题目：Studies on the anticonvulsant potential of 6-gingerol, an active ingredient of ginger rhizome

原文链接：https://www.frontiersin.org/journals/pharmacology/articles/10.3389/fphar.2026.1740324/full

期刊:Frontiers in Pharmacology

摘要

生姜（Zingiber officinale）凭借其多样的治疗特性，持续吸引着研究人员的关注。其中一种特性是其抗惊厥活性，正如我们此前的研究所示，这种活性可能源于6-姜烯酚的存在——该化合物可减轻戊四氮（PTZ）诱导的斑马鱼幼虫运动过度行为。在本研究中，我们进一步利用斑马鱼幼虫和小鼠的多种癫痫发作与癫痫模型，探究了6-姜烯酚的抗惊厥作用。首先，我们发现6-姜烯酚能降低戊四氮暴露的斑马鱼幼虫中神经元PAS结构域蛋白（npas4）基因的过表达，但对脑源性神经营养因子（bdnf）的表达无影响。6-姜烯酚的抗惊厥作用在斑马鱼幼虫的2-酮-4-戊烯酸乙酯癫痫发作测试中表现显著，但在毛果芸香碱模型，以及SCN1LAB（德雷夫综合征模型）和CACNA1AA（失神发作模型）斑马鱼 morphant 中未观察到该作用。在小鼠体内，6-姜烯酚可穿透血脑屏障，并在32毫安强度下抑制6赫兹电刺激引发的精神运动性癫痫发作，但在44毫安强度下则无此效果。我们未在小鼠的最大电休克测试或定时静脉输注戊四氮癫痫发作测试中观察到6-姜烯酚的任何抗惊厥作用。综上，本研究结果为6-姜烯酚的抗惊厥作用提供了进一步证据；不过，仍需开展更多研究以阐明其作用机制。

关键词：6-姜烯酚、抗惊厥活性、生姜、小鼠、癫痫发作、斑马鱼

引言

癫痫是一种由中枢神经系统神经元异常且同步放电引发的慢性疾病。全球约有7000万人受其影响，使其成为最常见的神经系统疾病之一（蒂斯等人，2019年）。癫痫综合征通常以癫痫发作为特征，发作的症状表现因神经元异常电活动累及的脑区不同而存在差异——从短暂的意识障碍、意识混乱与定向障碍，到各类自主神经（如血压变化、出汗、心率改变）和感觉（如瘙痒、嗅觉或视觉幻觉）障碍，再到运动性发作（肌阵挛性、阵挛性、强直性或张力丧失性发作）。

由于癫痫的症状和病因多种多样，其诊断具有挑战性。为实现最佳的癫痫发作控制，选择恰当且有效的治疗方案至关重要。尽管抗癫痫药物（ASM）的研发取得了重大进展，但约30%的患者对药物治疗无反应，这被称为耐药性或难治性癫痫（Belete, 2023; Löscher 等人, 2013）。目前医药市场上的抗癫痫药物仅能缓解症状，既无法预防高危人群患上癫痫，也不能逆转癫痫发生过程对大脑造成的改变。因此，要提高癫痫治疗的疗效，就需要开发能够特异性靶向癫痫发作和癫痫发生分子与细胞机制的药物。此外，研发更安全的药物也仍是当务之急，因为药物治疗期间出现的严重副作用会导致患者停药，即便这些药物能显著减少癫痫发作的次数（Löscher 等人, 2020; Łukasiuk 与 Lasoń, 2023）。

天然植物来源的化合物仍在被研究作为新型抗癫痫药物的潜在来源；例如，大麻二酚（Martimbianco 等人，2025；Moreira 等人，2024；Borowicz-Reutt 等人，2024）和石杉碱甲（Damar 等人，2016）。此外，姜根茎的提取物和化合物引起了研究人员的关注。众多研究表明，从姜中分离出的化合物，即6-姜酚，能够穿过血脑屏障（Simon 等人，2020；Lim 等人，2025；Kuswandani 等人，2025），因此可能会影响中枢神经系统的活动。我们之前的研究发现，在斑马鱼幼虫的戊四氮（PTZ）癫痫发作试验中，从姜根茎提取物中分离出的6-姜酚具有抗惊厥特性（Gawel 等人，2021）。PTZ 诱导的癫痫发作是早期临床前研究中使用啮齿动物和斑马鱼筛选具有抗惊厥活性化合物的常用模型（Rubio 等人，2024）。6-姜酚可降低 PTZ 诱导的斑马鱼幼虫运动亢进（这被视为惊厥活性的标志物），同时也能抑制幼虫视顶盖中检测到的局部场电位（LFP）事件的发生。通过行为学和脑电图（EEG）分析确定的6-姜酚抗惊厥作用，还与γ-氨基丁酸（GABA）和谷氨酸水平的变化相关；即6-姜酚可使 PTZ 诱导的谷氨酸/γ-氨基丁酸比例变化恢复正常（Gawel 等人，2021）。

本研究旨在进一步评估6-姜酚的抗惊厥特性，从而为对其治疗特性及作为癫痫疗法的潜在效用进行更准确的评估。首先，我们通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析，在分子水平上验证了此前在斑马鱼幼虫戊四氮（PTZ）癫痫发作实验中获得的结果，以此评估两种神经元活性标志物——脑源性神经营养因子（bdnf）基因和神经元Per-Arnt-Sim（PAS）结构域蛋白（npas4）基因的mRNA表达变化。我们继续利用斑马鱼幼虫的癫痫发作模型开展研究，即2-酮-4-戊烯酸乙酯（EKP）和毛果芸香碱（PILO）诱导的癫痫发作实验，同时也采用了小鼠的scn1lab、cacna1aa三种实验模型，即静脉注射（i.v.）戊四氮癫痫发作阈值实验、最大电休克实验以及6-Hz诱导的精神运动性癫痫发作实验。此外，我们还评估了6-姜酚对运动协调能力（通过烟囱实验评估）和神经肌肉力量（通过握力实验评估）的影响，以估算可能显著限制该化合物治疗用途的潜在副作用。

材料与方法

药物与试剂

PTZ、盐酸毛果芸香碱（PILO）和丙戊酸钠（VPA）购自美国密苏里州圣路易斯市的 Sigma Aldrich 公司，于使用当天溶解在超纯水（miliQW）或生理盐水（0.9% 氯化钠溶液）中。与超纯水混合的 2-酮-4-戊烯酸乙酯（EKP）由波兰卢布林医科大学的 Tomasz Wróbel 博士按照此前详细描述的方法合成（Nieoczym 等人，2024）。6-姜酚的提取方法详见补充材料。

斑马鱼饲养与伦理声明

在所有斑马鱼实验中（波兰卢布林医科大学以及挪威奥斯陆大学挪威分子医学中心），使用了受精后5天内（dpf）的AB品系斑马鱼幼鱼。胚胎及后续的幼鱼在标准养殖条件下（培养箱中：28.5℃±0.5℃，14/10小时明暗周期），于人工斑马鱼水（E3培养基）中饲养，该培养基成分为1.5 mM HEPES（pH 6.5）、17.4 mM 氯化钠、0.21 mM 氯化钾、0.12 mM (MgSO_{4})、0.18 mM (Ca(NO_{3})_{2})。实验开始前（第3天或第4天），每日更换鱼用水。

根据现行欧洲法规，由于使用的是5天受精后（dpf）的幼虫，因此无需获得在波兰开展实验的伦理许可。对于在挪威进行的实验（吗啉代寡核苷酸注射和局部场电位记录），已获得挪威食品管理局的批准（FOTS-ID 30816）。无论在哪个国家，饲养和实验程序均符合美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》、2010年9月22日欧盟关于保护用于科研目的动物的指令（2010/63/EU）以及ARRIVE指南的要求。研究人员尽一切努力最大限度地减少幼虫所承受的压力和痛苦。如适用，会使用15微摩尔的三卡因溶液对幼虫实施安乐死。在条件允许的情况下，分析工作由对实验组不知情的观察者完成。

EKP和PILO诱导的斑马鱼幼鱼癫痫检测实验

实验按照先前描述的方法进行（Gawel 等人，2024；Nieoczym 等人，2024）。简要来说，将4日龄的幼虫置于48孔板中，在培养箱（28.5℃±0.5℃）中用不同浓度的6-姜酚（12.5、25、31.25或37.5μM）孵育22小时。每孔包含1只幼虫。行为追踪在28.5℃、受控光照条件下进行。6-姜酚溶于纯DMSO制备储备液，使用前用胚胎培养基稀释。最终溶液中DMSO的终浓度不超过0.2%。添加等浓度DMSO的培养基作为溶剂对照。

所用浓度由我们早期的研究确定（Gawel 等人，2021）。作为后续处理，我们加入了 miliQW 或化学惊厥剂（最终浓度为 200 微摩尔的 EKP 或最终浓度为 50 毫摩尔的 PILO）（Gawel 等人，2024；Nieoczym 等人，2024）。延迟 2 分钟（针对 PILO）或 5 分钟（针对 EKP）后，启动 Noldus（荷兰瓦赫宁根）追踪设备进行轨迹记录。整个分析过程耗时 30 分钟（针对 EKP）或 28 分钟（针对 PILO）。使用 EthoVision XT 软件（荷兰瓦赫宁根 Noldus 公司）进行数据收集和分析。以幼虫移动的距离（单位：毫米）作为分析指标。所有实验均重复三次，并对数据进行汇总。

反义吗啉代寡核苷酸注射

为实现目标基因的部分敲低，我们从美国俄勒冈州菲洛马斯市的 GeneTools LLC 公司购买了反义吗啉代寡核苷酸（MOs）。将其注射到单细胞或两细胞阶段的斑马鱼胚胎中。使用斑马鱼标准对照吗啉代寡核苷酸（序列 5′-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA）作为对照（每个胚胎 9 纳克，体积 1.5 纳升）。德拉维综合征斑马鱼模型 scn1lab 的吗啉代寡核苷酸序列选自 Zhang 等人（2015 年）的研究（翻译阻断型吗啉代寡核苷酸：5′-CTGAGCAGCCATATTGACATCCTGC-(3'')；每个胚胎 9 纳克，体积 1 纳升）。失神性发作斑马鱼模型 cacna1aa 的吗啉代寡核苷酸序列基于我们此前的研究（Gawel 等人，2020 年）选定（针对 cacna1aa-201、cacna1aa-202 和 cacna1aa-203 转录本的 ATG 密码子的序列分别为 (5'')-TGTACTCAATGGAGTGAG AATCAT-(3'') 和 5′-TCATCTCCGAACCGAGCCATTCTAT-3′）。cacna1aa 吗啉代寡核苷酸的注射剂量为 2.5 纳克 + 2.5 纳克，每个胚胎总注射体积为 1.5 纳升。两个实验中的对照组均为注射 cacna1aa 和 scn1lab 吗啉代寡核苷酸的斑马鱼胚胎。

对scn1lab和cacna1aa morphant斑马鱼进行LFP记录的评估

为评估6-姜酚（浓度37.5微摩尔）对scn1lab和cacna1aa基因敲低斑马鱼胚胎中癫痫样放电的影响，本研究按照先前描述的方法进行了局部场电位（LFP）记录（Gawel等人，2020年；Gawel等人，2021年；Gawel等人，2024年）。癫痫样事件被定义为超过基线噪声水平三倍的放电。简要来说，将3天龄（dpf）的斑马鱼幼虫在6-姜酚中孵育22小时，随后置于含2%低熔点琼脂糖（Sigma-Aldrich公司）的载玻片上。美国）。随后，将空心玻璃电极（1–5兆欧）插入4天龄幼体的大脑中（精准插入中脑区域的视顶盖）（使用美国 Axon 仪器公司的 MultiClamp 700B 放大器和 Digidata 1550 数据采集仪）。人工脑脊液包含124毫摩尔氯化钠、2毫摩尔氯化钾、2毫摩尔(MgSO_{4})、2毫摩尔(CaCl_{2})、1.25毫摩尔(KH_{2} PO_{4})、26毫摩尔碳酸氢钠和10毫摩尔葡萄糖。每次记录持续20分钟。使用 Clampfit 10.20 软件进行数据处理（Molecular Devices 公司）。

表1 本研究中使用的各引物序列

实时荧光定量PCR

采用 PureLink™ RNA 迷你试剂盒（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司）按照制造商说明书进行 RNA 提取。使用高容量 cDNA 逆转录试剂盒（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司）按照制造商说明书进行逆转录反应。采用 (GoTaq {circledR}) 预混液（美国威斯康星州麦迪逊市普洛麦格公司）进行实时聚合酶链式反应。以核糖体 RNA（18S 核糖体RNA）和β2-微球蛋白（b2m）作为内参（持家基因）。计算基因的相对表达量使用(2{-Delta A C t})方法。中使用的引物的序列表1列出了实时荧光定量PCR的相关数据。

小鼠

最大电休克癫痫（MES）、6赫兹精神运动性癫痫和转棒实验均在美国西雅图的华盛顿大学开展，实验使用雄性CF-1小鼠（体重25-40克；5-6周龄；查尔斯河实验室）。小鼠以每笼五只的密度饲养，笼内铺有玉米芯垫料，饲养于温度可控的无特定病原体动物房，光照周期为14小时光照/10小时黑暗（开灯时间：上午06:00，关灯时间：晚上20:00）。除行为操作期间外，实验动物可自由获取辐照饲料（Picolab 5053）和过滤水。小鼠需适应饲养环境至少5天，并在实验前适应测试环境至少1小时。所有实验均在动物的光照期进行。实验动物通过(CO_{2})窒息法实施安乐死。本研究未设计评估性别作为生物学变量的影响，因此仅使用雄性小鼠。所有动物实验均获得华盛顿大学的批准华盛顿机构动物护理与使用委员会遵守《动物研究：体内实验报告》（ARRIVE）指南，并依据美国公共卫生服务部《实验动物人道护理与使用政策》开展相关研究。

在波兰卢布林的玛丽·居里-斯克洛多夫斯卡大学，研究人员使用从德国苏尔茨费尔德的查尔斯河公司购买的成年雄性Crl: CD1(ICR)小鼠（体重25–35克）开展了药代动力学研究、戊四氮（PTZ）静脉癫痫模型、握力测试和烟囱测试。实验动物饲养在温度21℃–24℃、相对湿度45%–65%、12小时光照/12小时黑暗的环境中（早6:00开灯）。实验动物可自由采食颗粒饲料并饮用新鲜水。小鼠经过至少7天的隔离检疫并适应饲养环境后，才用于实验。所有行为学测试均在光周期的早8:00至下午4:00之间进行。饲养和实验流程均符合2010年9月22日欧盟指令（2010/63/EU）的指导原则、ARRIVE指南以及波兰关于动物实验的法律法规。所有实验流程均获得卢布林当地伦理委员会的批准（许可证号：76/2024）。

药代动力学研究

6-姜酚悬浮于含1%吐温的生理盐水（0.9%氯化钠）中，以10毫克/千克的剂量腹腔注射给药（每个时间点n=5）。在给予化合物后的15、30、45、60、120和360分钟六个时间点采集血样，于室温下静置20分钟使其凝固。从颅骨中取出大脑，并用0.9%生理盐水冲洗。血样以8000转/分钟的速度离心10分钟。获得的血清和大脑均保存在-80摄氏度下，直至进行分析。生物材料中6-姜酚含量的测定方法详见补充材料。

药代动力学数据分析

药代动力学参数采用Monolix 2023R1（学术免费版）软件计算，该软件由模拟加公司旗下的利克索夫公司开发，采用非房室模型法。最大血药浓度（Cmax）与达峰时间（tmax）直接取自浓度 - 时间曲线。外推至无穷大的血清平均浓度 - 时间曲线下面积（AUC₀₋∞）采用对数 / 线性梯形法估算，外推面积计算公式为：终末点浓度（Clast）/ 终末消除速率常数（λz），其中Clast为末次采样时间（tlast）测得的药物浓度。同理，一阶矩曲线下面积（AUMC）通过AUMC₀梯形面积与外推面积相加计算得出。终末消除速率常数（λz）由药物浓度终末相数据经对数线性回归求得；** 终末半衰期（t₁/₂λz）** 计算公式为：0.693/λz。终末相表观分布容积（Vz/F）计算公式为：给药剂量 /（λz・AUC₀₋∞）；表观清除率（CL/F）计算公式为：给药剂量 / AUC₀₋∞，其中F为药物吸收分数。** 平均滞留时间（MRT）** 计算公式为：AUMC₀₋∞/AUC₀₋∞。

小鼠癫痫测试

动物在用于实验前，需适应饲养环境至少一周。实验在动物在实验室环境中适应30分钟或60分钟后开展。此外，为避免惊厥易感性的日间变化，对照组和药物组的实验均在同一天进行。

最大电休克试验

MES测试是一种经过验证的人类全身性强直-阵挛性癫痫发作模型，也是评估抗癫痫候选药物的关键临床前筛选工具（Castel-Branco 等人，2009；White 等人，1995；Löscher 等人，1991）。小鼠腹腔注射6-姜酚（10和60毫克/千克）15分钟后，采用与Woodbury和Davenport最初描述相似的装置（Woodbury和Davenport，1952），以50毫安（持续时间0.2秒；频率60赫兹）对小鼠进行经角膜电刺激。电刺激前，立即向眼部滴入一滴麻醉剂（0.5%丁卡因）进行局部麻醉。刺激前立即用0.9%生理盐水润湿电极尖端，以确保最佳的导电性和与角膜的接触。刺激过程中对小鼠进行手动固定，随后转移至观察笼中监测癫痫发作。MES诱导的癫痫发作表现为后肢强直伸展与身体平面的夹角大于90°。保护作用定义为未出现后肢强直伸展。每个实验组的动物数量在6至11只之间。

6型精神运动性癫痫发作测试

小鼠6 Hz诱导癫痫模型是一种实验工具，用于评估抗惊厥物质对人类部分性癫痫的潜在疗效（Barton等人，2001年）。实验过程中，实验人员手动固定小鼠，通过连接恒流电休克刺激器（Grass S48刺激器）的角膜电极，以32 mA或44 mA的强度给予低频电刺激（6 Hz，脉冲宽度0.2 ms矩形波，持续3秒）。刺激结束后，将小鼠置于有机玻璃观察箱中监测行为反应。精神运动性癫痫症状包括初始不动、胡须抽搐、下颌和前肢阵挛、点头、直立以及Straub尾征。未出现惊厥行为或症状持续时间少于10秒的动物被归为“保护组”，提示药物可能具有疗效。每组实验包含6-11只小鼠。

静脉注射戊四氮试验

戊四氮（PTZ）是一种γ- 氨基丁酸（GABA）受体拮抗剂，可在实验动物体内诱发惊厥，是强直 - 阵挛性惊厥的经典造模剂（Mandhane 等人，2007）。尽管皮下注射和腹腔注射（i.p.）均可诱发戊四氮惊厥，但静脉注射（i.v.）戊四氮惊厥阈值实验，在潜在抗惊厥化合物的临床前研究中具有特殊价值。该方法可评估受试化合物对可评估三种惊厥类型的发作阈值：肌阵挛性惊厥、全身性阵挛性惊厥和强直性惊厥（Mandhane 等人，2007）。本研究采用小鼠静脉注射戊四氮（PTZ）惊厥阈值实验，评估6 - 姜酚对惊厥阈值的影响。

戊四氮（PTZ）实验：将每只小鼠置于有机玻璃固定器中，便于进行尾侧静脉注射。注射采用27G、3/4 英寸规格针头（德国梅尔松根，贝朗梅尔松根公司，Sterican 系列），针头通过聚乙烯管（PE20RW）（美国弗吉尼亚州罗阿诺克市，Plastics One 公司）连接塑料注射器。注射器内装有0.9% 生理盐水配制的 1% 戊四氮溶液，并固定于微量注射泵（美国马萨诸塞州霍利斯顿市，哈佛仪器公司）。导管内出现回血，即确认针头成功刺入静脉；为防止惊厥时针头脱落，用医用胶带固定。注射完成后，将小鼠从固定器中取出，放入透明观察箱内自由活动。戊四氮溶液以0.2 毫升 / 分钟的恒定速率静脉输注，最长输注时长为 180 秒。记录从输注开始至三种惊厥发作的时间：肌阵挛抽搐、伴平衡丧失的全身性阵挛惊厥、后肢强直性伸展。惊厥阈值（诱发各类惊厥所需的戊四氮剂量）计算公式：戊四氮（毫克 / 千克）= [输注时长（秒）× 输注速率（毫升 / 秒）× 戊四氮浓度（毫克 / 毫升）] ÷ 体重（千克）实验组：每组12–18 只小鼠。

转棒实验

用于已接受最大电休克（MES）或 6 Hz 惊厥实验的小鼠，以评估运动协调能力损伤。将小鼠单独放置在一根绕长轴水平旋转的棒体上（转速6 转 / 分钟），连续进行 3 次测试，每次 1 分钟。运动协调正常的小鼠可停留在棒体上；协调能力受损的小鼠则会在60 秒内掉落（Dunham & Miya, 1957）。

烟囱实验

烟囱实验是一种简单的啮齿动物运动协调能力评估方法（Boissier 等人，2008）。实验中，让小鼠进入内径 3 厘米、长度 30 厘米的透明有机玻璃圆筒（烟囱）。当小鼠到达圆筒远端后，将圆筒竖直立起。若小鼠60 秒内未能向后爬出圆筒，则判定为运动协调能力受损。由于烟囱实验属于无创检测，因此在静脉注射戊四氮（PTZ）实验前立即进行。每组实验动物数量为 16 只。

抓力测试

抓力测试用于评估啮齿动物的神经肌肉功能，依据小鼠前肢抓握力进行检测（Meyer 等人，1979）。测试所用仪器由力传感器与金属网格连接构成。捏住小鼠尾部，将其靠近金属网格，使小鼠用前肢抓住网格，随后轻轻向后牵拉小鼠。仪器记录小鼠的最大抓握力（单位：毫牛，mN）。每只小鼠重复测量 3 次，结果按体重（g）标准化。抓力测试与烟囱实验均在静脉注射戊四氮（PTZ）实验前立即进行。

各组实验结果以平均肌力 ± 标准误（SEM）表示。每组实验小鼠数量为 16 只。

统计学分析

实验分组样本量在实验设计阶段确定，同时考虑统计检验效能。所有实验结果均进行离群值检验，仅对符合正态分布的数据集开展评估。

斑马鱼惊厥实验获得的运动活性数据不符合正态分布，因此采用非参数检验 Kruskal–Wallis 检验，后续进行Dunn 多重比较检验。统计推断主要基于总运动距离；分段时间数据仅作描述性呈现，以说明行为动态变化。数据以中位数及 95% 置信区间表示。

实时荧光定量 PCR 数据采用单因素方差分析（oneway ANOVA）进行统计，随后进行Tukey 事后检验。分析前先验证数据的正态性假设。结果以 ** 平均值 ± 标准误（SEM）** 表示。

cacna1aa 突变体与scn1lab 突变体中的局部场电位（LFP）事件数，因不符合正态分布，采用Kruskal–Wallis 检验进行比较。这两种癫痫遗传模型的数据以中位数及 95% 置信区间表示。

最大电休克（MES）、6 Hz 惊厥实验的惊厥发生率数据，以及烟囱实验结果，采用Fisher 精确检验分析。

静脉注射戊四氮（i.v. PTZ）实验的惊厥阈值数据：若变量符合正态分布，采用单因素方差分析 + Dunnett 事后检验；若不满足正态性假设，则采用Kruskal–Wallis 检验 + Dunn 事后检验。研究虽评估各组整体效应，但治疗效果判定以与对照组的事后比较结果为准。PTZ 实验数据以PTZ 平均剂量 ± 标准误或中位数及 95% 置信区间表示。

各项统计分析均针对各实验模型分别设定假设，因此未采用跨模型的整体校正。统计学显著性水平设定为 p < 0.05，所有检验均为双侧检验。

数据分析与图表生成使用GraphPad Prism 10 软件（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。

结果

6 - 姜酚从提取物中的分离结果

采用高效液相色谱 - 质谱联用技术（HPLC-MS），通过与标准品溶液比对，在制备的提取物中鉴定出6 - 姜酚。质谱分析结果显示，在所述实验方法下，6 - 姜酚的洗脱时间为 20.8 分钟，是生姜提取物中含量最高的主要成分之一（图 1A）。

图1 用于进一步分馏的姜根茎总离子色谱图，其中6-姜酚出峰时间为20.86分钟（A）；从姜提取物分馏得到的 CPC 色谱图，在290纳米下记录（B）；从 CPC 分馏的第一个峰中纯化6-姜酚时，制备型高效液相色谱仪在282纳米下记录的高效液相色谱-二极管阵列检测器典型色谱图（C）；在正离子模式下记录的总离子色谱图中，6-姜酚在20.8分钟处的出峰，该结果来自对 CPC 馏分的制备型高效液相色谱纯化（D）。

在CPC分析方法中引入梯度分离后，从姜提取物这种复杂基质中分离6-姜酚的效果令人满意。6-姜酚在分离12分钟后以第一个色谱峰的形式被洗脱出来——恰好出现在CPC色谱图的起始阶段。这一特点让该分析方法具备显著优势，分析时间短且溶剂消耗量低，后续针对6-姜酚分离的进样步骤也得以简化，仅需收集第一个洗脱峰即可（图1B）。 从CPC分离得到的6-姜酚富集馏分，通过半制备型高效液相色谱（HPLC）进一步纯化。制备型HPLC分析结果显示，收集到的馏分中含有四种主要成分，典型的制备型HPLC色谱图见图1C。该分析在等度洗脱条件下（乙腈/水体积比65:35）、282纳米波长处进行，流速为12毫升/分钟。 后续步骤旨在从收集的混合馏分中分离6-姜酚。代表性色谱图（图1D）显示，6-姜酚对应的色谱峰分离效果良好，于8至9分钟之间被收集，未观察到明显的共洗脱峰，表明6-姜酚与馏分中其他成分实现了有效分离。

通过HPLC-MS分析确认了纯化组分的身份和纯度（图1D）。正离子电喷雾电离（ESI+）模式下的质谱在20.8分钟处显示出单一主峰，背景噪音极低。该峰对应的质谱显示在质荷比（m/z）277.1798处存在[M–H]⁻离子，这是由6-姜酚（计算质荷比295.1904）失去一个水分子形成的。通过对6-姜酚纯品标准品的分析进一步验证了这一结果，其碎裂模式完全一致。基于峰面积积分，分离得到的6-姜酚纯度估计超过98%。

这些结果表明，所采用的半制备型高效液相色谱法能够将6-姜酚与其他提取物成分有效分离，而高效液相色谱和液相色谱-质谱联用技术中保留时间的重现性，也证明了该实验方案具有稳定性和可靠性。

综上所述，半制备高效液相色谱法与液相色谱-质谱联用法的结合为从天然来源中获取高纯度6-姜酚提供了可靠且有效的方法。所采用的色谱条件（乙腈-水体积比65:35的等度洗脱、流速12毫升/分钟、282纳米波长检测）被证明是最佳的，可进一步用于6-姜酚类似物的分离。

6-姜二醇对EKP诱导的斑马鱼幼体癫痫模型中癫痫活动的影响

以30分钟内的总移动距离评估6-姜酚处理的斑马鱼幼虫的EKP诱导运动活性变化，并采用Kruskal-Wallis检验结合Dunn事后检验进行分析（K W=71.91) (p<0.0001) 0.0001）。与对照组（赋形剂+超纯水）相比，200 µM浓度的EKP显著增加了斑马鱼幼虫的总移动距离（p (p <) < (0.001)) 0.001）。对照组与EKP孵育组之间的运动活性差异最显著的时期主要出现在实验的前半段，而在后半段，两组的运动活性差异则不再那么明显。用6-姜酚孵育22小时的斑马鱼幼虫姜烯酚在12.5至31.25微摩尔的浓度范围内，未对EKP诱导的运动活性表现出任何抑制作用（p (p>) (0.05) > 0.05）。在以最高测试浓度37.5微摩尔的6-姜烯酚孵育的实验组中，观察到幼虫运动活性出现统计学上显著的变化（p (p<0.001))

图2展示了6-姜酚对EKP诱导的运动过度的影响。

图2 6-姜酚（浓度12.5–37.5微摩尔）对乙基2-酮-4-戊烯酸酯（EKP，200微摩尔）诱导的斑马鱼幼鱼癫痫模型运动亢进的影响。在不同浓度的6-姜酚中孵育22小时后，向幼鱼施加急性剂量的EKP，5分钟后开始分析。实验结果以2分钟时间窗内的移动距离呈现（A）；时间窗分析以描述性方式展示，标注的统计推断基于检测30分钟内的总移动距离（B）。采用克鲁斯卡尔-沃利斯检验结合邓恩多重比较检验对30分钟内的总移动距离数据（B）进行分析：数据以中位数和95%置信限表示（与溶剂组相比，***p<0.001）。6-GIN代表6-姜酚；EKP代表乙基2-酮-4-戊烯酸酯；miliQW代表超纯水；Veh代表溶剂。

6-姜二醇对毛果芸香碱诱导的斑马鱼幼鱼癫痫发作实验中癫痫活性的影响

对结果的统计分析显示，浓度为50毫摩尔的匹鲁卡品显著抑制了斑马鱼幼体的运动活性（图3）。根据加维尔等人（2024年）的研究，匹鲁卡品诱导的斑马鱼幼体运动减退是癫痫发作的行为表现，且与大脑异常电活动相关（Gawel 等人，2024）。浓度为12.5至37.5微摩尔的6-姜酚预处理，对经PILO(p>0.05)处理的斑马鱼幼体的运动活性无显著影响。

图3 6-姜酚对毛果芸香碱诱导的斑马鱼幼鱼癫痫模型运动减退的影响。将幼鱼在不同浓度（12.5–37.5 微摩尔）的6-姜酚中孵育22小时后，用50毫摩尔的毛果芸香碱处理，延迟2分钟后开始分析其运动活性。实验结果以2分钟时间窗内的移动距离表示（图A）。时间窗分析为描述性结果；标注的统计推断基于28分钟内的总移动距离（图B）。数据采用Kruskal-Wallis检验结合Dunn多重比较检验进行分析：(K W=25.34)、(p<0.001)。数据以每组的中位数+95%置信限表示（= 32-48）。(*p<0.05)，P<0.05。6-GIN代表6-姜酚；miliQW代表超纯水；PILO代表盐酸毛果芸香碱；Veh代表溶剂。

6-姜酚对戊四氮暴露的斑马鱼幼虫中npas4和脑源性神经营养因子mRNA表达的影响

为验证我们先前研究中在斑马鱼幼虫戊四氮（PTZ）诱导癫痫模型中观察到的行为学效应，本研究分析了神经元Per-Arnt-Sim（PAS）结构域蛋白（npas4）和脑源性神经营养因子（bdnf）的mRNA水平表达情况。统计分析显示，暴露于PTZ可显著提高斑马鱼幼虫中npas4（p<0.001）和bdnf（p<0.05）的mRNA表达。尽管37.5μM浓度的6-姜酚未改变对照组（赋形剂处理组）中目标基因的表达（p (p>0.05)），但它显著降低了PTZ暴露幼虫的npas4表达（p<0.001）。PTZ与6-姜酚联合处理组的bdnf mRNA表达与仅暴露于PTZ的组无显著差异（p (p >0.05) > 0.05），但显著高于单独用6-姜酚处理的组。结果如图4所示[单因素方差分析：npas4 mRNA，(F(3,19)=32.12)；(p<0.0001) bdnf mRNA，(F(3,18)=6.403)；(p=0.0038)；采用Tukey事后检验]。

图4 随后，将斑马鱼幼鱼以每样本10条为一组收集。**图4** 6-姜酚对PTZ处理的斑马鱼幼鱼中npas4和bdnf mRNA表达的影响。在6-姜酚中孵育22小时后，以18S和b2m为参照对mRNA水平进行标准化处理。数据采用单因素方差分析结合Tukey事后检验进行分析：(A)，F(3, (19) = 32.12) (p<0.0001)；(B)，F(3,18)= 6.403 (p=0.0038) 3。数据以平均值±标准误表示 (in = 5-6/group) (***p<0.001) (*p<0.05.6) - GIN，6-姜酚；PTZ，戊四氮。(37.5 µM)时，斑马鱼幼鱼暴露于PTZ（20 mM）中60分钟。

6-姜烯酚对cacna1aa和scn1lab基因敲低胚胎中LFP数量的影响

在本研究中，我们分别使用靶向 scn1lab 和 cacna1aa 信使核糖核酸（mRNA）的吗啉代寡核苷酸（MOs），建立了德雷夫综合征及失神发作的斑马鱼模型。斑马鱼幼虫中这两个基因的敲低会导致脑电活动异常，其特征是出现振幅超过背景噪声3倍的放电。用37.5微摩尔的6-姜辣素孵育22小时，对cacna1aa (K W=3.546) (p=0.1699）或scn1lab (KW=1.388)、(p=0.4995）吗啉代寡核苷酸处理组的视顶盖区记录到的局部场电位（LFP）数量无显著影响。相关结果展示于图5中。

图5 6-姜酚对cacna1aa和scn1lab morphant斑马鱼视顶盖LFP数量的影响。将斑马鱼幼虫与6-姜酚（37.5微摩尔）或溶剂共同孵育22小时，随后在斑马鱼幼虫4天龄时，记录20分钟的局部场电位（LFP）。两个实验中的对照组均相同。数据以癫痫样样事件数量表示（中位数+95%置信限）。采用Kruskal-Wallis检验分析结果：(A) (K W=3.546)、(p=0.1699)；(B) (K W=1388)、(p=0.4995)。6-GIN代表6-姜酚

小鼠药代动力学研究

所建立的LC-MS生物分析方法用于测定脑组织和血清样本中的6-姜烯酚，如图6所示。6-姜烯酚在分析过程中约24分钟从色谱柱中洗脱出来。所进行的进样使得能够获取所有待测样本中6-姜烯酚对应的峰面积，为药代动力学计算提供了数据支持。

以10 mg/kg剂量单次腹腔注射6-姜烯酚后，基于浓度-时间数据采用非房室模型分析计算得到的药代动力学（PK）参数列于表2和图6。血清（以及大脑）中的最大浓度出现在第一个采样点，即给药后15分钟，这表明其吸收迅速。消除半衰期经测定为1.73小时，对于小鼠而言，这一半衰期相对较长。大多数成熟动物的无脂湿重中的水分百分比估计在70%至76%之间，而部分研究显示小鼠的该数值约为80%。因此，本研究中测定的6-姜烯酚的分布容积((V_{d}))（758.08 mL/kg）表明其在器官和组织中的分布程度较低，且与组织的结合程度有限。总清除率（CL）远低于小鼠肝血流量（约60–80 mL/毫克/千克），这表明6-姜酚可能不在肝脏中进行广泛代谢，但腹腔注射后计算得出的(V_{d})值和清除率（CL）由吸收分数（F）决定，因此需谨慎解读这些结果。由于药代动力学参数是通过腹腔给药估算的，清除率/生物利用度（CL/F）和分布容积/生物利用度（Vz/F）均取决于未知的生物利用度。研究化合物能够穿透血脑屏障，给药1小时后脑与血清的比值为0.18。给药6小时后观察到更高的脑与血清比值（1.25），这说明6-姜酚从大脑的清除速度远慢于从血液的清除，提示其在脑组织中滞留时间较长。不同时间点计算出的脑与血清比值见表3。本研究用于定量检测的色谱法对6-姜酚测定的线性范围、检测限（LOD）、定量限（LOQ）以及日内和日间稳定性进行了评估。优化后的计算参数详见补充材料。

表2 从Crl: CD1(ICR)小鼠以10 mg/kg剂量单次腹腔注射6-姜烯酚后，基于小鼠血清平均浓度值（n = 5）计算得出的6-姜烯酚药代动力学参数（非房室分析）。Cmax：峰浓度 / 最大血药浓度tmax：达峰时间λz：终末消除速率常数t1/2λz：终末半衰期CL：清除率AUC0−inf：外推至无穷大的血清平均浓度 - 时间曲线下面积Vz：表观分布容积MRT：平均滞留时间F：药物吸收分数

表3 姜辣素6在Crl:CD1(ICR)小鼠体内以10毫克/千克剂量单次腹腔注射后，不同时间点计算得出的脑与血清比值。

图6 在设定的色谱条件下，标准溶液（A）、脑匀浆（B）和血清样本（C）代表性进样中6-姜酚的提取离子色谱图，6-姜酚于第24分钟从色谱柱洗脱。

小鼠急性癫痫发作实验

在6赫兹精神运动性癫痫发作试验中，当以44毫安的电流刺激动物时，6-姜酚（60和90毫克/千克）未显示出任何显著效果。相反，在32毫安的电刺激强度下，观察到6-姜酚具有统计学上显著的剂量依赖性抗惊厥作用。在此情况下，30毫克/千克剂量的6-姜酚对(p=0.1429)组中33.3%的动物起到保护作用，而以60毫克/千克剂量给予该研究化合物时，72.7%的动物未出现精神运动性癫痫发作(p=0.014)，表4）。

在MES测试前15分钟，以10和60毫克/千克的剂量腹腔注射6-姜酚，无法保护小鼠免受50毫安强度电刺激诱导的强直性后肢伸展，相关结果见表4。

表4 6-姜酚对小鼠 maximal electroshock seizure（MES）试验及6赫兹诱导的精神运动性癫痫发作试验中癫痫发作发生情况的影响。

静脉注射戊四氮癫痫阈值测试

图 7 展示了6 - 姜酚（腹腔注射，10～30 mg/kg）对小鼠静脉 PTZ 惊厥模型中三种惊厥发作阈值的影响，包括肌阵挛抽搐、伴随翻正反射消失的全身性阵挛发作以及后肢强直性伸展。单因素方差分析与 Kruskal–Wallis 检验结果均显示组间整体差异具有统计学意义（单因素方差分析：肌阵挛抽搐，(F(4,72)=4.569)，(P=0.0024)；前肢强直，(F(4,37)=2.007)，(p=0.1024)；Kruskal–Wallis 检验：全身性阵挛发作，(KW=19.97)，(p=0.0005)。事后分析表明，上述整体组间差异仅由丙戊酸钠（VPA）处理组贡献。仅150 mg/kg 剂量丙戊酸钠实验组表现出具有统计学意义的抗惊厥作用。

图7 6-姜酚对小鼠腹腔注射戊四氮（iv. PTZ）试验中肌阵挛抽动阈值（A）、全身性阵挛阈值（B）和前肢肌张力阈值（C）的影响。分别在试验前15分钟和30分钟腹腔注射6-姜酚（10–30毫克/千克）和丙戊酸钠（VPA，150毫克/千克，作为阳性对照）。阴性对照组给予生理盐水配制的1%吐温溶液。实验组包含12–18只小鼠。肌阵挛抽动（A）和前肢肌张力发作（C）的数据以诱发相应类型发作的戊四氮平均剂量（毫克/千克）±标准误（SEM）表示，采用单因素方差分析（ANOVA）结合邓尼特氏事后检验（Dunnett's post hoc）进行分析（肌阵挛抽动：F(4, (72) = 4.569) (p=0.0024)；前肢肌张力：F(4, (37) = 2.007) (p=0.1024）。全身性阵挛发作的数据以中位数±95%置信限表示，采用克鲁斯卡尔-沃利斯检验（Kruskal–Wallis test）后再进行邓恩氏事后检验（Dunn’s post hoc test）分析（全身性阵挛：KW = 19.97, (p=0.0005)）。(*p≤0.05)与(**p≤0.01)均为P<0.01。PTZ：戊四氮；VPA：丙戊酸钠。

6-姜酚对小鼠运动协调能力和肌肉力量的影响

以30至90毫克/千克的剂量对6-姜酚进行腹腔急性给药，通过转棒实验评估，未对小鼠的运动协调能力产生影响（p (p>0.05) 0.05）（数据未显示）。此外，在在以 10-30 毫克/千克的剂量给予所研究的化合物后进行的烟囱试验（单因素方差分析：(F(4,75)=1.689) (p=) 0.1615）（图 8）。

图8 6-姜酚对小鼠神经肌肉力量的影响。分别在测试前15分钟和30分钟腹腔注射6-姜酚（10–30毫克/千克）和丙戊酸（150毫克/千克，作为阳性对照）。阴性对照组给予1%吐温溶液生理盐水。实验组包含16只小鼠。结果以每克小鼠体重毫牛（毫牛/克）的握力平均值（±标准误）表示，并采用单因素方差分析(< F(4,75)=1.689)进行分析。(p=0.1615)

讨论

6-姜烯酚是生姜根茎提取物中含量最丰富的活性化合物。因此，它也是研究最广泛的具有潜在治疗特性的化合物。数年前的研究表明，生姜提取物在戊四氮（PTZ）诱导的小鼠实验性癫痫模型中具有抗惊厥作用（Hosseini & Mirazi, 2014; 2015; Hosseini 等人, 2016），这推动了进一步的研究，旨在更精准地确定提取物在其他癫痫实验模型中的特性，尤其是明确负责抗惊厥效应的活性化合物。在前期研究中，我们证实了6-姜烯酚在斑马鱼幼鱼PTZ诱导的癫痫检测模型中具有抗惊厥作用，具体表现为PTZ诱导的过度运动行为减少，以及暴露于PTZ的幼鱼视顶盖中记录的局部场电位（LFP）事件数量和平均持续时间降低。该效应还与谷氨酸水平及谷氨酸/γ-氨基丁酸（GABA）比值下降相关，同时编码N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）型离子型谷氨酸受体亚基的grin2b基因的mRNA表达量也有所降低（Gawel 等人, 2021）。本研究将在前期研究的基础上，采用其他斑马鱼幼鱼癫痫模型（即乙基酮戊酸[EKP]和毛果芸香碱[PILO]诱导的癫痫检测模型，以及scn1lab和cacna1aa基因敲低幼鱼）以及小鼠中常用的癫痫模型（即电诱导癫痫[MES]和6赫兹精神运动性癫痫检测模型，还有静脉注射戊四氮[i.v. PTZ]癫痫检测模型）展开后续研究。同时，我们还测定了6-姜烯酚在小鼠体内的药代动力学参数，以及其经腹腔注射（i.p.）后穿过血脑屏障的能力。

在本研究中，我们评估了经6-姜酚预孵育的、暴露于戊四氮的斑马鱼幼虫中npas4和bdnf基因mRNA表达的变化，以进一步验证6-姜酚的抗惊厥作用——这一作用已在我们先前的研究中得到证实（Gawel等人，2021）。这两种基因均被用作临床前研究中神经元活动的重要标志物（Sun和Lin，2016）。Npas4是近年来发现的仅在神经元中表达的即刻早期基因之一。其激活发生在神经元近期活动之后，并由细胞内游离钙作为第二信使介导。利用癫痫发作和癫痫实验模型开展的临床前研究结果表明，NPAS4蛋白可通过恢复神经元活动的稳态在大脑中发挥保护功能。研究发现，戊四氮诱导的惊厥活性会上调小鼠海马体中npas4的表达，此外，该基因的失活会促进戊四氮点燃过程的发展（Shan等人，2018）。在匹罗卡品诱导的癫痫大鼠中，NPAS4蛋白水平在癫痫发作急性期（6-72小时）升高，而在慢性期（7-60天）下降。在经匹罗卡品处理且Npas4基因沉默的大鼠中，惊厥发作的频率更高、持续时间更长（Wang等人，2014）。在经匹罗卡品处理的斑马鱼幼虫中，npas4在治疗停止后22小时出现过表达（Gawel等人，2024）。NPAS4直接调控众多活动依赖型基因的表达，例如bdnf和homer1a，此外还可作为……抑制性和兴奋性神经传递过程中的稳态（Fu等人，2020；Sun和Lin，2016；Shan等人，2018）。兴奋性-抑制性平衡的破坏可能导致神经元死亡和神经系统功能受损，包括癫痫的发生。BDNF是神经营养因子家族成员，除其他功能外，还控制大脑中的神经元存活与发育、长时程增强（LTP）和可塑性过程，因此与癫痫发作及癫痫发生密切相关（AlRuwaili等人，2024；Gliwińska等人，2023）。我们关于npas4和bdnf mRNA表达的研究结果与此前的研究发现一致，这些研究表明这些标志物的表达在暴露于戊四氮（PTZ）后实验动物的大脑（Abdelaziz 等人，2025；Seo 等人，2020；Lopes 等人，2016；Klarić 等人，2014；Torres-Hernández 等人，2016；Shan 等人，2018）。此外，一些在实验性癫痫发作和癫痫模型中表现出抗惊厥特性的化合物可使这些标志物的表达恢复正常（Torres-Hernández 等人，2016；Seo 等人，2020；Abdelaziz 等人，2025）。尽管 6-姜酚对暴露于 PTZ 的斑马鱼幼虫中脑源性神经营养因子（bdnf）mRNA 的表达无显著影响，但它显著降低了神经 PAS 结构域蛋白 4（npas4）mRNA 的表达，这支持了其抗惊厥活性。另一种具有抗惊厥作用的植物源化合物也观察到了类似的效果柑橘类水果中含有的效应物质——D-柠檬烯——萜烯类物质（Seo 等人，2020）。尽管 naps4 和 bdnf 基因与癫痫发作过程的关联已明确，但目前的研究认知尚无法明确其在6-姜辣素对抗戊四氮诱导癫痫模型的抗惊厥作用机制中所扮演的角色。这一问题仍需进一步研究。

除了继续开展6-姜辣素对戊四氮（PTZ）处理的斑马鱼幼虫作用的研究外，我们还评估了该化合物在另外两种化学惊厥剂诱导的斑马鱼幼虫癫痫模型中的活性，即依克考匹仑（EKP）和毛果芸香碱（PILO）诱导的癫痫试验。EKP诱导的癫痫被描述为耐药性癫痫模型（Zhang等人，2017）。我们发现，6-姜辣素（37.5微摩尔）能显著减弱EKP诱导的癫痫活性，但对PILO暴露后诱导的癫痫无影响。EKP的致惊厥活性源于对谷氨酸脱羧酶的抑制，该酶可将谷氨酸转化为γ-氨基丁酸（GABA）（Zhang等人，2017）。与戊四氮（PTZ）类似，EKP的作用与γ-氨基丁酸能神经传递的减弱密切相关。戊四氮（PTZ）和依克考匹仑（EKP）诱导癫痫试验的结果表明，6-姜辣素可能通过增强γ-氨基丁酸能系统发挥抗惊厥作用，而无法拮抗胆碱能神经传递增强所诱导的癫痫。毛果芸香碱（PILO）是一种拟胆碱药物，可刺激毒蕈碱受体。在啮齿类动物中，给予毛果芸香碱（PILO）会引发边缘系统癫痫，并进展为癫痫持续状态（Turski等人，1984）。在斑马鱼幼虫中，急性给予毛果芸香碱（PILO）会导致行为抑制。在脑电图（EEG）层面，可观察到大量高振幅放电（Gawel等人，2024）。在我们的实验中，6-姜酚在匹罗卡品诱导的癫痫发作试验中对幼虫的行为无影响，因此其不太可能有效用于治疗人类颞叶癫痫。

在本研究中，我们接下来使用了两种斑马鱼幼虫癫痫模型，这两种模型通过敲低在大脑正常活动和癫痫发生过程中起关键作用的基因构建而成。Scn1lab基因编码电压门控钠通道α亚基Nav1.1，而scn1lab基因敲低斑马鱼被定义为德拉韦综合征的斑马鱼模型——德拉韦综合征是儿童癫痫综合征中最具破坏性且对药物治疗耐药的类型之一（Zhang等人，2015；Baraban等人，2013）。德拉韦综合征患儿会出现多种类型的癫痫发作，包括强直-阵挛性发作、阵挛性发作、肌阵挛性发作、非典型失神发作、失张力发作以及癫痫持续状态（Li等人，2021；Selvarajah等人，2021）。目前获批用于德拉韦综合征癫痫发作辅助治疗的药物包括芬氟拉明（血清素增强剂）、大麻二酚（离子通道调节剂，对内源性大麻素或腺苷系统具有作用）以及司替戊醇（以及(GABA)受体的正向变构调节剂等）（Guerrini等人，2024）。Tiraboschi等人（2020）首次证实了芬氟拉明在scn1lab−/−突变体中发挥抗癫痫作用的机制。Baraban等人（2013）利用斑马鱼scn1lab−/−突变体，明确了克利米唑（一种抗组胺药）目前正处于针对德拉韦综合征患者的III期临床试验阶段（https://clinicaltrials.gov/study/NCT04462770）。Cacna1aa基因功能丧失会导致P/Q型钙通道活性紊乱，进而可能引发癫痫发作（Gawel等人，2020）。在斑马鱼cacna1aa基因敲低模型中，研究人员观察到了脑电图放电现象（Gawel等人，2020）。给该模型施用获批用于治疗人类失神发作的抗癫痫药物后，脑电图放电次数显著减少（乙琥胺、丙戊酸、拉莫三嗪和托吡酯——需注意这些药物的共同特征是对钙离子通道具有作用）。尽管6-姜酚能有效阻断戊基四唑（PTZ）诱导的癫痫发作，但它在预防德拉韦综合征模型的癫痫发作以及cacna1aa基因敲低斑马鱼的癫痫发作方面均无效。6-姜酚在这些模型中未表现出抗惊厥作用，可能是因为基因敲低斑马鱼中的癫痫样活动是由钠通道和钙通道活性紊乱介导的，而我们从戊基四唑（PTZ）和乙基吡咯烷酮（EKP）诱导的癫痫发作实验中得到的结果表明，6-姜酚的抗惊厥作用机制主要是通过γ-氨基丁酸能系统实现的。

尽管6-姜酚能抑制斑马鱼幼虫中由降低γ-氨基丁酸能神经传递的化学惊厥剂诱发的两种癫痫，但它在小鼠定时输注戊四氮癫痫模型中未表现出抗惊厥作用。所有影响中枢神经系统功能（包括癫痫活动）的药物都必须具备穿过血脑屏障的能力。根据科学文献中的现有数据及本研究结果，6-姜酚能够穿过血脑屏障（Simon等人，2020；Lim等人，2025；Kuswandani等人，2025）。药代动力学研究显示，6-姜酚在腹腔注射后最早15分钟即可在脑组织中达到最大浓度，因此本研究在该时间点评估了其在小鼠癫痫模型中的抗惊厥活性。6-姜酚在静脉注射戊四氮癫痫阈值测试中未表现出抗惊厥作用，原因可能是尽管它能穿过血脑屏障，但其以30毫克/千克的剂量腹腔给药后，脑组织中的药物浓度不足以影响与抗惊厥活性相关的靶点。

在本研究中，我们还采用了两种电刺激诱导癫痫发作的小鼠模型，即6 Hz诱导的精神运动性癫痫发作模型和 maximal electroshock（MES）测试模型。精神运动性癫痫发作由低频（即6 Hz）、长时程（即3秒）的电刺激诱发，刺激为0.2毫秒时长的矩形脉冲，表现为胡须抽搐、僵住姿势、点头、下颌运动、肢体阵挛以及Straub尾征。该测试通常采用两种刺激强度，即32毫安或44毫安。采用更高刺激强度（即44毫安）的6 Hz精神运动性癫痫发作模型可被视为药物难治性癫痫发作的模型，因为此类癫痫发作无法被大多数抗癫痫药物（ASMs）缓解（Löscher和White, 2023; Barton等人, 2001）。我们发现6-姜酚（60毫克/千克）在精神运动性癫痫发作测试中具有显著的抗癫痫作用，但仅在低强度刺激条件下有效，而该条件并非药物难治性癫痫发作的模型。抗癫痫药物抑制精神运动性癫痫发作的具体作用机制尚未明确，不过，许多能有效抑制6 Hz诱导的精神运动性癫痫发作的抗癫痫药物均通过调节γ-氨基丁酸能神经传递发挥作用，例如氯硝西泮、苯巴比妥和替加宾（Löscher和White, 2023）。

在此需指出，在精神运动性癫痫发作和MES测试中，所测试的6-姜酚剂量范围高于静脉注射PTZ测试。出现这一差异的原因是这些测试分别在两种不同品系的小鼠上进行，即CD-1品系和Crl:CD1(ICR)品系，这可能会影响小鼠对6-姜酚的敏感性。30毫克/千克以上的剂量会对Crl:CD1(ICR)小鼠产生不良外周效应，包括活动能力下降以及难以维持正确的身体姿势；而在CD-1小鼠身上，该剂量则是安全的，且不会在转棒实验中对运动协调能力造成显著损伤。小鼠的遗传背景可能会影响腹腔注射6-姜酚后的生物利用度和药代动力学，进而影响其药效。此前已有研究发现可卡因的药代动力学参数存在品系依赖性变化（McCarthy等人，2004年；Zhu等人，2021年）。表观遗传和环境因素也是药物反应存在个体差异的原因（Löscher，2024年）。在6赫兹精神运动性癫痫发作测试中观察到的抗惊厥效应，是由高剂量（60毫克/千克）的6-姜酚引起的。而在静脉注射PTZ测试中，该化合物的最高测试剂量为30毫克/千克。在6赫兹测试中使用更高剂量的姜酚，可能会使其在小鼠脑部的浓度升高至足以作用于抗惊厥作用靶点的水平。因此，在6赫兹测试中，被测化合物浓度越高，其抗惊厥效应越显著；而在静脉注射PTZ测试中，低剂量则未出现这一效应。

MES测试被认为是人类全身性强直-阵挛发作的模型。短暂（即0.2秒）、高强度（即50毫安）且高频（即50赫兹）的电刺激会引发最大程度的发作，表现为前肢强直伸展，随后双前肢和双后肢出现阵挛性抽搐。在该测试中，主要通过钠离子发挥作用的药物表现出抗惊厥作用通道抑制类药物，即卡马西平、拉莫三嗪和托吡酯（Castel-Branco 等人，2009；Löscher 等人，1991；White 等人，1995）。6-姜酚未能减少小鼠戊四氮惊厥试验中癫痫发作的发生次数。

尽管本研究采用了三种不同的癫痫发作模型，其诱导机制各不相同，但并未使用啮齿类动物的慢性癫痫模型，因此无法评估6-姜辣素的抗癫痫作用。本研究的另一重大局限性是缺乏覆盖6-姜辣素给药后至少24小时的详细药代动力学研究，这将能更准确地评估该化合物在动物体内的生物分布。本研究尚未阐明6-姜辣素抗惊厥作用的分子机制，应视为进一步探究其在癫痫治疗中潜在应用的初步探索。尽管现有实验表明其作用机制为γ-氨基丁酸能机制，但无法精准确定6-姜辣素的作用靶点，也无法明确该化合物可抑制/缓解的癫痫发作类型。为此，需开展进一步研究，包括优化6-姜辣素的给药形式（如纳米粒）以提高其穿透血脑屏障的能力。

此外，若该研究取得进展，制定一套全面的标准化方案势在必行。这需要建立6-姜酚的全表征一级参比标准，并依据ICH Q2(R1)指导原则验证定量分析方法（如文中所述的高效液相色谱测定法），以确保其专属性、线性、准确度和耐用性。经验证的该测定法随后将成为依据ICH Q1A(R2)指导原则开展稳定性研究的基础，用于确定该化合物的保质期和最佳储存条件。不过，这些研究步骤有待在未来开展更深入的调查后制定。

值得注意的是，本研究的结论仅针对单一分离的植物化学成分6-姜酚，不应外推至生姜粗提取物。由于草本全提取物固有的化学复杂性，以及其成分组成存在显著且往往不受控制的差异，将其用作治疗剂面临着标准化方面的巨大挑战。这种差异源于多种因素，包括植物的遗传特性、地理来源、收获时间和加工方法。为确保剂量间的一致性、可预测的药代动力学以及明确的作用机制——这些是现代治疗剂的重要前提条件，未来的研发必须聚焦于单一、纯化的化学成分。因此，6-姜酚而非经过化学表征的提取物，才是潜在临床开发的唯一可行路径。

结论

本研究揭示了6-姜酚具有一定的抗惊厥作用，其作用机制可能是通过增强γ-氨基丁酸能神经传递来实现的。在化学致惊厥剂诱导的癫痫发作中，6-姜酚也表现出了抗惊厥效果本研究考察了高剂量该化合物作用下斑马鱼幼鱼的γ-氨基丁酸能神经传递，以及小鼠的6赫兹精神运动性癫痫发作试验（32毫安）。6-姜酚有限的抗惊厥作用可能与其难以充分穿透脑组织有关。为实现更强且显著的抗惊厥效果，应考虑采用合适的纳米颗粒作为6-姜酚的载体，这将使其更易穿透血脑屏障，从而提高其在脑组织中的浓度。尽管6-姜酚是生姜提取物的主要成分，其中还包含多种其他酚类和萜类化合物，即8-姜酚、10-姜酚、姜烯酚、姜酮以及姜二醇。既往研究中发现的生姜根提取物显著的抗惊厥作用，可能源于研究提取物中不同化合物的协同作用。综上所述，要全面评估6-姜酚的抗惊厥潜力及其作用机制，还需开展进一步研究。