减少（VPA组：6345±238.3毫米；2.5微摩尔BAA组：5988±172.7毫米；10微摩尔BAA组：6314±200.6毫米；所有组均p<0.0001 vs PTZ组）。阵挛性发作的距离（VPA组：1805±108.2毫米；2.5微摩尔BAA组：1686±75.3毫米；10微摩尔BAA组：1902±79.1毫米）和强直-阵挛性发作的距离（VPA组：1287±92.3毫米；2.5微摩尔BAA组：1110±70.6毫米；10微摩尔BAA组：1256±85.4毫米）也均显著降低（所有组均p<0.0001 vs PTZ组）。值得注意的是，2.5微摩尔BAA在降低游泳速度方面的效果比VPA更显著（p=0.004) vs VPA组）。在斑马鱼模型中，据报道VPA的半数有效剂量(ED_{50})为198.7毫克/千克（约1毫摩尔）25。相比之下，BAA在2.5微摩尔浓度下即表现出抗癫痫作用（约0.73毫克/千克），摩尔效价约为VPA的73倍。这些结果表明，在该模型中BAA的抗癫痫活性可能强于VPA。

BAA 缓解戊四氮诱导的斑马鱼幼鱼氧化应激与细胞凋亡

在癫痫发作期间，神经元过度兴奋会导致自由基过量产生，从而引发氧化应激并造成神经元损伤。27 为评估斑马鱼体内活性氧（ROS）的水平，本研究采用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色法对7天龄（dpf）的斑马鱼幼鱼进行活性氧检测。结果显示，戊四氮（PTZ）组的ROS荧光强度为1.2(pm 0.1) ± 0.1) 与对照组（0.2 ± 0.1）相比显著增加了约6倍（p<0.0001) 组 vs 对照组）。相比之下，BAA 预处理显著逆转了戊四氮（PTZ）诱导的活性氧（ROS）水平升高（2.5 μM BAA 组：0.3 ± 0.1；10 μM BAA 组：0.3 ± 0.1；两组均 (p<0.0001) 组 vs PTZ 组），使其恢复至与对照组相当的水平（图2A和B）。

过量的活性氧（ROS）会破坏线粒体膜的完整性，促使细胞色素c等促凋亡因子释放到细胞质中，进而激活半胱天冬酶-9（Caspase-9）及其下游效应分子半胱天冬酶-3（Caspase-3），最终启动内源性凋亡途径。28 与活性氧水平降低的结果一致，吖啶橙（AO）染色显示，戊四氮（PTZ）组的吖啶橙荧光强度（5.9±0.2）较对照组（3.1±0.4）显著升高约1.9倍（p<0.0001) 与对照组相比）。此外，β-甲氧基丙烯酸（BAA）预处理可显著抑制戊四氮诱导的吖啶橙荧光强度升高（2.5微摩尔β-甲氧基丙烯酸组：3.3±0.1；10微摩尔β-甲氧基丙烯酸组：2.6±0.1；两者均(p<0.0001) 与戊四氮组相比），使其恢复至与对照组相当的水平（图2C和D）。这些结果表明，β-甲氧基丙烯酸可能通过缓解戊四氮诱导的氧化应激及后续的细胞凋亡发挥神经保护作用。

图2 BAA可减轻7天龄斑马鱼幼虫由戊四氮（PTZ）诱导的氧化应激和细胞死亡。(A) 活性氧（ROS）染色（2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯，DCFH-DA）图像；(B) ROS荧光强度定量分析；(C) 细胞凋亡染色（吖啶橙，AO）图像；(D) AO荧光强度定量分析。将6天龄幼虫用1 mM 丙戊酸钠（VPA）、2.5 μM BAA或10 μM BAA预处理12小时。在7天龄时，将其暴露于10 mM 戊四氮（PTZ）中30分钟，随后用20 μg/mL 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）或5 μg/mL 吖啶橙（AO）染色20分钟。使用斑马鱼成像系统（4倍物镜放大倍数）拍摄荧光图像。数据以平均值±标准误（SEM）表示。每组6个幼虫，共5次独立生物学重复（每次重复6个幼虫）。#### p<0.0001 与对照组相比：**** p<0.0001 与戊四氮（PTZ）组相比。

BAA 可减弱戊四氮诱导的斑马鱼神经元过度兴奋与神经炎症，从而发挥抗癫痫作用

戊四氮通过抑制γ-氨基丁酸能传递诱导神经元过度兴奋，而增强γ-氨基丁酸能信号传导则可降低神经元兴奋性并抑制c-fos表达。29 作为神经元电活动增强的经典标志物，c-fos表达可在癫痫发作期间神经元同步高频放电的短时间内被快速诱导。30 经戊四氮处理30分钟的斑马鱼幼虫中，c-Fos mRNA表达水平（3.9±0.4）较对照组（1.0±0.1）显著升高3.9倍p<0.0001 与对照组相比）。BAA预处理可显著抑制戊四氮诱导的c-Fos表达上调，使其恢复至接近正常水平（2.5微摩尔BAA组：1.1±0.1；10微摩尔BAA组：1.8±0.3；两者p<0.0001 与戊四氮组相比），这表明BAA能有效缓解神经元过度兴奋（图3A）。

神经元过度兴奋不仅会造成神经元损伤，还会触发炎症级联反应。癫痫发作后，促炎细胞因子（如 (I l-1 beta)、白介素-6、肿瘤坏死因子-α 等）的表达上调，可能加剧神经元损伤并促进癫痫复发。31 为评估 BAA 对神经炎症的调控作用，本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测了 7 天龄斑马鱼幼虫中炎症因子的信使核糖核酸（mRNA）水平。戊四氮（PTZ）处理显著提高了促炎因子的表达：与对照组相比，PTZ 组中 (Tnf-alpha) 的 mRNA 表达上调了 2.4 倍（p<0.0001 与对照组相比）、Il-6 上调了 2.2 倍 p=0.03 与对照组相比）、I l-1 beta 上调了 6.2 倍 p=0.0005 与对照组相比）、环氧合酶-2（Cox-2）上调了 2.1 倍 p=0.015 与对照组相比）。与之相反，10 微摩尔（μM）BAA 预处理可显著抑制 PTZ 诱导的这些因子上调，使 (Tnf-alpha)（p=0.0012) 与 PTZ 组相比）、Il（ p=0.0076 与 PTZ 组相比）、白介素- （p=0.0396）与 PTZ 组相比）和环氧合酶-2 （p=0.2031 与 PTZ 组相比）的表达恢复至与对照组相当的水平（图 3B-E）。上述结果表明，BAA 能够抑制 PTZ 诱导的神经元过度兴奋和神经炎症。

图3 BAA抑制PTZ诱导的斑马鱼幼虫兴奋性及炎症标志物的表达。(A) c-Fos、(B) Tnf-α、(C) Il-6、(D) Il-1β、(E) Cox-2的mRNA表达水平。6 dpf的斑马鱼幼虫用2.5 μM BAA或10 μM BAA预处理12小时，7 dpf的幼虫用10 mM PTZ处理30分钟。以β-肌动蛋白作为内参。数据以平均值±标准误表示。每组来自5次独立生物学重复的幼虫（每次重复12只幼虫）。与对照组相比；与PTZ组相比。

网络药理学与分子对接揭示BAA的抗癫痫机制

为进一步阐明BAA抗癫痫作用的分子机制，本研究采用网络药理学和分子对接技术筛选其潜在作用靶点。从4个数据库中共检索到BAA的110个药物靶点，从2个数据库中收集到9640个癫痫相关基因。经取交集后，确定了BAA治疗癫痫的91个潜在靶点（图4A）。基于这91个靶点构建了蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，其中JAK2和Bcl-2表现出较高的网络中心性（图4B）。基因本体（GO）功能分析得到412个生物学过程，京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析识别出68条信号通路。KEGG富集分析显示，交集靶点显著富集于钙信号通路、缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路等（图4C、D）。通过分子对接技术评估BAA与关键靶点Bcl-2、JAK2的结合亲和力，结果显示二者存在较强的结合相互作用，Bcl-2的结合能为-13.38 kcal/mol，JAK2的结合能为-11.84 kcal/mol（图4E）。

BAA通过稳定钙稳态并破坏"ROS-Ca a{2+, "“正反馈环路来减轻氧化应激

基于网络药理学预测，BAA 可能调控钙信号通路。为验证该假设，我们构建了谷氨酸（Glu）诱导的 HT-22 细胞损伤模型。CCK-8 检测结果显示，Glu 对 HT-22 细胞具有显著的浓度依赖性毒性，其半数效应浓度（EC50）为 26.11 mM（图 5A）。综合考虑模型稳定性与细胞基于该条件，20 mM 谷氨酸被选为后续实验的诱导浓度。与斑马鱼的实验结果一致，20 mM 谷氨酸刺激24小时显著诱导了HT-22细胞的细胞毒性（p<0.0001) 与对照组相比），而2.5 μM和10 μM的BAA则显著逆转了这一效应，将细胞活力分别恢复至对照组的89.0±2.5%和92.2±4.0%（均为(p<0.0001) 与谷氨酸组相比）（图5B）。经2.5 μM和10 μM BAA处理的细胞呈现正常形态，未出现收缩、漂浮或细胞死亡等明显的细胞毒性迹象（补充图S2）。

图4 补阳还五汤治疗癫痫的网络药理学与分子对接研究。(A) 药物与疾病交集靶点的韦恩图；(B) 补阳还五汤-癫痫交集靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图；(C) 基因本体论（GO）生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）三元图；(D) 京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集气泡图；(E) 补阳还五汤与JAK2的分子对接结合能：−11.84 千卡/摩尔；补阳还五汤与Bcl-2的分子对接结合能为−13.38 千卡/摩尔。

图5 BAA可减轻谷氨酸（Glu）诱导的HT-22细胞毒性、钙超载和氧化应激。(A) 采用CCK-8法检测不同浓度Glu（2.5、5、10、20和40 mM）处理24小时后对HT-22细胞活力的影响，并计算半数抑制浓度（IC 50)）；(B) BAA可逆转Glu诱导的HT-22细胞活力下降。采用CCK-8法检测不同浓度BAA（2.5、5、10、20 μM）对20 mM Glu处理24小时的HT-22细胞活力的影响；(C) BAA抑制Glu诱导的HT-22细胞内(Ca{2+})水平升高。Fluo-4染色荧光显微镜图像（比例尺：40 μm，40倍）。绿色：钙信号；(D) Fluo-4荧光强度定量分析；(E) 活性氧（ROS）水平定量分析；(F) BAA可降低Glu诱导的HT-22细胞内活性氧水平。ROS染色荧光显微镜图像（比例尺：50 μm，20倍）。绿色：DCF信号。数据以平均值±标准误（SEM）表示。每组n = 6 (n=6)次独立生物学重复。mp<0.001. p<0.0001 与对照组相比：≈p<0.01。**p<0.001 45 ×4 p<0.001 与Glu组相比。

此外，20毫摩尔谷氨酸可显著诱导HT-22细胞中活性氧的积累（2',7'-二氯荧光黄二乙酸酯荧光强度：为对照组的1.9倍，p=0.0003以及胞质钙超载（荧光素-4荧光强度：为对照组的2.1倍，p=0.0004。10微摩尔BAA处理可有效逆转这些效应，将活性氧和钙水平降至与对照组相当的水平（活性氧：p<0.0001；荧光素-4：p=0.0009，与谷氨酸组相比）（图5C-F）。这些发现表明，BAA可能通过抑制钙超载有效破坏“活性氧-钙”正反馈循环，而这一循环是放大氧化应激和钙失调的关键机制。

BAA通过调控Bax/Bcl-2/半胱天冬酶-3通路抑制谷氨酸诱导的线粒体凋亡

在证实BAA可减轻氧化应激和钙超载后，我们进一步探究其是否能够抑制下游的线粒体凋亡通路。构建了以钙超载为特征的谷氨酸诱导的HT-22细胞凋亡模型，并通过流式细胞术检测细胞凋亡率。此外，采用蛋白质印迹法分析Bax、Bcl-2、Caspase-3和Cleaved caspase-3等蛋白的表达水平，以阐明BAA干预钙超载-线粒体凋亡通路的分子机制。

流式细胞术结果显示，用2.5和10微摩尔的BAA处理24小时后，谷氨酸诱导的细胞凋亡受到显著抑制 p<0.0001 与对照组相比），总凋亡率有所下降：从谷氨酸组的27.2±1.3%降至2.5微摩尔BAA组的18.6±1.2%和10微摩尔BAA组的17.8±1.0%（均 p<0.0001 与谷氨酸组相比）（图6A和B）。

蛋白质印迹法分析显示，与对照组相比，20 mM 谷氨酸处理24小时成功激活了凋亡执行程序，表现为Bax/Bcl-2比值升高1.7倍（p=0.0051) 与对照组相比），且裂解型caspase-3/caspase-3比值显著升高2.1倍（p=0.0284) 与对照组相比）（图6C-F）。值得注意的是，BAA预处理有效逆转了这些效应，将两种比值均降至正常水平与对照组相比无统计学差异（Bax/Bcl-2 比值：(p=0.0271)（250 万 BAA）、(p=0.0023)（1000 万 BAA）；裂解型半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-3 比值：(p=0.0435)（250 万 BAA）、(p=0.0017)（1000 万 BAA），对比 Glu 组）。综上，BAA 可通过抑制 Bax/Bcl-2 比值、抑制作为线粒体凋亡通路关键执行分子的半胱天冬酶-3 活化，显著挽救谷氨酸诱导的 HT-22 细胞凋亡。

图6 BAA抑制谷氨酸诱导的HT-22细胞凋亡。HT-22细胞单独用谷氨酸（20 mM）处理，或与BAA（2.5、10 μM）联合处理24小时。(A) 采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术分析，评估2.5和10 μM BAA对谷氨酸诱导的细胞凋亡的影响。象限定义：Q1：坏死细胞（Annexin V−/PI+）；Q2：晚期凋亡细胞（Annexin V+/PI+）；Q3：活细胞（Annexin V−/PI−）；Q4：早期凋亡细胞（Annexin V+/PI−）；(B) 总凋亡率（Q2+Q4）的定量分析。数据来自3次独立生物学重复。(C) Bax和Bcl-2蛋白的蛋白质免疫印迹条带；(D) Bax/Bcl-2比值的定量分析；(E) Caspase-3和裂解型Caspase-3蛋白的蛋白质免疫印迹条带；(F) 裂解型Caspase-3/Caspase-3比值的定量分析。数据来自3次独立生物学重复。以β-肌动蛋白作为上样对照。数据以平均值±标准误表示。与对照组相比：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与谷氨酸组相比：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。缩写：ns，无显著差异。

BAA通过抑制JAK2/STAT3磷酸化及下游炎症因子表达减轻神经炎症

在确定了BAA的抗凋亡作用后，我们接下来探究了其在减轻神经炎症中的作用。鉴于钙超载是神经炎症的关键诱导因子，且分子对接预测BAA与JAK2具有高结合潜力，我们重点关注经典的JAK2/STAT3炎症通路。结果显示，用20毫摩尔谷氨酸处理HT-22细胞24小时后，与对照组相比，JAK2（Tyr1007/1008）和STAT3（Tyr705）的磷酸化水平显著升高，倍数变化分别为1.3倍(p=0.0007) 与对照组相比）和1.2倍(p=0.0329) 与对照组相比）。相反，BAA处理显著抑制了JAK2和STAT3的磷酸化（p) -JAK2：(p=0.0350)（2.5微摩尔BAA）；(p=0.0243)（10微摩尔BAA）；p-STAT：(p=0.049)（2.5微摩尔BAA）；(p=0.0012)（10微摩尔BAA）与谷氨酸组相比）。各组间总JAK2或总STAT3蛋白水平无显著差异（图7A和B）。

qPCR分析显示，经Glu处理24小时后，与对照组相比，炎症因子Tnf-α、Il-6和Il-1β的mRNA表达显著上调，分别达到5.3倍、3.8倍和5.1倍(p=0.0018)：(Il) 6：(p=0.0003)；(Il-I beta: p<0.0001) 与对照组相比）。10 μM BAA预处理可显著抑制这些因子的表达，使其水平分别降至1.5±0.5、1.2±0.2和1.3±0.3，与对照组无显著差异（Tnf-a：(p=0.008)；Il-6：(p=0.0004)；I1-1B：(p<0.0001) 与Glu组相比）（图7C）。综上，BAA通过抑制JAK2/STAT3信号通路的磷酸化，显著下调促炎细胞因子Tnf-α、Il-6以及(I l-1 beta)的表达，从而减轻神经炎症反应。

图7 BAA抑制JAK2/STAT3信号通路及相关炎症因子的基因表达。HT-22细胞单独用20 mM谷氨酸处理，或与2.5 μM、10 μM BAA联合处理24小时。(A) JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白的蛋白质免疫印迹条带；(B) JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表达水平的定量分析。独立生物学重复。β-肌动蛋白作为上样对照。(C) Tnf-α、Il-6和Il-1β的mRNA表达水平。独立生物学重复。β-肌动蛋白作为内参。数据以平均值±标准误表示。统计分析：经正态性检验（Shapiro-Wilk检验）和方差齐性检验（Levene检验）后，采用单因素方差分析，随后进行Tukey事后检验。与对照组相比；与谷氨酸组相比。

利用BAPTA-AM验证BAA通过调节钙稳态抑制氧化应激的能力

为验证BAA的抗氧化作用是否依赖钙稳态，采用钙螯合剂BAPTA-AM进行平行对比实验。结合相关文献及CCK-8实验结果，确定HT-22细胞中BAPTA-AM的浓度为0.25 μM（图8A）。32 谷氨酸处理（20 mM，24 h）显著诱导神经元损伤：Fluo-4荧光强度从6.80±0.68升至16.43±0.35（p<0.0001) 与对照组相比），活性氧荧光强度从4.53±0.38增加至9.73±0.50（p<0.0001) 与对照组相比），丙二醛水平从115.0±1.06上升至150.3±4.83（p=0.0004) 与对照组相比），超氧化物歧化酶活性从21.49±1.78下降至15.15±2.24（p=0.0255) 与对照组相比）（图8B-G）。

10 μM BAA 处理可显著逆转这些效应：Fluo-4 荧光强度降至 9.20 ± 0.43（p<)，与谷氨酸组相比 P<0.0001），活性氧水平降至 2.99 ± 0.58(p<0.0001)，与谷氨酸组相比），丙二醛含量降至 119.6 ± 4.79(p=0.0017)，与谷氨酸组相比），超氧化物歧化酶活性升至 21.07 ± 2.38(p=0.0499)，与谷氨酸组相比）。单独使用 0.25 μM BAPTA-AM 处理也表现出与 BAA 相当的保护效应。Fluo-4 荧光强度降至 9.68 ±0.30（p<0.0001) 与 Glu 组相比），活性氧（ROS）水平降至 4.14±0.59(p<0.0001) 与 Glu 组相比），丙二醛（MDA）含量降至 138.0±4.40(p=0.0448) 与 Glu 组相比），超氧化物歧化酶（SOD）活性升至 23.08±1.62(p=0.0083) 与 Glu 组相比）。BAA 组与 BAA+BAPTA-AM 组在各参数上均未观察到显著差异。这些结果表明，BAA 与钙螯合剂 BAPTA-AM 在抑制钙超载和氧化应激方面效果相当，且二者联合使用未产生协同效应。BAA 可能通过调节细胞内钙稳态发挥其抗氧化作用。

图8 BAA与BAPTA联合使用可抑制谷氨酸诱导的HT-22细胞钙超载和氧化应激。(A)采用CCK-8法评估不同浓度的BAPTA-AM（0.125、0.25、0.5、1、5、10 µM）作用24小时后对HT-22细胞活力的影响。(B)Fluo-4染色荧光图像（比例尺：40 µm）。绿色荧光表示细胞内(Ca{2+})水平。HT-22细胞经20 mM谷氨酸处理24小时，再分别用10 μM BAA、0.25 μM BAPTA-AM或两者联合处理。(C)Fluo-4荧光强度定量分析；(D)DCFH-DA染色荧光图像（比例尺：100 µm）。绿色荧光表示活性氧（ROS）水平；(E)DCFH-DA荧光强度定量分析；(F)丙二醛（MDA）含量定量分析；(G)超氧化物歧化酶（SOD）活性定量分析。数据以平均值±标准误（SEM）表示。每组进行(n=6)次独立生物学重复。({prime prime} p<0.05)、(m m_{p}<0.001)。与对照组相比：(*p<0.05)、(**p<0.01)。(k+k>p<0.0001) I 与谷氨酸（Glu）组相比。缩写：ns，无显著差异。

利用BAPTA-AM验证BAA通过调控钙稳态改善线粒体功能的效果

我们探究了BAA对线粒体功能的保护作用是否依赖于钙稳态的调控。CCCP（10微摩尔）作为阳性对照，用于诱导线粒体膜电位去极化。与对照组相比，20毫摩尔谷氨酸处理24小时显著降低了线粒体膜电位（MMP），表现为JC-1红/绿荧光比值从42.79±9.52降至0.25±0.023（p<0.0001) 对比对照组），同时ATP水平从71.74±2.62降至47.88±0.68（p<0.0001) 对比对照组）（图9A-C）。10微摩尔处理BAA 显著逆转了这些效应，使 JC-1 比值恢复至 8.06 ± 2.30(p=0.0034)，与谷氨酸组相比），ATP 水平恢复至 67.69 ± 1.36(p<0.0001)，与谷氨酸组相比）。单独使用 0.25 微摩尔 BAPTA-AM 处理也表现出相当的保护作用，使 JC-1 比值恢复至 10.37 ± 3.07（p=0.004)，与谷氨酸组相比），ATP 水平恢复至 66.17 ± 1.48（p<0.0001)，与谷氨酸组相比）。BAA 组与 BAA + BAPTA-AM 组的 JC-1 比值无显著差异。相反，BAA + BAPTA-AM 组的 ATP 水平显著低于 BAA 组（p=0.0054)，与 BAA 组相比）。综上，这些结果表明 BAA 主要通过调节钙稳态来改善线粒体功能，且在 ATP 合成过程中可能还涉及其他不依赖钙的通路。

图9对照以验证JC-1染色实验；(B) JC-1聚集体/单体荧光比值的定量分析；(C) 细胞内ATP水平的定量分析。图9 白藜芦醇酸（BAA）联合1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸四乙酰氧基甲酯（BAPTA-AM）通过调节钙稳态改善谷氨酸诱导的线粒体功能障碍。HT-22细胞用20 mM谷氨酸处理24小时，同时给予10 μM白藜芦醇酸和/或0.25 μM 1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸四乙酰氧基甲酯。(A) JC-1染色荧光图像（比例尺：100 μm）；红色荧光代表JC-1聚集体（高膜电位），绿色荧光代表JC-1单体（低膜电位）；羰基氰化物间氯苯腙（CCCP，10 μM）作为阳性对照。数据以平均值±标准误均值（SEM）表示。每组进行(n=6)次独立生物学重复。与对照组相比：**p<0.01；与谷氨酸组相比：***p<0.0001；与白藜芦醇酸+1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸四乙酰氧基甲酯组相比：四四p<0.01。

通过BAPTA-AM调控钙稳态验证BAA对细胞凋亡及JAK2/STAT3通路的抑制作用

我们通过使用BAPTA-AM探究了BAA对下游细胞凋亡及JAK2/STAT3信号通路的抑制作用是否依赖于钙稳态调控。流式细胞术结果显示，与对照组（2.99±0.21%）相比，谷氨酸（Glu）处理使细胞凋亡率显著升高8.1倍（24.34±1.05%）（p<0.0001) 与 对照组相比）。10 μM BAA、0.25 μM BAPTA 单独或联合预处理，可将细胞凋亡率分别降至对照组的2.8倍、2.6倍和3.0倍（均为(p<0.0001) 与 谷氨酸组相比）（图10A和B）。

蛋白质印迹法分析显示，Glu 处理显著提高了 p-JAK2 和 p-STAT3 的水平（分别为 (p=0.0034) 和 (p<0.0001)，P<0.0001，与 Glu 组相比）。10 μM BAA 预处理显著抑制了 Glu 诱导的 p-JAK2 和p-STAT3 水平（分别为 (p=0.0071) 和 (p<0.0001)，均 P<0.0001，与 Glu 组相比）。同样，0.25 μM BAPTA-AM 单独处理也能抑制 JAK2/STAT3 激活（p-JAK2：(p=0.0448)；p-STAT3：(p=0.0027)，与 Glu 组相比）。值得注意的是，BAA 与 BAPTA-AM 联合处理未产生累加性抑制作用。各组间总 JAK2 或 STAT3 蛋白水平无显著差异（图 10C 和 D）。这些发现进一步表明，BAA 通过调节钙稳态抑制细胞凋亡和 JAK2/STAT3 信号通路。

图10  BAA联合BAPTA-AM对谷氨酸诱导的细胞凋亡及JAK2/STAT3信号通路的调控作用。用20 mM谷氨酸处理HT-22细胞24小时，同时给予10 μM BAA和/或0.25 μM BAPTA-AM。(A) Annexin V-FITC/PI双染的流式细胞术点图。象限定义：Q1：坏死细胞(Annexin (V/PI)；Q2：晚期凋亡细胞(Annexin V+/PI+)；Q3：活细胞(Annexin V−/PI−)；Q4：早期凋亡细胞(Annexin V+/PI−)；(B) 总凋亡率(Q2+Q4)的定量分析。(n=6)次独立生物学重复。(C) JAK2、(P-JAK2)、STAT3和P-STAT3蛋白表达的定量分析；(D) JAK2、(P-JAK2)、STAT3和p-STAT3蛋白的蛋白质印迹分析，以β-肌动蛋白为内参。(n=5)次独立生物学重复。数据以平均值±标准误(SEM)表示。(##p<0.01)：(m+m+p<0.0001) 与对照组相比：(*p<0.05)：(**p<0.01)。(k+k+s p<0.0001) 与谷氨酸组相比

讨论

癫痫发作的本质在于大脑神经元异常、同步性的过度放电。病理性的过度兴奋不仅会导致急性的行为和认知障碍，还会引发长期的神经退行性病变、生活质量下降，以及癫痫患者受伤和突发意外死亡的风险增加。BAA 是β-香树素的乙酰化衍生物，β-香树素是一种天然的五环三萜类化合物。研究表明，β-香树素具有通过减轻氧化应激和炎症等机制发挥抗癫痫作用。与作为母体化合物，乙酰化显著降低了BAA的极性，同时增强了其亲脂性。有研究报道，结构相似的五环三萜类化合物（如熊果酸）在经乙酰化后，生物利用度得到了显著提升。基于这些发现，我们推测BAA可能具备穿透血脑屏障的能力，这为其在抗癫痫模型中发挥功效提供了理论依据。本研究系统评估了BAA的抗癫痫作用及其潜在的神经保护机制。通过戊四氮（PTZ）诱导的斑马鱼癫痫模型和谷氨酸（Glu）诱导的HT-22神经元损伤模型，我们发现BAA可通过抑制神经元钙超载、减轻氧化应激、线粒体功能障碍、神经炎症及细胞凋亡，发挥多靶点抗癫痫作用。这些研究结果为BAA作为极具潜力的抗癫痫候选药物的开发提供了实验支持。

斑马鱼繁殖速度快，且与人类具有高度的遗传同源性，已成为癫痫研究中广泛使用的模式生物。它适用于高通量药物筛选、行为分析、脑电图（EEG）记录和活体成像，还能模拟多种遗传性和获得性癫痫类型。 在斑马鱼模型中，戊四氮（PTZ）通过拮抗与氯离子通道相关的GABAₐ受体诱发癫痫，引发一系列浓度依赖性的行为变化，最终表现为阵挛样抽搐。 本研究中，PTZ暴露显著增加了斑马鱼幼鱼的总游动距离、平均速度和强直-阵挛性癫痫发作频率，而BAA预处理可显著降低所有这些指标。值得注意的是，BAA在抑制游动速度方面的效果优于阳性对照丙戊酸钠（VPA）。

在PTZ诱导的癫痫模型及临床患者中，大脑内谷氨酸（Glu）浓度显著升高，这是导致神经元损伤的关键因素之一。谷氨酸的过度释放不仅介导兴奋性毒性，还会触发神经炎症。作为核心兴奋性神经递质，谷氨酸会过度激活突触后膜上的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体，导致大量钙离子内流，进而引发细胞内“钙超载”。钙超载随后触发一系列有害事件：线粒体功能紊乱、钙依赖性酶（如一氧化氮合酶、磷脂酶）的激活、活性氧（ROS）生成急剧增加以及严重的氧化应激。活性氧进一步攻击细胞膜上的磷脂生成脂质过氧化物（如丙二醛MDA），并通过羟自由基氧化细胞核与线粒体的DNA，激活多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）通路，造成能量耗竭。此外，活性氧还能上调促凋亡蛋白Bax的表达，诱导线粒体孔蛋白开放，触发细胞色素C的释放并激活半胱天冬酶（caspase）级联反应，最终导致细胞凋亡。值得注意的是，钙超载和活性氧爆发也是激活促炎通路的关键因素例如NF-κB，它可进一步加重神经炎症反应。

为进一步探究BAA的抗癫痫潜力，我们检测了斑马鱼体内活性氧（ROS）水平、细胞凋亡及炎症因子的变化。研究表明，戊四氮（PTZ）可诱导斑马鱼体内活性氧（ROS）积累、细胞凋亡增加以及炎症因子（如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-12（IL-12）和环氧合酶-2（COX-2））的上调。 环氧合酶-2（COX-2）是癫痫发作后神经炎症反应的关键驱动因子。癫痫发作数小时内，它会在海马神经元和皮质神经元中被快速诱导，并催化花生四烯酸转化为前列腺素（H_{2}(PGH_{2}）。随后，细胞特异性合成酶将(PGH_{2})转化为各类前列腺素，包括(PGE_{2})、(PGD _{2})和(PGF_{2} alpha)α。这些前列腺素会激活相应的然而，关于选择性COX-2抑制剂（如塞来昔布和罗非考昔）在癫痫治疗中的应用，相关研究结果相关模型的结论一直不一致。部分研究显示其具有神经保护作用⁴⁵,⁴⁶，而另一些研究则未观察到该效果具有明确的益处，部分甚至表现出抗惊厥作用⁴⁷。与直接靶向COX-2不同，BAA作用于更上游的钙稳态，有望避免与直接抑制COX-2相关的心血管风险⁴⁸。此外，经典抗氧化剂（如N-乙酰半胱氨酸，NAC）主要通过补充谷胱甘肽直接清除活性氧，并在癫痫模型中展现出保护作用⁴⁹。然而，NAC的作用主要局限于氧化应激的下游阶段，其对钙超载及后续炎症通路的调节相对间接⁵⁰。相比之下，尽管BAA的抗癫痫神经保护作用在表型上与经典抗炎或抗氧化药物重叠，但其作用机制侧重于调节钙稳态，并对“钙-氧化应激-炎症”级联进行多水平阻断。BAA或适用于由钙稳态失衡驱动的难治性癫痫亚型，为其开发为新型多靶点候选化合物提供了理论依据。

本研究进一步发现，BAA能显著抑制谷氨酸诱导的HT-22细胞钙超载。BAA的作用与钙螯合剂BAPTA-AM相当，二者联合使用时未观察到额外效应。这表明BAA的保护作用主要依赖于其对细胞内钙稳态的调控。值得注意的是，在兴奋性毒性模型中，神经元细胞内钙超载并非仅依赖于电压门控钙通道或NMDA受体的激活。越来越多的证据表明，钙池操纵性钙内流（SOCE）是该过程的关键组成部分。SOCE由内质网钙耗竭触发，并通过基质相互作用分子（STIM）蛋白（如STIM1）感知钙浓度变化，进而激活质膜上的Orai通道，介导钙的持续内流51-53。在癫痫模型中，异常的SOCE激活已被证实会增强神经元兴奋性、促进同步放电。并加剧癫痫易感性。特别是在缺乏功能性NMDA受体的HT-22细胞中，谷氨酸诱导的钙超载主要依赖于氧化应激诱导的内质网钙耗竭以及后续的 SOCE 激活。 因此，我们假设 BAA 可能通过抑制病理性钙内流来干扰STIM/Orai介导的钙库调控性钙内流（SOCE）通路。我们未来的研究应采用基因敲减（例如靶向STIM1/Orai1的小干扰RNA）或特异性SOCE抑制剂等技术，以阐明BAA在SOCE通路中的调控作用及其分子靶点。

“ROS–(Ca{2+})”正反馈环路不仅是调控神经元氧化还原状态和钙的核心机制内环境稳态，同时也被认为是直接激活JAK2/STAT3信号通路的关键上游事件。与经典的细胞因子介导的激活通路（例如，白细胞介素-6与膜受体的胞外结构域结合并诱导JAK二聚化）不同，这种激活方式表现出独特的非细胞因子依赖性特征。JAK2属于非受体酪氨酸激酶家族，JAK-STAT信号通路通过多个过程参与癫痫的发生和进展，包括调节神经元兴奋性、突触可塑性、胶质细胞激活tion 以及神经炎症反应。激活的 JAK2/STAT3 信号通路可促进下游基因的表达炎症因子。这些高表达的炎症因子进而与其受体结合，进一步激活JAK2和STAT3，促进其磷酸化并持续放大炎症反应⁵⁸。Kong等人研究发现，JAK2/STAT3通路的激活会显著加剧神经炎症⁵⁹。此外，JAK2/STAT3调控的下游信号包括Caspase-3以及Bax/Bcl-2家族蛋白等凋亡相关靶点，从而加重神经元凋亡。Hu等人报道称，抑制JAK2/STAT3通路可减轻癫痫诱发的脑损伤⁶⁰。Hong等人证实，JAK1/2抑制剂AZD1480可通过抑制JAK2/STAT3信号通路，减少小胶质细胞和巨噬细胞中炎症基因的表达⁶¹。值得注意的是，临床使用的JAK抑制剂（如托法替布）不仅能抑制癫痫发作，还可改善认知功能，有望成为癫痫的辅助治疗药物⁶²。结合分子对接结果显示BAA与JAK2具有高结合亲和力，本研究推测BAA可作为新型JAK2/STAT3通路抑制剂，通过干预该信号轴在癫痫中发挥多靶点的抗神经炎症和抗凋亡作用。

尽管本研究已取得一定研究成果，但仍存在一些局限性。BAA 虽具有较高的亲脂性，但其水溶性差的特点给制剂开发和全身给药带来了挑战。纳米粒制剂有望提高其生物利用度，并实现向中枢神经系统的靶向递送，例如如脂质体和纳米乳剂。BAA 穿越血脑屏障的能力需通过相关模型进行实验验证，例如血脑屏障平行人工膜通透性测定法（PAMPA-BBB）、转染人多药耐药蛋白 1（MDR1）的马-达二氏犬肾细胞（MDCK-MDR1），或斑马鱼脑组织分布实验。分子对接结果需通过表面等离子体共振（SPR）、微量热泳法（MST）等直接结合测定技术进行验证。现有结论主要基于斑马鱼和 HT-22 细胞模型。未来研究应进一步验证其在原代神经元和哺乳动物癫痫模型（如戊四氮诱导的癫痫小鼠、毛果芸香碱诱导的颞叶癫痫模型）中的转化潜力。BAA 可能产生非特异性中枢神经系统抑制或免疫调节作用的可能性尚未被排除，需通过行为学和分子测定实验进一步研究以明确其靶点特异性。此外，BAA 与标准抗癫痫药物（AEDs）的协同作用或作为其辅助治疗药物的潜力仍有待探索，BAA 与钙调节蛋白（如 STIM/Orai 通道）相互作用的具体机制需利用基因敲除和电生理技术进一步研究。

结论

本研究首次揭示了BAA的抗癫痫作用及其多靶点神经保护机制。在戊四氮（PTZ）诱导的斑马鱼癫痫模型中，BAA可显著抑制类癫痫行为，缓解氧化应激、细胞凋亡及神经炎症反应。网络药理学和分子对接预测钙信号通路以及JAK2和Bcl-2为其潜在作用靶点。体外实验进一步表明，BAA可减轻HT-22细胞中谷氨酸（Glu）诱导的钙超载，下调Bax/Bcl-2比值，抑制JAK2/STAT3信号通路的过度激活，从而减少神经元凋亡和炎症反应。与BAPTA-AM联合处理进一步验证了BAA的保护作用依赖于对细胞内钙稳态的调控。综上，BAA通过抑制神经元钙超载、调控JAK2/STAT3信号通路以及阻断神经炎症和细胞凋亡的级联反应发挥抗癫痫作用。但目前结论主要基于表型观察和网络药理学推断，其作用机制仍需进一步实验验证。未来研究应验证其在多种癫痫模型中的普适性，并运用分子生物学和基因编辑技术阐明其具体靶点及调控机制。

材料与方法

斑马鱼的饲养与卵的收集

野生型成年斑马鱼购自中国南京艺树丽华有限公司，按照先前描述的方法，在28摄氏度、10小时光照/14小时黑暗的周期条件下饲养。实验鱼每日投喂三次活体卤虫。在实验室条件下适应7天后，将斑马鱼按雌雄2:1的比例分入产卵池。分池2小时后收集胚胎，所有实验均使用受精后7天的斑马鱼幼鱼进行。

斑马鱼实验设计

研究人员对斑马鱼幼鱼采用了不同处理方式，以探究BAA（TargetMol，货号TN1438）对戊四氮（Aladdin，货号P103065）诱导的癫痫发作的影响。24 实验前，将斑马鱼幼鱼随机分配至各处理组，每组12条鱼。实验环境温度维持在28℃，共开展了五次独立实验。本实验设计包含四个处理组，具体说明如下：

对照组：该组的斑马鱼幼鱼未添加任何额外化合物。

PTZ组：该组幼虫在受精后第7天暴露于10毫摩尔的戊四氮中30分钟，以诱发癫痫并建立病理状态。

PTZ + 缬草酸（1 mM）组：该组斑马鱼幼虫在受精后第6天用1 mM缬草酸预处理12小时，随后在受精后第7天用10 mM戊四氮处理30分钟。

PTZ + BAA（2.5微摩尔/10微摩尔）组：该组斑马鱼幼虫在受精后第6天先用2.5微摩尔/10微摩尔BAA预处理12小时，随后在受精后第7天用10毫摩尔PTZ处理30分钟。

斑马鱼行为学分析

为评估BAA对戊四氮（PTZ）诱导的运动功能缺陷的影响，我们测定了斑马鱼幼鱼的游泳行为参数，包括总移动距离和平均速度。6天龄（6 dpf）的斑马鱼幼鱼用2.5微摩尔/10微摩尔BAA和1毫摩尔丙戊酸（VPA）处理12小时。7天龄（7 dpf）时，将幼鱼暴露于10毫摩尔PTZ中。PTZ暴露后，立即使用自动化斑马鱼行为分析系统（Hunter Lab，HT-XW2D-2100）进行30分钟的行为分析。在轨迹图中，线条密度对应斑马鱼30分钟内的总移动距离。根据游泳速度，斑马鱼的癫痫样行为被分为三个不同阶段：第一阶段：活动增加-初始给药后，斑马鱼整体活动水平上升，但游泳模式保持正常。黑色线条代表低速运动( speed <20 ~mm / s）。第二阶段：阵挛性癫痫-斑马鱼出现短暂、快速的抽搐或“突进”运动，游泳不协调。绿色线条代表中速运动（速度：20毫米/秒-50毫米/秒）。第三阶段：强直-阵挛性癫痫-以典型的“狂奔”行为为特征，斑马鱼失去平衡，沿鱼缸边缘或单一方向（常呈圆形）进行高速、不受控制的爆发式运动。该阶段是PTZ模型中的核心评价指标。红色线条代表高速运动(speed >50 ~mm / s）

斑马鱼吖啶橙（AO）染色与活性氧（ROS）染色

DCFH-DA（阿拉丁，货号# H131224）是一种用于检测活性氧（ROS）的荧光探针，而吖啶橙（AO）（阿拉丁，货号# A100495）染色可反映细胞凋亡。对照组和处理组的斑马鱼幼虫分别浸泡在含有5 μg/mL AO和20 μg/mL DCFH-DA的溶液中，于室温避光条件下孵育30分钟。洗涤后，使用0.02%的三卡因溶液（阿拉丁，货号#E107465）对幼虫进行麻醉。通过斑马鱼成像系统（Hunter Lab，HT-CX-001）（激发波长488 nm，发射波长525 nm）观察并拍摄各组斑马鱼幼虫的荧光，利用ImageJ软件对图像进行分析。

靶点筛选

利用瑞士靶点预测平台（http://www.swisstargetprediction.ch/）、Pharm Mapper 数据库（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/）以及基于整合药理学的方法，预测了 BAA 潜在的人类作用靶点中医药研究平台（http://www.tcmip.cn/）以及药物银行数据库（https://go.drugbank.com/）。去除重复靶点后，利用UniProt数据库对剩余靶点进行标准化统一，得到活性成分BAA的靶点集。以“癫痫”为检索词，从治疗靶点数据库（TTD，https://db.idrblab.net/ttd/）和基因卡片数据库（Gene Cards，https://www.genecards.org/）中检索癫痫相关靶点。去除重复靶点后，同样通过UniProt对剩余靶点进行标准化，得到癫痫相关靶点。将BAA靶点集和癫痫靶点集导入生物信息学在线平台（https://www.bioinformatics.com.cn/），绘制韦恩图并提取BAA与癫痫的重叠靶点信息。利用STRING数据库（置信度评分＞0.7）构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并通过Cytoscape 3.9.1进行可视化。基于拓扑特征（度、介数中心性、紧密度中心性）筛选核心靶点。使用DAVID（v6.8）进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，显著性阈值设为P＜0.05。

分子对接

该蛋白质的二级结构以PDB格式从蛋白质数据库（https://www.rcsb.org/）下载。使用AutoDock Tools 1.5.6处理蛋白质结构，去除水分子、添加电荷并添加氢原子。活性成分BAA的结构从中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）下载并保存，随后将所得结构转换为PDB格式。利用AutoDock Tools 1.5.6进行分子对接以计算结合能。将结果导入PyMOL软件，对对接结果进行可视化展示。

细胞培养

HT-22 神经元细胞系购自中国上海众乔新舟生物技术有限公司。HT-22 细胞在添加了10%胎牛血清、青霉素和链霉素的杜氏改良伊格尔培养基中培养。所有细胞系均通过实时荧光定量聚合酶链式反应或蛋白质印迹法进行鉴定，且支原体检测结果为阴性。

细胞活力测定

使用CCK-8检测试剂盒（Linbio，货号LC300105）检测细胞活力。将HT-22神经元细胞以每孔1×10⁸个细胞的密度接种于96孔板中。用谷氨酸（Glu，2.5、5、10、20、40 μM）、1,2-双（2-氨基苯氧基）乙烷-N,N,N',N'-四乙酸乙酰氧基甲酯（BAPTA-AM，0.125、0.25、0.5、1、5、10 μM）、20 mM谷氨酸+不同浓度BAPTA-AM（2.5、5、10、20 μM）、20 mM谷氨酸+0.25 μM BAPTA-AM、20 mM谷氨酸+0.25 μM BAPTA-AM+10 μM BAA处理细胞24小时。随后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2小时。使用酶标仪（MD，SpectraMax ID5）在450 nm波长下测定光密度（OD）值。所有实验均在96孔板中进行，设置六个生物学重复。

Annexin V/PI 双染法检测细胞凋亡

采用膜联蛋白V/PI细胞凋亡检测试剂盒（Linbio，货号LC300303）评估细胞凋亡。将处于对数生长期的HT-22细胞以每孔(3 ×10{5})个细胞的密度接种于6孔板中。随后，用20 mM谷氨酸、2.5或10 μM BAA、0.25 μM BAPTA-AM，或0.25 μM BAPTA-AM联合10 μM BAA共同处理细胞24小时。使用流式细胞仪（Beamdiag，Beam Cyte-1026）检测细胞凋亡情况。膜联蛋白V-FITC：488 nm激发，530 nm通道检测；PI：488 nm激发，585 nm通道检测。

细胞内活性氧与钙表达的测定

采用Fluo-4 AM荧光染料（碧云天，货号S1060）检测细胞内钙水平。将HT-22细胞以每孔1×10(1 ×10{4})个细胞的密度接种于96孔板中，并用20 mM谷氨酸及2.5或10 μM BAA共同处理24小时（37 ℃）。随后，向每孔加入100 μL 20 μg/mL的DCFH-DA或2 μM的Fluo-4 AM。孵育结束后，用PBS洗涤细胞两次。通过蔡司荧光显微镜（激发波长488 nm，发射波长525 nm）拍摄荧光明场图像，并利用ImageJ软件进行分析。

qPCR分析与引物序列

按照制造商的说明书，使用 TRIzol® 试剂提取试剂盒（Vazyme，货号R401-01-AA）从斑马鱼幼虫和细胞样本中分离总RNA。以提取的RNA为模板，在梯度PCR仪（Bio-Rad，T100）中通过逆转录试剂盒（Sparkjade，货号AG0304）合成cDNA。基因特异性引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。在qPCR系统（Applied Biosystems 7500）上使用SYBR Green qPCR预混液（Sparkjade，货号AH0101）进行扩增。热循环条件如下：50 ℃孵育2 min，95 ℃预变性3 min，随后进行40个循环，每个循环包括94 ℃变性15秒、60 ℃退火延伸1 min。以β-肌动蛋白为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对mRNA表达水平。用于qPCR分析的相应正、反向引物列于补充表S1中。

蛋白质印迹分析与抗体

使用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液在冰上裂解细胞样本20分钟。随后将裂解液以12000转/分钟离心10分钟，获得澄清的上清液。接着，将细胞裂解液在100℃下加热5-8分钟。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，并将其转移至硝酸纤维素膜（默克密理博，货号HATF00010）上。用5%脱脂牛奶在室温下封闭1小时后，将膜与一抗在4℃下孵育过夜，再与二抗在室温下孵育1小时。向印迹膜上滴加超敏化学发光试剂（Sparkjade，货号ED0016），使用凝胶成像系统（伯乐，ChemiDoc MP成像系统）拍摄图像。所用抗体如下：白介素-6（IL-6，赛默飞世尔生物，货号500286，1:1000）、信号转导与转录激活因子3（STAT3，安捷伦，货号ab68153，1:1000）、磷酸化信号转导与转录激活因子3（酪氨酸705）[phospho-STAT3 (Y705)，安捷伦，货号ab267373，1:1000]、酪氨酸激酶2（JAK2，赛默飞世尔生物，货号R24775，1:1000）、磷酸化酪氨酸激酶2（酪氨酸1007/1008）[phospho-JAK2 (Tyr1007/1008)，赛默飞世尔生物，货号R381556，1:1000]、半胱天冬酶3（Caspase3，普罗泰克，货号66470-2-Ig，1:1000）、切割型半胱天冬酶-3（Cleaved caspase-3，赛默飞世尔生物，货号341034，1:1000）、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白（Bax，细胞信号技术，货号2772T，1:1000）、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2，安捷伦，货号ab182858，1:1000）、β-肌动蛋白（β-actin，普罗泰克，货号81115-1-RR，1:3000）。原始未裁剪的印迹膜图片见附录。

统计学分析

使用 GraphPad Prism 软件进行统计分析。所有数据以平均值±标准误（SEM）表示。采用Shapiro-Wilk检验评估正态性，采用Levene检验评估方差齐性。多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行Tukey事后检验；两组间比较采用双侧Student t检验。以(p -value <0.05)为标准，差异具有统计学意义。所有实验均作为独立生物学重复至少重复五次。