题目：In vivo single-cell RNA metabolic labeling resolves early transcriptional responders in the regenerating zebrafish heart

原文链接:https://www.nature.com/articles/s41467-026-72781-2

期刊:Nature Communications

摘要

成年斑马鱼心脏在受损后具有再生能力，但触发这一过程的最早基因表达变化仍知之甚少。本研究表明，体内单细胞RNA代谢标记技术可对单个细胞中新合成的RNA进行标记，能够捕捉成年斑马鱼心脏受损后的快速反应。在损伤后的最初6小时内，我们在一类巨噬细胞样免疫细胞亚群中检测到先天免疫程序被激活，其中包括Toll样受体信号通路。对更大规模单细胞数据集的分析显示，中性粒细胞也参与了这一早期反应。基于这些数据，我们证实抑制巨噬细胞特异性Toll样受体衔接蛋白MyD88可减少损伤部位促炎性巨噬细胞的反应，并改善再生的早期特征。本研究确立了RNA代谢标记技术作为一种在单细胞分辨率下测量体内急性反应的有效方法，并证实早期免疫细胞激活是心脏再生的一个可调控环节。

在成年哺乳动物中，心肌梗死会导致心脏组织不可逆转的损失，因为受影响的组织被纤维化的疤痕取代。相比之下，新生小鼠以及成年蝾螈和斑马鱼在受伤后拥有有效再生心脏的能力。对斑马鱼的广泛研究表明，心脏再生是一个紧密协调的过程，涉及多个连续步骤，包括早期炎症、血管重建、再生支架的形成和纤维化疤痕的沉积，以及后来通过增殖的心肌细胞替换疤痕以形成功能组织7。虽然心肌细胞去分化和增殖的过程已经被深入研究，但最近大量的工作也集中在心肌细胞的组成和贡献上。

转录细胞状态的改变是驱动成功心脏再生的动态事件所必需的。对于例如，心肌细胞获得去分化状态以增殖，成纤维细胞呈现以col12a1a8,17表达为特征的短暂促再生状态。巨噬细胞极化是心脏再生过程中的另一个动态过程，其中巨噬细胞在早期阶段倾向于更促炎症，并在后期阶段过渡到更促再生状态。在心外膜和心内膜中也有细胞状态变化的报道。然而，对心脏损伤的早期反应，触发后期再生级联，在很大程度上仍然未知。虽然有报道称中性粒细胞和巨噬细胞浸润早在损伤后3小时就开始了，但最早的转录状态转变尚未确定到。

长时间的细胞命运决定通常用Cre-lox谱系追踪等方法评估，或者最近用此类方法并不适用于测量动态变化显著且可能短暂存在的转录细胞状态改变。具体而言，测量细胞对扰动的响应颇具挑战：损伤后不久的分析存在信号微弱的问题，而样本间预先存在的差异很容易主导分析结果；在后续时间点进行分析则可能包含次级效应，使得直接靶点的识别变得困难甚至无法实现。我们认为，单细胞代谢RNA标记技术通过为每个基因和每个细胞测量两个时间点（扰动前后），在检测短期转录状态改变方面具有巨大潜力。然而，此类方法目前大多仍处于已被证实可在细胞培养中发挥作用。

本研究建立了适用于成年斑马鱼心脏RNA代谢标记的单细胞巯基（SH）连接烷基化代谢测序技术（scSLAM-seq³⁰），并利用该方法检测了冷冻损伤后早期转录状态的变化。研究发现巨噬细胞样细胞是最早的响应细胞之一，其会上调Toll样受体（TLR）信号通路等先天免疫反应通路。通过构建可诱导的巨噬细胞特异性显性负相髓样分化因子88（MyD88）过表达转基因品系对TLR通路进行干扰，结果显示冠状动脉内皮细胞增殖、冠状动脉血管覆盖度以及心肌细胞增殖均有所增加。综上，本研究数据表明早期促炎反应需要在强度和时间上保持平衡，而早期再生级联反应可通过精细调控来实现调节。

结果

SLAM-seq 可对成年斑马鱼心脏的转录过程进行标记

为了测量短期转录状态变化，我们旨在在活体成年斑马鱼心脏中建立RNA的代谢标记方法。具体而言，我们选定了巯基（SH）连接的烷基化技术基于4-硫尿苷（4sU）掺入新转录RNA的RNA代谢测序（SLAM-seq）方法（图1a）³⁰。在使用碘乙酰胺进行巯基修饰步骤后，带有标记的转录本可通过测序数据中特征性的T-to-C转换在测序数据中被检测到（“方法”部分）。然而，4sU的给药方式、浓度和标记时间等多个参数必须经过精心优化，以避免转录本标记过度或不足。为建立适用于整体水平上成年斑马鱼心脏转录标记的实验体系，我们进行了胸内（IT）注射不同浓度4sU的实验（补充数据1）。尽管腹腔内（IP）注射是化合物递送中更常用的方式，但我们认为，相较于IP注射，在心脏附近直接注射4sU可降低实验变异性。我们发现，胸内注射5微升200毫摩尔浓度的4sU，在心脏中实现了最高的转换率（即比对读数中每个覆盖的T位点的T-to-C替换数），且标记6小时后未产生任何不良反应（图1b）。为控制胸内注射4sU的斑马鱼在损伤和假损伤心脏中潜在的4sU泄漏问题，我们首先进行4sU胸内注射，并在注射1小时后实施假损伤或冷冻损伤操作。随后在假损伤或冷冻损伤6小时后采集心脏样本。我们发现，打开体壁和心包以实施冷冻损伤并不会影响转换率（图1b）。

我们接下来测定了4sU转化率与标记时间的关系（补充数据1）。我们发现，单次注射4sU后，转化率在注射后12小时持续上升，但在注射后24小时略有下降（图1c）。这种下降可能是由于当时4sU的可利用量耗尽所致。在此，我们重点研究较短的标记时间（通常为7小时），该时间处于mRNA平均半衰期范围内，因此单次注射4sU即可满足需求。我们检测到的总体转化率相对较低，约为1%，检测到的T-to-C转换数比背景水平高出约3-4倍33。我们推测，这可能是由于未受伤的成年心脏中mRNA更新率较低，且检测到的标记效率会因高丰度的____而降低表达半衰期长的管家基因。实际上，按基因解析数据后，我们发现转化率与表达水平存在明显的相关性，并且观察到许多基因具有更高的转化率（图1d）。

图1. |SLAM-seq 对成年斑马鱼心脏的转录过程进行标记。a 标记6小时后表达的示意图功能（样本1）。CPM……每百万计数，批量SLAM-seq实验流程。b 心脏样本的T-to-C转换率，log1p……输入值加1的自然对数。e 来自SLAM-seq时间序列的两个代表性基因（左：来自注射IT的不同4sU浓度的斑马鱼，每个点代表fosl2；右：myh6）。点表示单个样本的平均值，(n=3)（未注射）、(n=1(50 mM))、(n=2)（100毫摩尔）、(n=3)（200毫摩尔），生物学重复样本间的总读数比例，误差棒表示标准差，虚线表示拟合曲线，灰色阴影区域代表95%置信区间，τ值为估算的RNA半衰期（单位：小时）。图a部分由BioRender制作，Mintcheva, J. (2026) https://BioRender.com/mchf1ny。更多细节见“方法”部分的图表章节。c 单次注射4sU后SLAM-seq时间序列的T-to-C转换率。每个点代表一个样本，每个时间点均获取生物学重复样本。d 每个基因的T-to-C转换率

由于SLAM-seq技术基于检测T向C的转化，测序错误和单核苷酸变异（SNVs）原则上可能导致假阳性结果34。虽然可通过对测序读长设置严格的质量阈值来最大程度降低测序错误的影响（见“方法”部分），但评估单核苷酸变异可能产生的影响仍十分重要。我们推断，单核苷酸变异会导致单个核苷酸位点出现极高的T向C转化率，因此我们对这类事件进行了过滤处理（见“方法”部分）。研究发现，转化速率受到了中等程度的影响，这表明单核苷酸变异的影响需进行审慎评估（补充图1a-c）。相比之下，若要求将转录本标记为已标记需满足至少两次T向C转化而非一次，则已标记转录本的占比会出现更显著的下降（补充图1c）。

由于4sU暴露和IT注射都可以引起转录反应，我们试图探索4sU注射的影响。对时间过程数据的分析显示，与PCA空间中未注射的样本相比，标记3小时和更长时间的未损伤心脏分离，表明潜在的潜在转录反应（补充图1d）。此外，未注射心脏和用4sU标记6小时后采样的心脏的差异基因表达显示免疫相关基因如cxcl18、lect2l、irf1b、mmp9和mmp13a.1的上调，表明潜在的炎症反应（补充图1e）。然而，PCA与IP注射样本和IT注射以及随后的假或冷冻损伤样本表明，假和冷冻损伤的转录效应超过了仅4sU注射的转录效应，其标志是PCA空间中的更大分离（补充图1f）。

在斑马鱼心脏中完成对标记策略的验证后，我们进一步探究批量SLAM-seq数据是否也能用于计算RNA周转率。为此，我们量化了注射后12小时内标记转录本与总转录本的比例，并通过数学模型计算衰变率（数学补充材料）。我们鉴定出超过3100个基因，可通过(R{2}>0.7)估算其半衰期（图1e，补充数据2）。平均半衰期为2.5小时（τ[0.5小时，48小时]，(R{2}>0.7)），略短于哺乳动物细胞中报道的平均半衰期35,36。更多与已发表的利用代谢标记技术推导的衰变率汇编进行详细对比后发现，考虑到推导的RNA衰变率存在的既定生物学和方法学差异，我们计算的半衰期总体上落在现有半衰期汇编的范围内（补充图2）。

综合来看，这些数据表明可通过SLAM-seq对成年斑马鱼心脏的转录情况进行定量分析，该方法非常适用于检测短期转录变化（如早期损伤反应），因为标记检测的时间尺度与转录组变化的时间尺度相匹配。

scSLAM-seq 解析心脏的早期损伤反应

在验证新转录的RNA可通过SLAM-seq实现高效标记后，我们接下来希望探究该方法能否用于解析成年斑马鱼体内心脏冷冻损伤后的早期应答反应。结合对RNA半衰期的估算，我们推测在冷冻损伤后6小时（hpci），损伤前已存在的转录本仍会对检测结果产生显著贡献。我们认为，scSLAM-seq区分损伤前RNA与损伤后新转录RNA的能力，能够提高信噪比并消除个体间的固有差异。因此，我们将实验体系适配至单细胞水平（详见“方法”部分），并聚焦于冷冻损伤后最初6小时内的早期应答：损伤后新转录的mRNA分子会被标记，而损伤前心脏中存在的mRNA则保持未标记状态。

为了进行scSLAM-seq，我们注射了4sU，并在注射后一小时对心脏进行假伤或冷冻损伤。假控制至关重要，因为我们不能排除IT注射本身也可能引发（可能较弱的）损伤样反应。分别在假伤（hps）或6 hpci后6小时取样心脏，解离，细胞接受我们的scSLAM-seq 10X方案（图2a，补充数据1，见“方法”）。我们的scSLAM-seq样本的数据质量与scRNA-seq数据相当，每个细胞的平均UMI计数相似，每个细胞检测到的基因数量也相当，尽管在分布范围上接近低端（补充数据3）。我们发现基于标记和未标记mRNA总和的聚类解决了所有主要细胞类型，证实了数据的质量（图2b，c）。仅基于标记或未标记的转录本的聚类导致了一致的结果，表明两个时间点都有足够数量的转录组信息（补充图3a）。此外，我们能够检测到心脏所有细胞类型的标记（图2d，补充图3b），表明4sU有效地扩散到整个心脏。这一观察符合IP注射斑马鱼的批量SLAM-seq，以及以前的发现，即注射后，可以在斑马鱼的许多不同器官中检测到标记，这表明4sU甚至可能通过血脑屏障（补充图3c）。我们进一步观察到大约20-25%的被标记的转录本，即包含至少一个T-to-C转换，这与以前使用SLAM-seq测量细胞培养中扰动反应的研究一致（补充图3d）28。考虑到我们观察到的转化率和平均每次读取50个胸腺嘧啶，一个简化的估计近似于大约15%的漏放率（数学补充）。

接下来，我们着手构建一个用于测定损伤反应的数学模型。该模型采用了假手术组和冷冻损伤样本的相同实验设置（即稳态下注射4sU且标记时间一致），并在损伤速率不随损伤变化这一简化假设下运行（数学补充材料）。在该模型中，损伤反应通过计算损伤后6小时的标记RNA与损伤前6小时的标记RNA的比值来确定（图2e，数学补充材料）。基于模型的假设，我们对损伤反应的测定既不依赖mRNA降解速率，也不受预先存在的未标记mRNA的影响。尽管该模型与此前发表的方法类似，但我们通过加入背景模型对其进行了进一步拓展，该背景模型考虑了scSLAM-seq特有的噪声特性（数学补充材料）。分析结果显示，巨噬细胞样细胞通过上调与促炎性先天免疫反应通路相关的KEGG术语，表现出特异性反应，这些通路包括Toll样受体、C型凝集素受体（CLR）和NOD样受体（NLR）信号通路（图2f左图、补充图4a、b、补充数据4）。尽管此前已有研究报道髓样细胞的浸润或激活出现在较晚时间点，但我们的研究首次为其在损伤后最初阶段的从头转录激活提供了直接证据。利用我们新的RNA检测技术，在冷冻损伤后6小时¹⁰ˏ¹⁸。在所有细胞中在这些类型中，我们观察到了一种通用的反应，这可能反映了对细胞应激的反应。这种反应也可能部分源于死亡心肌细胞的环境RNA污染，心肌细胞通常是心脏解离过程中最脆弱的细胞类型（补充数据4）。有趣的是，在没有SLAM信息的情况下对相同数据运行模型，或对转录组进行标准差异基因表达分析时，我们无法在巨噬细胞样细胞中检测到这种特定反应（图2f右侧面板，补充数据5）。这一点表明，RNA标记信息提高了识别扰动后损伤反应基因的灵敏度。我们进一步通过确认这些结果未受单核苷酸变异（SNVs）或测序伪影等因素导致的假阳性影响，验证了研究结果的稳健性（补充图5a–c）。

图2.代表5个生物学重复样本混合后的一次10X测序运行，6 hpci代表图2 | scSLAM-seq揭示冷冻损伤后最早的转录状态变化。b 6小时后（左）和6小时冷冻损伤后（右）scSLAM-seq数据的UMAP图。a scSLAM-seq实验流程示意图。图由BioRender.com制作。6 hps代表5个生物学重复样本混合后的一次10X测序运行。c 6小时后（左）和6小时冷冻损伤后（右）scSLAM-seq数据中细胞类型特异性标记基因表达的点图。d 6小时后（左）和6小时冷冻损伤后（右）数据集中按细胞类型划分的每个基因的T-to-C转换率。e scSLAM-seq分析流程示意图。图由BioRender.com制作。f 利用SLAM信息（左）和不利用SLAM信息（即包含标记和未标记RNA的转录组，右）的巨噬样细胞中损伤响应基因的上调KEGG条目。图a部分由BioRender制作。Mintcheva, J. (2026) https://BioRender.com/ 5023n5v。

图3.(n=10)（3个dpci）、(n=10)（7个dpci）、(n=5(30 dpci))。图由BioRender.com制作。使用g:Profiler进行GO术语富集分析（超几何检验，单侧，g:SCS多重检验校正）。图（a）部分由BioRender制作。Mintcheva, J.（2026）。巨噬细胞样（即巨噬细胞和单核细胞）细胞和中性粒细胞的亚聚类分析。图3：对再生斑马鱼心脏的scRNA-seq图谱进行cNMF分析，识别出损伤响应性基因表达程序（GEP4）。a 心脏巨噬细胞样细胞（巨噬细胞和单核细胞）、中性粒细胞、树突状细胞的示意图。b 心脏scRNA-seq图谱的UMAP降维图。c 髓系细胞中示例性标记基因的点图。d 髓系细胞亚群的UMAP降维图，包含各自的样本量。样本量：(n=7)（未损伤）、(n=6)（6小时损伤后）、(n=6)（1天损伤后）。e 损伤响应性基因表达程序的cNMF使用情况。f 损伤响应性GEP中上调的KEGG术语。再生特征和scRNA-seq的采样时间点，以及嗜酸性粒细胞。输入：z分数>平均值+2倍标准差的基因。

我们接下来研究了损伤响应基因的半衰期。我们发现，巨噬细胞样细胞中损伤响应基因的半衰期仅略短于非损伤响应基因。然而，对比氧化磷酸化、核糖体以及Toll样受体/核苷酸结合寡聚化结构域样受体/C型凝集素受体通路等所有上调通路中基因的半衰期，结果显示促炎通路中基因的半衰期明显短于核糖体通路中的基因（补充图5d、e）。

值得注意的是，尽管我们的研究结果在很大程度上具有可重复性，但我们也观察到重复实验之间存在微小差异（补充图6、补充数据6）。具体而言，在一次重复实验中，我们还观察到中性粒细胞通过上调CLR和NLR通路表现出促炎反应（补充图6b），这表明要么是生物样本间存在个体差异，要么是细胞数量相对较少造成的影响（例如，图2和补充图6中6小时后时间点的数据集里，中性粒细胞数量分别仅为116个和187个）。综上，我们的研究结果表明，scSLAM-seq是解析短期扰动反应的有力工具，且巨噬样细胞在转录水平上是冷冻损伤最早的反应细胞之一，其会上调先天免疫反应通路。

损伤响应基因表达程序的特征是部分巨噬细胞样细胞中的TLR信号通路活性。为进一步研究和表征巨噬细胞样细胞中损伤响应细胞状态，我们利用了一项大型已发表的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据再生斑马鱼心脏图谱，我们通过补充6小时心脏损伤后（hpci）和24小时心脏损伤后（hpci）等早期时间点的数据对其进行了扩展（预处理和过滤后共获得约185,000个细胞，其中髓系亚群包含超过22,000个细胞，见图3a、b，补充数据1、3，以及编号为9879c2-2048-4e9b-88df-51ea33fa1e2e的补充信息）。具体而言，我们假设更多的细胞数量将使我们能够识别出损伤响应性巨噬细胞的特定亚型，以及其他在单细胞测序转录组动态标记（scSLAM-seq）数据中因细胞数量较少而无法检测到的、参与损伤应答通路激活的细胞类型。在髓系细胞中，我们检测到13个巨噬细胞样细胞簇（由巨噬细胞和单核细胞组成），其中包括具有促炎活性的亚型，这表明巨噬细胞存在显著的功能异质性（见图3c、d，补充数据7）。接下来，我们旨在进一步解析这种异质性，并将其与图2中鉴定的损伤应答通路激活关联起来。为此，我们对髓系亚群进行了一致性非负矩阵分解（cNMF，编号(CNMF{+0}）分析，以鉴定基因表达程序（GEP）（补充图7，补充数据8）。与常规非负矩阵分解相比，cNMF增加了一步荟萃分析步骤，即对多次非负矩阵分解（NMF）重复实验结果取平均值以提升结果的可靠性。值得注意的是，在总共17个基因表达程序中，我们发现其中一个基因表达程序（GEP4）与单细胞测序转录组动态标记（scSLAM-seq）分析中鉴定的促炎型损伤响应状态高度相似，这与我们的单细胞测序转录组动态标记（scSLAM-seq）结果一致（见图3e、f）。需要指出的是，损伤响应性基因表达程序的核心基因中，仅有10%与单细胞测序转录组动态标记（scSLAM-seq）分析中的核心基因存在重叠（补充图8）。然而，这种低重叠度高于与其他GEP的重叠度，且由于两种方法之间存在根本性的概念差异（例如，cNMF还能检测到冷冻损伤前的变异来源），这一结果并不意外。重要的是，对重叠基因的GO术语分析显示，这些基因参与先天免疫反应通路，而非重叠基因则参与其他过程（补充图8）。为进一步探究基于scSLAM-seq的损伤反应与损伤反应性GEP的相似性，我们对髓样亚簇、整个心脏图谱和scSLAM-seq数据集中的交集基因进行了评分（补充图9）。巨噬样细胞和中性粒细胞在6小时冷冻损伤后均表现出最高的模块评分，且上调程度最高。进一步观察损伤反应性GEP发现，该状态主要存在于促炎巨噬样细胞（il1b）簇和中性粒细胞中，在其他簇中也有一定程度的存在（图3d、e）。

原则上，GEP的激活可在两个层面发生：要么是表达该程序的细胞数量增加，要么是已在使用该程序的细胞中程序的表达水平升高。本研究发现，使用损伤响应性GEP的细胞比例呈上升趋势，同时也有证据表明，与未受伤的心脏相比，在6小时后（hpci）使用该程序的巨噬细胞样细胞中，该GEP的表达水平有所升高（图4a、b）。为了更细致地了解巨噬细胞样细胞状态的差异丰度，我们使用miloR41进行了差异丰度检测。这一统计框架可识别数据集中的邻域，并在这些邻域内对不同条件下的细胞丰度进行差异检测。相较于离散的细胞簇，使用邻域分析的miloR能更准确地定位巨噬细胞样细胞激活这类存在连续状态转变的数据集中的受扰动状态。通过这一方法，我们证实，与未受伤的心脏相比，主要由使用损伤响应性GEP的细胞构成的邻域在6小时后（hpci）呈现出正差异丰度（图4c）。当根据图3d中鉴定的细胞簇而非损伤响应性GEP的使用情况对邻域进行注释时，我们发现巨噬细胞样（il1b）细胞簇呈现轻微的正差异丰度，而巨噬细胞样（mmp13/cxcl8b）细胞簇对应的邻域则呈现强烈的正差异丰度（图4d）。然而，在巨噬细胞样（mmp13/cxcl8b）细胞簇的前50个标记基因中，我们在单细胞SLAM测序（scSLAM-seq）分析的损伤响应基因中仅检测到9个；相比之下，巨噬细胞样（il1b）细胞簇的前50个标记基因中有27个被检测到。这一结果表明，巨噬细胞样（mmp13/cxcl8b）细胞簇的细胞可能是浸润至心脏的，而非在转录水平对损伤产生响应。

接下来，我们着手鉴定巨噬细胞样细胞中损伤响应性GEP的转录驱动因子。为此，我们绘制了基因组的累积表达图谱。我们将TLR、NLR和CLR通路作为主要候选通路，同时还将其细分为通路层级：受体基因为第一层，胞内结构域和首个下游信号分子为第二层，作为通路活性响应转录产物的分子为效应层（图4e，补充数据9）。在这三条先天免疫反应通路中，我们发现TLR通路是作为损伤响应性GEP功能验证替代指标的最具潜力候选通路，因为在6小时心肌损伤后，其在GEP中的表达显著上调（图4f，补充图10）。在分析单细胞RNA测序心脏图谱中鉴定出的所有细胞类型的TLR通路时，我们还发现中性粒细胞呈现出极强的响应，血管内皮细胞和心内膜的响应程度则相对较弱（图4g，补充图11）。我们推测，由于单细胞测序标记转录组数据集中性粒细胞和血管内皮细胞的数量极少，导致在RNA标记实验数据中未能检测到这两种细胞的TLR通路响应，这一低细胞丰度很可能造成了更强的与数百个细胞的细胞类型相比，噪声效应更小。总之，这些分析表明，损伤响应性细胞状态具有促炎特性，且在冷冻损伤后立即，其表达强度和巨噬细胞样细胞数量均有所扩增。此外，TLR信号通路是6小时冷冻损伤后损伤响应性基因表达程序中上调最显著的通路，因此是功能验证的理想候选对象。

由于损伤反应通路的激活速度极快，我们希望排除它们部分由细胞解离（单细胞RNA测序中的必要步骤）激活的可能性。具体而言，我们担心组织解离可能触发类似损伤的反应。此外，我们还旨在探究通过单细胞SLAM测序和单细胞RNA测序检测到的通路激活的空间调控规律。因此，我们开展了杂交链反应（HCR）实验，以mfap4.1作为巨噬细胞样细胞标志物，以il1b作为损伤响应基因表达程序的替代指标，因为il1b是该基因表达程序中上调程度最高的基因之一。我们在6小时 post-injury（损伤后6小时）的冷冻切片中通过杂交链反应检测到，在大量mfap4.1阳性细胞中存在共表达现象（图4h、补充图12a）。有趣的是，在损伤后6小时，il1b阳性的mfap4.1巨噬细胞样细胞并未在损伤区域表现出明显的定位，但在损伤后1天和3天可观察到这一现象（图4h、补充图12b）。由此我们推测，巨噬细胞样细胞可能仅在后续才定位于损伤区域。这些发现通过正交方法验证了促炎型损伤响应细胞状态的存在，并表明促炎型巨噬细胞样细胞以及巨噬细胞样细胞整体，仅在损伤后6小时才会定位于损伤区域。

巨噬细胞中TLR信号通路的扰动会导致再生特征失调

接下来，我们希望探究这些被激活的促炎性巨噬细胞样细胞的功能作用，并且我们还专门旨在评估TLR信号通路在损伤早期反应以及后续再生级联反应中的作用。髓样分化初级反应88（MyD88）是先天免疫系统中TLRs下游的关键因子42。因此，MyD88是研究TLR信号传导作用的理想靶点。我们首先对Goumenaki等人发表的一项关于myd88-/-斑马鱼心脏冷冻损伤的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集进行了重新分析15，该研究中所有细胞的TLR信号传导均严重减弱（图5a）。为了结合本研究的背景解读这些数据，我们利用标签转移技术（参见“方法”部分）将本研究数据中的细胞簇名称分配到已发表的数据集（补充图13a）。我们将分析重点放在被归为巨噬细胞样细胞（il1b）簇的细胞上，因为损伤响应性基因表达程序（GEP）的激活在该细胞簇中最为显著。我们发现，在心脏损伤后24小时（hpci），被归为巨噬细胞样细胞（il1b）簇的髓样细胞在myd88-/-斑马鱼体内大量耗竭（图5b，补充图13b）。此外，我们观察到MyD88敲除细胞中TLR效应分子的表达急剧下降（补充图13c）。这一结果表明，干扰TLR通路会在很大程度上消除损伤响应性细胞状态。在表型层面，Goumenaki等人的研究表明，MyD88的缺失会导致斑马鱼心脏再生不完全，且再生特征出现失调；他们还证实，仅在myd88-/-斑马鱼的内皮细胞中重新表达MyD88，就能挽救部分再生缺陷。这些数据进一步说明，内皮细胞参与了心脏损伤后的早期转录反应。

相比之下，利用魏等人发表的另一项数据集16，我们发现注射氯膦酸脂质体后，巨噬细胞中巨噬细胞样（il1b）细胞群的丰度增加，这一过程会延迟巨噬细胞的募集（补充图13d-f）。该观察结果表明，延迟巨噬细胞募集会在伤后1天和3天引发促炎反应的过度激活，而正如魏等人所报道的，这会导致心脏再生受损。综合来看，对这些已发表数据集的重新分析显示，整体促炎信号的增强与减弱均对心脏再生产生不利影响，这表明促炎信号的精准平衡对于成功实现再生至关重要。

图4.表达，白色箭头头：仅显示 mfap4.1 表达的细胞。左侧：图块 (p=0.9923) b 损伤响应性基因表达程序在巨噬细胞样细胞中的使用情况（使用比例≥10%）。红色邻域：显著的正差异丰度，绿色 图4 | 损伤响应性基因表达程序的表征。 巨噬细胞样细胞中转录组百分比层面1，按时间点划分，通过  按使用情况分组的髓样亚簇邻域。红色邻域：显著的正差异丰度，绿色  巨噬细胞样细胞中使用损伤响应性基因表达程序的比例（临界值：10%）与未受伤心脏，通过 miloR 鉴定。邻域按髓样亚簇的使用情况分组。红色邻域：显著的正差异丰度，绿色邻域：显著的负差异丰度。  每个重复中使用该基因表达程序的细胞比例，紫色柱代表重复间的平均值±标准差。统计检验：双尾方差分析，采用邓尼特事后检验，将对照组与每个时间点进行比较。P值： e 通路层级的示意图。 f TLR 层面1和2的平均表达值±标准误，占心脏图谱所选细胞类型转录组的百分比。 h 6小时 post-injury（损伤后）心脏的杂交链式反应（HCR），使用 DAPI 以及针对 mfap4.1 和 il1b 的探针。品红色箭头头：同时显示 mfap4.1 和 il1b 表达的细胞  混合效应模型，随后对对照组与每个时间点进行事后比较。经邦弗尼尼多重检验校正的双尾P值。P值：6 hpci (p=0.0025) .1dpci (p=0.505 ,) 3 dpci (p=1.00) .7 dpci (p=0.745,30) (dpci =1.00) c 6小时 post-injury（损伤后）与未受伤心脏的差异丰度，通过 miloR 鉴定。邻域按损伤响应性基因表达程序的使用情况分组（临界值：使用比例>10%）。箱线图表示中位数和四分位距（25%–75%分位数），须线延伸至1.5倍四分位距。统计检验：线性  6小时 post-injury（损伤后）心脏切片的全景图，比例尺：100微米，虚线方框表示右侧放大区域，虚线表示损伤区域。右侧：指定区域的z-stack最大强度投影示例，比例尺：10微米。

图5. 冷冻损伤的dn - myd88转基因斑马鱼心脏切片中，巨噬细胞特异性过表达（品红色）对TLR信号通路的干扰及Mfap4（黄色）免疫染色。a 基于已发表注释，对3天和7天冷冻损伤（dpci）后TgKI(mpeg1:CreERT2);Tg(hsp:LSL-DN-MyD88)斑马鱼的(myd88)和(myd88)心脏样本髓样亚群的UMAP分析。b 将心脏图谱髓样数据的标签转移至Goumenaki等人的数据结果，按野生型（m y d 88{++})和(I11b {+} Mfap4 {+}）和敲除型（myd88-/-，ko）划分，显示每种条件下分配到本研究数据聚类中的细胞比例。黑色箭头指向分配至巨噬细胞样细胞（il1b）的比例。c 巨噬细胞特异性、可诱导表达DN-MyD88的转基因系示意图。该图由BioRender.com制作。d 巨噬细胞特异性过表达DN-MyD88的实验流程。他莫昔芬（TAM）或乙醇（EtOH）腹腔注射作为载体对照。温度计图标表示热休克，雪花图标表示冷冻损伤，放大镜图标表示采样时间点。e 3天冷冻损伤（dpci）后载体处理心脏和TAM处理心脏的Il1b免疫染色代表性图像；7天冷冻损伤（dpci）后载体处理心脏和TAM处理心脏的Il1b免疫染色代表性图像。白色虚线勾勒损伤区域。比例尺：100 µm。f 图e中白色方框区域的放大视图。箭头指向损伤区域内促炎巨噬细胞（Il1b+ Mfap4+）。比例尺：10 µm。g 3天冷冻损伤（dpci）后载体处理心脏和TAM处理心脏损伤区域的Mfap4+细胞密度和Il1b+细胞密度定量分析；7天冷冻损伤（dpci）后载体处理心脏和TAM处理心脏损伤区域的Mfap4+细胞密度和Il1b+细胞密度定量分析。每个点代表单个心室；数据以平均值±标准差表示；统计检验：双侧t检验。图c和图d部分由BioRender制作。Mintcheva, J. (2026) https://BioRender.com/dwj9s3i

图6.显性负效MyD88转基因在巨噬细胞中特异性过表达对血管再生的影响。a 经溶剂或他莫昔芬（TAM）处理的3天和7天损伤后（dpci）TgKI(mpeg1:CreERT2);Tg(hsp:LSL-DN-MyD88)斑马鱼损伤区域冠状动脉内皮细胞（cEC）增殖的代表性免疫染色图像及定量分析。白色虚线勾勒出损伤区域。红框区域的放大视图显示在中间面板。红色箭头指向增殖的冠状动脉内皮细胞（Fli1⁺PCNA⁺，ID：b3c0c3f-5dfc-4070-a6d2-3189b9d2711d），在损伤区域和边界区域的心外膜区域（白色虚线标注）对其进行了定量：3天损伤后（dpci），溶剂对照组和他莫昔芬处理组均统计了ID：(n=8)的样本；7天损伤后（dpci），溶剂处理心脏统计了ID：(n=13)的样本，他莫昔芬处理心脏统计了ID：(n=12 )TAM)的样本。比例尺：100微米和10微米（放大图像）。b 经溶剂或他莫昔芬（TAM）处理的7天损伤后（dpci）TgKI(mpeg1:CreERT2);Tg(hsp:LSL-DN-MyD88);Tg(−0.8flt1:RFP)斑马鱼冠状动脉覆盖的整体原位图像及定量分析。白色虚线勾勒出损伤区域。对损伤区域表面再生冠状动脉（RFP⁺）的覆盖面积进行了定量：溶剂处理心脏统计了ID：(n=6)的样本，他莫昔芬处理心脏统计了ID：(n=7)的样本。损伤区域为心脏心尖处及附近无自发荧光的暗区。比例尺：500微米。本图所有柱状图中，圆点代表单个心室，柱形代表平均值±标准差；统计检验：双侧t检验。

基于这些观察结果，我们提出假设：特异性抑制巨噬细胞中的TLR信号通路应能改善再生效果。由于内皮细胞功能正常，TLR信号通路的早期效应（如中性粒细胞募集）应不受影响，但伤后1-3天促炎信号通路的减弱可能会产生有益作用。为实验验证这一假设，我们利用斑马鱼品系Tg(mpeg1.1-2A-creERT2,gcry1:NLS-EGFP)as602；Tg(hsp70l:loxpTagBFP-loxp-DN-myd88-t2A-mCherry)bns711构建了可诱导的巨噬细胞特异性显性负效MyD88（DN-MyD88）过表达模型，下文简称为TgKI(mpeg1:CreERT2);Tg(hsp:LSL-DN-MyD88)（图5c）。该HOTcre模型43可在他莫昔芬（TAM）处理后，仅在巨噬细胞中通过热休克诱导表达DNMyD88（图5c）。我们首先在幼鱼中验证该模型，确实观察到TAM处理后其巨噬细胞成功发生重组（补充图14）。随后我们对成年斑马鱼心脏开展实验，同样发现伤后3天经TAM处理后，其巨噬细胞成功发生重组，且通过RT-qPCR检测到myd88显性负效形式的表达（补充图15、补充数据10）。接下来，我们着手探究冷冻损伤后巨噬细胞特异性表达DN-MyD88是否会影响成年斑马鱼心脏再生的特征。为诱导重组，我们在冷冻损伤前3天和2天对斑马鱼腹腔注射TAM，或注射25%乙醇作为载体对照。从冷冻损伤前1天开始，除损伤当天外，我们每天对斑马鱼进行一次热休克处理，直至伤后6天，以减少对实验动物的应激（图5d）。该处理方式使伤后3天和7天，损伤区域内Mfap4+细胞密度以及Mfap4+Il1b+细胞密度均显著降低，表明巨噬细胞特异性过表达DN-MyD88可减少损伤区域的促炎巨噬细胞（图5e-g）。

为探究对再生过程的影响，我们首先通过对 Fli1a 和 PCNA 进行免疫染色，量化了冠状动脉内皮细胞（cEC）的增殖情况。我们观察到，在 3 天损伤后（dpci），冠状动脉内皮细胞的增殖显著增加，而在 7 天损伤后，其增殖比例与对照组样本相当（图 6a）。我们还发现，在 7 天损伤后，经他莫昔芬（TAM）处理的斑马鱼体内冠状动脉血管的覆盖范围有所增加（图 6b）。使用分别标记心肌细胞和去分化心肌细胞的 Mef2 与 N2.261 抗体进行免疫染色的结果显示，在 3 天或 7 天损伤后，心肌细胞的去分化情况并无差异（图 7a）。然而，通过对 Mef2 和 PCNA 进行免疫染色，我们观察到在 7 天损伤后，经他莫昔芬处理的斑马鱼体内心肌细胞增殖显著增加（图 7b）。值得注意的是，尽管在 7 天或 30 天损伤后，纤维蛋白或胶原蛋白的沉积未出现显著差异，但我们在 14 天损伤后观察到纤维蛋白沉积明显减少（图 7c、补充图 16）。这些研究结果表明，巨噬细胞特异性显性负性 MyD88（DN-MyD88）过表达改善了斑马鱼心脏再生的多个特征；且鉴于 14 天损伤后纤维蛋白沉积减少，部分再生事件似乎以稍快的速度发生。不过，在损伤后各时间点，整体再生结果（以补充图 16d 中的瘢痕面积衡量）似乎未受到显著影响，这凸显了成功实现心脏再生的多因素特性。

讨论

本研究建立了成年斑马鱼心脏体内单细胞RNA代谢标记技术，并证实scSLAM-seq能够在损伤后的特定时间窗口内，对体内新生转录过程进行时间分辨的检测。通过将每个细胞中各基因的新转录RNA与已存在的RNA区分开来，该方法提高了对急性转录激活的检测灵敏度，还能将真实的激活事件与细胞组成变化（如免疫细胞的募集或浸润）区分开来——这在流动性极高的免疫细胞群体中是一项关键的区分手段。在心脏冷冻损伤后的最初6小时内应用scSLAM-seq技术，我们检测到先天免疫程序的快速诱导，包括Toll样受体信号通路和促炎效应分子，在巨噬细胞样细胞亚群中表达，这表明早期髓系转录激活是即时损伤反应的重要组成部分。对大型单细胞RNA测序图谱的补充分析进一步显示，中性粒细胞也会启动强烈的早期先天免疫反应，而内皮和心外膜细胞群则表现出较为温和的激活，这与多谱系早期反应一致——在该反应中，巨噬细胞样细胞（与中性粒细胞一起）是转录水平上最早且激活程度最高的细胞群之一。

图7. 显性负效MyD88转基因在巨噬细胞特异性过表达对心脏再生的影响。a 经载体或他莫昔芬（TAM）处理的3天和7天心脏切除后再生（dpci）TgKI(mpeg1:CreERT2);Tg(hsp:LSL-DN-MyD88)斑马鱼中心肌细胞去分化的代表性免疫染色图像及定量分析。白色虚线勾勒出100微米边界区域。中间图为红色框区域的放大视图。红色箭头指向边界区域内正在去分化的心肌细胞（Mef2+ N2.261+），并对其进行定量；3 dpci时（载体对照组和TAM处理组均为）n = (n=7)；7 dpci时载体处理组心脏n =(n=13)，TAM处理组心脏n = 12。比例尺：100微米，放大图像为10微米。b 经载体或TAM处理的3天和7 dpci TgKI(mpeg1:CreERT2);Tg(hsp:LSL-DN-MyD88)斑马鱼中心肌细胞增殖的代表性免疫染色图像及定量分析。白色虚线勾勒出100微米边界区域。中间图为红色框区域的放大视图。红色箭头指向边界区域内正在增殖的心肌细胞（Mef2+ PCNA+），并对其进行定量；3 dpci时载体处理组心脏n = (n=6)，TAM处理组心脏n = (n=8)；7 dpci时载体处理组心脏n = (n=13)，处理组心脏n = (n=12 TAM)。比例尺：100微米，放大图像为10微米。c 经载体或TAM处理的14 dpci TgKI(mpeg1:CreERT2);Tg(hsp:LSL-DN-MyD88)斑马鱼的代表性AFOG染色图像及瘢痕沉积定量分析。黑色虚线勾勒出瘢痕区域。对瘢痕区域中纤维蛋白（红色）和胶原蛋白（蓝色）沉积比例进行定量；载体处理组心脏n = 10，TAM处理组心脏n = 8。比例尺：200微米。本图所有柱状图中，圆点代表单个心室，柱形代表平均值±标准差；统计检验：双侧Student t检验。

先前的研究表明，解除促炎信号通路或早期巨噬细胞反应的调控对心脏再生有害，而心脏损伤后调控促炎信号通路的整体重要性已得到充分证实。基于我们的时间分辨数据以及重新通过对既往发表数据集的分析，我们对巨噬细胞中的TLR衔接蛋白MyD88进行了特异性抑制，这一操作减弱了促炎性巨噬细胞反应，并改善了再生的多个早期特征，为早期先天免疫信号的强度和时机可被调控以塑造再生级联信号这一观点提供了支持。基于这一理念，我们的研究结果可能为哺乳动物心脏再生研究带来转化潜力。结合我们的数据，探究巨噬细胞特异性的促炎反应精细调控是否能提升成年小鼠的再生效果，将是一项有趣的研究方向。

虽然我们的研究聚焦于成年斑马鱼心脏的损伤反应，但我们的方法应具有广泛适用性，例如也可用于提高类器官药物筛选中的信噪比。因此，我们的研究证明，对单细胞进行时间分辨分析水平是构建预测模型以及开展靶向干预以优化再生效果的前提条件。

方法

斑马鱼的饲养、处理及伦理声明

本研究的所有操作均遵守适用的伦理准则。斑马鱼的繁育、饲养和维持遵循了欧洲实验动物协会联合会（FELASA）指南，以及马克斯·德尔布吕克分子医学中心、马克斯·普朗克学会以及相关地方动物福利主管部门（德国柏林健康与社会局、德国达姆施塔特地区委员会兽医处、德国卡尔斯鲁厄州政府）的方案，对应的方案编号分别为 G0052/20、B2/2036 和 359185.81/G-31/23。这些操作符合德国现行的动物保护法规以及欧盟关于动物用于科学研究的 2010/63/EU 指令。此外，饲养和繁育标准也符合国际《实验动物护理原则》（美国国立卫生研究院出版物第 86-23 号，1985 年修订版）。

斑马鱼品系

本研究使用的野生型和转基因品系如下：AB品系、Tg(−0.8flt1:RFP)hu5333品系、Tg(mpeg1.1-2A-creERT2,gcry1:NLS-EGFP)as602品系（本研究构建）、Tg(hsp70l:loxp-TagBFP-loxp-DN-myd88-t2A-mCherry)bns711品系（本研究构建）、Tg(mpeg1:eGFP)gl22品系、Tg(mfap4:mTurquoise)tud30244,45品系（由Nikolai Ninov实验室惠赠）、[Tg(ubi:Cas9;U6:sgRNA-RFP)]/Tg(Zebrabow)品系32。

斑马鱼转基因品系的构建

序列信息从Ensembl数据库（https://www.ensembl.org/index.html）（GRCz11）下载，并通过SnapGene软件进行进一步编辑与分析。为构建Tg(hsp70l:loxpTagBFP-loxp-DN-myd88-t2A-mCherry)bns711品系（下文简称Tg(hsp:LSL-DN-MyD88)），对先前报道的hsp70l:loxP-TagBFPloxP-il11ra-t2a-mCherry表达载体进行了修饰⁴⁶。克隆myd88的TIR结构域编码序列，随后用其替换载体中的il11ra编码序列。克隆实验采用In-Fusion HD Cloning Kit完成。将10皮克纯化后的表达载体与25皮克tol2信使核糖核酸（mRNA）共同显微注射至斑马鱼单细胞期野生型（WT）胚胎中。胚胎经热激后筛选TagBFP表达阳性个体，培育至成体后进行首建子鉴定。为验证表达载体，向单细胞期Tg(hsp:LSL-DN-MyD88)胚胎注射12.5皮克cre信使核糖核酸（mRNA）。注射cre mRNA的胚胎经热激处理后，通过检测mCherry荧光验证重组反应是否发生。

敲入品系Tg(mpeg1.1-2A-creERT2,gcry1:NLS-EGFP)as602（以下简称TgKI(mpeg1:CreERT2)）是采用GeneWeld CRISPR/Cas9短同源定向靶向整合技术构建的，该方法与此前构建内源性Cre和CreERT2驱动因子的方法一致47,48。通过CRISPR/Cas9系统及向导RNA 5'-TTATGAGAGTAGTTGTTGATTGG-3'（PAM序列下划线标注），将表达盒以框内融合的方式整合至mpeg1.1编码序列的3'端。首先将对应CRISPR切割位点侧翼基因组序列的48个碱基对的5'和3'同源臂，分别克隆至载体pPRISM-2A-Cre;gcry1:NLS-EGFP（Addgene#117791）的BfuAI和BspQI限制性内切酶位点中。为实现他莫昔芬诱导的Cre活性，利用NEB高保真DNA组装技术（NEB #E2621S），将该载体中的cre编码序列替换为来自pENTR_D_CreERT2（Addgene #27321）的creERT2序列，构建得到载体pPRISM-2A-creERT2;gcry1:NLS-EGFP。

心脏冷冻损伤、热休克处理、他莫昔芬处理

斑马鱼的冷冻损伤操作按照之前发表的方案49进行。斑马鱼先在系统水中的Tricaine（Pharmaq有限公司）中预镇静。斑马鱼镇静后，将其放置在浸泡有镇静水箱水的海绵上，腹侧朝上向上。随后通过在皮肤和心包上做一个小的水平和垂直切口暴露心脏。通过轻轻按压腹部进一步暴露心室。为了对心室造成冷冻损伤，将液氮预冷的冷冻探针应用于心室尖部。冷冻损伤成功后，将斑马鱼放入装有系统水且含1.5毫克/升硫酸吗啡（瑞替制药）的养殖箱中。斑马鱼在添加吗啡的系统水中饲养6小时，之后被放回配备系统水的斑马鱼养殖设施。由于当地不同的伦理规定，在显性负向MyD88过表达相关实验中进行的冷冻损伤操作未使用吗啡处理。

对于TgKI(mpeg1:CreERT2);Tg(hsp:LSL-DN-MyD88)斑马鱼的巨噬细胞特异性重组，在冷冻损伤前3天和2天，向成鱼腹腔注射10微升1他莫昔芬（Sigma H7904），或注射等体积的25%乙醇-磷酸盐缓冲液作为对照。

通过将胚胎或成年斑马鱼置于预热的卵水或系统水（39摄氏度）中孵育1小时来进行热激处理。根据相应的实验方案，进行了多次热激处理。

用于SLAM-seq的4sU处理

在进行SLAM-seq实验时，对斑马鱼进行了腹腔注射或按已发表的方案经胸内注射50,51。简要而言，斑马鱼用MS-222进行麻醉，然后向其腹腔注射25微升或胸腔注射5微升的4-硫代尿苷（4sU，Sigma-Aldrich公司）、磷酸盐缓冲液（PBS）与异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（Life Technologies公司）的混合液。由于4-硫代尿苷是一种光敏试剂，需在避光条件下解剖心脏并进行处理，直至完成碘乙酰胺（Sigma-Aldrich公司）处理。通过观察强烈的异硫氰酸荧光素信号来确认注射是否成功。

批量SLAM-seq时间进程

为获取不同标记时间的时间进程，斑马鱼经三卡因麻醉后，经腹腔注射5微升200毫摩尔4-硫代尿苷（溶于磷酸盐缓冲液）与荧光素异硫氰酸酯右旋糖酐，随后放回装有新鲜养殖水的养殖箱。在4-硫代尿苷注射后的30分钟、1小时、3小时、6小时、12小时和24小时采集心脏样本，每个时间点设置生物学重复，随即在TRIzol试剂中匀浆，用于RNA提取和文库构建。对于0小时时间点，我们使用了三只未注射的斑马鱼的心脏。

批量SLAM-seq文库制备

对于批量SLAM-seq实验，经4sU处理的斑马鱼心脏被解剖，并在装有陶瓷磁珠和TRIzol试剂（赛默飞世尔科技英潍捷基公司）的管中进行匀浆。随后提取RNA，并采用改良的CEL-seq方案构建文库，具体步骤如先前文献34所述。简要而言，RNA经氯仿提取后用异丙醇沉淀。将RNA重悬于无RNase的水中，通过与碘乙酰胺孵育，将提取的RNA中掺入的4sU进行转化27。用二硫苏糖醇（德国AppliChem公司）终止衍生化反应，再进行第二次RNA提取以去除过量的二硫苏糖醇。接下来，使用带条形码的引物（“样本条形码”）进行逆转录生成cDNA，随后进行第二链合成。使用磁珠（美国贝克曼库尔特公司）对cDNA进行纯化，再通过体外转录步骤合成反义RNA（aRNA）。用核酸外切酶I（美国新英格兰生物实验室公司）和碱性磷酸酶（美国新英格兰生物实验室公司）处理去除残留引物。随后对反义RNA进行片段化处理，并用磁珠纯化。对片段化的反义RNA进行第二次逆转录，再使用带索引引物（“索引条形码”）进行文库PCR扩增。通过Qbit荧光定量仪（赛默飞世尔科技英潍捷基公司）对文库进行定量，并使用TapeStation生物分析仪（美国安捷伦科技公司）验证片段分布。在该文库布局中，转录本序列位于Read1，样本条形码和短唯一分子标识符（UMI）位于Read2。

对于我们的SLAM-seq时间进程实验，我们对上述方案进行了轻微修改，以支持基于UMI的分析。因此用于第一轮逆转录的修饰引物额外包含一段22个核苷酸（nt）长的唯一分子标识符（UMI）和一段6个核苷酸的样本标签。在该文库布局中，样本条形码和唯一分子标识符（UMI）位于读长1（Read1）上，转录本序列位于读长2（Read2）上（补充数据11）。

文库在 Illumina NextSeq500 或 NovaSeq6000 平台上进行测序。

斑马鱼心脏解离

将斑马鱼心脏解剖后，在添加了100毫摩尔氯化钾（卡尔·罗思公司）和60毫克/毫升肝素（西格玛-奥德里奇公司）的冰磷酸盐缓冲液（生命技术公司）中进行灌流。随后按照已发表的方案8对心脏进行解离。简要步骤如下：将心脏置于装有500微升汉克斯平衡盐溶液（吉布科公司）的试管中，该溶液添加了0.001%的普鲁尼克-F68（吉布科公司）和0.9单位/毫升的离解酶（罗氏公司）；将试管放入艾本德恒温混匀仪F1.5中，在37摄氏度、750转/分钟的振荡条件下进行解离。每7至10分钟通过间歇性移液管吹打辅助解离。完全解离后立即终止解离反应，最迟在40分钟时，加入500微升添加了1%牛血清白蛋白（西格玛-奥德里奇公司）和0.001%普鲁尼克-F68的汉克斯平衡盐溶液。随后将悬浮液在(300 ×g)、4摄氏度条件下离心5分钟形成沉淀，并用添加了0.05%牛血清白蛋白和0.001%普鲁尼克-F68的汉克斯平衡盐溶液洗涤两次。最终的悬浮液经35微米滤网（费尔康公司）过滤后，用台盼蓝（吉布科公司）染色，在计数板（福斯特实验室科学公司）中对活细胞进行定量分析。

单细胞RNA测序

采用10X Genomics 3'基因表达试剂盒v3.1进行单细胞RNA测序。将解离的斑马鱼心脏细胞悬液上样至10X微流控芯片，目标回收10,000个细胞，实验操作严格遵循制造商说明书。简要步骤如下：将细胞与凝胶微珠及逆转录混合物一同乳化并包封在凝胶微滴（GEMs）中；完成逆转录和模板转换后，破乳并对cDNA进行纯化；随后对cDNA进行PCR扩增与定量；接着对扩增后的cDNA进行片段化、末端修复和加A尾处理，再经磁珠纯化、接头连接及再次磁珠纯化；最后进行样本索引PCR，对文库进行磁珠纯化与定量，以用于测序。单细胞RNA测序文库在Illumina NextSeq500或NovaSeq6000平台上进行测序，目标为每个细胞获得20,000条读长。

单细胞SLAM-seq

为开展单细胞转录组测序（scSLAM-seq），我们对现有方案32,34进行了小幅修改。首先麻醉成年斑马鱼，通过颅内注射（IT）向其注入5微升由200 mM 4-硫代尿苷（4sU）溶于磷酸盐缓冲液（PBS）与荧光素标记葡聚糖组成的混合液，随后将斑马鱼放回装有系统水的养殖缸中。注射一小时后，再次麻醉斑马鱼以实施冷冻损伤或假损伤操作。假损伤组仅打开心包膜，不将冷冻探针放置于心室位置。操作结束后，将斑马鱼置于添加了吗啡的充氧系统水中饲养6小时。在冷冻损伤后6小时（hpci）或假损伤后6小时（hps），采集斑马鱼心脏样本，通过检测到强烈的荧光素信号确认颅内注射成功，随后按照前述方法进行组织解离。与单细胞RNA测序（scRNA-seq）方案不同，为弥补固定和转化过程中的细胞损失，我们将3至5个心脏组织样本合并处理。组织解离完成后，将细胞重悬于180微升含0.05%牛血清白蛋白（BSA）和0.001%普鲁诺尼克F-68（Pluronic-F68）的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中，在涡旋振荡器上以低速轻轻振荡的同时，逐滴加入720微升预冷的甲醇。随后将细胞在-20℃条件下固定1小时。固定完成后，加入100微升溶于80%甲醇水溶液的0.1摩尔碘乙酰胺，将细胞置于室温黑暗环境中，轻轻旋转孵育。次日清晨，将细胞悬液在冰上冷却10分钟，随后在4℃、1000倍重力加速度条件下离心10分钟。弃去上清液，将细胞轻轻重悬于500微升淬灭缓冲液中（该缓冲液为含1单位/微升核糖核酸酶抑制剂（RNaseOUT，赛默飞世尔科技）、100毫摩尔二硫苏糖醇（DTT）和0.1%牛血清白蛋白的杜氏磷酸缓冲液（DPBS，赛默飞世尔科技））。细胞在室温下孵育5分钟后，进行10分钟离心(1000 ×g) 置于4摄氏度。再次移除上清液，将细胞重悬于60微升重悬缓冲液（DPBS中含0.5单位/微升RNaseOUT、1毫摩尔二硫苏糖醇、0.05%牛血清白蛋白）。使用10X Genomics 3'基因表达试剂盒v3.1进行单细胞RNA测序前，先对细胞进行计数。按照制造商的说明（见上文）构建文库，并在Illumina NovaSeq6000平台上进行测序。

批量SLAM-seq数据的定位

批量 SLAM-seq 数据使用 STAR 2.7.3 版本比对到斑马鱼 GRCz11 基因组（第 95 版，52 版本）。

为了绘制批量SLAM-seq时间进程图，我们使用STAR 2.7.8a版53进行比对。先用bcl2fastq对RPi索引进行初始解复用后，我们将样本条形码作为“细胞条形码”输入，以便在比对时执行第二轮解复用。由于STARsolo支持的最大UMI长度为16个核苷酸，我们选取前16个核苷酸作为比对用的UMI。比对参考基因组采用斑马鱼版本GRCz11、92版。

scSLAM-seq 与 scRNA-seq 的定位及分析

使用 CellRanger 4.0.0 版本对 ScSLAM-seq 和 scRNA-seq 测序数据进行比对，以斑马鱼基因组 GRCz11（92 版）为参考，并在参考基因组中加入 RFP 基因。采用 Seurat 4.0.6 版本，结合适配参数的标准流程对数据进行分析54。具体而言，先对数据进行过滤、预处理，识别邻域细胞并完成细胞聚类。随后通过主成分分析（PCA）和均匀流形逼近与投影（UMAP）算法进行降维处理，并通过计算每个聚类的标记基因来鉴定细胞类型。为与已发表数据进行对比，我们采用 Seurat 的标签转移算法，将本研究的细胞注释信息迁移至已发表的数据集。标记基因通过 Seurat 的双侧 Wilcoxon 秩和检验鉴定，p 值经 Bonferroni 校正，仅计算显著富集的上调基因。

SLAM-seq 数据的预处理及 SLAM 信息的提取

使用先前发布的计算流程（采用 pysam 0.16.0.1 版和 samtools 1.1334 版），对 SLAM-seq 文库的二代测序数据中的 T-to-C 转换进行了识别。

对于批量文库，简言之，首先使用 samtools calmd 对 bam 文件进行 MD 标记，以添加错配和缺失的参考碱基信息。随后我们将替换信息整合至所谓的 MT 标签中，该标签包含每个替换的全基因组位置、替换类型及测序质量。最后使用 Rsubread 对读段进行注释。

对于scSLAM-seq文库，简要来说，首先针对过滤后的转录组数据集中的细胞条形码对bam文件进行子集划分。随后，添加MD标签和全局MT标签。基于全局MT标签，可在伪批量、单基因和单细胞水平上计算T-to-C转换百分比。对于基于转录本的分析，生成了两个独立的bam文件，分别包含标记和未标记的转录本。除非另有说明，我们将Q20质量过滤以及至少一次T-to-C转换作为判定转录本被标记的条件。最后，从每个bam文件中生成计数矩阵。

可选地，通过将频繁发生T-to-C转换的基因组位置加入黑名单来进行SNV过滤。如前所述，与参考序列相比，至少25%的reads包含T-to-C转换的位置被注释为SNV并加入黑名单³⁴。此外，测序覆盖度低于10条reads的位置也被排除不计。

cNMF

按照之前描述的方法，使用版本 (1.3.44) 进行了共识非负矩阵分解。我们对髓样亚簇的未协调计数矩阵执行 cNMF，使用以下参数：(n_iter =100)、(num genes =3000)、beta_loss=frobenius、(k=17)、(d=0.05)。为了可视化目的，使用情况输出已转换为百分比。为了将某个细胞归类为“使用”某基因表达程序，我们以10%的使用率作为阈值。我们使用R包gprofiler2进行GO术语分析，采用超几何检验（单侧检验），并通过g:SCS方法进行多重检验校正⁵⁵。分析的输入数据为各基因表达程序中z值大于拟合均值加两倍标准差的基因。

使用miloR进行差异丰度检测

按照先前描述的方法41，使用 R 包 miloR 1.0.0 版进行了差异丰度分析。

对于髓样亚群，在整合后的数据上使用了ID为(k=80)和(d=20)的buildGraph函数，以及参数prop=0.1的makeNhoods函数，以实现约200个细胞的平均邻域大小；同时采用0.7的阈值来分配混合簇。分析仅进行了未受伤心脏与受伤后特定时间点之间的成对比较。

为了对髓系细胞中损伤响应性GEP运行miloR，我们以10%的使用率作为阈值，将细胞分为“表达GEP”或“不表达GEP”两类。随后使用buildGraph（参数为(k=80)和(d=20）运行miloR，并使用makeNhoods（参数为(prop =0.1)，prop=0.1）处理整合后的数据，以实现约200个细胞的平均邻域大小，同时采用0.7的筛选标准来分配混合聚类簇。分析仅进行未损伤心脏与损伤后特定时间点之间的成对比较。

杂交链反应与成像

针对mfap4.1的杂交链反应（HCR）探针是通过insitu_probe_generator（GitHub仓库rwnull/insitu_probe_generator）56设计的。研究人员从NCBI获取剪接后的mRNA序列并将其作为输入。探针设计时使用了完整的mRNA序列，且允许最长4个核苷酸的均聚物。将探针与斑马鱼基因组GRCz11（92版）进行BLAST比对，剔除低质量探针。mfap4.1的探针序列以寡核苷酸池（oPool）的形式从Integrated DNA Technologies公司订购，探针序列详见补充数据11。il1b探针则从Molecular Instruments, Inc.公司订购。

对经多聚甲醛（PFA，Electron Microscopy Science 公司）固定的心脏组织进行10微米冷冻切片的杂交链式反应（HCR）。将切片放置在Superfrost™ Plus粘附载玻片（epredia 公司）上，37℃干燥30分钟，随后于-80℃保存备用。杂交链式反应实验严格按照制造商的说明书进行。简要步骤如下：切片经4%多聚甲醛后固定，随后进行连续脱水与复水的多步处理。载玻片先在杂交缓冲液中37℃预杂交10分钟，再置于加湿培养箱中37℃与探针进行24小时杂交，每种探针使用1.6皮摩尔，总体积为100微升。次日，载玻片在37℃条件下用浓度梯度递减的洗涤缓冲液（溶于5×SSCT缓冲液，Sigma-Aldrich 公司）洗涤，随后于室温在5×SSCT缓冲液中快速洗涤。之后，载玻片在扩增缓冲液中室温预扩增30分钟，再与快速冷却的发夹探针进行24小时扩增。最后一步，载玻片用5×SSCT缓冲液多次洗涤，并用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的ProLong Gold封固液（Invitrogen 公司）封片。用指甲油密封载玻片，4℃保存直至成像。

HCR样本在Leica SP8 Stellaris共聚焦显微镜下以63倍放大倍数及3倍帧平均参数进行成像。首先，对每个切片进行 tilescan（瓷砖扫描）。随后，对感兴趣区域（即在tilescan中检测到mfap4.1阳性巨噬细胞的区域）进行z轴堆叠成像，以更准确地判断细胞是否表达il1b。对每个样本，对4-6个切片进行成像，以更可靠地评估il1b阳性或阴性巨噬细胞的比例。

组织学分析与成像

对于AFOG染色和免疫荧光染色，将提取的斑马鱼心脏在4%多聚甲醛（PFA）中固定1小时，于室温下放置，随后用PBS洗涤3次，再置于蔗糖溶液（30%重量/体积，溶于PBS）中4℃条件下过夜。次日，心脏样本被包埋于O.C.T.（Tissue-Tek）中，并于-80℃保存备用。使用Leica CM1950冰冻切片机在SuperFrost Plus载玻片（赛默飞世尔科技）上切取12微米厚的冰冻切片，随后于-20℃保存。进行AFOG染色时，先将载玻片在室温下解冻15分钟，再用2次PBST（0.2% Triton X-100）洗涤以去除O.C.T.。将载玻片置于Bouin固定液中60℃固定2小时，随后按照AFOG染色试剂盒（BioGnost）的说明进行染色，染色步骤不使用苏木精溶液2。染色后的载玻片在配备Nikon Digital Sight DS-Ri1相机的Nikon SMZ25体视显微镜下进行成像观察。

进行免疫荧光染色时，将载玻片在室温下解冻15分钟，并用PBST洗去O.C.T。使用抗MEF2抗体时，先将载玻片在柠檬酸钠溶液（10 mM柠檬酸钠、0.1% Triton X-100，pH 6.0）中于95℃煮沸10分钟进行抗原修复，随后在透化液（3% (H_{2} O_{2}) 甲醇溶液）中于室温孵育30分钟。将切片在封闭液（(1x PBS)，成分为1×PBS、2%（体积/体积）山羊血清、0.2% Triton X-100和1%二甲基亚砜）中于室温孵育1小时，再将切片与一抗共同加入封闭液中于4℃孵育过夜。用PBST洗涤3次，每次10分钟后，将切片与二抗共同加入封闭液中于室温孵育3小时。最后，用PBST洗涤3次，每次10分钟，再将切片与含DAPI（稀释比例1:10000，Sigma-Aldrich公司）的PBST在室温下孵育5分钟，随后用Fluoromount-(G{TM})（Invitrogen公司）封片，置于4℃保存并进行成像。针对Mfap4和mCherry的免疫荧光染色，先在第一轮染色中使用Mfap4抗体，二抗孵育完成后用PBST洗涤3次，再将切片在封闭液中于室温孵育1小时，随后在第二轮染色中使用抗mCherry的一抗。

使用的一抗如下：抗Fli1（克隆EPR4646），稀释比例1:200（兔源，货号ab133485，Abcam公司）；抗PCNA（克隆PC10），稀释比例1:200（鼠源，货号sc-56，圣克鲁斯生物技术公司）；抗MEF2，稀释比例1:150（兔源，货号DZ01398，博仕德生物公司）；N2.261，稀释比例1:20（鼠源，由H. M. Blau研发，获自发育杂交瘤库）；抗白介素1β，稀释比例1:200（鼠源，货号GTX634188，Genetex公司）；抗Mfap4，稀释比例1:200（兔源，货号GTX132692，Genetex公司）；抗绿色荧光蛋白（GFP），稀释比例1:200（鸡源，Aves Labs公司，货号GFP-1010）；抗红色荧光蛋白（DsRed），稀释比例1:200（可识别mCherry，Living Colors，兔源，Takara Bio公司，货号632496）。

使用的二抗（均为1:400稀释）如下：抗小鼠IgG（重链+轻链）Alexa Fluor 568（山羊，货号A-11004，Invitrogen）；抗鸡IgG（重链+轻链）Alexa Fluor 488（Invitrogen，A-11041）；抗兔IgG（重链+轻链）Alexa Fluor 568（山羊，货号A-11036，Invitrogen）以及抗兔IgG（重链+轻链）Alexa Fluor 647（山羊，货号A-21244，Invitrogen）。

成像使用配备了SlideExpress 2载物台加载器（Märzhäuser公司）、SOLA光引擎（Lumencor公司）以及DS-Qi2单色数码显微镜相机（Nikon公司）的尼康Ni-E Eclipse宽场显微镜完成。整染心室成像是使用搭配尼康Digital Sight DS-Ri1相机和NIS Elements v.4.30软件的尼康SMZ25显微镜完成的。

免疫荧光图像和AFOG染色的定量与统计分析

对切片进行定量分析时，每个心室选取3-5个非连续切片，并使用ZEN Blue Edition软件进行分析。对于心肌细胞去分化和心肌细胞增殖，在外周边缘区（100微米）计算N2.261阳性和PCNA阳性心肌细胞（MEF2阳性）的比例。对于心肌内皮细胞增殖分析，在损伤区域定量心外膜中PCNA阳性心肌内皮细胞（Fli1α阳性）的百分比区域和边缘区域。对于促炎性巨噬细胞，对损伤区域中的Mfap4+和Mfap4+Il1b+细胞进行计数，并通过损伤区域的大小进一步归一化，以获得损伤区域的细胞密度。对于纤维蛋白和胶原蛋白分析，使用ImageJ（v.1.54p）分析AFOG图像，以测量所有损伤切片中的损伤面积、纤维蛋白面积和胶原蛋白面积。

所有统计分析均在GraphPad Prism（版本10.4.1）中完成。在进行统计分析前，通过Shapiro-Wilk正态性检验对每组数据的分布进行了检验。正态分布的数据采用双侧Student t检验进行分析，未通过正态性检验的数据则采用双侧Mann-Whitney U检验进行分析。所有检验的显著性水平均设为0.05，具体P值在图中已标注。误差棒表示平均值±标准差。

RT-qPCR

使用TRIzol试剂（Invitrogen公司）并采用酚-氯仿纯化法，从冷冻损伤的心室中提取RNA。每个样本至少使用250纳克总RNA，按照Maxima第一链cDNA合成试剂盒（赛默飞世尔科技公司）的制造商指南进行逆转录反应。所有反应均采用SYBR Green PCR预混液（赛默飞世尔科技公司），在CFX Connect实时荧光定量PCR系统（CFX Manager 3.1软件，伯乐实验室公司）上进行3次技术重复，程序设置如下：95℃预扩增7分钟，随后进行39个扩增循环，95℃变性5秒、60℃退火延伸20秒；熔解曲线程序为从60℃升至92℃，每5秒升高1.0℃。基因的mRNA表达水平以rpl13a的mRNA水平为内参进行标准化，倍数变化采用(2- Delta Delta C t)法计算。RT-qPCR引物序列见补充数据11。

统计学与可重复性

数据收集与分析均未在盲态条件下开展。样本量已在图、对应图注或本节中注明。每项实验的定量方法均在相应的“方法”或补充方法部分进行了说明，并标注了所用软件。

图1b中的实验使用了腹腔注射的斑马鱼（50 mM (n=1)、100 mM (n=2)、200 mM 联合冷冻损伤 (n=2)、200 mM 联合假手术损伤 (n=2）和腹腔注射的斑马鱼（200 mM (n=3），n 为单次独立实验中的生物学独立样本。还包括未注射样本以及在SLAM-seq时间序列实验中获取的6小时200 mM 4sU样本。图1c-e和补充图1的实验在单次独立实验中，每个时间点设置了生物学独立的三重重复样本。 对于图2、补充图2a、b、d和补充图4a-c的实验，我们使用了6小时冷冻损伤后(n=1)和6小时假手术（n=1）的样本，二者均为生物学和实验上独立的样本。每个样本混合5个来自生物学独立实验的心脏。 补充图5的实验展示了6小时冷冻损伤后(n=1)和6小时假手术(n=1)的独立scSLAMseq生物学重复样本，二者均为生物学和实验上独立的样本。每个样本混合5个来自生物学独立实验的心脏。 补充图2c的实验使用了腹腔注射斑马鱼的多个器官（200 mM (n=3），n 为单次独立实验中的生物学独立样本。 图3、补充图6和7、图4a-d、g以及补充图9和10的实验，我们使用了已发表数据（见数据可用性），并额外加入了3个独立实验的3个生物学独立样本的未损伤心脏(n=3)、4个独立实验的6个生物学独立样本的6小时冷冻损伤后心脏(n=6)，以及4个独立实验的6个生物学独立样本的1天冷冻损伤后心脏(n=6)。 图4h的原位杂交链反应（HCR）实验使用了2次独立实验中的2个生物学独立样本（仅展示1个样本），并分别对3个和6个切片进行成像。 图5e-g的实验使用了3天冷冻损伤后经他莫昔芬（TAM）处理的样本(n=8)，以及赋形剂对照处理的样本(n=10)，同时还包括7dpci 载体处理(n=8)和 TAM 处理(n=7)的心室，n 为生物学独立样本。图 6a 的实验使用了 3 个 dpci TAM 处理(n=8)和载体处理(n=8)的样本，以及 7 个 dpci TAM 处理(n=12)和载体处理(n=13)的心室样本，n 为生物学独立样本。图 6b 的实验使用了 7 个 dpci TAM 处理(n=7)和载体处理(n=6)的心室样本，n 为生物学独立样本。图 7a 的实验使用了 3 个 dpci TAM 处理(n=7)和载体处理(n=7)的样本，以及 7 个 dpci TAM 处理(n=12)和载体处理(n=13)的心室样本，n 为生物学独立样本。图 7b 的实验使用了 3 个 dpci 载体处理(n=6)和 TAM 处理(n=8)的样本，以及 7 个 dpci 载体处理(n=13)和 TAM 处理(n=12)的心室样本，n 为生物学独立样本。图 7c 的实验使用了 14 个 dpci TAM 处理(n=8)和载体处理(n=10)的心室样本，n 为生物学独立样本。补充图 12b–e 的实验各使用了 (n=4) 个心室样本，n 为生物学独立样本。补充图 15d 的实验使用了 3 个 dpci TAM 处理(n=4)和载体处理(n=4)的心室样本，n 为生物学独立样本。补充图 16b 的实验使用了 7 个 dpci TAM 处理(n=9)和载体处理(n=7)的心室样本，n 为生物学独立样本。补充图 16c、d 的实验使用了 30 个 dpci TAM 处理(n=6)和载体处理(n=4)的心室样本，n 为生物学独立样本。

图形学

图表由 AffinityDesigner 2 制作。图1a、2a、3a、5c、d 以及补充图15a、16a 中的斑马鱼、细胞类型、注射、冷冻损伤和斑马鱼心脏图标由 BioRender.com 生成，随后使用 AffinityDesigner 2 进行了进一步编辑、修改、色彩调整，并扩展至各图表面板。因此，仅为所使用的相应图标申请了出版许可。