题目：Reproducibility and replicability in zebrafish behavioural neuroscience research: The importance of animal-human interaction and temporal aspects of husbandry conditions

原文链接:https://www.elsevier.com/locate/neubiorev

期刊:Neuroscience and Biobehavioral Reviews

摘要

在行为神经科学（包括斑马鱼研究）领域，可复现性和可重复性仍是一大挑战。这一问题的根源之一，可能源于实验室中饲养和养护斑马鱼方式的差异。尽管学界已致力于统一饲养条件，但一个潜在的重要变量却常被忽视：人与动物的互动。在这篇观点文章中，我们认为，捞取、喂食、清理鱼缸、换水等常规饲养操作，会构成反复的急性应激源，进而导致斑马鱼生理状态和行为发生慢性改变。已知在其他物种中，这类人为诱导的应激效应会与实验处理产生相互作用，因此预计这也会干扰斑马鱼实验的研究结果。此外，包括人工处理在内的养护任务时间安排，以及其他时间相关因素，还可能带来特定于实验设施、研究项目或操作人员的系统性影响。我们提出，这些未被记录的人与动物互动以及未标准化的时间养护模式，是影响数据可复现性的潜在变量，而认识并记录这些因素，是提升斑马鱼研究可靠性的必要举措。

引言

行为神经科学乃至整个科学界的可重复性与可复制性都是热议的话题，因为许多实验室都难以复现已发表数据的研究结果（Kafkafi 等人，2018）。斑马鱼研究界也未能摆脱这一困境（Gerlai，2019）。在这种背景下，大多数斑马鱼研究者聚焦于实验因素，探究针对其操作或处理应采用何种最适宜的对照方法。另一研究重点是控制并记录斑马鱼在饲养箱或实验室中所处的日益增多的环境条件（Varga 等人，2018）。这些条件包括水化学性质（pH 值、电导率、盐分组成）、温度、光照强度、喂食频率与食物种类、鱼缸大小与鱼群密度、过滤方式等（Varga 等人，2018；Gerlai，2019；Aleström 等人，2020；Tsang 等人，2020；Silva 等人，2023；Tsang & Gerlai，2024；Hillman 等人，2025）。然而，几乎无人关注斑马鱼饲养维护中另一个潜在的重要方面——人与动物的互动，包括人工操作（Shishis 等人，2023）。在这篇观点文章中，我们认为这是一种疏漏。我们主张研究斑马鱼设施时考虑人与动物的相互作用，对于获得可复制、可重现的结果至关重要。此外，我们还探讨了斑马鱼饲养的时间相关因素，即斑马鱼实验室环境中随时间变化的特征也应得到考虑、控制和记录。

许多个体研究人员以及资助机构（如美国国立卫生研究院）认为，标准化饲养条件应能提高斑马鱼研究结果的可复制性和可重复性（瓦尔加等人，2018）。为实现这一目标，已有大量研究尝试为斑马鱼养殖设施中各类环境因素设定合理的数值范围（瓦尔加等人，2018；阿莱斯特伦等人，2020；曾等人，2020）。尽管存在一些差异，斑马鱼研究界通常会遵循这些饲养参数，以尽可能保证实验结果在实验室内部及不同实验室之间具有可比性。然而，即便在同一实验室内部，不同实验室之间也会出现结果的差异性，包括行为学研究结果在内（希尔曼等人，2025；约翰逊等人，2025）。

在这篇评论文章中，我们认为造成这一问题的一个可能原因是斑马鱼因日常与人类接触而承受的日常压力——动物相互作用。在此，我们提出看似无关紧要的饲养操作，如投喂鱼类、清理鱼缸、更换鱼缸用水、用网捕捞并转移鱼类等，可能是导致斑马鱼行为乃至其他多种生物表型出现误差变异的潜在因素。这些单次急性应激诱导事件可能会引发慢性变化的累积，例如斑马鱼下丘脑-垂体-肾间轴功能的改变（德·阿布鲁等人，2021年）。这进而可能影响皮质醇依赖的众多生理过程及其他生理反应（克拉克等人，2011年）。经历这些日常饲养操作的鱼类可能形成特定的生理状态，而该状态会因不同实验室的具体饲养制度而有所差异。然而，目前我们必须承认，这仅为一种推测。例如，尽管人为接触对斑马鱼的急性影响已得到充分证实（希希斯等人，2023年），但斑马鱼日常饲养程序（包括人为接触程序）的差异如何导致其行为、生理或其他生物表型发生慢性变化，这一问题尚未得到系统探究，不过在小鼠相关文献中已有充分记载（如陈与格尔纳，2023年）。尽管如此，我们推测在斑马鱼身上，长期采用的实验室或设施专属程序（包括人与动物相互作用相关程序）也会表现为独特的表型特征；这些特征看似是研究群体的固有特质，实则是实验室饲养流程的衍生特征，这一工作假设有待未来的实证研究加以验证。

此外，在设计实验和规划统计比较时，大多数研究都隐含地假设效应具有加性，即：(C+T=R)；其中C为对照组的表型，T为处理效应，R为接受实验处理组的表型。若考虑饲养条件（例如人工饲养）的效应，在加性假设下，对照组鱼的表型为C+H（H为人工饲养的效应），处理组的表型为(R+H)。也就是说，上述公式可写为：(C+H)+T=(R+H)。换言之，在该公式中，我们假设对照组和处理组受人工饲养的影响相同，即人工饲养的效应具有加性。因此，只需从公式两侧减去人工饲养的效应，即可忽略该效应。 然而，生物学中几乎从未满足加性假设，因为不同因素的效应往往存在交互作用。神经科学研究中存在无数此类交互作用的例子（Gerlai, 2000），而研究最深入的案例或许来自行为遗传学领域（Wahlsten, 1990），该领域主要探究基因（G）与环境（E）的效应，例如在小鼠（Adams et al., 2002）或鱼类（Gerlai and Cs´anyi, 1990）中的研究。这些研究常证实，表型（P）并不等于基因与环境的加性效应（P ∕= G + E），而是因基因型×环境（G×E）交互作用而偏离该值（即(P=G+E+G x E)）。 同理，在我们的研究中，当考虑饲养（H）与处理（T）效应的交互作用时，正确的公式应写为：(C+H) (+T+TxH=(R+H))；其中TxH为所用处理与人工饲养的交互作用导致的处理效应表型偏差。换言之，由于处理与人工饲养的交互效应，处理效应会被修正。例如，人工饲养引发的应激可能放大处理效应（TxH为正），也可能削弱处理效应（TxH为负），相关实验案例将在下文学习与记忆的分析中讨论。 综上，交互作用的效应会干扰对处理效应的解读。斑马鱼养殖设施中，人工饲养以及常规饲养过程中人与动物的多种交互作用均被忽略且未被记录，这可能导致实验结果出现差异，进而危及实验发现的可复制性与可重复性。这一问题并非斑马鱼研究独有，家鼠神经行为遗传学研究中也出现了概念上类似的问题（Crabbe et al., 1999），家鼠是一种模式生物这种生物的应用已主导了生物医学和基础实验生物学的研究。此外，与家鼠相关研究结论类似（如Crabbe等人1999年的研究），人类饲养处理的影响也可能因斑马鱼遗传特性不同的品系或种群而存在差异，这可能会进一步使实验处理对斑马鱼产生的影响解释变得复杂（Gorissen等人2015年；Scerbina等人2012年；Drew等人2012年；Gerlai等人2009年；Egan等人2009年）。相较于家鼠，斑马鱼在行为神经科学、行为遗传学以及生物学其他多个子领域中属于相对较新的研究对象，因此我们认为上述问题尤其值得重视，下文我们将对这一话题展开详细阐述。

饲养常规作为隐性变量

在斑马鱼设施的日常运营中，人与斑马鱼的互动无处不在。这种互动可能很简单，比如用网捞鱼进行行为分析等测试，或是清洁更换鱼缸；也可能是看似无关紧要的举动，比如在喂食时靠近斑马鱼缸。人们通常不假思索地将这些互动视为日常维护工作，而非实验操作。然而，我们认为从斑马鱼的角度来看，这些日常活动可能会成为应激源。例如，近期一项研究明确指出，捕捞操作会在斑马鱼体内引发可测量的应激反应（Philippe 等人，2023；Shishis 等人，2023）。Philippe 等人（2023）的研究表明，成年斑马鱼在经历短暂的网捕和空气暴露（旨在模拟饲养流程）后，皮质醇水平会升高。同样，Shishis 等人（2023）发现，与能最大程度减少或消除网捕和/或空气暴露影响的温和处理方式相比，采用网捕加空气暴露的处理方式会在斑马鱼体内引发最强烈的类焦虑反应。此外，Philippe 等人（2023）还发现，即便这些应激源长期频繁出现，被处理的斑马鱼也不会对其产生适应。这一发现表明，日常用网捞鱼或用虹吸管清理鱼缸杂物的行为，与任何实验操作一样，会可靠地引发斑马鱼持久的激素应激反应。这些日常轻微急性应激刺激的影响会不断累积，久而久之可能导致斑马鱼的大脑功能、行为、生理状态以及整体健康状况发生慢性改变。

值得注意的是，统一人与动物互动的日常流程可能颇具难度。例如，即便在不同实验室严格按照相同流程开展所有操作，饲养者带来的影响也难以在小鼠实验中实现标准化（克拉布等人，1999年）。而在斑马鱼实验中，人与斑马鱼互动的标准化难度可能更高，因为斑马鱼对这类互动或许尤为敏感。斑马鱼属于被捕食者物种，我们认为其可能会将人类饲养者视为捕食者。如前文所述，这种影响可能依赖于实验设施，也可能因饲养者个体而异，这些都是未来需要通过实证检验的工作假设。例如，某一设施可能在上午8点喂食，另一设施则在上午11点喂食，这种时间差异可能产生显著影响（如曾等，2018年）。部分饲养人员会严格按照固定时间进行鱼缸维护，比如每周二上午用网捕捞并搭建繁殖缸，而另一些人员则仅在有需要时才偶尔进行。即便是细微差异，例如某实验室的实验人员在检查时轻敲鱼缸以促使鱼类活动，而另一实验室的实验人员不做此操作，也可能引发不同的应激事件。此外，部分饲养者执行常规且可能引发应激的维护流程时会更为温和，比如慢慢移动网具，直至鱼类被妥善赶入网中，而另一些饲养者则缺乏耐心，快速移动网具追逐鱼类（如希西斯等人，2023年）。此类事件和流程差异从未被记录或报告，但它们可能对鱼类的行为、脑功能相关指标、生理状态以及整体健康产生显著影响，且这种影响具有实验室或饲养者个体特异性。由于它们可能在鱼体内诱发不同的压力。实际上，每个斑马鱼设施可能都在后台运行着独特的压力调控计划，这会塑造斑马鱼的生物学特性，包括大脑功能和行为。下文我们将探讨这种差异对斑马鱼行为表型的影响。

实验室特异性行为表型

传统上，当在不同实验室的斑马鱼之间观察到行为差异时，实验者通常会怀疑原因是鱼类的品系来源不同，或是水化学性质、温度、光照水平等多种环境参数存在差异。事实上，与人类饲养方法不同，这类差异在文献中常有报道，涉及不同的斑马鱼养殖设施以及不同的斑马鱼研究（近期综述可参见曾与格尔莱，2024）。

一条因反复应激而在生理上被预先设定的鱼，其行为表现可能与未经历此过程的鱼存在稳定且一致的差异。随着时间推移，这些差异会表现为稳定的表型特征。事实上，斑马鱼行为神经科学家近期已采用“主动型与被动型应对方式”或“大胆型与羞怯型”人格类型等表述（Rajput 等人，2022；Wong 等人，2019）来描述个体斑马鱼之间的差异。斑马鱼研究人员观察到，部分鱼表现出更多焦虑样或被动行为，而另一些则更为大胆或活跃（Mamede 等人，2024；Rajput 等人，2022）。这些观察背后的假设通常是，个体之间可能存在遗传差异，即遗传易感性会体现在鱼的行为谱和人格特征中。这一假设或许是正确的。但我们也认为，此类人格特征实际上可能是实验室特定饲养流程与鱼的基因型相互作用的结果。这种相互作用本身并非问题所在。然而，问题在于，在某一实验室开展的关于个体差异的研究结果可能仅适用于该实验室，且从这些结果中得出的结论未必能推广至其他实验室饲养的斑马鱼。总之，尽管在某一实验室中，X品系的鱼会表现出一致的行为模式，但在另一实验室中，这些鱼可能展现出不同的行为谱。此外，在同一实验室内，基因型与环境的这种相互作用会加剧鱼之间的个体差异，这不仅使得有意义的研究结果仅具有实验室特异性，还会因统计效力降低而更难获得显著结果（Gerlai，2019；2000）。

现在我们回到斑马鱼实验室中未控制/减少人为操作引发应激所带来的一些具体问题。应激水平升高会对多种行为表型产生影响，而非仅局限于与焦虑相关的表型。例如，在养殖鱼类中，多种应激源已被证实会引发一系列神经内分泌变化以及神经递质水平的改变（袁等人，2025）。尽管斑马鱼中的此类效应特征尚未得到充分阐明，但慢性应激也被证实会影响该物种的学习能力、社交互动和攻击性。例如，不可预测的慢性应激会改变斑马鱼的攻击性和基础皮质醇水平（兰博等人，2017），同时也会影响其对社交刺激的反应以及在学习和记忆中起关键作用的神经递质水平（富尔彻等人，2017）。尽管后述研究中使用的应激源强度高于斑马鱼常规操作流程可能带来的应激，但斑马鱼实验室中人与动物的互动每天会发生多次，且这类日常互动会持续数月。因此，这些应激事件的累积可能会以实验室特有的方式改变斑马鱼的各类行为及其他生物学反应。这类慢性应激的影响难以预测。不过，我们可以思考以下推测性观点，这些也是未来有待验证的工作假设。当斑马鱼受到温和操作时，其产生的轻度应激可能会提升实验斑马鱼在联想性学习任务流程中的警觉性，也可能使斑马鱼对该任务流程产生习惯化。尽管此类这一效应尚未在斑马鱼中得到证实，但在小鼠中却恰好得到了验证（上野等人，2020年）。然而，如果处理应激超过一定阈值，也可能在斑马鱼中引发相反的效应，即致敏作用，这一效应在小鼠中也已得到证实（克拉布等人，1999年）。尽管尚未发表，但我们也观察到了人类处理对斑马鱼及其他鱼类产生的习惯化和致敏作用（格尔莱，个人观察）。若斑马鱼出现致敏反应，将其放入联想训练池或迷宫时，鱼类可能会表现出被动回避行为，例如僵住，从而导致条件刺激-非条件刺激（CS-US）的联想训练无法有效进行。这种结果上的差异可能会被错误地归因于实验方案的不同或鱼类的遗传背景（品系来源），而实际上，其根源在于实验室或研究特有的常规饲养方法存在差异，其中就包括人类处理方式的不同。

我们还推测，人为操作引发的压力和焦虑可能对某些表型产生差异化影响。也就是说，并非所有生物学功能（包括大脑功能）都会以相同的方式和/或相同的程度受到影响。尽管这只是针对斑马鱼的一个初步假设，但已有大量研究在小鼠身上证实了这一点。小鼠研究文献早已明确，其对焦虑某些方面的识别能力存在差异，而对其他方面则无此差异。例如，鲍尔斯等人（2008年）发现，特定的应激源会在小鼠体内引发不同的、与应激源特异性相关的皮质酮和免疫功能改变，以及独特的行为反应。旷场试验已被证明对部分抗焦虑化合物敏感，但并非对所有此类化合物都有效（普鲁特和贝尔宗，2003年）。克拉布等人（1999年）也发现了应激源的差异化影响：包含更多厌恶性成分的行为测试对不同实验室间人为操作相关的差异较为敏感，而厌恶性成分极少的行为测试则不敏感。上野等人（2020年）同样发现，人为操作仅会在行为测试组合中的部分（而非全部）测试里，以可测量的方式改变小鼠的行为反应。即便是与癌症相关的表型，也已被证实会受到小鼠体内特定水平/方面的压力和焦虑的负面影响（贝林格等人，2021年）。此外，有研究发现，人为操作引发的应激反应具有小鼠品系（即基因型）依赖性（古韦亚和赫斯特，2013年）。基于此类选择性和任务特异性效应，我们认为斑马鱼也会出现类似的、由人为操作引发的复杂应激反应。在小鼠研究的相关文献中，这些复杂性已围绕结果的可复制性和可重复性展开了深入探讨（卡夫基等人，2018年）。尽管这一点尚未得到广泛认可，但我们认为此类问题同样困扰着斑马鱼研究。总之，研究、实验室或设施特有的饲养条件（包括操作流程），预计会降低斑马鱼研究结果的可复制性和可重复性。

当前标准化工作中被忽视的空白：斑马鱼设施中人类活动的潜在影响并非唯一问题

斑马鱼研究领域已采取措施解决可重复性和可复制性问题。该领域的科学家制定了详细的建议，例如“斑马鱼学”以及《动物研究：体内实验报告指南》（ARRIVE），以鼓励研究人员记录方法学和实验细节（Bedell 等人，2025）。标准饲养因素——包括水温、电导率、pH值、水箱尺寸、放养密度、光周期、光照强度及光源、饲料类型和投喂频率、富集方法，以及斑马鱼繁育和饲养过程中众多其他方面——均被视为潜在的变异来源，应在每篇同行评审出版物中加以控制，或至少予以报告（Varga 等人，2018；Aleström 等人，2020）。尽管这些是已开始落地的积极举措，但我们认为，在所有这些标准化努力中，斑马鱼日常饲养维护的某些方面，例如与人工操作相关的方面，以及众多其他人类活动（如水箱清洁、鱼类投喂、健康检查、水质检测、设备检测等）修复斑马鱼水箱及其周边区域等），这些行为对斑马鱼来说是可察觉的，但几乎总是被忽视。例如，机构动物护理规程通常允许一系列可接受的操作，却未意识到此类人类活动可能会对斑马鱼产生重大影响，且不同程度的侵入性会引发设施特有的独特环境影响。

哪些人类活动确实会对斑马鱼的应激和焦虑反应、表型改变以及/或动物福利受损产生实质性影响，这是一个实证问题，必须通过对上述人类活动的影响进行系统性分析来解答。部分活动可能被证明是无害的，另一些则可能具有显著且重要的影响，且如前所述，这些活动的影响预计具有表型特异性，即并非所有表型和生物学功能都会受到同等影响。鉴于相关实证研究的缺乏，我们只能进行推测。例如，人类操作斑马鱼的方式已被证实至关重要（Shishis 等人，2023）。其他人类活动还包括投喂鱼类。投喂行为通常需要饲养人员在斑马鱼缸周围或鱼缸上方移动。研究表明，斑马鱼缸上方出现大型移动物体会引发强烈的焦虑样反应（Luca & Gerlai，2012a；2012b）。在部分实验设施中，饲料会通过鱼缸顶盖的小孔投入缸内；而在另一些设施中，投喂人员需要掀开顶盖，这会产生振动和额外的移动动作。还有一些设施则通过自动投喂器完成投喂。这类自动投喂器可能是小型旋转滚筒式投喂器，仅产生极少的视觉或振动刺激；但也有部分设施采用大型投喂机器人，这些机器人会沿着斑马鱼饲养架/鱼缸的侧面移动。目前尚不清楚这些不同的投喂方式是否会引发不同的焦虑样反应，但明确记录投喂方式是十分必要的，这将为后续研究收集有价值的参考信息。斑马鱼饲养架之间的空间距离，即人类操作人员、设施技术人员与斑马鱼缸之间的距离，也可能产生影响。操作人员距离鱼缸越近，斑马鱼的焦虑反应预计就越强烈。同样，人类与斑马鱼之间的互动频率也需要记录和报告。总之，尽管目前就明确出版物中必须报告的内容（即 ARRIVE 清单中应包含的内容）还为时过早，但实验人员至少应考虑记录所有与人类活动相关的信息，这些信息可在未来的系统性研究中通过实验验证其有效性或无效性。例如，目前我们建议斑马鱼研究应记录以下内容：转移流程，包括操作方式（如网捞 vs 倾倒）；操作的大致时长以及斑马鱼是否接触过空气；操作频率和强度，包括斑马鱼被网捞、转移的频次，追逐的时长与剧烈程度，以及捕捉尝试的次数；操作人员的一致性，包括不同实验组是否由同一人员执行实验流程（如 Shishis 等人，2023）。若实验时未收集这些变量，即便仅进行大致报告，也能改善不同实验室或不同研究之间的对比分析，并提高研究人员对常规实验流程的重视程度与标准化意识，否则这些流程可能成为干扰因素。

斑马鱼养殖设施中另一个被忽视的问题是斑马鱼饲养的时间相关因素。大多数设施都聚焦于并试图将我们所说的斑马鱼实验室环境“静态参数”标准化。诚然，制定适合斑马鱼的最佳饲养条件参数至关重要。然而，斑马鱼饲养的各个方面都与时间相关，包括人与动物互动相关的环节。斑马鱼养殖设施会在固定时间投喂饲料，清洁和换水也会在特定的日期或时间进行，诸如此类。此外，多种环境参数的数值会随时间变化，偏离最佳值或在目标绝对值附近波动。这些变化均与时间相关，但无论是标准操作流程（SOPs）还是同行评审的出版物，都未对其进行描述或考虑。或许此类文献中唯一提及的时间相关变化是……文本指的是光周期。其他所有因素都被忽略了。这是一个错误。为了说明原因，我们来看以下现实中的例子：pH值的时间变化。大多数斑马鱼养殖设施会尝试将pH值维持在一个狭窄范围内，通常在6.5至7.5之间，即中性或接近中性。由于有机废物的积累，pH值往往会下降，即低于7，这会使水体酸化，这是斑马鱼养殖设施中的常见情况。为了规避这一问题，大多数设施会使用缓冲盐，例如碳酸氢钠（小苏打）（Tsang等人，2020）。一些设施配备了连接pH探针的自动加盐装置，当pH值超出目标范围（例如低于6.5）时，探针会触发检测。一旦发生这种情况，蠕动泵就会启动，将少量碱性水从碳酸氢钠加药装置输送到斑马鱼养殖缸/养殖架，从而将pH值提升至目标值。有些设施则采用人工方式，即技术人员定期测量pH值，当发现数值偏低时，手动向养殖缸中加入碳酸氢钠。然而，目前没有人尝试优化pH值的变化速度，也没有研究调查pH值突变可能带来的有害影响。斑马鱼在自然界中能适应范围很广的pH值（5至9）（McClure等人，2006；Tsang等人，2020）。但这些数值在自然界中不会出现快速波动。同样，在实验室环境中，也有观察到斑马鱼在pH值偏离最佳范围的水体中生存，且没有出现任何明显的应激或疾病迹象（Kumai等人，2011；Tsang和Gerlai，2024，个人观察）。但已知pH值的快速变化对鱼类有害（Zahangir等人，2015）。然而，我们尚未发现任何以斑马鱼为研究对象的实证论文，将pH值变化速率视为标准化或优化的重要因素。因此，我们建议实验性论文需报告养殖参数的时间相关信息，包括养殖操作的时间、投喂、清洁、换水、水体化学参数，以及相对于这些养殖事件的实验测试时间。

总之，当前的标准化工作主要集中在静态条件上，即更关注环境的“现状”，而非动态条件，也就是环境、事件发生变化或出现的“时间”“频率”与“速度”相关问题。我们认为，在斑马鱼研究中，考虑环境参数变化的时间模式以及斑马鱼设施内的人类活动（包括人员对斑马鱼的操作），对于获取更可靠、可重复的数据至关重要。

结论

在这篇评论文章中，我们旨在提出这一观点：在解读斑马鱼实验结果时，必须考虑实验室中人与动物的常规互动。这些潜在的急性应激事件，包括抓取、捞鱼、喂食以及鱼缸维护相关操作，可能会使斑马鱼处于慢性伪基线应激状态。由于日常饲养流程和护理操作时间的差异，不同实验室的这种应激状态可能存在区别，进而可能形成实验室特有的表型。我们还认为，关注包括人与动物互动在内的环境参数的时间规律至关重要。我们推测，这些此前未被重视的斑马鱼饲养环节，可能是导致实验室特有研究结果的隐性因素，也是斑马鱼研究中影响结果可重复性与可复制性的混杂变量；这一普遍假设已在小鼠神经行为遗传学研究中获得了大量证据支持（卡夫卡菲等人，2018年）。我们建议，实验研究应报告多种饲养和维护相关参数、操作方法，以及这些参数和方法的时间维度特征。除了对这些因素的潜在影响进行系统性分析外，这样的报告方式将帮助斑马鱼研究领域的研究者明确哪些环境因素可能对实验结果产生影响。尽管我们并非旨在否定过往的研究，但我们建议应关注各类相关因素，同时认识到斑马鱼的行为、生理乃至所有表型，都建立在其在实验室中日常经历的背景之上。