题目：Aquaculture facility-specific microbiota shape the zebrafish gut microbiome

原文链接：https://animalmicrobiome.biomedcentral.com/articles/10.1186/s42523-026-00573-6

期刊:Animal Microbiome

摘要

环境微生物组（如循环水养殖系统（RAS）中的微生物组）在塑造宿主相关微生物群落方面可发挥关键作用。在斑马鱼（斑马鲐）研究中，这些相互作用可能引入不可控的变异来源，进而可能干扰不同实验室的实验结果。尽管微生物组研究中广泛使用斑马鱼，但鲜有研究对多个独立实验室中养殖桶水和斑马鱼体内的微生物组成进行表征，以探究环境微生物组变异对宿主微生物组的影响。

我们采用嵌套采样设计和16S rRNA基因测序技术，对美国的两家和挪威的三家水产养殖设施中的水体与斑马鱼肠道微生物组进行了对比分析。水箱水体中的α多样性始终高于鱼肠道，β多样性分析显示样本类型、养殖设施和地理位置均对微生物组有显著的聚类效应，其中养殖设施的差异解释了微生物组成变异的最大比例。不同养殖设施间的多元离散度也存在显著差异，这表明观测到的组成差异既反映了群落组成的变化，也体现了设施内部变异性的不同。每家设施的水体和鱼肠道中均存在独特的微生物群落对水和鱼肠道样本进行分析后发现，地理位置进一步区分了俄勒冈州和挪威研究机构之间的微生物群落组成。相似性百分比分析确定了导致各研究机构存在差异的关键类群，包括鱼肠道微生物组中的**鲸杆菌属**、**弧菌属**和**气单胞菌属**，以及养殖水体中的**假单胞菌属**和**莱茵海默氏菌属**。利用 FEAST 进行微生物源追踪显示，在大多数研究机构中，机构级养殖水体对鱼肠道微生物组组成有显著贡献，不过在所有研究机构中，未知来源在估算结果中占主导地位（占比 71%–99%），且鱼与水体之间的微生物组关联强度在各研究机构之间存在显著差异。

本研究表明，斑马鱼养殖设施中存在独特的微生物群落，其形成受环境和地理因素共同影响。养殖水箱水体微生物组与斑马鱼肠道微生物组组成存在关联，但未知来源对肠道微生物组组成的主导贡献表明，水箱水体直接环境之外的因素——包括饮食、宿主生理状况以及其他设施特异性条件——是驱动肠道微生物组变异的主要因素。这种关联的强度在不同设施间差异显著，且似乎与鱼类的驯化历史相关，这一规律值得开展直接的实验研究。这些研究结果强调，将环境微生物组评估纳入斑马鱼实验设计具有重要意义，尤其适用于聚焦宿主的研究。微生物相互作用。若不考虑这一点，环境微生物群中未被计入的变异可能会影响微生物组的组成，并降低跨研究的可重复性。未来，各机构对环境条件和微生物组成进行标准化报告，对于提升斑马鱼微生物组研究的可重复性与解读能力至关重要。

关键词：斑马鱼、宿主微生物组、环境微生物组、水产养殖、16S 核糖体RNA基因测序

研究背景

过去数十年的研究表明，微生物组通过调控营养、代谢、生理和免疫学等方面，对脊椎动物宿主的发育和适应性产生着重大影响。然而，在不同宿主之间以及同一宿主内部，微生物组都存在显著差异。为了更好地理解这种差异产生的原因及其对动物宿主健康和功能的影响，首先明确微生物组的获取和维持方式至关重要。

宿主微生物组的结构和组成部分受宿主个体之外的因素影响，这些因素包括但不限于食物、与其他宿主的相互作用以及环境因素微生物组。尽管饮食等因素已得到充分研究，但环境微生物组对宿主-微生物组差异的贡献仍不明确。以往研究已发现环境因素与宿主微生物组变异性之间存在相关性，但很少有研究通过同时评估宿主和环境微生物组来直接探讨微生物在环境中的获取可能性。

斑马鱼（斑马拟丽鱼）因发育迅速、繁殖率高且可培育成无菌个体（在无微生物的环境下饲养），被广泛用作实验室动物模型，用于研究宿主与环境相互作用相关的问题。然而，斑马鱼实验得出结论的普适性取决于结果的可重复性。对包括小鼠和非人灵长类动物在内的实验动物的研究表明，即便在基因型匹配的个体之间，微生物组也会因饲养条件和供应商来源而存在显著差异。若未考虑到这种差异，可能会干扰跨研究的对比分析，尤其是在微生物组相关的研究中。

斑马鱼中也存在类似的设施内和设施间宿主-微生物组变异。然而，据我们所知，目前尚无研究直接探究环境微生物组对多个现代研究水产养殖设施中斑马鱼肠道微生物组变异性的影响。

现代斑马鱼养殖设施通常采用循环水养殖系统（RAS），顾名思义，该系统在闭环内对水进行处理并重复利用。近几十年来，无论是在科研领域还是商业领域，人们对这类系统的关注度都在不断提升，部分原因在于其高效性以及对环境影响的降低。研究表明，这类系统可能会维持大量有益细菌的种群，至少能减少可能对鱼类有害的快速生长异养细菌的数量。这与水的长滞留时间、消耗细菌生长底物的生物滤池的存在，以及整个系统中一致的养殖容量和细菌密度有关——最终筛选出生长缓慢但竞争优势显著的非致病菌。不过，水处理的技术规范可能存在差异，部分设施会采用流水养殖系统，该系统中所有流出的水都会被排放，而非循环利用。

尽管为斑马鱼维持清洁、安全的饲养环境是普遍的共同目标，但外部输入和管理方式的差异可能会导致不同水产养殖设施之间水体微生物群落组成存在差异。因此，如果斑马鱼微生物组在很大程度上由环境获取所塑造，那么不同设施下水体微生物群落的差异可能会引发斑马鱼肠道微生物组的显著变化。不过，研究表明斑马鱼肠道至少具有一定的选择性，有研究报道存在一种“核心”肠道微生物组在不同设施中。因此，斑马鱼肠道的选择作用可能会减轻环境微生物组变异性对肠道微生物组组成的影响。

本研究旨在解决两个核心问题：（1）不同水产养殖设施的环境微生物组和鱼类肠道微生物组存在何种差异？（2）我们能否识别出环境微生物组与斑马鱼肠道微生物组之间的共变异模式？为探究这些问题，我们选取了位于挪威特隆赫姆和美国俄勒冈州尤金市两个地理区域的五家设施，这些设施均为典型的斑马鱼研究环境。在每个区域内，设施均分布在俄勒冈大学（UO）校园内彼此相距不超过300米的区域，以及挪威科技大学（NTNU）校园内相距不超过700米的区域（图1）。这些设施主要采用循环水养殖系统（RAS），仅有一家设施（Nor2B）采用流水系统并搭配不同的水处理方式。我们特别聚焦于为基础研究提供斑马鱼的养殖设施，由于实验动物饲养的特殊性，这类设施在运营上往往具有相似性。这使我们能够更好地分离宿主与环境微生物组之间的相互作用，同时也能探究不同来源斑马鱼实验结果的可重复性。

我们通过16S rRNA基因测序技术，对这五个设施中鱼类及其水箱水的配对样本进行微生物变异定量分析，尽管鱼类养殖水体系统在技术层面相对相似，但其水体和鱼肠道微生物组均表现出显著差异。此外，研究表明总体而言，鱼和水体的微生物组在同一养殖设施内部的相似度高于不同设施之间。最后，通过源追踪方法，我们证实了环境微生物组对斑马鱼肠道微生物组存在持续的影响。

结果

养殖水箱微生物群

本研究旨在评估不同水产养殖设施中养殖水箱水体微生物组的变异如何影响斑马鱼肠道微生物组。在开展这一研究之前，我们首先确定了这五个设施的水箱水体微生物组是否存在可观测的变异。我们分析了50个水箱水体样本内部及样本之间的群落组成和多样性指标，在将每个样本的测序数据标准化为1291条读长后，共鉴定出1632个独特的扩增子序列变体（ASVs）（(n=Ore1 (22)；Ore2 (12)；Nor1 (7)；Nor2A (6)；Nor2B (3)）。

水箱微生物群的变化由优势细菌类群的转变驱动为比较不同设施间的水体微生物多样性，我们首先检测了α多样性指标。香农-威纳指数和逆辛普森指数均未显示出显著差异在对两两比较应用Benjamini-Hochberg校正（BH）后，不同设施间的数值存在显著差异（香农指数：Kruskal-Wallis检验：(p=0.233)；逆辛普森指数：Kruskal-Wallis检验：(p=0.035）。尽管逆辛普森多样性的综合检验结果显著，但经校正后无一组两两比较达到显著水平，最接近显著的比较为Ore1与Nor1（p-adj. =0.053）以及Ore2与Nor1（校正后p值：(=0.085)（图2）。总体而言，水样中的α多样性在不同设施间无显著差异。

我们进一步分析了不同设施中水箱水的微生物群落组成。在所有设施的水样中，有22个属的平均相对丰度超过1%。变形菌门（包括γ-变形菌纲、β-变形菌纲和α-变形菌纲）是所有设施中的优势菌门，占优势属的绝大多数。水箱水中有14个属的平均相对丰度超过1%，但在鱼肠道样本中未达到这一阈值，包括环境中的变形菌门和拟杆菌门细菌，如莱茵海默氏菌属、不动杆菌属、酸微菌属、黄杆菌属和河生菌属，不过这些菌属在鱼肠道样本中均以较低丰度被检测到。

Ore1和Ore2设施水微生物组均以鲸杆菌属（厚壁菌门；Ore1占20.2%，Ore2占43.1%）为优势类群，其中Ore1还以高相对丰度的嗜冷杆菌属为特征（γ-变形菌纲；19.3%）、气单胞菌属（γ-变形菌纲；11.8%）和副球菌属（α-变形菌纲；7.0%）。相比之下，假单胞菌属（γ-变形菌纲）在 Nor1 中占主导地位（35.6%），而 Nor2A 的特征菌属为食酸菌属（β-变形菌纲；11.7%）、涅斯捷连科氏菌属（γ-变形菌纲；10.6%）和湖杆菌属（β-变形菌纲；9.2%）等。Nor2B 的特征菌属为莱茵海默氏菌属（γ-变形菌纲；33.1%）、不动杆菌属（γ-变形菌纲；16.6%）和河生菌属（拟杆菌门；10.8%）（图3）。

水产养殖设施是养殖水箱水体微生物变异的主要驱动因素。

不同设施的水箱微生物组组成存在显著差异。鉴于本研究设计的嵌套结构（设施嵌套于地理位置内），我们采用分层方法进行了置换多变量方差分析（PERMANOVA），测试了地理位置（挪威 vs. 俄勒冈州）、设施和鱼类基因型状态的综合效应。所有因素均检测到显著效应（Bray-Curtis 距离和未加权 UniFrac 距离：(p<0.001)，其中地理位置分别解释了 Bray-Curtis 距离和未加权 UniFrac 距离 20.4% 和 13.3% 的变异，而单个设施的标识又额外解释了 22.9% 和 18.1% 的变异。

为了评估在考虑了设施层面的差异后，鱼类基因型是否会独立影响水体微生物组组成，我们进行了一项约束性PERMANOVA分析，其置换被限制在每个设施。这种方法是必要的，因为在本研究设计中，基因型与设施存在固有的混杂关系，特定基因型被饲养在特定设施中（参见表S6）。当在设施内进行排列限制时，基因型状态无显著意义（Bray-Curtis：(p=0.429)；未加权UniFrac：(p=0.288)，这表明无约束层次模型中观察到的基因型效应很可能反映的是设施层面的差异，而非鱼类遗传学对水体微生物组组成的直接生物学效应（表S2）。

成对PERMANOVA分析显示，对于Bray-Curtis距离和未加权UniFrac距离，所有设施配对之间均存在显著的组成差异（所有(p-adj. ≤0.012)），且地理区域间的分化程度强于区域内部。Nor2A与Nor2B之间的分化程度最弱（Bray-Curtis：(R^{2}=)、(0.374)，校正后p值(=0.010)；未加权UniFrac：(R^{2}=0.417)、(p -adj. =0.012)），这与它们共享的地理位置相符，不过这些群落仍在统计学上具有可区分性（表1）。

表1：对水产养殖设施水体微生物组数据的Bray-Curtis距离和未加权UniFrac距离进行的成对PERMANOVA分析。经Benjamini-Hochberg校正后的p值。

对于Bray-Curtis距离(p=0.011)和未加权UniFrac距离(p=0.013)，不同设施间的多元离散度存在显著差异，这表明PERMANOVA分析中的差异既反映了群落组成的变化设施内变异性的组成与差异。成对离散度比较显示，Ore1 的 Bray-Curtis 离散度显著高于 Ore2、Nor1 和 Nor2B（均为 (p-adj. ≤0.018)），而 Nor2A 的未加权 UniFrac 离散度显著低于 Ore1、Ore2 和 Nor1（均为 (p-adj. ≤0.034)），这表明相较于其他设施，Nor2A 可能拥有系统发育受限的水体微生物组。Bray-Curtis 距离和未加权 UniFrac 距离的主坐标分析（PCoA）图进一步证实了这些结果，水箱水体微生物组按设施呈现出明显的聚类特征，不过挪威的各设施之间存在一定的重叠（图4）。

为进一步探究哪些属水平类群对不同水产养殖设施间观察到的差异贡献最大，我们进行了相似性百分比（SIMPER）分析。

SIMPER分析显示，不同养殖设施中养殖水体微生物群的差异主要以厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门成员的丰度变化为特征。由于SIMPER分析对数量上占优势的类群具有权重偏向，这些结果反映的是群落中丰度最高成员的差异，而非群落组成变化的全部驱动因素。在涉及Ore2的比较中，鲸杆菌属（厚壁菌门）是造成差异的主要类群，在Ore2不同设施配对的差异中占比达14.9%-20.9%，但在Ore1与挪威设施的对比中未检测到该属。经BH校正后的比较分析表明，鲸杆菌属（Cetobacterium）与Ore2水域微生物群具有显著的特异性关联。在所有涉及Nor1的比较分析中，假单胞菌属（Gammaproteobacteria，γ-变形菌纲）均为主要贡献类群，占比达14.9%-18.1%；而在所有涉及Nor2B的比较分析中，莱茵海默氏菌属（Gammaproteobacteria，γ-变形菌纲）则是导致微生物群落差异的核心类群，其相对丰度为13.4%-17.2%，这与在Nor2B水样中观察到的莱茵海默氏菌属高相对丰度（33.1%）结果一致。涉及Nor2A的比较分析则以多种β-变形菌纲类群为特征，尤其是嗜酸菌属（Acidovorax）和湖杆菌属（Limnobacter）。上述结果表明，设施特异性类群是区域内水域微生物组差异的关键驱动因素，假单胞菌属、莱茵海默氏菌属和鲸杆菌属分别对应不同的设施类型（表S3）。

斑马鱼肠道微生物群

为确定斑马鱼肠道微生物组在不同养殖缸和设施间是否存在差异，我们对群落组成和多样性进行了类似分析。对134个斑马鱼样本的数据进行标准化处理后（每个样本1171条序列，样本数量分别为：Ore1组55个、Ore2组5个、Nor1组36个、Nor2A组23个、Nor2B组15个），我们共鉴定出1267个独特的扩增子序列变体（ASVs）。

斑马鱼肠道菌群呈现出设施特异性的多样性和组成模式

不同养殖设施下斑马鱼肠道微生物群的香农α多样性存在显著差异（以养殖池为随机效应的线性混合模型：(p=0.003），而逆辛普森多样性无显著差异（p=0.219）。经Benjamini-Hochberg（BH）校正的事后两两比较显示，Nor2A的香农多样性显著低于Nor1（p-a d j .=)、(0.006）、Nor2B（p -adj. =0.006）和Ore1（p-a d j .=0.001），其余所有养殖设施配对间无统计学差异（完整两两比较结果见表S1）。Nor2A设施的α多样性始终最低（图5）。排除样本量不足的Ore2设施（n=5)条鱼，单个养殖池）的敏感性分析得到了定性一致的结果（见补充文件5）。

在所有养殖设施的鱼肠道微生物组样本中，有13个属的平均相对丰度超过1%的阈值，其中4个属（鲸杆菌属、气单胞菌属、弧菌属和邻单胞菌属）在全部5个养殖设施中均超过了该阈值。有5个属的平均相对丰度仅在鱼肠道样本中超过1%，分别是链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、芽孢杆菌属和葡萄球菌属；其中3个属（乳球菌属、链球菌属和肠球菌属）隶属于乳杆菌目（厚壁菌门），这表明相较于养殖水体，厚壁菌门在鱼肠道环境中存在富集现象。

在俄勒冈州的养殖设施中，鱼的肠道微生物组以鲸杆菌为主（俄勒冈1号：55.6%；俄勒冈2号：48.6%），而俄勒冈2号还具有以下特征与其他设施相比，链球菌（12.5%）和肠球菌（11.4%）的相对丰度显著更高。在挪威的设施中，气单胞菌是诺2B（Nor2B）中的优势菌属（60.4%），在诺1（Nor1）和诺2A（Nor2A）中也大量存在，占比分别为22.5%和15.9%。诺2A以弧菌（44.5%）为优势菌属，而与其他挪威设施相比，诺1的假单胞菌（18.6%）和气单胞菌（22.5%）相对丰度相对更高（图6）。

养殖设施对斑马鱼肠道微生物组的变异具有显著影响。基于Bray-Curtis距离和非加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）可视化了斑马鱼微生物组的组成差异（图7）。基于养殖桶水平的群落汇总特征分析显示，地理位置和养殖设施均对β多样性产生显著影响（置换多元方差分析；Bray-Curtis距离：地理位置：(R^{2}=0.323)、(p<0.001)；地理位置×养殖设施：(R^{2}=0.165)、(p<0.001)；非加权UniFrac距离：地理位置：(R^{2}=0.201)、(p<0.001)；地理位置×养殖设施：(R^{2}=0.147)、(p<0.001)。地理位置对鱼类肠道微生物组组成变异的解释比例高于其对养殖桶水体样本的解释比例（Bray-Curtis距离：肠道0.210 vs 水体0.204；非加权UniFrac距离：肠道0.142 vs 水体0.133），这表明地理位置对肠道微生物组的影响可能超过其对周边养殖桶水环境的影响。

与对水箱水样的观察结果一致，在无约束层次模型中，基因型状态表现出显著性（Bray-Curtis：(p=0.006)；无权重UniFrac：(p<0.001)，但在进行置换分析后，该状态的显著性消失采用BH校正的成对PERMANOVA分析证实，对于BrayCurtis距离（所有(p-adj. ≤0.030 )）和未加权UniFrac距离（所有(p-adj. leq)、(0.005))、0.005），所有非Ore2设施对之间均存在显著的组成差异。在这两个距离指标下，所有涉及Ore2的比较均无统计学显著性，这与该设施样本量过小（仅(n=5 fish,)个样本池）导致统计效能有限的情况一致。排除Ore2后的敏感性分析显示，其余所有设施对的分析结果在定性上保持一致（补充文件5）。

对于Bray-Curtis距离(p=0.024)和未加权UniFrac距离(p<0.001)，不同设施间的多元离散度均存在显著差异，这表明PERMANOVA分析的差异既反映了群落组成的变化，也体现了设施内变异性的不同。成对Bray-Curtis离散度比较显示，Ore1的离散度显著高于Nor1(p=0.045)，而Nor1的离散度也显著高于Nor2B(p=0.029)。尽管未加权（整体）

不同研究中心的UniFrac离散度存在显著差异，但校正后没有任何两两比较达到显著性水平，这表明离散度效应分布于多个研究中心对之间，而非由单个异常值研究中心导致。

对鱼类微生物群的SIMPER分析显示，设施差异主要以厚壁菌门和变形菌门成员的丰度变化为特征。在对每对设施内的多重比较进行BH p值校正后，不同比较中显著贡献类群的数量差异较大。经BH校正后，在Ore1与Ore2、Ore2与Nor1、Ore2与Nor2A的比较中，无任何类群对群落差异产生显著贡献，这与Ore2设施组无显著PERMANOVA结果及该设施鱼类样本量较小导致统计效力有限的情况相符。

在俄勒冈州与挪威的对比中，鲸杆菌属（梭杆菌门）是导致俄勒冈1号设施与挪威相关设施微生物群落差异的主要贡献菌，其对俄勒冈1号与挪威1号设施差异的贡献占比达25.1%（p -adj. =0.00），对俄勒冈1号与挪威2B设施差异的贡献占比为25.7%（p-a d j .=0.005）。校正后，弧菌属（γ-变形菌纲）是导致俄勒冈1号与挪威2A设施差异的唯一显著贡献菌，贡献占比为20.9%（p -adj. =0.033）；而气单胞菌属（γ-变形菌纲）则是造成俄勒冈1号与挪威2B设施差异的首要贡献菌，贡献占比达27.5%（p -adj. =0.002）。

在挪威养殖设施的对比中，弧菌属是导致Nor2A与Nor1样本差异的主要贡献菌（占比22.1%，编号(p -adj. =0.011）。气单胞菌属是造成Nor2A与Nor2B样本差异的主要显著贡献菌（占比20.1%，编号(p-adj. =0.040），而经校正后，Nor2B与Nor1的对比样本则以低丰度类群为特征，未出现单一优势贡献菌。这些研究结果表明，在具有足够统计效力检测到差异的前提下，鲸杆菌属、弧菌属和气单胞菌属是导致不同养殖设施下斑马鱼肠道微生物组组成差异的关键驱动菌，这与各设施特异性相对丰度分布中观察到的这些类群占主导地位的现象一致（表S5）。

斑马鱼肠道与水体微生物组的共变关系

在确认不同养殖设施中鱼类和水体微生物组均存在显著差异后，我们利用从同一养殖缸收集的匹配样本、源追踪分析以及群落水平的综合比较，探究了鱼类肠道与水体微生物组之间的共变异关系。在对鱼类肠道和养殖缸水体微生物组进行综合分析时，我们将所有样本重新稀疏化至1171条序列的统一阈值（这是保留的鱼类肠道样本中最低的序列数），以确保不同样本类型间的测序深度一致，从而进行直接对比。

鱼类和水体微生物组在设施间的组成重叠特异性模式。

在两种样本类型中，共检测到471个属，其中178个属存在于鱼肠道和水体微生物组中。尽管存在这种重叠，鱼肠道和水体微生物组仍拥有数量相当的特有属——仅在鱼肠道中发现的有147个，仅在水体样本中发现的有146个，这表明尽管二者在属水平上具有共同的多样性，但群落组成仍存在显著差异。共有属中以变形菌门为主（78个属），其次为放线菌门（29个）、厚壁菌门（19个）、拟杆菌门（14个）和浮霉菌门（14个）。有8个属在两种样本类型中的平均相对丰度均超过1%：鲸杆菌属（鱼肠道：26.3%，水体：13.6%）、气单胞菌属（鱼肠道：20.7%，水体：4.2%）、弧菌属（鱼肠道：14.0%，水体：4.0%）、假单胞菌属（鱼肠道：5.6%，水体：9.0%）、邻单胞菌属（3.8%，1.8%）、代尔夫特菌属（1.3%，2.5%）、寡养单胞菌属（1.1%，1.7%）和希瓦氏菌属（1.0%，2.1%）。

斑马鱼肠道与养殖水箱水体微生物群在群落组成上存在显著差异（置换多元方差分析；样本类型：决定系数R² = 0.073，(R^{2}=0.073)，(p<) 0.001；养殖设施：(R^{2}=0.291)，(p<0.001）。研究还检测到样本类型与养殖设施间存在显著的交互作用(R^{2}=0.162)，(p<0.001)，表明不同养殖设施下，鱼肠道与水体微生物群的差异程度有所不同。成对比较显示，Ore1(p-a d j .=0.002)、Nor1(p-a d j .=0.003)、Nor2A(p -adj. =0.002)和Nor2B(p -adj. =0.030)的鱼肠道与水体微生物群均存在显著差异，而Ore2组的差异未达到显著水平(p-a d j .= 0.316），这与该养殖设施下统计检验的效力有限相符。养殖设施的身份对变异的解释比例远高于样本类型，表明地理和设施层面的因素是两个样本类型中微生物组组成的主要驱动因素。多变量离散度在样本类型(p=0.012）和设施(p<0.001)之间差异显著，表明观察到的组成差异反映了群落组成的变化和组内变异性的差异。不包括Ore2的敏感性分析产生了定性相同的结果，在所有四个剩余设施中检测到显著的鱼水分歧（所有(p-adj. ≤0.034)；补充文件5）（图8）。

为了进一步描述鱼类肠道和水箱水微生物群之间的关系，我们使用水箱平均鱼类群落概况，检查了三个比较类别的成对Bray-Curtis差异：相同的水箱水、来自相同设施但不同水箱的水以及来自其他设施的水。Ore2被排除在该分析之外，因为单水箱表示排除了有意义的设施内比较。结果以描述性的方式呈现，因为类别间成对比较数量的内在不平衡排除了形式意义测试。鱼肠微生物群组成和与水箱水的地理接近度之间的关系因设施而异，在所有设施中没有观察到与相同设施水更相似的一致模式（图S1）。

水微生物组对斑马鱼肠道微生物组的影响因设施而异。

为了评估罐水微生物组对斑马鱼肠道微生物组的贡献程度，我们使用了快速Expectation-Maximization微生物源跟踪（FEAST），这是一种概率建模方法，可以估计给定样本（“汇”）中可归因于潜在定义源环境的微生物类群的比例。每个分析中的未知部分代表设施罐水未捕获的微生物源，包括饮食、宿主生理学或其他设施特定环境因素的潜在贡献。

当鱼肠道微生物群被归类为水槽时，未知部分在所有设施中占主导地位，从Ore1的71.5%到2B的98.9%不等，这表明水箱水只能解释所有设施中鱼肠道微生物群组成的一小部分。尽管如此，设施水箱水在一些设施中仍有重要贡献——同样的设施水在Ore1中贡献了25.6%，在Nor1中贡献了26.7%，在Nor2A中贡献了57.2%——而特定的同水箱水样在所有设施中的贡献始终很低（范围：0.8-9.7%）。2B是一个明显的例外，同样的设施水基本上没有贡献（0.5%），未知来源占肠道微生物群组成的98.9%，这表明2B鱼肠道微生物群在很大程度上与当地水环境脱钩。这与明显的在相对丰度分析中观察到2B鱼肠道微生物群（以气单胞菌为主，60.4%）和2B水箱水（以Rheineimera为主，33.1%）之间的组成差异（图9A）。

在将水归类为汇的反向分析中，Ore1中相同设施的鱼肠道微生物对水微生物组组成的贡献不大（48.4%），但在挪威设施中贡献较小（Nor1:19.9%，Nor2A：23.1%），而2B再次显示出最小的鱼对水的贡献（3.2%），未知来源占主导地位（91.8%）。Ore2被排除在作为汇的水分析之外，因为12个水样中只有一个水样具有来自同一水箱的相应鱼肠道样本，排除了有意义的设施级解释。在所有设施中，同一水箱的双向贡献始终很低（图9B）。

讨论

在这项研究中，我们旨在表征水产养殖设施中的微生物变异，并评估斑马鱼肠道和水微生物群之间的微生物关联程度。通过分析来自五个以研究为重点的水产养殖设施的配对水箱水和斑马鱼肠道微生物群，我们发现设施特定的因素强烈地塑造了鱼类和水中的微生物群落组成。虽然水和鱼类微生物群在组成上仍然不同，但两者之间共享许多最丰富的微生物类群，鱼类肠道微生物群组成不同

与同一设施内的水体微生物组存在显著差异。源追踪分析进一步表明，设施层面的水体微生物组与斑马鱼肠道微生物组组成相关，不过这种相关性的强度在不同设施间差异较大，且在所有采样点，未知来源均主导着肠道微生物组的组成。双向分析显示，在部分设施中，微生物的交换可能是双向的，斑马鱼也会对周围水体微生物组产生影响。

设施水微生物群的变化

对设施水微生物群落的β多样性分析揭示了不同地点（俄勒冈州对挪威）以及每个地理区域内设施之间微生物群落组成的明显差异。对俄勒冈州和挪威之间广泛差异的一个简单解释是生物地理——来自地理上不同地区的水天生拥有不同的环境细菌群落，受当地气候、地质和水文的影响。设施特定的操作因素可能会进一步构建每个区域内的这些群落，如下文所述。检查群落组成为这些差异背后的驱动力提供了额外的线索。在所有设施中，两种植物——变形菌和梭杆菌——占大多数样本总读数的75%以上。变形菌由多个属代表，梭杆菌几乎完全由一个属代表，鲸鱼杆菌，分配给一个ASV（ASV1）。俄勒冈州在这些设施中，鲸杆菌的相对丰度占据主导地位并使其具有独特性。

鲸鱼杆菌已被确定为斑马鱼肠道微生物组的“核心”成员以及广泛的其他淡水鱼物种。与这种宿主关联一致，我们的数据显示鲸鱼杆菌在鱼类样本中的相对丰度明显高于在所有设施的水样中的相对丰度。在斑马鱼中，鲸鱼杆菌似乎在成人肠道中富集，并与潜在的宿主益处相关，包括葡萄糖稳态、减少寄生虫负担和对肝脏健康的益生菌效应。这种模式表明，在水样中检测到的鲸鱼杆菌可能与宿主相关，起源于本研究系统中的斑马鱼宿主或被斑马鱼宿主强烈扩增，与源跟踪结果一致，表明鱼类肠道微生物群对Ore1中的水微生物组组成做出了有意义的贡献。

俄勒冈州设施水样中其他高丰度类群，包括不动杆菌属和弧菌属，也与鱼类微生物组密切相关。虽然部分弧菌菌种是已知的病原体，但这一多样的菌属包含许多常见于健康鱼类和水生环境中的菌种，其中一些甚至在鱼类中表现出潜在的益生特性。这一模式与大肠杆菌在人类体内既可作为共生菌又可致病的情况类似——该菌属同时包含这两类菌种有益和有害菌群。来源追踪分析显示，在Ore1中鱼类微生物群平均占水体微生物组组成的48.4%，这表明斑马鱼的微生物输入可能在塑造该设施的水体微生物组方面发挥重要作用，不过仅靠观测数据无法确定这种关系的方向和作用机制。

相比之下，挪威的养殖设施中变形菌门占据主导地位，不过丰度最高的类群因设施而异。这些类群中的多数常见于开阔水域和沉积物中，它们与鱼类的关联具有情境依赖性——主要出现在鱼类受到胁迫、患病或环境发生扰动的条件下，而非鱼类微生物组的稳定成员。例如，Nor2B养殖设施的水体中以莱茵海默氏菌属和不动杆菌属为主。尽管不动杆菌属已在多种野生和养殖鱼类中被检测到，且在养殖设施换水后可能短暂出现，但它并非斑马鱼肠道微生物组中稳定的“核心”成员。Nor1设施中存在大量代尔夫特菌属，该类群常见于水体和土壤中，但偶尔会在受病原体侵袭的斑马鱼肠道中被发现；而Nor2A设施则以酸杆菌属和湖杆菌属为特征——湖杆菌属已在重新常规化的斑马鱼及鱼类皮肤微生物组中被检测到，但其整体被归为环境类群。这些关联的情境依赖性特征表明，鱼类相关类群与环境来源类群之间的界限并非固定不变，尽管整体模式显示挪威的设施水体微生物群相比俄勒冈州设施中的水体微生物群更能反映环境定植情况，在俄勒冈州的设施中，与鱼类关联更强且更稳定的类群主导了水体群落。

俄勒冈州与挪威养殖设施水体微生物组存在显著差异，其中一个可能的解释是设施的相对使用年限以及养殖鱼类的总数量。俄勒冈州的设施运营时间长于挪威的设施——Ore1和Ore2分别于2012年和2001年建成，而Nor1于2014年投入使用，Nor2A/Nor2B则在2015年建成。由于这些设施均采用循环水养殖系统（RAS），俄勒冈州设施的水体循环时间显著更长。此外，俄勒冈州设施的养殖鱼类数量远多于挪威的设施（Ore1约5万尾，Ore2约3万尾；而Nor1约1万尾，Nor2A和Nor2B仅100至200尾）。尽管生物滤池在运营近十年后可被视为“成熟”，但俄勒冈州设施更长的运营周期加上更高的鱼类种群数量，可能使得投喂制度、清洁流程、人类活动以及鱼类排泄物等运营因素带来的微生物累积输入量更大。随着时间推移，这些累积的输入可能会改变整个设施管道系统中生物滤池、水体和生物膜内的微生物群落，使其越来越能反映鱼类微生物组的特征，而非水源水或初始环境定植菌的特征。类似的模式在……中也已被观察到。建筑环境（如办公室和住宅）中，宿主的长期停留与活动会通过累积的生物输入影响环境微生物组。

此外，与俄勒冈州的设施相比，挪威的设施饲养了更多用于疾病模型研究的斑马鱼基因型。用于疾病模型研究和免疫缺陷的斑马鱼可能会降低宿主选择能力，使其更容易被环境微生物定植，而这些微生物通常会被宿主的免疫过滤机制排除在外。例如，存在影响纤毛功能突变的基因改造品系（如挪威斑马鱼资源中心1号设施（Nor1）中饲养的foxj1b突变品系，见表S6）可能会损害宿主防御能力。在斑马鱼中，foxj1b基因对于运动性纤毛的形成至关重要，而其哺乳动物同源基因Foxj1也通过抑制炎症通路来调节适应性免疫反应。纤毛功能受损以及可能存在的免疫功能缺陷，可能会降低宿主选择性维持宿主相关微生物群的能力，使环境微生物更易定植。因此，挪威设施水体中病原体相关和抗生素相关微生物群的高流行率，不仅可能受这些设施中饲养的疾病模型斑马鱼比例更高的影响，还可能与这些斑马鱼选择性维持宿主适应性微生物群落的能力受损有关。

关于不同设施中微生物组组成存在差异的一个假设是，细菌生长速率因以下差异而发生变化：养殖系统水箱的换水率。有研究提出，循环水养殖系统（RAS）中较短的水力停留时间与水箱较高的换水率直接相关，这种条件会促进r-策略型细菌生长，而较长的停留时间则会促进K-策略型细菌生长。尽管我们未直接测量换水率，但大多数设施使用了相似的斑马鱼养殖设备——Ore1、Ore2、Nor1和Nor2A均采用意大利布贾贾特市Techniplast公司的斑马鱼养殖系统。鉴于这些系统中水箱设计限制了换水率的波动范围，同一设施内不同水箱间的换水率差异，很可能大于不同设施间平均水箱换水率的差异。

因此，仅靠水交换率不太可能导致各设施间微生物群落组成出现已观测到的差异。

另一个更合理的导致观察到的设施层面差异的因素是水箱维护和清洁规程的差异。俄勒冈州的设施执行最严格的清洁规程，每两周更换一次水箱，若观察到藻类或生物膜生长则提前更换（T. 梅森，俄勒冈1号设施经理，个人沟通，2021年1月30日；D. 莱恩斯，俄勒冈2号设施经理，个人沟通，2022年9月21日）。挪威的Nor2A和Nor2B设施遵循类似的两周清洁周期（F. 尤特费尔特，Nor2A/Nor2B设施经理，个人沟通，2024年1月12日），而Nor1更换水箱的频率则低得多——大约每两到三个月一次（E. 亚克西，Nor1设施经理，个人沟通，2022年6月14日）。所有设施均使用个人防护装备以限制潜在的交叉污染。我们注意到，尽管可通过与设施管理人员的私下沟通获取清洁频率信息，但并非所有设施都系统地保存标准化的清洁记录，这使得我们无法对清洁制度对水体微生物组组成的影响进行更定量的评估。

尽管Nor1和Nor2A/B的清洁方案存在差异，但挪威设施中几乎所有采样水箱都出现了至少一定程度的可见生物膜或藻类生长，而俄勒冈州设施的水箱则基本没有生物膜。这一观察表明，清洁强度（而非仅清洁频率）可能是导致不同设施之间微生物组成存在差异的关键因素。

俄勒冈州设施中更强化的清洁方案很可能造就了独特的生态条件，使水体中与鱼类相关的微生物群占据优势。通过高强度清洁带来的频繁干扰会降低整体微生物生物量，并清除水箱水中已形成的具有竞争性的细菌群落（即K-选择类群）。这种干扰可通过两种潜在机制促进与鱼类相关微生物的检出：其一，从宿主体内扩散的与鱼类相关的微生物能够快速占据水体中新出现的生态位空间；其二，仅因水体背景微生物生物量减少，这些微生物也能被更易检测到，从而使鱼类相关微生物在相对丰度分布中，衍生类群更为突出，而这不一定需要水体中存在生长。这两种机制都可以解释本研究中观察到的鱼类微生物群与俄勒冈州水样之间的强烈关联。

相比之下，在挪威设施水箱中观察到的更大的生物膜和藻类生长，可能会提供具有竞争优势的类群，从而限制水体中与鱼类相关的微生物的定殖。如果这些生物膜有助于稳定水体微生物组，这或许可以解释为何挪威的设施水样在群落组成上比俄勒冈州的水样彼此更为相似。

最终，不同设施间观察到的水体微生物组差异很可能由多种相互作用的因素共同塑造，这些因素包括但不限于设施使用年限、鱼类密度、斑马鱼微生物群的扩散、水箱维护流程以及水柱内的微生物竞争。源水化学性质和区域微生物库所建立的生物地理背景，很可能奠定了群落组成的基线，而设施特有的运行因素则在此基础上作为次级构建因素发挥作用。鉴于这些差异，不同设施中饲养的斑马鱼所处的微生物环境存在显著不同，这反过来又可能影响其肠道微生物组的组成。下一部分将探讨这些设施层面的差异如何导致斑马鱼肠道微生物组的变化。

斑马鱼肠道微生物组的变异

斑马鱼肠道样本与养殖水体样本的模式存在诸多相似之处——二者均呈现出由养殖设施和地理位置主导的显著群落结构分化，且在各养殖设施中均以变形菌门和梭杆菌门为优势菌群。然而，塑造肠道微生物群落的各类因素，其相对影响力与塑造水体微生物组的因素有所不同。养殖设施层面的环境因素对斑马鱼肠道微生物组组成的塑造作用显著，设施对肠道群落结构的显著影响便是有力佐证。但这种变异主要由已被认定为斑马鱼核心微生物组组成部分的类群之间的丰度变化驱动，而非被环境定植菌全面替代，这表明宿主自身的调控过程会调节而非抵消环境因素的影响。值得注意的是，这种宿主层面筛选的相对影响力在不同养殖设施间存在差异，我们将在下文对这一模式展开更深入的探讨。

在 Roeselers 等人（2011年）的研究中，作者对比了野生和驯化斑马鱼的微生物组，发现在实验室水产养殖设施中饲养的野生捕获斑马鱼中，变形菌门（Proteobacteria）的测序读段占比超过99%，但在这类设施中饲养多代的斑马鱼基因型的微生物组中，其占比要小得多。我们的数据也观察到了类似模式，变形菌门在Nor2A和Nor2B样本中占测序读段的比例最高——分别超过95%和75%——而在 （注：原文未完整，译文保留原文未完结的状态）其他设施不同。其他设施均饲养高度驯化的斑马鱼品系，而 Nor2B 斑马鱼是2015年在印度采集的野生斑马鱼的约第六代后代，Nor2A 斑马鱼则是这些野生后代与驯化的 Casper 品系的杂交种。

这种与野生环境的邻近性或许是这些设施中观察到的群落组成模式的成因。高度驯化的斑马鱼品系已在实验室水产养殖设施中饲养了多代，在此期间，宿主与设施特有的微生物群落长期共存，可能促进了某些细菌谱系的适应，使其能更高效地定殖于这些宿主。在这种背景下，俄勒冈州饲养长期驯化品系斑马鱼的设施中，梭杆菌门（尤其是鲸杆菌属）占主导地位，这可能反映的是宿主与微生物多代共同适应的累积结果，而非单纯的被动环境定殖。相比之下，Nor2B和Nor2A中来源更近野生的斑马鱼，可能尚未与实验室相关的微生物谱系形成这种共同适应的历史，这也能解释为何这些设施中环境变形菌门的占比更高。各设施中斑马鱼品系的驯化状态表明，宿主的繁育历史与肠道菌群和水体菌群组成的关联程度之间可能存在潜在关系。饲养高度驯化斑马鱼品系的设施——包括俄勒冈州设施以及鱼类种群源自长期实验室品系的Nor1设施——均显示出在源追踪分析中，水体与鱼类肠道微生物组组成之间存在中等程度的关联。相比之下，诺尔2B（Nor2B）是所有设施中野生来源鱼类数量最多的设施，其鱼类肠道微生物组与当地水环境基本完全解耦，未知来源占肠道微生物组组成的98.9%，同设施水体仅贡献0.5%——这是所有设施中观察到的最显著的鱼-水组成不匹配现象。这一点进一步体现在以气单胞菌属（Aeromonas）为主（60.4%）的诺尔2B鱼类肠道微生物组与以莱茵海默氏菌属（Rheinheimera）为主（33.1%）的诺尔2B养殖水体之间的显著差异上。诺尔2A（Nor2A）养殖的是野生-家养杂交鱼，其同设施水体贡献度在所有设施中最高（57.2%），这一结果与该模式并不完全契合，可能反映了设施特异性的微生物条件或杂交基因型的特征。诺尔2B也是本研究中唯一的流水养殖系统，与循环水养殖系统（RAS）相比，流水系统固有的累积微生物暴露量更低，这可能进一步促成了该设施中观察到的解耦现象。如果宿主品系与设施水体微生物组的长期共同暴露会在多代中促进特定微生物类群的定殖——正如针对从奥雷1号（Ore1）斑马鱼中分离的希瓦氏菌（Shewanella）所实验证实的那样——那么共同暴露历史有限的鱼类品系，其与当前水体环境的关联可能较弱。我们缺乏直接验证这一假设所需的菌株水平分辨率和跨设施实验重复数据，但诺尔2B模式的一致性多项证据表明，这为未来的研究提供了一个极具吸引力的方向。

最后，在斑马鱼研究中，基因型对宿主微生物组组成和结构的影响已有充分文献记载，而本研究各设施间基因型的多样性——从高度驯化的实验品系到野生来源的后代——既构成了本研究设计的优势，也带来了局限性。我们尝试通过将野生型与转基因品系进行二元分类来考量基因型因素（表S6），但这种方法必然掩盖了每个类别内显著的遗传多样性。当排列分析限定在各设施内部进行时，基因型状态在鱼肠道和水体微生物组模型中均不显著，这表明在当前数据集中，我们无法将基因型效应与设施层面的混杂效应区分开来。数十年的杂交育种和基因改造所带来的复杂性，加之本研究设计中基因型与设施固有的混杂关系，意味着基因型对微生物组组成的影响仍是一个悬而未决的问题，未来开展专门的跨设施基因型重复研究将更有能力解答这一问题。

斑马鱼肠道与水体微生物组的共变关系

最后，为探究鱼类肠道与水体微生物组之间的共变关系，我们采用了两种互补的方法：一是分析共享细菌类群的特征及其已知的生态关联，二是通过来源追踪来估算微生物交换的方向性。

在两种环境之间存在关联。第一种方法的一个关键警告是，分类学关联具有高度的环境依赖性，会因环境、宿主物种或实验条件而变化，且我们的组成测序方法无法直接评估微生物功能或宿主-微生物相互作用的本质。因此，对于基于已报道关联得出的方向性推断，应谨慎解读。

在俄勒冈州的养殖设施中，水体微生物群落以与鱼类关联紧密的类群为主——如前所述，即**鲸杆菌属**（Cetobacterium）、**嗜冷杆菌属**（Psychrobacter）和**弧菌属**（Vibrio）——这表明这些设施中鱼类与水体之间存在大量微生物重叠。挪威的养殖设施则呈现出相反的模式，丰度较高的水体类群在鱼肠道微生物组中也大量存在的情况较少见。鱼类微生物组在设施间的差异，主要由斑马鱼正常肠道微生物组中已有的微生物类群组成结构变化驱动，而非由优势水体类群的引入导致。不过，斑马鱼与水体仍共享各设施特有的稀有扩增子序列变体（ASVs），这说明除了数量优势类群的变化外，设施特异性的稀有类群也可能是造成观测到的差异的原因之一。这一模式与不同环境梯度下鱼类微生物组的观测结果一致，即尽管稀有类群的数量丰度较低，但其仍能区分不同条件下的微生物群落，这表明这些类群可能发挥着与其丰度不成比例的重要生态作用。

来源追踪结果进一步凸显了不同设施中鱼类与水体之间微生物关联的可变特性。这些分析的一个关键发现是，在所有设施中，未知来源主导了肠道微生物组的组成，占比从Ore1设施的71.5%到Nor2B设施的98.9%不等。无论来自哪个设施，斑马鱼肠道微生物组的大部分组成都无法归因于养殖水体，这表明饮食、免疫选择和生理过滤等宿主层面的过程是肠道微生物组组成的主要决定因素。养殖水体似乎发挥着次要的调节作用，其作用强度在不同设施间差异显著。同一设施的水体在Ore1设施（25.6%）、Nor1设施（26.7%）和Nor2A设施（57.2%）中做出了有意义的贡献，而特定同一养殖箱水体样本的贡献在所有设施中均持续偏低（范围为0.8%至9.7%），这表明鱼类肠道微生物组组成反映的是对整个设施水体环境的暴露情况，而非特定时间点单一养殖箱的微生物组。这与其他水生生物的研究结果一致，例如宽吻海豚、加州海狮、大西洋鳕鱼和地中海金头鲷，这些生物的宿主微生物组与环境微生物组存在一定相似性，但环境微生物群的丰度和多样性未必与宿主微生物组的变化相关。在将水体归为汇的反向分析中，同一设施的鱼类肠道微生物组对Ore1设施水体微生物组组成的贡献中等（48.4%），但在挪威的设施中贡献较低（Nor1设施：19.9%，Nor2A设施：（23.1%），而Nor2B再次显示出极小的鱼向水体贡献量（3.2%）。值得注意的是，各设施中水体向鱼群贡献量与鱼群向水体贡献量之间并不存在负相关关系——那些水体微生物群对鱼群微生物组贡献较小的设施，其鱼群微生物群对水体微生物组的贡献并未相应地更大。Nor2B在两个方向上的贡献均较低，而Ore1的鱼向水体贡献量在所有设施中最高。这种不对称性表明，调控微生物交换的因素并非简单的互惠关系，且设施特有的条件以尚未完全明确的方式决定了鱼-水微生物关联的方向性和强度。

本研究的一个显著局限性是仅在单个时间点对鱼类和水体微生物组进行了采样。以往的研究表明，这些养殖设施内的水体微生物组组成会随时间发生显著变化，且这种变化与鱼类肠道微生物组的改变相关。因此，时间上的变异可能会影响水体与肠道微生物组之间的相对关联，未来开展包含多次重复采样的研究，将能更准确地揭示这些相互作用的动态变化。此外，所有养殖设施的养殖池维护计划均未被系统记录，这使得无法对清洁制度如何影响水体微生物组组成及其对鱼类肠道群落的下游影响进行更定量化的评估。

尽管我们无法完全明确斑马鱼肠道与周围水体微生物组之间微生物交换的机制或方向性，但研究结果表明，二者均深受养殖设施和地理位置的影响，且共享相当比例的微生物类群。斑马鱼是基础研究中广泛使用的模式生物，其微生物组的差异会对实验结果的可重复性产生显著影响。如前所述，宿主-微生物组的相互关系介导了宿主健康与功能的诸多方面，此前在小鼠和灵长类动物中的研究已发现，微生物组的差异与设施来源相关的实验结果差异存在关联。本研究中观察到的不同设施和区域间的微生物组差异，可能会降低斑马鱼在微生物组介导过程相关研究中的可重复性。通过改善饲养操作的一致性——包括饲料、清洁流程、水质和养殖密度——并结合环境微生物组状况的标准化报告，有望提升不同斑马鱼研究设施间实验结果的可重复性。未来研究应致力于明确并标准化这些因素，最终减少微生物组差异，提高实验的一致性。

讨论

我们的研究结果表明，即便在相对可控的水产养殖设施中，设施特有的因素也会显著影响水体和斑马鱼肠道微生物群落的构成，而地理位置则在更广泛的空间尺度上为群落结构增加了一层调控作用。养殖水箱水体微生物组与斑马鱼肠道微生物组共享大量微生物类群，且存在关联证据，但所有设施中未知来源对肠道微生物组构成的主导贡献表明，宿主层面的过程（包括免疫过滤、饮食和生理选择）是决定肠道微生物组构成的主要因素，设施水环境仅起次要的调节作用。这种关联的强度在不同设施间差异显著，且似乎与所养殖斑马鱼品系的驯化历史相关，这一规律值得开展直接的实验研究。斑马鱼与其环境间的微生物关联，很可能只是影响斑马鱼肠道微生物组的一系列更广泛的设施特有因素中的一个方面，这些因素还包括养殖管理措施、水质、放养密度和鱼类基因型。本研究加深了我们对广泛使用的模式动物斑马鱼微生物组影响因素的理解，并强调了环境微生物组评估作为斑马鱼研究实验设计组成部分的重要性。我们提醒，使用来自单一设施斑马鱼的研究人员应注意设施间微生物组的差异，因为未被考虑的环境微生物组这些差异可能会影响实验结果，并降低不同设施间的可重复性。

方法

研究地点

本研究在美国俄勒冈州尤金市的俄勒冈大学校园内和挪威特隆赫姆的挪威科技大学（NTNU）两个地理区域的五个斑马鱼养殖设施中开展，其中俄勒冈大学校园内有三个设施，挪威科技大学有两个设施。选择这些设施是因为它们为研究不同空间尺度和设施设计下宿主-环境微生物相互作用提供了独特的研究体系。具体而言，每个地理区域内的设施紧密相邻，便于探究同一区域内不同设施之间以及设施内部微生物组组成的差异，而跨大洲的设施选择则实现了更大尺度的地理对比。此外，这些研究站点涵盖了多种养殖方式、基因型多样性和生命支持系统，这些都是现代水产养殖的常见实践，使得研究结果可广泛应用于其他研究场景。

本研究涉及的两所美国设施均坐落于俄勒冈大学主校区。第一所是水生动物护理服务斑马鱼设施（Ore1），该设施于2012年建成，最初投放的鱼类来自商业供应商。该设施占地面积约1000平方米，平均养殖容量为50000尾鱼（最大容量约88000尾），涵盖约2900个基因型品系。鱼类饲养在3.5升的亚克力水族箱中，这些水族箱连接着两套封闭式循环水养殖系统（RAS），该系统配备自动化的机械与生物过滤装置，以及紫外线（UV）消毒设备。此外，还设有独立的检疫区，配备专用的流水养殖系统。

美国第二个斑马鱼研究设施——斑马鱼国际资源中心（Ore2）于1999年建成，2001年投入运营。Ore2占地面积900平方米，平均饲养3万条斑马鱼（最大容量约15万条），拥有约45个活体基因型品系，并有超过4.4万个基因型保存在低温环境中。Ore2的布局与生命维持系统与Ore1相当，斑马鱼分别饲养在3.5升亚克力鱼缸和75升玻璃鱼缸中。该设施与Ore1相距约300米，可对这两个相邻设施进行对比研究——二者共享相似的局部环境，但各自独立运行。

挪威的三个斑马鱼研究设施位于挪威特隆赫姆的挪威科技大学Øya校区和Gløshaugen校区。Yaksi实验室设施（Nor1）位于Øya校区，于2014年建成，用于脑功能和神经系统疾病的研究。该设施面积为70平方米，饲养着约10000条斑马鱼，涵盖100多种基因型品系。斑马鱼被饲养在容量为3.5升的亚克力水箱中，这些水箱连接着循环水养殖系统经过紫外线处理。此外还有一个独立的隔离区，该区域采用流通系统，配备约50个水箱。

尤特费尔特实验室设施（Nor2）位于格洛绍根校区，该设施最初于20世纪90年代作为通用动物设施建成，2015年至2020年间被改造为饲养鱼类的场所。实验室在五个独立的房间（每个房间面积约10至30平方米）内饲养斑马鱼和孔雀鱼（孔雀花鳉），每个房间均配备独立的生命维持系统。尽管行政上该实验室被视为一个整体，但由于系统配置存在差异，我们将尤特费尔特实验室中两个仅饲养斑马鱼的房间分别称为Nor2A和Nor2B。

Nor2A 配备了约50个3.5升丙烯酸水箱，安装在独立的循环水养殖系统上并配备紫外线处理装置。Nor2B 包含14个75升玻璃水箱，这些水箱连接有流通式过滤系统，但未配备紫外线处理装置。Nor2 两个房间总共饲养着约2000条鱼。与其他饲养实验室常用斑马鱼品系的设施不同，尤特费尔特实验室仅饲养两种斑马鱼：一种是2016年在印度野外捕获个体的后代（与野生个体相隔约6至10代，饲养于Nor2B），另一种是野生型与卡斯珀品系的杂交斑马鱼（饲养于Nor2A）。

样本采集与处理

养殖箱水

我们从每个设施内具有代表性数量的水箱中，每个水箱采集一份水样，目标是连接单一循环水养殖系统且饲养成年斑马鱼的水箱。我们调整了水箱数量根据各设施的规模和养殖系统配置进行抽样（样本编号：(n =)，其中 Ore1 有 22 个养殖池；Ore2 有 12 个养殖池；Nor1 有 7 个养殖池；Nor2A 有 6 个养殖池；Nor2B 有 3 个养殖池）。对于每个循环水养殖系统（RAS），我们选取一到两个相邻的养殖架组，再从每组中随机挑选三个养殖架。在每个选定的养殖架上，随机抽取三个养殖池。当可用养殖架或养殖池数量少于三个时（例如 Nor2B，仅有两个养殖架，每个养殖架有两个养殖池），则对所有可用养殖池进行抽样。

为收集微生物生物量，我们使用60毫升注射器将150毫升水箱水通过0.2微米的Sterivex滤筒（美国马萨诸塞州的MilliporeSigma公司）。我们将Sterivex滤膜密封并置于冰上直至处理。若无法立即进行DNA提取，我们将干燥的滤筒储存在−80摄氏度的环境中。

斑马鱼

我们从用于水样采集的同一水箱中收集斑马鱼（样本编号：(n =)，其中Ore1组55尾、Ore2组5尾、Nor1组36尾、Nor2A组23尾、Nor2B组15尾）。我们通过快速冷冻的方式对斑马鱼实施安乐死，并从每个水箱中采集4尾个体。若可获取的斑马鱼数量不足4尾或采样条件受限，则尽可能采集个体。

同日，我们对每条鱼的完整肠道进行无菌解剖，将其转移至一个2毫升的RHINO螺口管中，该管内装有氧化锆珠和400微升酶裂解缓冲液（20毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH值8.0；2毫摩尔乙二胺四乙酸二钠；1.2% Triton X-100）。若无法立即进行DNA提取，我们将这些管置于-80摄氏度下保存。

微生物DNA提取

水箱水

我们使用DNeasy PowerWater Sterivex试剂盒（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市凯杰公司）进行DNA提取。DNA提取严格按照试剂盒手册（2009年，第9页）提供的标准方案进行。

斑马鱼

我们参考Stephens等人（2015年）的研究，基于DNeasy血液与组织组织试剂盒快速启动方案，对斑马鱼肠道样本进行了改良的DNA提取操作。

16S rRNA基因扩增、文库制备与测序

使用 Qubit dsDNA HS 检测试剂盒（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司）对 DNA 提取产物进行定量分析。为扩增 16S 核糖体RNA基因的 V4 区域，使用双索引引物（515F–806R），并按照卡波拉索等人（2011年）的研究加入独特的8碱基对索引序列：515F (AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[index]TATGGTAATTGTGTGCCA GCMGCCGCGGTAA) 和 806R（CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[索引]AGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT）。

PCR反应体系包含12.5微升NEBNext Q5热启动高保真PCR预混液（美国马萨诸塞州伊普斯维奇市纽英伦生物实验室公司）、10.5微升DNA模板、1微升牛血清白蛋白（美国赛默飞世尔科技公司）以及1微升混合引物（浓度为12.5毫摩尔/升）。循环条件设置为：98℃初始变性30秒；30个循环，每个循环包括98℃变性10秒、61℃退火20秒、72℃延伸20秒；最后72℃终延伸2分钟。样品在4℃下保存，直至从PCR扩增仪中取出。

为确认扩增成功，将PCR产物在琼脂糖凝胶上进行可视化。使用Mag-Bind RxnPure Plus磁珠分离磁珠，采用改良的0.8倍反应体积方案（Omega Bio-Tek公司，美国佐治亚州诺克罗斯市）对扩增子文库进行两轮纯化。随后使用Quant-iT 1倍双链DNA高灵敏度检测试剂盒（赛默飞世尔科技公司）和SpectraMax M5E微孔板读板机（Molecular Devices公司，美国加利福尼亚州圣何塞市）对文库浓度进行定量。将各文库按等摩尔浓度混合，由俄勒冈大学基因组学与细胞表征核心实验室使用Illumina MiSeq测序仪（Illumina公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥市）进行测序，采用150碱基对双端读长模式。

生物信息学

我们在 R 语言中完成了所有生物信息学分析。我们使用 DADA2 1.16 对序列进行解复用和去噪，以构建扩增子序列变体（ASV）表。我们利用 RDP 分类器和 Silva NR99 v.138.1 16S 核糖体 RNA 基因参考序列对序列进行分类学注释数据库。我们采用基于流行率的方法结合'decontam'工具评估样本污染物，该工具根据污染物在阴性对照样本中相对于真实样本的出现频率来识别污染物。此分析将三个ASV鉴定为污染物：ASV 10（施氏假单胞菌）、ASV 29（生丝单胞菌属）和ASV 466（紫杆菌属），随后将其从所有下游分析中移除。

基于扩增子序列变体（ASV）序列构建了系统发育树，用于非加权UniFrac距离计算。ASV序列通过'msa'包中实现的MUSCLE算法进行比对。利用'phangorn'包从最大似然距离构建初始邻接树，随后采用包含随机重排的GTR+Γ+I替换模型，通过最大似然估计对其进行优化。所得的最大似然树在纳入后续系统发育分析前已完成定根。

统计分析

我们在 R 语言中完成了所有统计分析。使用 phyloseq 包计算了α多样性指标（香农指数和逆辛普森指数）。采用 Bray-Curtis 相异度和非加权 UniFrac 距离来评估β多样性，这些指标通过 vegan 包计算得到。所有图表均由 ggplot2 包绘制。

分析前，我们剔除了读长少于1000的样本，这类低质量样本不太能代表真实的群落组成，最终得到50个水样样本（Ore1：(n=22)；Ore2：(n=12)；Nor1：(n=7)；Nor2A：(n=6)；Nor2B：(n=3)）和134个鱼类样本（Ore1：(n=55)；Ore2：(n=5)；Nor1：(n=36)；Nor2A：(n=23)；Nor2B：n(=15)）。针对所有单一样本类型的分析，鱼类肠道样本和水样在质量过滤后分别进行稀疏化至各自的最小读长数——鱼类肠道样本为1171条读长，水样为1291条读长。对于鱼类肠道与水样微生物组的联合分析，所有样本均稀疏化至1171条读长的统一阈值，以确保不同样本类型间的测序深度一致。联合分析的结果对稀疏化阈值的选择具有稳健性，不同阈值下仅观察到可忽略的差异。稀疏化前，每个样本的平均序列读长数为：水样16624±10171（标准差），鱼类样本22047±27137（标准差）。

为检测不同设施水样中α多样性的差异，我们采用非参数Kruskal-Wallis检验，随后进行带有Benjamini-Hochberg p值校正的两两Wilcoxon秩和检验。对于鱼肠道样本，使用线性混合模型（LMM）评估α多样性，以设施为固定效应、养殖缸为随机效应，以考虑养殖缸内鱼类的非独立性，该模型通过‘lme4’和‘lmerTest’包实现。整体显著性采用Satterthwaite法的III型方差分析（ANOVA）进行评估，事后两两使用 'emmeans' 包结合 Benjamini-Hochberg 校正对估计边际均值进行了比较。

为评估地理位置、设施和基因型状态对微生物群落差异的影响，我们运用`vegan`包中的`adonis2`函数，通过9999次置换完成了置换多变量方差分析（PERMANOVA）。我们采用分层模型公式来考虑数据的嵌套结构，即设施嵌套于地理位置（挪威与俄勒冈州）之中。为确定在排除设施水平差异后，基因型状态是否独立影响微生物组组成，我们借助`permute`包的`how()`函数，在每个设施内部限定置换范围，开展了约束性PERMANOVA分析。我们使用`vegan`包中的`betadisper`函数评估组内离散度的多变量同质性，并通过9999次置换的`permutest`函数检验其显著性。对于鱼类样本，为考虑 tanks 内鱼类的非独立性，我们利用`permute`包的`how()`函数按 tanks 对`betadisper`置换进行分层。在`permutest`中，我们采用基于置换的成对检验完成了成对离散度比较。

在进行鱼类β多样性分析时，由于每个养殖缸均采集了多条鱼类样本，因此在计算距离矩阵前，需将单个鱼类样本汇总至养殖缸水平的群落平均特征谱。该汇总步骤在稀疏化处理后进行，以保留基于计数的完整性标准化。水箱水平的聚合解决了水箱内鱼类的非独立性问题，并确保无论采样的鱼类数量如何，每个水箱对设施水平分析的贡献都相等。使用 'pairwiseAdonis' 包进行成对 PERMANOVA 检验，采用 Benjamini-Hochberg 校正和 9999 次置换。主坐标分析（PCoA）用于可视化微生物组组成的聚类。对于鱼类肠道和水体微生物组的联合分析，仅使用 Bray-Curtis 相异度，因为 UniFrac 距离的计算需要共享的系统发育树。合并鱼类和水体的 phyloseq 对象会导致不同样本类型之间的特征点数不同，若要使用共享的系统发育树，就必须大幅减少类群的表征，因此无法采用该方法。

选择Bray-Curtis相异度和未加权UniFrac距离作为互补指标；Bray-Curtis能捕捉以丰度加权的组成差异，而未加权UniFrac整合了系统发育相关性，可捕捉存在/缺失变异，鉴于观察到地理上不同的谱系间存在分类学重叠，这一点尤为重要。未纳入加权UniFrac是为了限制距离指标的数量并保持分析的聚焦性。

为生成相对丰度汇总，将扩增子序列变体（ASVs）在属水平进行合并。对于鱼肠道样本，先合并至养殖池水平的平均丰度谱再计算相对丰度，随后平均至设施水平，以确保各养殖池权重相等，不受鱼样本数量影响。对于水样，直接将相对丰度平均至设施水平。

针对每种样本类型单独及组合分析，筛选出了在所有设施中相对丰度超过1%的菌属。使用‘fantaxtic’包绘制相对丰度可视化图。为识别对设施间群落组成差异贡献最大的菌属，我们在‘vegan’包中采用Bray-Curtis相异度进行了相似性百分比（SIMPER）分析。对于鱼肠道样本，为与其他β多样性分析保持一致，SIMPER分析基于养殖缸水平的聚合群落特征进行。在每两两设施比较中均应用Benjamini-Hochberg校正，以同时检测多个分类群的多重检验偏差。报告结果为每次比较中贡献度最高的显著差异菌属。

在对鱼肠道与养殖水箱微生物组进行成对β多样性比较时，Bray-Curtis相异度值被按层级划分为三组：（1）同一养殖水箱的鱼肠道与水样样本；（2）同一养殖场所但不同水箱的鱼肠道与水样样本；（3）不同养殖场所的鱼肠道与水样样本。该层级分类确保同一水箱的样本对不会被归入同一养殖场所类别。所有比较均采用水箱平均后的鱼类群落丰度谱作为数据基础。由于不同类别间成对比较的数量存在固有失衡，且同一养殖场所内的样本不具有独立性，研究结果以描述性方式呈现，未进行正式的显著性检验。Ore2 被排除在该分析因采用单缸鱼类表征(n=1) 号缸）而无法开展有意义的设施内对比。

FEAST 分析在每个设施内分别按 ASV 级别进行，因为鱼类不会接触到来自其他设施的水体。污染源被定义为与水槽鱼类肠道样本来自同一设施的水箱水体样本，未知部分则代表设施水箱水体未覆盖到的微生物来源，包括饮食、宿主生理或其他设施特定环境因素的潜在贡献。单个鱼类肠道样本被作为汇，因为源追踪旨在评估环境来源对单个群落组成的贡献，而非检验组水平差异。来源贡献被分为同水箱（来自鱼类自身水箱的水体）、同设施（来自同一设施内其他水箱的水体）或未知三类。由于微生物交换可能是双向的，我们还进行了反向分析，将水体样本作为汇、鱼类肠道样本作为源。由于来源比例的组成特性以及设施内样本的非独立性，无法进行正式的显著性检验，因此仅对结果进行描述性呈现。在以水体为汇的分析中排除了 Ore2，因为十二个水体样本中仅有一个有来自同水箱的对应鱼类肠道样本，无法进行有意义的设施水平解读。

所有基于鱼类的分析均重复进行，剔除了 Ore2 设施(n=5) 鱼类，单缸）作为敏感性分析，原因是该设施内不存在养殖缸。复制性以及样本量较小的问题。敏感性分析结果见补充文件5，若结论与主要分析结果存在差异，则在结果部分予以说明。

图1：水产养殖设施（区域、名称、缩写及水系类型）以及从养殖水箱水体和斑马鱼身上采集的样本。两张斑马鱼养殖水箱的照片（左侧为Ore1；右侧为Nor2B）展示了现代水产养殖设施中常见水箱的多样性和布局。Ore1设施图片由凯利·克里斯滕森于2024年（俄勒冈大学）提供。Nor2B设施图片由凯拉·埃文斯于2022年拍摄。

图2：养殖水体微生物群的α多样性指标，(A) 香农多样性。（B）逆辛普森多样性。图基式箱线图展示了中位数（中间的水平线）和四分位距（箱体的上下边界），须须延伸至四分位距的±1.5倍；单个点代表单个水样。经本雅米尼-霍奇伯格校正的成对威尔科克森秩和检验后，各设施的香农多样性与逆辛普森多样性均无显著差异（香农多样性：克鲁斯卡尔-沃利斯检验 (p=0.233)；逆辛普森多样性：克鲁斯卡尔-沃利斯检验 (p=0.035)；校正后无任何成对比较达到显著性水平）。

图3：不同水产养殖场水箱水微生物组样本的门和属水平分类组成。每个柱状图代表一个水箱水样本。平均相对丰度按水产养殖场分组，仅展示各样本中丰度排名前五的门以及每个门内丰度排名前四的属的平均相对丰度。

图4：不同水产养殖设施中养殖水体微生物群的β多样性。(A) 布莱-柯蒂斯距离和(B) 非加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）。颜色和实心椭圆代表各个养殖设施（95%置信椭圆）。虚线椭圆表示地理区域分组（俄勒冈州和挪威）。单个点代表单个水样，每个养殖池采集一个样品。

图5：斑马鱼肠道菌群的α多样性指标，其中(A)为香农多样性，(B)为逆辛普森多样性。图基式箱线图展示了中位数（中间水平线）和四分位距（箱体的上下边界），须线延伸至四分位距的±1.5倍。采用线性混合模型评估显著性，将养殖箱作为随机效应以消除养殖箱内斑马鱼的非独立性影响。事后两两比较采用估计边际均值法，并进行Benjamini-Hochberg p值校正；共享同一字母的设施之间无显著差异 (p-adj. >0.05)。Nor2A（b）的香农多样性显著低于Nor1、Nor2B和Ore1（均为(p-adj. ≤0.006)）。逆辛普森多样性未检测到显著的两两差异。经质量控制审核后，所有分析中均保留了一个逆辛普森多样性升高的Ore1样本。

图6：不同水产养殖场斑马鱼肠道微生物组样本的门和属水平分类组成。平均相对丰度按水产养殖场分组，仅展示各养殖场样本中丰度排名前五的门，以及每个门内丰度排名前四的属。

图7：不同水产养殖设施中斑马鱼肠道菌群的β多样性。(A) 布莱-柯蒂斯距离和(B) 非加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）。颜色和实心椭圆代表各个养殖设施（95%置信椭圆）。虚线椭圆表示地理区域分组（俄勒冈州和挪威）。每个点代表养殖桶的群落平均图谱。

图8：不同水产养殖设施中斑马鱼肠道与养殖水体微生物群的β多样性。对合并的鱼肠道（圆形）和养殖水体（三角形）样本进行基于Bray-Curtis相异度的主坐标分析（PCoA）。不同颜色代表各个独立的养殖设施。实心椭圆代表各设施的95%置信区间。单个鱼肠道数据点代表以养殖池为单位的群落平均特征；单个水体数据点代表单一样本的水体微生物群，每个养殖池采集一份水样。Bray-Curtis相异度仅用于合并分析，因为UniFrac距离的计算需要共享的系统发育树，而若要在两种样本类型间构建这样的系统发育树，势必会大幅减少类群的代表性。

图9：利用微生物源追踪快速期望最大化算法（FEAST）对不同水产养殖设施中斑马鱼肠道和养殖水箱水体微生物组进行微生物源追踪。（A）以设施内养殖水箱水体为源、被归类为汇的鱼肠道微生物组。（B）以设施内鱼肠道微生物组为源、被归类为汇的养殖水箱水体微生物组；图B中排除了Ore2，因为12个水体样本中仅有1个来自同一水箱的对应鱼肠道样本，无法进行有意义的设施水平分析。源贡献分为同一水箱（与汇样本来自同一水箱的水体或鱼）、同一设施（同一设施内其他水箱的水体或鱼）或未知来源（未被设施内养殖水箱水体或鱼肠道样本覆盖的来源，可能包括饲料、宿主生理或其他设施特异性环境因素）。每个点代表单个汇样本；箱线图展示了中位数（中间水平线）和四分位距，须须延伸至四分位距的±1.5倍处。结果以描述性方式呈现，原因在于来源占比的构成特性以及机构内样本的非独立性，使得无法进行正式的显著性检验。