题目：Overlapping expression and co-operative function of the zebrafish pcdh15 paralogs

原文链接:https://tvst.arvojournals.org/article.aspx?articleid=2808688

期刊:Translational Vision Science & Technology

摘要

斑马鱼拥有超过70%人类基因的直系同源基因，是研究发育和疾病的常用模型，尤其在哺乳动物模型不适用的情况下。斑马鱼遗传模型的一个局限是旁系同源基因的普遍存在，其代偿作用和转录适应性会使相关研究的理解变得复杂。由PCDH15突变引发的1F型Usher综合征（USH1F）就凸显了对替代模型的需求；其主要损伤部位杯状突起（CP）是夜行性啮齿动物感光细胞所独有的结构。本研究发现，与以往报道相反，斑马鱼pcdh15a/b旁系同源基因并非分别绝对局限于耳部和眼部组织。实际上，这两个旁系同源基因均在机械敏感毛细胞和视网膜感光细胞中表达且发挥功能。双突变体表现出最严重的表型：耳部动纤毛和静纤毛连接消失，杯状突起结构紊乱、内外节段分离以及感光细胞死亡。研究还证实，可通过异构体特异性敲除分离出耳部和眼部的特异性表型。这些数据凸显了斑马鱼在体内研究致病机制方面的优势，同时也提醒研究人员，若无确凿证据，不应将旁系同源基因定义为独立且绝对受限的功能单元。在条件允许的情况下，双突变体可能更适用于研究基因功能以及模拟人类仅存在单个直系同源基因的疾病。

引言

自20世纪80年代以来，斑马鱼（斑马鱼属）已成为生物研究中应用最广泛的模式生物之一1,2。作为一种身体结构与智人高度契合的基础脊椎动物，斑马鱼的应用具有诸多优势；饲养成本低、体外快速发育、胚胎阶段透明，以及丰富的遗传工具库，使其成为剖析基因功能的可操作的体内模型。十年前斑马鱼参考基因组的发布表明，(>70%)比例的人类基因至少存在一个鱼类直向同源物3。此后，斑马鱼已被证实是研究发育和疾病的宝贵模型。

斑马鱼作为遗传模型的一个显著特征是其存在大量重复基因（旁系同源基因）。除了所有脊椎动物共有的两轮全基因组复制（WGD）事件（2R假说）⁴⁻⁵外，斑马鱼从四足动物分化出来后还经历了一次额外的、硬骨鱼类特有的全基因组复制⁶⁻⁷。在选择压力放松的情况下，大多数重复基因迅速丢失⁸⁻⁹，而人类直系同源基因中约有三分之二拥有两个斑马鱼旁系同源基因³,¹⁰。这些重复基因的保留主要通过两种机制实现：1）新功能化——获得与祖先基因不同的全新功能；2）亚功能化——两个旁系同源基因分别分担祖先基因的部分功能。在斑马鱼中，亚功能化通常表现为表达模式的分化¹¹⁻¹³；即两个旁系同源基因的表达结构域比其祖先直系同源基因更局限，这意味着必须保留两个基因拷贝才能完整实现祖先基因的全部功能¹⁴。然而，旁系同源基因的保留对斑马鱼的疾病建模具有重要影响。例如，引入移码突变可能会触发mRNA的无义介导的降解，并上调相关的代偿基因，这一过程被称为转录适应（TA）¹⁵,¹⁶。旁系同源基因的上调可以弥补基因缺失带来的影响，导致表型变温和，甚至可能掩盖基因的真实功能¹⁷,¹⁸。

一个由两个斑马鱼旁系同源基因代表的人类基因例子是PCDH15，其编码细胞黏附蛋白原钙粘蛋白相关。人类PCDH15编码22种可变剪接转录本（表S1）¹⁹，这些转录本在长度、外显子使用和终止密码子方面存在差异。除一种变体外，所有PCDH15同工型均具有共同的结构：信号肽、11个细胞外钙粘蛋白重复序列、PICA结构域、跨膜结构域和C端结构域（图1A）。同工型的序列多样性主要归因于三个大型3'端外显子的可变使用。由此产生的产物被归类为PCDH15-CD1、-CD2或-CD3（C端胞质结构域1-3）²⁰，它们在结合能力、定位模式和冗余性上存在差异²¹⁻²³。两个斑马鱼旁系同源基因（pcdh15a和pcdh15b）均保留了这一结构域组成，且两个基因都具有可变的C端结构域：-CD1、CD2和-CD3（表S2）。然而，以往的研究表明二者存在严格的亚功能化：pcdh15a在内耳毛细胞和侧线神经丘中表达，而pcdh15b仅在视网膜光感受器中表达²⁴。这种分工使得仅突变单个旁系同源基因即可分别模拟人类疾病相关的听觉和视觉表型²⁴⁻²⁶。

图1 – 原钙粘蛋白相关15的作用。A) PCDH15是一个1.8兆碱基的基因，编码非典型钙粘蛋白成员原钙粘蛋白相关15。该蛋白根据外显子40、46或47的包含情况分为三大类同工型。所得蛋白在细胞外区域具有共同的结构域架构，但在C端细胞质结构域（CD1、CD2、CD3）上存在差异。这三个C端结构域的序列同源性较低，表明其具有独特的功能和结合伴侣。B) 在内耳毛细胞中，原钙粘蛋白相关15参与细胞黏附和听觉功能。原钙粘蛋白相关15同源二聚体定位于暂时性动纤毛，与钙粘蛋白相关23（CDH23）同源二聚体结合，形成动纤毛连接，这对组织的平面极性至关重要。原钙粘蛋白相关15也定位于静纤毛尖端，并与相邻静纤毛形成尖端连接。静纤毛的偏转会导致尖端连接的弯曲，并通过机械电转导（MET）通道使(Ca^{2+})和(K^{+})内流。C) 原钙粘蛋白相关15的视网膜功能尚未完全明确，但PCDH15在光感受器中表达，并定位于近端外节。由内节产生并围绕外节基部的肌动蛋白丝足（杯状突起）与原钙粘蛋白相关15的定位区域重叠。有研究推测原钙粘蛋白相关15可形成两种分子连接：1）与动纤毛连接同源的杯状突起与外节之间的连接（外节连接）；和/或2）与尖端连接类似的相邻杯状突起之间的连接（杯状突起连接）。

人类PCDH15基因的疾病变异会导致1F型Usher综合征（USH1F），这是一种常染色体隐性遗传病，以先天性感音神经性听力损失、前庭功能障碍和进行性视锥视杆营养不良为特征。该疾病的发病机制与原钙黏蛋白相关15在内耳和视网膜细胞中的功能密切相关（图1B、C）。在内耳的机械敏感性毛细胞中，同二聚体原钙黏蛋白相关15在相邻的静纤毛（肌动蛋白丝状伪足）和动纤毛（微管纤毛）之间与同二聚体钙黏蛋白相关23（CDH23）结合。这些分子间的相互作用在动纤毛连接处提供黏附力，并通过门控机械电转导（MET）离子通道的激活，助力顶端连接处的机械电转导过程（图1B）。在视网膜中，原钙黏蛋白相关15定位于光感受器外节（OS）的基部。该细胞区域的特征是存在肌动蛋白突起（杯状突起），这些突起跨越内节/外节边界，并在基底(OS ^{31-33})周围形成环状结构。有理论认为，原钙黏蛋白相关15可能通过形成类似于内耳顶端连接或动纤毛连接的分子桥，在高度特化的光感受器细胞中发挥结构作用（图1C）。然而，PCDH15在视网膜中的作用仍知之甚少。尽管小鼠突变体对于揭示Usher蛋白的听觉功能具有重要价值，但它们在研究视网膜功能方面的应用有限；小鼠缺乏明确的杯状突起，且Pcdh15突变体无法以复制USH1F患者的视网膜营养不良症。这些局限性凸显了对替代脊椎动物模型的需求。

本研究利用斑马鱼pcdh15单突变和双突变模型，探究原钙粘蛋白相关15在机械感觉和视觉功能中的作用。研究发现，已有的pcdh15a/b二分表达模式模型过于简化。实际上，这两个旁系同源基因均在感觉器官发育过程中发挥作用，且各自对应的表型存在差异；双突变体的表型几乎总是更为严重。视网膜表型尤为能体现旁系同源基因的协同作用：pcdh15b单突变体即使在老年斑马鱼中也仅表现出轻微表型，但当两个旁系同源基因均发生突变时，会出现严重的视网膜细胞形态异常和细胞死亡。这些研究揭示了斑马鱼旁系同源基因存在遗传冗余的可能性，同时强调在研究人类隐性疾病时，有必要利用双突变体。若仅对单个基因拷贝进行突变，斑马鱼的旁系同源基因无论通过功能补偿还是转录适应机制，都可能掩盖基因缺失所带来的功能影响。

在取代旁系同源基因特异性表达的过程中，我们发现原钙粘蛋白相关15（pcdh15）在感觉器官中存在异构体特异性偏好。视网膜主要表达pcdh15-CD1亚型，而内耳则对pcdh15-CD3亚型具有强烈偏好。对-CD1或-CD3异构体进行定向诱变，以组织特异性的方式分别分离出严重的光感受器和感觉毛细胞表型。这些研究深化了我们对原钙粘蛋白相关15生物学特性的理解，并提示USH1F型Usher综合征的治疗策略应考虑异构体的多样性。

结果

pcdh15b^uot15

等位基因于 2021 年被报道，该等位基因在斑马鱼pcdh15b基因的第 5 号编码外显子中存在一段17 个碱基对（17bp）的插入突变。此突变会引发阅读框移位，并产生提前终止密码子，影响该基因的所有亚型。尽管pcdh15b纯合突变体幼鱼会出现早期光感受器形态异常及带状突触缺陷，但它们会在受精后 20 天（dpf）死亡，且未观察到视网膜细胞凋亡现象。由于1F 型乌舍尔综合征（USH1F）患者的视网膜变性呈渐进性发展，本研究旨在探究pcdh15b纯合突变体老年个体是否会表现出更严重的视网膜病变表型。

为提高纯合突变体的存活率，研究人员建立了一套更宽松的饲养方案。在受精后第 3 天（3 dpf），通过幼鱼尾鳍活检鉴定基因型；随后将纯合突变体以低密度集中饲养，避免因抢食而死亡。在此条件下，约20%的pcdh15b纯合突变体能够存活至成年（图 S1A）。研究人员推测，低存活率可能与大多数纯合幼鱼无法成功充气鳔有关（图 S1B、C），这在平衡感知缺陷的突变品系中十分常见。pcdh15b-/-纯合突变体在受精后第 2 天（2 dpf）时眼球大小会短暂缩小，该现象在后续发育阶段逐渐恢复；除此之外，其发育过程与野生型（WT）对照组无明显差异（图 S1D）。

pcdh15b-/- 纯合突变体与野生型同窝鱼在标准饲养条件（光照周期 14 小时：10 小时、光照强度 300 勒克斯）下饲养至受精后 8 个月和 18 个月（mpf），随后进行取样检测。尽管鱼龄已较高，但突变体视网膜在这两个时间点均未出现细胞凋亡增加的现象（图 2A）。此外，对视网膜各层细胞核数量的统计显示，pcdh15b 纯合突变体与同龄野生型对照组的细胞数量无差异（图 2B）。不过，研究人员确实观察到视网膜组织学出现轻微改变18 个月龄时，紫外视锥外段（OS）形态异常，中央视网膜中紫外视锥外段数量减少；但紫外视锥外段长度无变化（图 2C、D），杯状突起仍紧贴外段（图 2C 箭头）。蓝色视锥外段也出现形态异常，偶见外段与细胞主体分离的情况（图 2E 箭头）；但蓝色视锥外段的数量与长度均无改变（图 2F）。

图2 – pcdh15b纯合突变体出现轻度视网膜形态异常，但未发生视网膜变性。A）在8月龄或18月龄时，pcdh15b纯合突变体的任何视网膜层中细胞凋亡率均未升高。B）在两个时间点，野生型与pcdh15b纯合突变体各视网膜层的细胞核绝对计数均无变化。C）18月龄视网膜经紫外视锥细胞视蛋白和F-肌动蛋白染色的代表性共聚焦显微图。在pcdh15b纯合突变体中，紫外视锥细胞外节形态异常，但肌动蛋白突起仍紧密相连（箭头）。D）定量分析显示，pcdh15b纯合突变体的紫外视锥细胞外节数量减少，但其外节长度未发生改变（分别对应P=0.0048和P=0.2583；Welch t检验）。E）18月龄视网膜经蓝视锥细胞视蛋白和F-肌动蛋白染色的代表性共聚焦显微图。有证据显示蓝视锥细胞外节存在形态异常或定位异常情况（箭头头），但肌动蛋白突起仍存在（箭头）。F）pcdh15b纯合突变体的蓝视锥细胞外节数量和长度均无差异（分别对应 P=0.8010和P=0.6693；Welch t检验）。G）WGA染色标记18月龄视网膜中的视杆细胞外节（括号）和部分视锥细胞外节。H）野生型与pcdh15b纯合突变体的视杆细胞外节层厚度无显著差异（P=0.1875；Welch t检验）。

由于 1F 型乌舍尔综合征（USH1F）会导致人类视杆 - 视锥营养不良，研究人员还使用荧光标记的小麦胚芽凝集素（WGA）对pcdh15b-/- 纯合突变体进行染色，以标记视杆外段。在成年斑马鱼视网膜中，WGA 可强染色视杆外段层及部分视锥外段（图 2G）。由于视杆外段密度极高，无法对单个细胞进行测量，但pcdh15b 纯合突变体的视杆外段层厚度未发生改变。综合以上结果表明：pcdh15b 成年突变体仅出现轻度外段形态异常，并未出现类似 USH1F 患者的严重视网膜营养不良。

pcdh15 旁系同源基因在眼睛和耳朵中存在重叠表达，且具有异构体特异性偏好

鉴于pcdh15b^uot15等位基因会产生提前终止密码子，研究人员推测转录适应（TA）或许能解释该突变体视网膜表型轻微的现象。当截短的 mRNA发生无义介导的降解时，相关代偿基因表达上调是一种常见现象。在pcdh15b突变体的眼部组织中，研究人员观察到pcdh15b 的 mRNA 含量显著降低，同时pcdh15a 的 mRNA 含量上调约 2.5 倍（图 3A）。这些数据符合转录适应特征，也为视网膜表型轻微提供了合理解释。然而，令人意外的是：在野生型（WT）眼部组织中，受精后第 8 天（8 dpf）时pcdh15a 与 pcdh15b的基础表达量仅相差 3 倍（平均 ΔCq 值：15a 为 4.6，15b 为 3.0；图 S2A）。这一结果与既往研究结论相悖—— 既往研究称受精 1 天后的眼部组织中几乎检测不到 pcdh15a 表达，且当时的亚型特异性分析也未检测视网膜中的基因表达情况。

图3 – 斑马鱼pcdh15基因在眼睛与耳朵中表现出异构体特异性偏好。A）在pcdh15b纯合子中，pcdh15a的相对眼部表达水平升高，而pcdh15b的表达水平降低（P= 0.0213，P=0.0315，未配对t检验）。B）相对于3天龄（dpf）pcdh15b水平，pcdh15a和pcdh15b的眼部表达随时间变化。C）相对于pcdh15a CD3转录本，五种pcdh15a和pcdh15b C端异构体的眼部表达随时间变化，表明CD1异构体是两个旁系同源基因的主要贡献者。D）相对于4天龄（dpf）pcdh15a，pcdh15a和pcdh15b的耳部表达随时间变化。E）相对于pcdh15b CD2转录本，五种pcdh15a和pcdh15b C端异构体的耳部表达随时间变化，表明CD3异构体是两个旁系同源基因的主要贡献者。F）斑马鱼感觉器官中pcdh15表达的修正模型。在早期发育阶段，pcdh15b-CD1是眼部组织的主要贡献者，但在成年期两个旁系同源基因的-CD1异构体均有贡献。在胚胎和成体耳部组织中，两个旁系同源基因的-CD3异构体均有表达，但pcdh15a的表达水平通常更高。

因此，为验证两个 pcdh15 旁系同源基因是否均在眼部表达，研究人员设计了三对互不重叠、不区分亚型的 PCR 引物（图 S2B），并对眼部组织提取的 cDNA 样本进行终点 PCR 检测。对从幼鱼到成年鱼三个发育时间点的表达检测结果显示：两个旁系同源基因确实均在眼部表达（图 S2C）。为此，研究人员进一步深入分析各旁系同源基因的特异性表达特征。pcdh15在发育中的感觉器官中的表达模式。研究人员还利用靶向三大主要亚型类别（-CD1～-CD3）的引物，检测了各亚型特异性表达水平。

在眼部组织的cDNA中，我们发现pcdh15b在发育早期时间点的相对表达量更高，但其表达在发育过程中保持相对稳定（幼体到成体组织间表达量增加约2倍）。相比之下，pcdh15a在发育早期时间点的表达量较低，但随后迅速上升（表达量增加超过14倍）。到成年阶段，这两个旁系同源基因在眼睛中的贡献相当（图3B）。通过异构体特异性引物（-CD1、-CD2和-CD3）检测，我们发现两个旁系同源基因在眼睛中丰度最高的异构体均为-CD1亚型（图3C）。 采用相同方法，我们对解剖后的听觉器官制备的cDNA进行表达量检测。两个旁系同源基因的表达在整个发育过程中均保持相对稳定，但pcdh15a在发育后期的表达量更高（图3D）。对单个异构体的分析显示，两个旁系同源基因的-CD3异构体通常丰度最高（图3E）。尽管我们检测到两个基因的-CD2转录本存在表达，但这些异构体从未成为眼部或耳组织中的主要表达亚型。 综合来看，这些数据表明，斑马鱼感觉器官中pcdh15a和pcdh15b并非存在旁系同源基因特异性的功能，而是在眼部和耳组织之间存在异构体特异性的表达偏好性：-CD1异构体在发育中的眼睛中优先表达，而-CD3异构体在耳朵中丰度更高（图3F）。关键在于，这种转录偏好性在两个旁系同源基因中表现一致。

构建 pcdh15a；pcdh15b 双突变体

观察到pcdh15 旁系同源基因在感觉器官中高共表达后，研究人员接下来尝试构建双突变体，使原钙黏蛋白 15（Protocadherin related 15）功能完全丧失，以更好地模拟USH1F 患者的情况。采用与构建pcdh15b^uot15等位基因类似的策略，向pcdh15a基因第 5 号编码外显子注射两条 gRNA，靶向编码第一个细胞外钙黏蛋白重复结构域的区域（图 4A）。该结构域对与细胞外伴侣蛋白形成同源二聚体结合至关重要。研究人员获得了一种复杂突变（22 bp 重复、3 bp 缺失），命名为pcdh15a^uot23（图 4B）。该突变（NM_001012482.1:c.253_274dup;289_291del; NP_001012500.1:p.(Leu92GlnfsTer3)）导致阅读框移位，并在3 个氨基酸残基内产生提前终止密码子，可通过常规凝胶电泳检测区分（图 4C）。无证据表明该突变会引发无义介导的降解，因为pcdh15a 的 mRNA 水平未发生改变。相应地，也未观察到 pcdh15b 出现转录适应（图 4D）。

为确认pcdh15 突变体属于完全功能缺失型，研究人员随后对视网膜组织进行了免疫组织化学染色。在受精后第 8 天（8 dpf）幼鱼的中央视网膜中，已存在所有视锥亚型和视杆细胞的终末分化光感受器。这些光感受器排成两排：紫外视锥和短波视锥位于基底侧，中 / 长波双视锥与视杆则更靠近顶端侧（图 4E 示意图）。原钙黏蛋白 15在光感受器外段层中呈现点状信号，这与既往在人类和猕猴中的研究结果一致。通过对Z 轴层叠图像进行正位（正交）投影，发现这些点状信号沿光感受器外段周缘分布，与外段周围 F - 肌动蛋白染色位置吻合。该定位模式与杯状突起包裹外段的分布特征一致。在pcdh15a和pcdh15b单突变体中，视网膜内原钙黏蛋白 15 的表达均减少（图 4F）；而在pcdh15a⁻/⁻; pcdh15b⁻/⁻双纯合突变体中，原钙黏蛋白 15 信号完全消失，说明这两个等位基因大概率为无效突变（null）。

图 4 pcdh15a^uot23 突变等位基因的构建与特征鉴定。A）利用 CRISPR 向导 RNA 靶向pcdh15a基因第 5 号编码外显子，该区域编码蛋白首个胞外重复结构域，此构建策略与此前培育pcdh15b^uot15等位基因所用方法一致。B）pcdh15a^uot23 等位基因的桑格测序峰图，该突变包含 22 个碱基对重复与 3 个碱基对缺失，最终引发阅读框移位。C）通过琼脂糖凝胶电泳可清晰区分 pcdh15a 突变型条带。D）受精后 8 天的突变幼鱼体内，未检测到 pcdh15a mRNA 发生无义介导降解，也未出现 pcdh15b 基因表达上调（独立样本 t 检验，P=0.6734、P=0.1989）。E）受精后 8 天幼鱼视网膜光感受器层细胞结构示意图。原钙黏蛋白 15 定位于两层光感受器细胞的外段近侧区域；正位投影结果显示该蛋白沿光感受器外段全周分布，与 F - 肌动蛋白染色分布模式相符。F）pcdh15a、pcdh15b 单突变体中原钙黏蛋白 15 点状荧光信号减少，双纯合突变体内该蛋白信号完全消失。

两个pcdh15旁系同源基因均在斑马鱼机械感觉中发挥作用

从第一代ENU筛选中研究人员发现，pcdh15a突变体的机械感觉能力下降，导致其无法对振动刺激做出反应³⁸。然而，以往的研究并未报道pcdh15b突变体的机械感觉存在任何变化。因此，我们通过惊响反应实验检测了所获得的pcdh15突变体的机械感觉能力。研究人员将一枚6克的重物投入水中，通过声学振动刺激在6天龄（dpf）的幼鱼体内诱发惊跳反射。在对单突变体和双突变体pcdh15进行检测时，我们均观察到显著的这种反射所特有的快速、急促的游泳行为有所减弱（图5A）。这一结果表明，pcdh15a和pcdh15b旁系同源基因对于引发正常的惊跳反射都是必需的。

接下来，我们希望通过FM1-43 染料摄取实验，对侧线机械感觉器官进行功能检测。FM1-43 是一种亲脂性苯乙烯类分子，无法穿透完整细胞膜且无毒性。然而，将斑马鱼幼鱼浸泡于该染料溶液后，染料可通过静纤毛顶端开放的机械电转导（MET）通道进入神经丘细胞（图 1B）。通过测量神经丘与周围组织之间的荧光差值（ΔF），可评估神经丘功能。与既往研究结果一致，pcdh15a⁻/⁻纯合突变体 **** 无法摄取荧光染料（图 5B、C）。但pcdh15b⁻/⁻纯合突变体的染料摄取能力与野生型（WT）无差异（图 5D），这与此前pcdh15b 吗啉代敲低模型的结果相符。值得注意的是，携带三个突变等位基因的pcdh15a⁺/⁻; pcdh15b⁻/⁻幼鱼，染料摄取水平与野生型一致；而双纯合突变体则无法摄取 FM1-43（图 5E）。综上，这些数据表明：pcdh15a 是调控神经丘 MET 通道开放所必需且充分的因子，其作用机制很可能与参与顶端连接（tip-link）形成有关。

图 5 两种 pcdh15 旁系同源基因均参与调控斑马鱼机械感觉器官功能。A）pcdh15单纯合突变体与双纯合突变体对突发惊吓刺激的反应均显著减弱（各组P＜0.0001，布朗 - 福赛斯与韦尔奇单因素方差分析；样本量依次为 73、60、51、17）。B）显微成像结果显示，单突变体与双突变体的神经丘能否通过开放的机械电转导通道摄取 FM1-43 染料。C）pcdh15a纯合突变体无法摄取 FM1-43 染料（眶侧线：杂合子P=0.3997，纯合子P＜0.0001；后侧线：杂合子P=0.6773，纯合子P＜0.0001；布朗 - 福赛斯与韦尔奇单因素方差分析；样本量 12、12、8）。D）携带两个pcdh15b突变等位基因不会影响 FM1-43 染料摄取能力（眶侧线：杂合子P=0.8807，纯合子P=0.1424；后侧线：杂合子P=0.5897，纯合子P=0.8196；布朗 - 福赛斯与韦尔奇单因素方差分析；样本量 9、15、8）。E）基因剂量实验证实，仅pcdh15a是染料摄取过程的必需基因；pcdh15a杂合 /pcdh15b纯合突变体与野生型对照组无显著差异，而pcdh15a、pcdh15b双纯合突变体染料摄取量显著下降（眶侧线：pcdh15a⁺/⁻;pcdh15b⁻/⁻组P=0.9121，双纯合组P=0.0003；后侧线：pcdh15a⁺/⁻;pcdh15b⁻/⁻组P=0.9732，双纯合组P=0.0341；布朗 - 福赛斯与韦尔奇单因素方差分析；样本量 4、19、8）。F）受精后 4 天幼鱼内耳内侧嵴免疫荧光染色图，分别以乙酰化微管蛋白标记动纤毛、肌动蛋白标记静纤毛。局部放大图可见：pcdh15a纯合突变体静纤毛束散开，pcdh15b纯合突变体出现动纤毛脱落现象。G）揭示pcdh15两个旁系同源基因各自功能分工的作用模型内耳。Pcdh15a负责维持相邻静纤毛之间的连接；Pcdh15b则负责维系动纤毛与静纤毛束之间的连接。SO：眶上侧线；PLL：后侧线。

为了确定斑马鱼所有机械感觉器官是否仅依赖 pcdh15a发挥功能，我们接下来观察了内耳毛细胞的组织学结构。内耳内侧嵴细胞会伸出粗大的动纤毛和静纤毛束，伸入半规管中，用于感知身体位置。使用乙酰化微管蛋白和荧光标记鬼笔环肽进行全组织染色，可清晰显示这些结构特征。与以往研究结果一致，我们发现pcdh15a 纯合突变体出现静纤毛束散开（图 5F 右上）；但我们首次发现，动纤毛仍附着在散开的静纤毛上。有趣的是，pcdh15b-/- 纯合突变体呈现相反表型：静纤毛束保持完整，但动纤毛完全脱落，且该表型 100% 出现（图 5F 左下）。最后，pcdh15a;pcdh15b 双突变体表现为动纤毛脱落，且静纤毛散开程度更严重。这些结果揭示了pcdh15 旁系同源基因对祖先基因功能存在此前未报道的分工模式（图 5G）：原钙黏蛋白 15b 是内耳毛细胞动纤毛连接形成所必需且充分的因子；静纤毛连接则由两个旁系同源基因共同参与，同时缺失两者会导致最严重的静纤毛散开；仅缺失 pcdh15b，幼鱼期静纤毛不会散开。

pcdh15突变体存在视觉功能缺陷

接下来，通过运动行为实验评估pcdh15 突变体的视觉功能。将受精后 6 天（6 dpf）幼鱼暗适应 20 分钟，待运动行为稳定后，突然开启强光刺激（图 6A）。在这种光切换实验模式下，野生型（WT）幼鱼受到光刺激后，运动活性显著增强。相比之下，pcdh15a⁻/⁻、pcdh15b⁻/⁻单突变体及pcdh15a⁻/⁻; pcdh15b⁻/⁻双纯合突变体的运动启动次数、运动距离均无变化，提示其视觉功能存在缺陷（图 6B）。一个潜在的干扰因素是：pcdh15 单突变体与双纯合突变体在稳定光照条件下，运动活性本身也偏低（图 S3）。因此，研究人员进一步开展视动反射（OKR）实验，以排除游泳能力影响，独立评估视觉感知功能。

在这项经典的视觉功能检测中，受精后 6 天（6 dpf）幼鱼被固定以防止身体移位，随后黑白星芒状光栅刺激以每秒 10 度的速度顺时针旋转，覆盖幼鱼全部视野。幼鱼眼睛会平滑跟随刺激旋转，直到外展达到极限，随后产生快速逆时针扫视运动（图 6C）。尽管所有基因型幼鱼均能追踪刺激，但pcdh15a⁻/⁻、pcdh15b⁻/⁻单纯合突变体及pcdh15a⁻/⁻; pcdh15b⁻/⁻双突变体的扫视次数均减少（图 6D）。综上，这些数据表明：与对照组相比，pcdh15 单纯合突变体和双纯合突变体均存在视觉缺陷。

图6 – 单突变体和双突变体pcdh15对视觉刺激的反应均减弱。A) 运动敏锐度检测示意图及代表性原始轨迹。将6天龄（dpf）幼鱼暗适应后，给予强光刺激，对比光照切换前后2.5分钟内的运动情况。B) 所有测试中，野生型（WT）动物在光照切换后，启动次数和移动距离均增加；相比之下，<b>pcdh15a ; pcdh15b</b> 或 <b>pcdh15a ^{-1} ; pcdh15b</b> 双纯合子的行为无差异（表S3中为P值；双因素方差分析结合Sidak事后检验；<b>9587b9d2-7564-4131-853a-070997e2d44c</b>）。但无论光照强度如何，所有突变体组的游动距离均更低（图S3）。C) 视动反射（OKR）检测示意图及代表性轨迹。幼鱼固定于琼脂中，眼睛可自由活动。将黑白星爆刺激投射至全视野，以10度/秒的速度旋转，从上方记录眼球运动。D) 对比不同基因型幼鱼在3分钟测试中的扫视次数，<b>pcdh15a ; pcdh15b</b> 或 <b>pcdh15a-/-;pcdh15b-/-</b> 双纯合子的扫视次数均减少（<b>P=0.005215 a^{-1}</b>、<b>0.042915 b^{-1}</b>、<b>0.0285</b>；<b>15 a^{-1}</b>、<b>15 b^{-1}</b>）。Brown-Forsythe和Welch单因素方差分析，样本量n = <b>(value =13,13,17,18)</b>。

pcdh15突变体光感受器存在外节/内节边界分离、外节弯曲以及肌动蛋白突起紊乱的现象

本实验室此前已证实，pcdh15b纯合子会在视锥细胞外节出现早期形态异常，表现为盘片生长异常以及视锥细胞外节部分脱离²⁶。然而，我们并未检测到非洲爪蟾敲低模型中所报道的外节弯曲或过度生长现象⁴⁵。为了对视网膜进行特征分析为了研究双突变体的表型，我们使用了能特异性标记紫外视锥细胞和视杆细胞光感受器亚型的转基因斑马鱼品系。

尽管光感受器的丰度并无差异（图S4），但pcdh15a；pcdh15b-/-双纯合子在8日龄时出现了极为严重的紫外光视锥细胞形态异常（图7A）。在组织平面内，外节段出现了明显的孔洞（白色箭头头）和水平弯曲。值得注意的是，细胞在内节段与外节段的交界处还出现了“收缩”现象（白色箭头）。这一特征似乎是由细胞内节段和外节段几乎完全分离导致的，仅存的纤细桥状结构即为连接纤毛。Tg[opn1sw1:EGFP]转基因鱼中，紫外光视锥细胞的内节段因线粒体密集分布的区域无细胞质荧光而可被识别。双突变体的内节段位置比野生型对照组更靠基部，更靠近外丛状层的突触处。由于外限制膜位于内节段基部，我们以该结构为标志测量了内节段与外丛状层之间的距离。双突变体中，外限制膜到外丛状层的距离比野生型对照组缩短了约25%（图7B左）。相反，双突变体中外限制膜与外节段近端边缘的肌动蛋白带之间的距离则是野生型对照组的近4倍（图7B右）。这些数据证实，在pcdh15a；pcdh15b-/-双纯合子中，外节段与内节段边界发生分离，进而导致内节段向基部移位。

采用鬼笔环肽染色观察视网膜的肌动蛋白突起。令人意外的是，pcdh15a⁻/⁻; pcdh15b⁻/⁻双纯合突变体中杯状突起（CP）仍然存在，并环绕在视锥外段周围（图 7A 黄色箭头）。但双突变体的突起排列严重紊乱：野生型中平直、平行排列的突起，在双突变体中变为弯曲、杂乱无序。透射电镜（TEM）分析进一步证实了免疫荧光观察到的形态异常：电镜图显示，双突变体外段盘膜间存在间隙、形态异常（图 7C 箭头）；内段 / 外段（IS/OS）边界分离（图 7C 箭头）；内段线粒体向基底侧迁移、远离内外段连接区。

由于人类乌舍尔综合征以视杆细胞为主的变性为特征，研究人员还利用Tg [rho:EGFP] 转基因品系观察了视杆光感受器的组织学形态。受精后第 8 天（8 dpf）时，单突变体和双纯合突变体的视杆外段（OS）过度生长，并沿组织平面发生弯曲（图 7D）。借助Tg [rho:EGFP] 品系的 GFP 信号标记视杆、CoxIV 标记内段（IS），研究人员计算了中央视网膜内视杆光感受器的平均角度。与野生型（WT）对照组相比，pcdh15a⁻/⁻、pcdh15b⁻/⁻单纯合突变体及pcdh15a⁻/⁻; pcdh15b⁻/⁻双纯合突变体的视杆外段角度均出现显著偏移，且pcdh15b⁻/⁻单突变体与双纯合突变体的异常程度更严重。这种弯曲是杯状突起支撑作用缺失所致，还是外段盘膜过度生长引起，目前尚不清楚。值得注意的是，视杆细胞中未发现内段 / 外段（IS/OS）分离现象，提示斑马鱼视杆与视锥光感受器在内外段连接的分子机制上可能存在差异。

图7——pcdh15两个旁系同源基因的缺失会导致更严重的视网膜表型。A) 紫外线视锥细胞特异性转基因背景下pcdh15突变体的代表性共聚焦显微图像。双突变体在外节染色中出现孔洞/间隙（箭头头），内节/外节边界分离，表现为细胞收缩（箭头）。B) 外界限制膜向基底侧向外网层移位，而位于新形成外节基部的肌动蛋白与外界限制膜的距离增大（附随图表）。野生型动物中，围绕紫外线视锥细胞的肌动蛋白丝状伪足呈有序的平行顶端突起排列，而在双突变体中，其排列紊乱并呈发散状，沿细胞轮廓分布（分别对应[P=0.0002和P=0.0112)；Welch氏t检验）。C) 代表性透射电子显微镜显微图像证实了外节盘膜存在间隙以及内节/外节分离边界（伪彩色处理以分别将视锥细胞和视杆感光细胞标记为品红色和黄色）。D）对视杆感光细胞的分析显示，与野生型对照组相比，单突变体和双突变体的外节（OS）过度生长，且以更锐角弯曲。径向直方图显示了以20度为区间的视杆外节百分比。在线性X轴上绘制每只动物的平均角度，结果表明所有组别（单突变体和双突变体）均与野生型对照组存在显著差异（P=0.015615 a^{-/-}、0.000815 b^{-/}、0.0026 15 a^{-1}；15 b^{-1} 采用Brown-Forsythe和Welch方差分析，n-value =10,5,6,5）。

视网膜表型的严重程度取决于pcdh15的基因剂量

即便采用改良的饲养方案，pcdh15a-/-; pcdh15b-/- 双纯合突变体仍会在受精后约 14 天（14 dpf）死亡，推测原因是鱼鳔无法充气，且该表型100% 出现。这些幼鱼的游泳行为不协调，难以有效摄食（视频 S1）。因此，研究人员想探究：持续强光暴露所造成的细胞应激增强，是否能凸显 pcdh15 突变体幼鱼光感受器间的存活差异。实验动物先在标准光暗周期下饲养至5 dpf，随后转入7000 勒克斯持续强光环境中饲养72 小时，在8 dpf时取样检测（图 8A）。在此条件下，与野生型（WT）对照组相比，所有突变组的外核层（ONL）固缩细胞核数量均显著增加，其中双纯合突变体数量最多（图 8B）。对外核层细胞核进行计数（图 8C），发现光感受器细胞数量呈现野生型 > pcdh15a-/- > pcdh15b-/- > 双纯合突变体的趋势；其中pcdh15a-/-组的细胞核数量差异未达到统计学显著性（P=0.1119）。两项分析结果均显示，突变等位基因的遗传效应呈累加性，双纯合突变体的表型比单突变体更严重。这些数据首次报道了在 USH1F 动物模型中观察到光感受器细胞死亡，但需要通过人为诱导视网膜应激的实验条件才能实现。

由于双纯合子幼虫无法发育至成年，我们接下来检测了pcdh15a+/-; (pcdh15b)突变体，该突变体保留了一个野生型pcdh15a等位基因。这些不同合子类型的双突变体成年后具有生存和繁殖能力，无明显可检测的差异，并在标准光照条件下饲养。然而，当它们生长至约15月龄后，这些突变体开始表现出游泳行为不协调的现象，且难以维持中性浮力（视频S2）。由于平衡定位需要视觉和平衡觉的共同刺激38，这一现象可能表明其视觉或机械感觉发生了进行性退化。

聚焦视网膜表型，研究人员收集了受精后 18 个月（18 mpf）的 pcdh15a；pcdh15b 突变体及同龄野生型（WT）对照组。杂合双突变体表现出严重的视网膜营养不良：外核层（ONL）中大部分蓝色视锥和双视锥细胞核消失（图 8D 箭头）。研究人员常观察到细胞核脱离外核层、散落在光感受器外段之间（图 8D 箭头）。这些细胞核呈凋亡标志物 —— 活化半胱天冬酶 - 3（cleaved caspase-3）阳性，提示为凋亡的光感受器细胞。对凋亡细胞计数显示：pcdh15a 杂合；pcdh15b 纯合突变体的外核层凋亡细胞数量增加约 8 倍 ，外核层细胞总数也相应减少（图 8E）

通过免疫荧光显微镜观察光感受器形态，同样发现严重结构异常。与对照组相比，紫外视锥（图 8F）和蓝色视锥（图 8G）的外段形态高度不规则、排列紊乱。细胞周围的肌动蛋白突起严重紊乱、出现大片空缺，且完全缺失 F - 肌动蛋白。蓝色视锥在外段数量和长度上受损程度比紫外视锥更严重（图 S5A、B），这与外核层（ONL）顶端几乎完全缺失蓝色视锥细胞核的现象一致。该视网膜营养不良的严重程度，与pcdh15b⁻/⁻单纯合突变体（图 2）的表现截然不同，提示存在强烈的基因剂量效应：缺失一个 pcdh15a 等位基因会加剧 pcdh15b 纯合突变体的表型。用小麦胚芽凝集素（WGA）对pcdh15a⁺/⁻; pcdh15b⁻/⁻突变体切片染色，证实中央视网膜视锥外段大量缺失（图 8H 箭头）；但令人意外的是，视杆外段层厚度未发生改变。这表明：在斑马鱼 USH1F 模型中，视杆细胞可能对细胞死亡更不敏感（与人类疾病相反）；或是新生视杆祖细胞在不断补充视杆细胞。综上，这些数据表明：双突变体的视网膜表型比 pcdh15b⁻/⁻单纯合突变体更严重，且无论是在细胞应激条件下，还是正常衰老过程中，均易发生细胞死亡。

图8 – 双突变体光感受器的细胞死亡与形态异常。A）高强度光照试验方案。幼鱼在标准光暗周期下饲养至5天龄（dpf），然后置于7000勒克斯持续光照下72小时。B）光照试验后，单纯合子和双纯合子的外核层（ONL）固缩细胞数量增加（P=0.011615 a^{-/-}、0.000415 b^{-/-}、0.000415 a^{-1} ; 15 b^{-1}；Brown-Forsythe和Welch方差分析，）。C）在 pcdh15b和 pcdh15a 品系中，检测到外核层（ONL）细胞数量显著减少；pcdh15b 双纯合子P=0.111915 a^{-1}、0.036615 b^{-/}、0.0012 15 a^{-1} 15 b^{-1}；Brown-Forsythe 与 Welch 方差分析，n-vaule =8 8、7、7。D) 18 月龄pf的 pcdh15a+/-; (pcdh15b) 混合杂合性双突变体视网膜中凋亡光感受器的代表性共聚焦显微图像。E) 这些突变体中凋亡细胞数量增加（P=0.0012)：Welch 检验）和外核层细胞核绝对数量减少（P=0.046)；Welch 检验）的定量分析。混合杂合性双突变体视网膜中紫外视锥细胞和F-肌动蛋白的代表性显微图像。紫外视锥细胞严重畸形，无法形成典型的锥形外节（OS）形态。肌动蛋白突起稀疏且排列紊乱。G) 蓝视锥细胞和F-肌动蛋白的代表性显微图像显示蓝视锥细胞已变得极为稀少。剩余的蓝视锥细胞畸形，在外核层上方伸出的外节极少。肌动蛋白突起的缺口与细胞缺失的位置相吻合。H) 凝集素（WGA）染色的代表性图像显示，混合杂合性双突变体中视锥细胞缺失（箭头所示），但视杆外节层厚度正常（P=0.7495)；Welch 检验）。

Pcdh15 异构体的特异性作用

我们此前已证实，pcdh15 在眼睛中的主要表达来源于 pcdh15a 和 pcdh15b 的 -CD1 表达亚型，而 -CD3 亚型在耳朵中含量最高（图3C+E）。为探究这种表达模式的差异是否提示了亚型特异性功能，我们尝试分别敲除各亚型。针对每个旁系同源基因的 -CD1 编码外显子和 -CD3 编码外显子，我们设计了两种双链向导RNA（dgRNA）。为了在全身范围内最大化诱变的概率，我们使用了两种不重叠（间隔 >300 bp）的 dgRNA⁴⁸。通过定量野生型（WT）位点相对于产生的插入缺失（indels）的比例，确定了每种 dgRNA 的切割效率（图9A、图S6A）。使用该方法，我们常规测得每种 dgRNA 在导致低于20%胚胎发育畸形（<20%）的剂量下，切割效率介于30%至70%之间（图S6B）。由于每种亚型均使用两种不重叠的 dgRNA，这种组合方法适用于构建功能缺失的F0代动物（crispant）。

ΔCD3 斑马鱼幼鱼可通过其在 5 天龄（dpf）时无法充气鱼鳔来识别，而 ΔCD1 幼鱼与未注射对照组无法区分（图 9B）。通过 FM1-43 染料摄取评估发现，ΔCD3 幼鱼的神经丘机械电转导也存在缺陷（图 9C）。对内侧嵴的检查显示，ΔCD3 幼鱼的静纤毛呈散开状，但动纤毛仍相连。ΔCD1 幼鱼的毛细胞形态未发现可检测的差异（图 9D）。这些数据与含 -CD3 的同工型参与机械感觉、而 -CD1 同工型并非必需的观点相符。相反，视网膜组织学ΔCD1 幼虫中出现异常，但在 ΔCD3 动物中无明显差异。对外核层（ONL）的评估显示，ΔCD1  crispant 中光感受器细胞核呈圆形且排列更紧密（图9E 黄色箭头）。紫外线视锥细胞在内节/外节（IS/OS）边界处出现收缩，几乎完全脱落，外节染色出现缺口（分别为白色箭头和白色箭头所示）。最后，ΔCD1 视网膜中的丝状肌动蛋白（F-actin）顶端突起排列紊乱，失去了平行排布（图9E 红色箭头）。这些数据证实了原钙粘蛋白相关15（Protocadherin related 15）在感觉器官中具有异构体特异性作用：-CD1 异构体是光感受器细胞形态发育所必需的，而 -CD3 异构体则是侧线和耳朵处机械敏感性毛细胞发育与功能所必需的。

图9——pcdh15旁系异构体特异性作用的证据。A) 野生型扩增子迁移率（虚线）与在5天龄（dpf）时注射pcdh15a（绿色）或pcdh15b（蓝色）CD1和CD3双基因向导RNA（dgRNA）的胚胎中产生的扩增子群体的代表性轨迹。柱状图显示了每种dgRNA诱导插入缺失（indels）的平均切割效率和变异性。B) 胚胎期0代（F0）CRISPR注射的幼鱼与未注射对照组无明显差异，仅ACD3组幼鱼存在鱼鳔无法充气的情况n=3批次。分别为未注射组146条、ACD1组161条、ACD3组104条）。C) ΔCD1幼鱼的FM1-43染料摄取正常，但ΔCD3 CRISPR注射的幼鱼染料摄取显著降低（SO P=0.9999 Delta C D 1)，ACD3组P=0.0015；后侧线（PLL）ACD1组P>0.9999，ACD3组P=0.0005；布朗-福赛斯与韦尔奇单因素方差分析；n-value =48,24,24。D) 共聚焦显微照片显示，ΔCD1幼鱼的内侧壶腹嵴与对照组无差异，而ΔCD3 CRISPR注射的幼鱼静纤毛呈散开状，动纤毛仍保持连接。E) pcdh15 ΔCD1 CRISPR注射幼鱼存在光感受器形态异常，而ΔCD3组无此现象。ΔCD1注射胚胎的紫外视锥细胞（Tg(5.5opn1sw1:EGFP)kj9）出现内节/外节（IN/OS）边界分离（箭头）、外节（OS）出现孔洞（白色箭头头）、肌动蛋白突起排列紊乱（红色箭头头）以及细胞核形态异常（黄色箭头头）。OS=外节；IS=内节；OLM=外界膜；OPL=外网层。

讨论

本研究首次构建了任一耳石症相关基因的斑马鱼双突变体，并证实pcdh15a和pcdh15b这两个旁系同源基因均参与机械感觉与视觉的发育及功能调控。与以往研究不同，本研究发现斑马鱼旁系同源基因的表达并非呈二分分化，即不存在pcdh15a仅特异性表达于耳朵、pcdh15b仅特异性表达于眼睛的情况。相反，只有同时敲除这两个旁系同源基因，才能在任一组织中观察到最严重的表型。在内耳毛细胞中，双基因敲除会导致静纤毛出现最严重的散开现象，同时伴随动纤毛脱落；在视网膜感光细胞中，只有双基因敲除才能观察到肌动蛋白突起严重紊乱，以及内外节脱落的表型。成年阶段，混合合子双突变体（pcdh15a)；(pcdh15b）出现明显的视网膜退行性病变，而单基因纯合子（pcdh15b）则无此表型。这些数据拓展了我们对pcdh15在耳朵和视网膜中作用的认知，同时也凸显了斑马鱼模型研究中一个潜在的干扰因素：当基因存在旁系同源拷贝时，研究单突变体可能会因旁系基因的补偿功能而无法完全反映真实表型。本研究建议，对存在重复拷贝的基因进行研究时，应尽可能构建双突变体，以明确是否存在功能冗余，并更全面地解析其功能与分化进化机制。

自斑马鱼中发现两个重复的pcdh15基因以来，有研究提出祖先功能发生了亚功能化²⁴。原位杂交（ISH）分析显示，pcdh15b的表达结构域仅限于神经视网膜和松果体（推测在松果体光感受器中表达⁴⁹），仅有少量额外的表达结构域，而pcdh15a则在耳泡和神经丘中表达。然而，通过现代参考数据集重新检测用于生成该pcdh15b ISH探针的序列（AY772391.1）后，我们发现该探针仅与pcdh15b-CD1亚型互补（序列同源性达99.6%，图S7），因此不太能反映pcdh15b的整体表达情况。在此背景下，原位杂交数据与我们的观察结果一致，即pcdh15b-CD1具有以下特点：a）在幼鱼眼部组织中大量表达；b）在耳泡中表达量不高。后续的一项原位杂交研究还发现，在成年斑马鱼的耳朵中，pcdh15a-CD3亚型的表达量比-CD1亚型高2倍以上²⁵（该研究发表于pcdh15a-CD2亚型注释之前）。我们的实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析也与这些发现相符，因为-CD3亚型在耳组织中始终是表达量最高的亚型（图3E）。不过，我们通过对感觉器官从胚胎期到成年期整个发育过程中各亚型进行定量分析，进一步拓展了这些研究结论。从这些数据中，我们明确了两个旁系同源基因在野生型（WT）发育过程中对耳朵和眼睛均有贡献，证实这两个旁系同源基因协同发挥作用，且需要双突变体才能构建完整的pcdh15功能丧失模型。我们还发现，部分亚型在耳朵中的表达量高于眼睛，这可能与不同的功能相关。

原钙粘蛋白相关15是一种非典型钙粘蛋白，被认为可作为细胞粘附分子发挥作用。在内耳机械敏感性毛细胞中，原钙粘蛋白相关15与钙粘蛋白相关23的细胞外钙粘蛋白重复结构域形成“握手”相互作用，执行结构或感觉功能⁵⁰。在顶端连接链处，这种分子桥充当“机械敏感弹簧”，响应剪切力调控机械转导（MET）通道的开放⁴¹。而在暂时性侧连接链和动纤毛连接链中，该复合物将相邻的细胞突起结合在一起，在发育过程中形成阶梯状的静纤毛排列（侧连接链相关）或组织组织的平面极性（动纤毛连接链相关）²⁰,²²,⁵¹。同一基因如何实现这些不同功能，原因可能在于C端细胞质结构域的可变剪接以及与不同细胞质结合蛋白的相互作用。后一种功能或许可以解释为何每种同工型的细胞内部分仅具有20%至30%的序列同一性（图1A）。

尽管已在耳蜗中检测到原钙粘蛋白15（Pcdh15）的所有同工型20，但关于同工型特异性功能的证据复杂且有时相互矛盾。在同工型特异性小鼠突变株中，ΔCD1和ΔCD3基因敲除不会导致听力损失，而ΔCD2的缺失则会引发耳聋。一致的是，当在出生后毛细胞中条件性敲除-CD2结构域时，顶端连接的形成被废除。这些研究表明，原钙粘蛋白相关15的CD2结构域可能是顶端连接的主要组成部分，而其他同工型则参与形成其他连接。然而，另有研究发现，虽然普遍存在的ΔCD2确实会导致极性缺陷和听力损失，但顶端连接结构保持完整。然而进一步研究表明，三种异构体的定位将- CD1和- CD3异构体确定为顶端连接最可能的组成部分。对于这些差异，最合理的解释是基因网络中存在显著的功能冗余，且不同发育阶段需要多种异构体。由于PCDH15蛋白通过细胞外钙粘蛋白重复序列的相互作用形成二聚体，不同的C端异构体也可能发生异二聚化以形成这些连接。在我们的分析中，发现异构体的丰度在发育过程中会发生很大变化，但在斑马鱼的耳朵和眼睛不同发育阶段，这三种异构体均有不同程度的表达（图3）。

内耳静纤毛的散开是斑马鱼Usher综合征突变体的一个共同特征。本研究表明，静纤毛散开是由pcdh15a/b突变体中- CD3异构体的缺失导致的（图8D）。然而，在任何相应的异构体特异性小鼠模型中均未观察到耳蜗静纤毛散开的现象。相反，影响所有小鼠异构体的突变确实会导致静纤毛散开，并最终引起神经上皮的变性。这些数据表明不同物种在表型上存在差异，需谨慎将研究结果直接外推至人类疾病。由于成年之前的人类组织病理学分析较为缺乏，目前尚不清楚Usher综合征患者的耳蜗中是否也存在静纤毛散开的情况。在已发表的颞骨解剖研究中，唯一一致的发现是神经上皮变性，这与老年小鼠耳蜗的表现相似。然而，这些患者的解剖均未在其二十岁之前进行，因此可能代表了该组织的晚期病变。事实上，USH1F患者存在先天性耳聋，这表明细胞损伤发生在发育阶段。

与前庭毛细胞不同，小鼠耳蜗毛细胞拥有在发育过程中至关重要的瞬时动纤毛6668。这些细胞器有助于柯蒂氏器的模式形成，而动纤纤毛的扰动会破坏其平面极性组织。在斑马鱼中，毛细胞动纤毛会持续到成年阶段，但动纤毛与静纤毛之间的相互作用特征仍不明确。据我们所知，本研究首次报道了pcdh15基因的缺失会导致斑马鱼动纤毛与静纤毛分离，这一效应由pcdh15b基因介导（图5F）。有趣的是，ΔCD1和ΔCD3基因敲除模型均未重现这一缺陷（图9D），这表明pcdh15-CD2结构域可能是动纤毛连接所必需的。相关证据显示，小鼠ΔCD2突变体存在耳蜗平面极性缺陷。不过，我们尚未在斑马鱼中直接验证这一假说，也无法排除多种异构体的共同作用。目前，神经丘中动纤毛与静纤毛的连接是否依赖pcdh15b基因，以及pcdh15b基因的缺失是否会影响毛细胞平面极性，仍有待进一步阐明。

研究Usher综合征发病机制最具挑战性的方面是理解患者的进行性视力丧失。USH1型小鼠模型确实存在轻微的视觉缺陷，但并未出现明显的组织学改变或视网膜营养不良。这与USH1型斑马鱼、非洲爪蟾和猪模型形成对比，相关研究表明这些模型中因USH1基因缺失会出现显著的视网膜病变。有研究提出，这种差异是由于夜行性啮齿动物失去了致病的主要部位。Usher蛋白定位于杯状突起，这是一种丝状肌动蛋白依赖性突起，跨越视杆细胞内节与外节的边界。尽管杯状突起是大多数物种感光细胞的特征，但夜行性啮齿动物已失去这一结构。这些杯状突起被认为在视网膜中发挥结构作用，支撑形成外节的细长复杂纤毛。本研究数据表明，原钙黏蛋白15确实定位于视杆细胞外节基底的圆周处（图4F），且通过双纯合子中信号消失的结果验证了该抗体的有效性。其定位模式与感光细胞周围的肌动蛋白顶突一致，但由于抗原修复处理会导致鬼笔环肽结合失效，因此无法评估二者的直接共定位情况。在双突变体中，纤维状肌动蛋白仍与视杆细胞外节相对，但视杆细胞内节与外节发生分离，导致连接纤毛处出现收缩现象。从异构体特异性crispant（成簇规律间隔短回文重复序列编辑细胞）实验中可将该表型归因于pcdh15-CD1异构体的缺失。crispant还出现了视杆细胞内节向外侧网状层（OPL）基底退缩的现象，在临床光学相干断层扫描（OCT）中，该退缩区域形成了椭球体区80。由于椭球体区的收缩和中断是Usher综合征患者视网膜营养不良的早期指标，因此对这一表型的进一步研究或许能揭示疾病的发病机制。

总之，本研究对通过表达模式分化使旁系同源的pcdh15基因之间存在严格功能划分的观点提出了挑战。尽管pcdh15基因表现出一定程度的亚功能化，但要揭示任一耳或眼组织中真正纯合缺失突变体的表型，有必要敲除这两个基因。无论基因功能是通过遗传冗余还是转录适应来维持，若不删除两个基因拷贝，都存在掩盖基因功能的风险。在CRISPR/Cas系统实现高效基因组编辑的时代，本研究希望能激励研究人员考虑构建双突变体，以研究人类单基因遗传病。对比单突变体与双突变体的表型能够揭示旁系同源基因的协同作用，还有助于阐明疾病发病机制的不同方面（例如动纤毛连接与静纤毛连接的断开）。通过细致的表型分析，这类研究可以将斑马鱼基因组（即硬骨鱼全基因组复制）的一个潜在干扰因素，转化为解析基因功能的一个有利特征。

方法

鱼类养殖

所有实验均按照加拿大动物护理委员会制定的动物实验规范进行，并经多伦多大学动物护理委员会批准，实验方案编号为20011288。我们已遵守动物使用的所有相关伦理规范。本研究中使用的所有斑马鱼均来自AB实验室品系，分别在受精后2天、5天、8天、14天以及1个月、4个月、8个月或18个月进行研究。动物在受精后4个月前无法确定性别，4个月后选取数量相等的雄性和雌性个体。本研究中使用的转基因品系和突变体品系详见补充表3。

视网膜免疫组织化学

取出成年小鼠的眼球，分离晶状体，将组织置于1毫升4%缓冲多聚甲醛（pH 7.4，溶于磷酸盐缓冲液）中，4℃固定过夜。冷冻保存前，沿前后轴将成年眼球对半切开。对于幼鱼，剪下尾部进行基因分型，头部按上述方法固定。随后将组织置于梯度蔗糖溶液中处理，最终用20%蔗糖进行冷冻保存。将组织包埋在20%蔗糖与O.C.T.包埋剂（樱花芬泰克4583）按2:1混合的介质中，以20微米的厚度进行冰冻切片。切片在PBS-T（磷酸盐缓冲液+1%吐温-20）中透化，用5毫克/毫升牛血清白蛋白、5%正常山羊血清进行封闭，随后在封闭液中加入1:500的一抗，4℃孵育过夜。经三次PBS-T洗涤后，在封闭液中加入1:500的二抗和/或荧光染料偶联的鬼笔环肽，孵育2小时。用1:1000的Hoechst 33342对切片复染30分钟，最后用ProLong™金型封片剂（赛默飞世尔P36930）封片。在徕卡SP8共聚焦显微镜下拍摄Z轴堆叠图像，并生成最大强度投影图。检测抗Pcdh15时，在封闭步骤前增加抗原修复步骤：将切片置于95℃、含10毫米柠檬酸钠和0.05%吐温-20（pH 6.0）的修复液中孵育10分钟。为控制眼球偏心性，所有分析的切片均选取视神经处的同一张切片。分析的感光细胞位于视网膜中央区域内。所用抗体信息详见补充表3。

使用 IMARIS（牛津仪器公司）对神经视网膜中的细胞核进行半自动化定量分析。研究人员在外核层、内核层和神经节细胞层周围手动绘制表面，并创建霍斯特通道的掩模。随后使用斑点工具自动识别细胞核。由于视锥细胞核呈细长形，易出现重复计数，因此需要对野生型切片中的部分外核层细胞核进行人工校正。使用测量工具对光感受器的长度和角度进行测量。角度测量以外节最远端尖端为起点，至细胞色素c氧化酶亚基IV信号的表面，再到细胞体基部进行测定。

全 mounts 内侧嵴免疫荧光

为对内嵴的静纤毛和动纤毛进行成像，我们遵循了Maeda发表的方案（编号(201725)）。按前述方法收集并固定幼体。将头部置于PBS-Tx（磷酸盐缓冲液+0.5% Triton X-100）中，以50转/分钟振荡透化1小时，随后于4℃放置过夜。按前述方法对组织进行2小时封闭，之后在4℃条件下于1:200稀释的抗乙酰化微管蛋白溶液中孵育过夜。经3次、每次1小时的PBS-Tx洗涤后，用1:500稀释的二抗与1:50稀释的鬼笔环肽对组织进行标记。头部再经3次、每次1小时的PBS-Tx洗涤，随后包埋于1%低熔点琼脂糖（Fisher Scientific，货号BP165-25）中。通过共聚焦显微镜对内嵴机械感受性毛细胞进行Z轴序列成像，并生成最大强度投影图。所用抗体信息详见补充表3。

pcdh15a^uot23 品系的构建

参照Gagnon等人2014年84号文献补充材料中的改良方案，完成了pcdh15a基因的CRISPR/Cas9诱变。从CHOPCHOP服务器85选取两个间隔序列RNA，靶向pcdh15a的编码外显子（序列编号(5th)）。间隔序列两侧分别连接SP6启动子和恒定寡核苷酸的互补序列。间隔序列与恒定寡核苷酸均从Integrated DNA Technologies（IDT）公司订购，将其与表3中的片段杂交并结合，随后使用T4 DNA聚合酶进行延伸。使用SP6 MEGAscript试剂盒转录sgRNA，并以1:1的比例混合，最终浓度为300纳克/微升。在注射到单细胞阶段斑马鱼胚胎之前，加入1微升EnGen Spy Cas9 NLS蛋白。在使用前进行连续回交以产生F0代。通过桑格测序确认UoT23等位基因的序列变异。

基因组DNA提取与PCR基因分型

通过将组织在50毫摩尔氢氧化钠溶液中煮沸20分钟，剧烈涡旋振荡，并用1摩尔三羟甲基氨基甲烷（pH值为8.086）中和，获得了可用于PCR反应的基因组DNA。通过将幼虫置于55微克/毫升丁香油酚中麻醉，使用解剖刀切除尾部尾血管远端的尾尖，进行幼虫尾部活检。随后将幼虫转移至24孔板中，加入新鲜的E3培养基使其恢复，将尾部组织转移至20微升氢氧化钠溶液中，按上述方法处理。使用GoTaq G2 DNA聚合酶进行基因分型PCR反应，引物序列详见补充表S3。电泳实验采用1%-3%的琼脂糖凝胶，以硼酸钠电泳缓冲液为介质，在250伏恒定电压下进行。

透射电子显微镜

胚胎在pH 7.2的0.1摩尔/升索伦森磷酸盐缓冲液配制的2.5%戊二醛溶液中于4℃固定超过24小时。组织在索伦森缓冲液中洗涤3次，每次10分钟，随后用1%四氧化锇进行二次固定，固定时长为1小时。再次经3次、每次10分钟的洗涤后，样品依次脱水至90%乙醇浓度。将样品转移至斯普耳环氧树脂中，定向做冠状切片，之后在65℃条件下固化18小时。将100纳米超薄切片转移至高透射电镜载网，先用50%甲醇配制的3%醋酸铀溶液染色45分钟，再在索伦森磷酸盐缓冲液中用雷诺兹柠檬酸铅溶液染色15分钟。使用日立HT-7700透射电子显微镜在80千伏电压下进行透射电镜观察。

逆转录聚合酶链式反应与实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应

使用磨尖的钨针在所需阶段从野生型或突变体品系中解剖眼和耳组织。成年斑马鱼的耳朵在切除大脑后，使用弹簧剪和磨尖的钨针进行解剖88。若使用pcdh15a或pcdh15b纯合子组织，需先通过幼鱼尾鳍活检对动物进行基因分型，再按上述方法解剖。将组织立即投入1毫升TRIzol™试剂中制备混合样本：眼组织对应3天胚胎期n=50、8天胚胎期n=35、14天胚胎期n=35、1月龄n=3、4月龄n=2；耳组织对应4天胚胎期n=50、8天胚胎期n=35、14天胚胎期n=15、1月龄n=3、4月龄n=2。加入200微升氯仿并以最大转速离心后，吸取水相。总RNA通过异丙醇沉淀法提取，并用1毫升75%乙醇洗涤。取500纳克总RNA，利用SuperScript™ IV逆转录酶进行cDNA合成，使用前按1:5比例稀释。末端逆转录PCR实验采用GoTaq® G2 DNA聚合酶。PCR反应的退火温度为58℃，延伸时间30秒，共35个循环。引物序列见补充表3。凝胶电泳采用含1%琼脂糖的SB缓冲液，150伏条件下电泳60分钟。

所有实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）均按照Taylor等人2019年的建议进行89，并依据MIQE指南90通过标准系列稀释进行验证。所有10微升的qRT-PCR反应均采用技术重复三次的方式，使用LightCycler® 480 SYBR Green I Master试剂进行，且设置了不少于6次生物学重复；以β-肌动蛋白、Ism12b和mob41三个持家基因的几何平均值进行标准化处理。随后，针对图3A中的野生型（WT）样本、图3B中的pcdh15a 3天胚胎（3dpf）、图3C中的pcdh15a-CD3、图3D中的pcdh15b 4天胚胎（4dpf）、图3E中的pcdh15bCD2以及图4D中的野生型（WT）样本对Cq值进行标准化。所有引物序列详见补充表3。

惊跳反射测试

使用Zebralab自动追踪系统追踪幼鱼在惊吓刺激下的游泳行为。每个重复实验中，将6天龄（dpf）的野生型（WT）n=6斑马鱼以及推定突变体n=18放入24孔板，随后转移至Zebrabox装置中适应至少20分钟。记录2分钟内的游泳行为，每30秒施加一次刺激，共施加三次。惊吓刺激通过将6克的金属重物从15厘米高度掉落至放置24孔板的底座来提供。快速游泳距离（单位：毫米）由软件确定并提取为Excel文件。触发窗口被设定为从触发启动时间开始的5秒时间段。惊跳反射计算为刺激后5秒的快速游动距离减去刺激前5秒的快速游动距离。对三次惊跳刺激重复实验的距离取平均值。所有为负值的惊跳反射值（即幼虫在刺激前立即进行快速游动）均被排除在分析之外。每组排除的样本数分别为5、1、4、2。

视觉功能测试

在持续光照或暗转光切换条件下的运动行为通过300秒的记录完成。6天龄（dpf）的斑马鱼幼虫被转移到六孔板中，放置在悬挂的5MP CMOS单色相机（Mightex）下方，并由红外光从上方照射。随后，在拍摄视频前，幼虫需适应光照条件20分钟。视频以每秒20帧的速度拍摄，在切换范式中，150秒后开启250勒克斯的白光，或在整个测试过程中保持持续光照。记录完成后，按照上述方法对实验动物进行基因分型。使用FIMTrack92软件计算总移动距离和运动启动次数，并对100秒的时长进行归一化处理。

在进行视动反射测试时，本研究采用了一款定制开发的名为Socialize的网络应用程序。6天龄的斑马鱼幼鱼被包埋在2.5%低熔点琼脂糖中，切除头部周围的琼脂糖以确保眼睛能够自由活动。琼脂糖浸没在E3培养基中，在整个测试过程中持续监测幼鱼的存活情况。将幼鱼放入20厘米的培养皿成像槽中，通过AAXA P8智能微型投影仪从下方投射视觉刺激。使用配备理光FL-CC1614A 2米镜头和BP800-27红外滤光片的BFS-U3-23S3M-C USB 3.0 Blackfly S单色相机从上方拍摄眼部运动视频。以10度/秒的速度顺时针旋转一个直径15厘米、带有20度宽扇形段的黑白太阳辐射圆盘刺激物。视动反射测试的反应以30帧/秒的速度记录180秒。经过预训练的DeepLabCut93网络逐帧追踪每只眼睛的位置，标记每个眼球的前端、后端和中心。使用定制分析脚本处理眼动追踪数据以获取眼位轨迹。对于每一帧，根据双眼的中点估算头部朝向，并计算垂直参考向量以通过头部方向归一化眼角。对于每只眼睛，对标记点进行线性拟合以定义方向向量，并利用向量点积公式计算相对于头部参考的眼角。

使用高斯滤波器（SD = 4 帧）对眼角轨迹进行时间平滑处理。将眼速量化为眼角的逐帧变化，并采用中位数绝对偏差（MAD）异常值检测阈值 (K=5-10) 识别扫视运动。将超过 K*倍 MAD 的高速帧归类为扫视运动。对无反应或未完成完整 180 秒眼-头反射反应试验的幼体进行分析剔除。

FM1-44 摄取实验

斑马鱼胚胎在E3培养基中培养至2天龄（dpf）并去除绒毛膜。将FM1-43FX染料（赛默飞世尔科技公司）溶解在200微升二甲基亚砜（DMSO）中，随后在E3培养基中稀释至15微摩尔。胚胎在FM1-43FX工作液中浸泡1分钟，然后立即在(E3 ^{94})中洗涤3次，每次1分钟。随后按照上述方法对胚胎进行麻醉，并在配备Axiocam 712单色相机（蔡司）的Lumar V12（蔡司）体视显微镜下进行成像。在(FIJI ^{95})实验中，使用点工具计算神经丘细胞与背景之间的荧光差值（ΔFluorescence）。

强光饲养

斑马鱼幼鱼在标准条件下饲养至5天龄（dpf）。在5至8天龄期间，斑马鱼改置于培养皿中饲养，置于恒定7000勒克斯光照下，并覆盖铝箔以反射光线。其余所有变量均保持不变。日常健康检查、喂食和换水操作均按常规进行。光照72小时后，处死幼鱼，头部组织固定，尾部用于上述基因型鉴定。随后按常规进行切片和免疫荧光实验。赫斯特染色后鉴定固缩细胞核按上述方法进行33342染色。固缩细胞核通过其浓缩的形态进行鉴定：健康细胞核的(<50%)区域具有更高的信号强度。

存活曲线

对于生存曲线实验，进行了pcdh15b+/-亲本互交，将幼鱼饲养至3天龄（dpf）。按上述方法对幼鱼进行尾部活检，随后将幼鱼单独置于96孔板中饲养，直至完成基因型鉴定。三种基因型（15 b+/+)、(15 b+/-)、(15 b-1}）随后在水产设施的标准条件下单独饲养。每周拍摄育苗缸的图像，用于统计鱼的数量并绘制生存曲线。

统计学与可重复性

所有数据在分析前均进行了盲法处理，统计检验采用 GraphPad Prism 版本 10 完成。所有实验均在不同日期至少重复进行两次。在所有分析中，生物学重复定义为不同的动物，对于qRT-PCR分析则定义为不同的组织池。除非未进行定量分析，否则每个图面板或图例中均会标注生物学重复的数量。对于定性数据，我们展示了来自n=3次重复实验的代表性图像（用于验证pcdh15抗体和电子显微镜实验），或来自n=6次重复实验的代表性图像（用于内耳免疫荧光染色和crispant组织学分析）。参数检验仅在数据集通过Shapiro-Wilk正态性检验后才进行。在可行的情况下，我们采用不假设组间标准差相等的检验方法。所有图表均使用Prism制作，径向直方图除外，后者通过MATLAB 2025（Mathworks公司）的polarhistograms函数生成。柱状图上的所有误差棒均显示标准误（SEM）的上下限值。