题目：Introduction of artificial plants has no detrimental or beneficial effects on laboratory zebrafish husbandry but limits available swimming space

原文链接：http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0348591

期刊：PLOS One

摘要

学界普遍认为，实验动物的饲养条件需要不断改进，以保障最佳的动物福利和研究数据质量。斑马鱼（斑马属）作为生物医学和毒理学领域的主要动物模型之一，目前在大多数实验装置以及畜牧养殖环境中均被饲养在缺乏环境丰富度的鱼缸中。目前，通过放置人造植物进行结构丰富被视为一种潜在的优化措施，可为斑马鱼提供更多样化的环境。另有研究表明，这一措施可减轻斑马鱼的应激或焦虑情绪，提升其认知能力、存活率与繁殖能力。不过，人们仍对其长期利弊存在顾虑。  因此，我们在饲养缸中引入了人造植物，并在为期一年的时间内评估在我们的特定养殖系统中，该措施的收益是否大于风险。在对16个未进行环境丰富和16个放置人造植物的鱼缸进行配对比较时，我们未发现斑马鱼在饲养期间的存活率、性别比例、繁殖能力或病原体负荷方面存在显著差异。  在分析斑马鱼在8升饲养缸中的行为时，我们观察到斑马鱼会显著避开靠近人造植物的区域，且更偏好鱼缸中部或对面的开阔水域。这种偏好效应在较低的饲养密度下更为明显。  综上，我们发现向我们特定的斑马鱼养殖设施中引入结构丰富措施成本较低，且未对斑马鱼产生不利影响，但会缩减其自由游动的空间。同时，由于未进行结构丰富时斑马鱼的存活率本就很高，我们的监测数据难以体现该措施的益处。我们呼吁其他研究者撰写类似的设施相关报告，以推动围绕人造植物环境丰富在斑马鱼养殖系统中潜在长期益处展开更广泛的讨论。

引言

斑马鱼（斑马拟丽鱼）是全球范围内最成功的动物模型之一。过去十年间，相关发表论文数量增长了75%（根据PubMed数据库数据，以“斑马鱼”为检索词，2014年发表论文2814篇，2024年发表论文4949篇，数据检索于2025年9月29日）。尽管斑马鱼在生物医学、毒理学等众多研究领域备受青睐，但关于实验室斑马鱼的最佳饲养条件，目前人们的认知仍十分有限。过去，研究人员主要采用空缸饲养以提升卫生标准和饲养效率。如今，斑马鱼饲养条件的重要性，尤其是对其进行优化的必要性，正日益受到重视。原因一方面在于欧盟2010/63号指令明确了保障动物福利的伦理义务，要求尽可能为实验动物提供良好生存条件；另一方面则是人们逐渐认识到环境因素对实验数据质量和可重复性的重要影响。因此，研究人员应致力于深入了解斑马鱼的生存需求。作为推进这一进程的第一步，欧洲近期修订了相关法规，将允许的水质参数范围限定在特定区间，这也体现了对斑马鱼饲养需求的重视。

改善饲养条件的一种方法是提供适当的环境丰容，旨在通过结构、饮食、社交或认知措施提高动物所处环境的复杂程度。结构丰容被定义为对动物栖息地进行改造，或增加物理结构与物品，以促进动物的自然行为并提升其整体福利水平。相关研究表明，结构丰容可降低动物的皮质醇水平，这意味着其焦虑和压力有所减轻，同时还能改善记忆力、学习能力和存活率。相比之下，不同研究中结构丰容对动物攻击性的影响存在差异，既有研究观察到攻击性增强，也有研究发现攻击性降低。尽管这些研究结果令人鼓舞，但结构丰容的接受度仍不及视觉丰容、社交丰容或使用活体饲料等其他丰容形式，后几种丰容方式已愈发普及。一项针对斑马鱼养殖设施的国际调查对结构丰容这一议题展开了研究，结果显示，这些设施普遍担忧结构丰容会带来工作量大幅增加、额外成本投入、科研结果一致性难以保证以及病原体滋生风险上升等问题。因此，仅有少数斑马鱼养殖设施实施了结构丰容，或计划开展相关工作。遗憾的是，目前缺乏更新的相关数据，且在斑马鱼相关研究论文的方法学部分提及丰容措施的比例依然很低：在PubMed数据库中以“斑马鱼”为检索词（检索时间为2025年7月8日），筛选出的100篇最新研究论文中，仅有1篇提及了任何形式的优化或丰容措施（详见补充材料S1表）。显然，对许多斑马鱼养殖设施而言，其担忧的风险与成本仍超过了结构丰容可能带来的益处，此外，相关研究报告的缺失也阻碍了这一措施的推广。核心问题之一在于，结构丰容的潜在益处远不如改善水质或优化水质参数标准化那样具体明确，同时，单个研究的结果能否推广至标准化的饲养环境中，目前仍存在诸多不确定性。

在那些使用单养或成对饲养的鱼而非群养鱼、且将鱼从原饲养缸转移至新环境[10,11]的研究，以及在短短几天或几周内观察到环境丰富化短期效应的研究中，其结果可能无法代表实际养殖环境的情况。在系统综述中关于Gallas-Lopez等人关于结构富集效果的研究，纳入的27项研究中仅有3项的持续时间超过3个月，而21项的开展时间不足1个月[12]。因此，仍需进一步探究结构富集的积极效果是否能长期维持，或是需要持续的变化以避免习惯化现象。尽管如此，该系统综述得出结论，尽管存在诸多混杂因素，结构富集的整体积极效果依然存在[12]。

不同形式的结构丰容已被测试，取得了不同程度的成功。尽管在砾石底床、人工植物或类似的植被模拟装置上取得了令人满意的效果，但更多人工设施（如玻璃棒或气石的排布）不仅无益，甚至会产生反作用。此外，鱼缸内的这些结构不应限制鱼类的自由游动行为，阻碍日常健康检查时对鱼的观察，降低水质，或引发鱼类间的领地攻击性]。因此，结构丰容的实施方式必须确保其益处大于风险。应参考所饲养鱼类物种自然栖息地的观察结果，来指导鱼缸环境的布置方案。

总体而言，挑战依然存在：除了判断鱼类未患病之外，还需找到合适的指标来评估其福利状态。为此，研究人员已采用多种方法，包括探究鱼类的选择偏好、压力或焦虑水平、学习与记忆能力的提升、探索行为、攻击性或繁殖力等。对于标准养殖环境而言，这些方法需满足非侵入性的要求，且应在鱼类的原生饲养缸中开展，以避免给鱼类带来额外的压力或负担。如此一来，这些方法便可作为福利评估的一部分定期进行。例如，存活率和性别比例这类参数会在动物饲养设施中被持续记录，且可轻松用于评估环境丰容的效果。

总而言之，斑马鱼是一种群游性鱼类，偏好开阔水域，且在自然栖息地中演化出了适应多种植被形态的特性。它们的适应能力极强，能在广泛的环境条件下生存，这也使其成为主要的研究模式生物之一。有必要通过结构丰富化来优化斑马鱼的实验室饲养条件，这一精细化措施可提升动物福利并提高研究数据质量。但该措施的广泛应用仍存在不足，因为相关研究尚未充分证明其长期益处能够抵消其在标准化饲养适用性、病原体风险及成本方面的顾虑。为解决这些问题并填补知识空白，我们记录了在实验设施中引入人工植物的做法，并在所有已建立的与研究相关的读数指标中，将其效果与标准饲养条件进行对比。我们在一年的时间内，记录了斑马鱼在有或无结构丰富化的饲养环境下，饲养后的存活率、性别比例、交配成功率、水体中的病原体负荷以及鱼群在原生饲养缸中的行为表现。因此，本研究的目的是探究在本设施特有的长期饲养条件下，于原生饲养缸中开展实验时，结构丰富化是否会产生正面或负面影响，同时确保该措施不会给斑马鱼带来额外负担，且对设施而言仅需极低的额外成本或工作量。

方法

实验动物

使用的斑马鱼品系如下：elavl3:H2B-GCaMP6sjf5（水箱组1和2）、图宾根野生型（WT TU，水箱组3和4）、HuC:GCaMP5ga4598（水箱组5）、HuC:Gal4/UAS:RFP（水箱组6）、mitfaw2（水箱组7）以及斑点长鳍野生型（WT TL，水箱组8）。除WT TL外，所有品系均以图宾根野生型为遗传背景维持。此外，elavl3:H2B-GCaMP6s、HuC:GcaMP5g和HuC:Gal4/UAS:RFP品系处于mitfa-/-遗传背景中。在将这些品系与TU野生型或mitfa-/-品系进行回交之前，仅进行了不超过3代的同胞交配为避免近交衰退而保持异质性。TU 和 TL 野生型种群每 3 年从欧洲斑马鱼资源中心（EZRC）重新引入，以防止亚系的产生。

环境参数与健康状况

成年斑马鱼饲养于3.5升或8升的水箱中，水箱底部铺设砾石图案，未按性别分养，饲养密度约为5条/升，置于独立养殖架（Tecniplast，Active Blue）上，使用无铜循环水，每日换水10%至20%。自来水经无铜管道通过反渗透法净化后，加入海盐重新配制。水质参数维持为：温度28℃、pH值7.5、电导率800微西门子/厘米、含氧量(>7 mg/L)、二氧化碳含量1-6毫克/升、碳酸盐硬度2-5德国度、总硬度2-6德国度、(ammonia <0.05 mg / L)、(nitrite <0.02 mg / L)以及(nitrate <25 mg / L) 21]。所有水质参数中，温度、pH值、电导率为连续监测，含氧量、二氧化碳为每日监测，碳酸盐硬度、总硬度、氨、亚硝酸盐、硝酸盐至少每周监测一次。室温为24-25℃，水箱前方光照强度为500勒克斯，后方为10-20勒克斯。光照设置为：10小时黑暗，随后30分钟黄昏期，光照强度逐渐升至500勒克斯最大值并维持13小时，再经30分钟光照减弱后恢复黑暗。成年鱼每日投喂两次干饲料（Sparos 400-600），自由采食，每日投喂一次丰年虫（Sanders）。每日投喂时根据获批的护理表进行视觉健康检查。若鱼出现患病迹象或需用于常规健康监测，将按照获批的冷水休克方案对其实施安乐死。由荷兰QM Diagnostic公司开展的基于PCR的健康监测显示，环境拭子或鱼样本中检出分枝杆菌属（Mycobacteria spp.），但未检出嗜血分枝杆菌（Mycobacterium haemophilum）或海分枝杆菌（Mycobacterium marinum）。

结构富集

为确定结构富集最具潜力的形式与位置，开展了预实验。研究人员采购了多款经认证由无析出聚乙烯制成的不同形态和尺寸的仿真植物。其中四种仿真植物被选中，它们分别模拟印度或东南亚本土的水生植物物种[22]，且体积适中、无尖锐凸起，既能适配养殖缸的空间，又不会对鱼类造成受伤风险或阻碍其游动（Dohse 水族用品公司，水蓑衣#51559、苦草#41507、节节草#41514、巴戈草#51555）。  由于固定植物的连接胶在清洁过程中无法长期耐受热水，且可能含有可析出的化学物质，研究人员手动去除了植物的基部。随后，将总重量约5克、长度5至10厘米的塑料仿真植物随机混合，通过橡胶吸盘固定在养殖缸左侧内壁。摆放时确保植物直立于水体中，既不阻碍缸内水流，也不会让食物残渣在植物周围堆积（图1）。总体而言，养殖缸仍便于清洁和捞鱼。3.5升的养殖缸内固定一束仿真植物，8升的养殖缸内则固定两束相邻摆放（图1C-1F）。  每1至2个月，当养殖缸需要彻底清洁并去除生物膜时，鱼类会被转移至新缸，并更换一束尺寸相近但成分略有差异的仿真植物，以避免鱼类产生适应性。

图1. 以正视图呈现，并通过数字标注划分为左、中、右三个区域；(E) 为俯视图，(F) 为侧视图。图中展示了一个3.5升的容器，其橡胶杯的连接结构以单独放大图呈现。(D) 展示了8升容器左侧壁上植物的摆放位置，水罗兰（3）被捆扎在一起（B），并使用半透明橡胶吸盘（红色箭头）固定在容器左侧壁上。(C) 展示了植物的位置。图1 作为结构丰富物的人工植物。

饲养

所用的所有鱼系均在我们的隔离系统中培育，鱼卵需先进行漂白处理，再转移至主饲养系统培育。简言之，基于斑马鱼国际资源中心（ZIRC）“胚胎表面卫生处理”的实验方案，对受精后24小时（hpf）的胚胎进行漂白处理：将胚胎置于60ppm的次氯酸钠溶液中浸泡两次，每次5分钟；洗涤步骤使用E3培养基替代E2培养基。1倍浓度的E3培养基包含5.14毫摩尔氯化钠、0.18毫摩尔氯化钾、0.34毫米氯化钙24c1b54-d09e-4961-b503-2af7597b8697以及0.41毫摩尔(MgCl_{2})，该培养基以60倍母液形式配制，pH值调至7.2。胚胎和幼体置于培养箱中培育，培养箱温度设置为28.5摄氏度，光照周期为14小时光照/10小时黑暗；将胚胎放置于培养皿中，每10厘米的培养皿中加入20毫升E3培养基，最多可容纳50枚鱼卵。通过体视显微镜（奥林巴斯SZX16/SZX2-ILLT）观察幼体，其形态无异常，且行为。它们在受精后5天（dpf）被转移到主系统，并随机分配到准备好的养殖缸中。要么25尾幼鱼饲养在3.5升的缸中，要么30-37尾幼鱼饲养在8升的缸中，具体数量取决于该品系在养殖设施中的整体繁育需求以及交配成功率。所有可用的幼鱼均被平均分配到两种养殖环境的缸中：非富集型养殖环境（无结构丰富物）和富集型养殖环境（含人工水草）。所有缸的底部均铺设了砾石底图。幼鱼最初仅投喂干饲料（Sparos 100-200），随后根据鱼体大小的增长，添加或替换更大粒径的饲料（Sparos 200-400、400-600）。从受精后10天开始投喂卤虫幼体，养殖过程中逐渐增加投喂量。所有品系在一年内均饲养在同一组养殖架上。研究人员对它们的存活率、性别比例以及前两次交配结果进行了评估。同一品系、有无结构丰富物的养殖缸在养殖架的同一层相邻摆放。当鱼龄达到3-6个月、首次用于交配时，统计其存活率和性别比例。各养殖缸的详细日期和数量见补充材料（表S2）。

交配

研究使用了3至6个月大的鱼，探究饲养阶段家鱼缸中的结构富集对前两次交配的影响。为进行交配，于下午4至5点准备4个1升的交配缸，每个缸随机放入2条雌性和1条雄性鱼，按性别分隔。随后将交配缸置于铺有砾石的布景上过夜。次日上午8点30分至9点，更换鱼缸中的水并移除分隔板。将鱼缸倾斜放置在砾石布景上，以形成浅水区并使用深水模拟岸边环境并提供触觉刺激。允许交配持续一小时。交配结束后，将鱼放回原饲养缸。鱼卵用滤网收集，随后转移至培养皿中进行计数。

为探究仅添加到交配水箱中的结构富集环境的影响，本研究选用4至9个月大的图宾根野生型斑马鱼（水箱组3和4）。在25次实验中，按上述方法设置三个水箱进行交配，但在水箱之间用层压纸板隔开，以防止相邻水箱中的鱼发生视觉互动（图2）。这三个水箱中，一个放置在等色的米色沙色托盘上，第二个放置在砾石图案托盘上，第三个同样放置在砾石图案托盘上，并额外添加一小段可游动的植物部件作为富集环境。交配1小时后，将鱼放回原饲养水箱，统计鱼卵数量以确定每窝卵的数量。

图2. 交配过程中的结构富集。(A) 利用被硬纸板分隔的交配水箱的三种不同条件评估了对交配成功率和产卵数量的影响：无富集的水箱、仅放置砾石图案的水箱以及同时放置砾石图案和小型植物的水箱（从左至右）。(B) 展示的是交配过程中用于结构富集的砾石图案，该图案以A4纸打印并进行了覆膜处理。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0348591.g002

鱼与植物的相互作用观察

为探究结构丰富化对鱼类行为的影响，本研究调查了鱼类在有无人工植物的鱼缸中的位置偏好。通过初步预实验，估计效应量为10%；在检验效能90%、显著性水平α=0.05的前提下，计算得出需采集34张样本图像。每种非丰富化或丰富化条件下均设置4个鱼缸（鱼缸编号1-4，每8升鱼缸饲养26-31条8-13月龄的鱼），因此每个鱼缸需拍摄9张独立照片用于最终评估。拍摄过程中，所有鱼均游动平稳从容，未出现明显的应激或异常表现。

此外，研究区分了两种情况：一是饲养室持续有人活动，二是鱼处于未受干扰的状态。平均而言，这两种情况在实验设施13小时的光照时间内各占约50%，其中上午至午后早些时候活动较为频繁，下午晚些时候至晚间则为鱼的未受干扰阶段。第一种情况为实验设施内有人持续活动，研究人员在9个不同日期的下午4点，从1.5米的距离对每个养殖池各拍摄一张照片。第二种情况为观察未受干扰的鱼的行为，研究人员在某一天的下午4点，在与之前相同的位置架设相机，从下午5点到晚上9点30分，以每分钟一帧的频率自动拍摄图像。下午，且在最后一人离开设施后一小时开始。然后为每个储罐提取了9张静止图像，每张图像之间间隔30分钟。

总微生物计数

本实验室定期对集水坑的水样进行总微生物计数，以检测卫生状况。在三个月的周期内，分别从1号和2号两组8升储水箱的左后角额外各采集三次样本，分别对应未富集和富集条件，以此排查结构富集是否会增加病原体风险。样本用无菌去离子水按1:10和1:100的比例稀释，使菌落数落在可计数范围。以无菌水作为对照，将每份稀释样本和对照的0.1毫升样品涂布于20毫升无菌平板计数琼脂（PCA）培养基平板（20.5克/升DM 195，Mast Group #121950），室温下静置15分钟直至液体被平板吸收。随后将平板倒置，在28℃条件下培养72±3小时，对菌落进行计数并计算每毫升的菌落形成单位（CFU）数量。若水对照的菌落数超过25 CFU/毫升，实验结果将被弃用并重新开展。结合鱼类健康与福利的标准，菌落数低于10000 CFU/毫升被判定为安全，低于100000 CFU/毫升则为可接受范围。

统计与数据分析

基于预实验数据进行了效能分析，以估算所需的样本量，所用工具为 NC3R 在线工具（https://eda.nc3rs.org.uk/experimental-design-group），该工具基于 R 3.5.2 软件及 power.t.test 包开发。所有实验均设定公认的α错误率为0.05、检验效能为0.90。由于结构富集的特征显而易见，无法实施盲法操作。

使用GraphPad Prism 10.1.2软件进行统计学分析。通过Shapiro-Wilk正态性检验验证数据是否符合高斯分布，并在QQ图中进行可视化确认。采用ROUT法（最大期望错误发现率为1%）对数据集进行检验，未发现异常值。生存率、性别比例和交配成功率的统计学显著性通过配对t检验计算。卵数的显著差异，对于富集饲养后的相同交配条件采用非配对t检验，或通过单因素方差分析检验交配过程中不同富集条件的影响。左右水箱侧的位置偏好差异通过非配对t检验确定。左、中、右区域位置偏好的统计学显著性通过双因素方差分析，随后进行多重非配对t检验或Tukey多重比较检验计算。

结果

在一年的时间里，8对鱼缸中的斑马鱼在同一饲养系统中饲养，每对鱼缸包含一个未富集鱼缸和一个放置人工植物的富集鱼缸。共饲养470条幼鱼，最终得到360条成鱼。包含鱼只数量及遗传背景的详细结果表见补充材料（补充表S2）。

从历史数据来看，在引入结构性丰容措施之前的两年里，本实验室斑马鱼饲养至90日龄后的存活率平均为73%。本研究中，再次在无丰容鱼缸中饲养的斑马鱼平均存活率为74%，与这一历史数据高度吻合（图3A、3B）。放置人造植物的丰容鱼缸虽使斑马鱼平均存活率提升至77%，但这一差异未达到统计学显著水平。结合目前已知的11%的标准差，要以90%的置信度判定该差异具有统计学意义，效应量需达到20%。

养殖密度是影响斑马鱼养殖期间性别决定的已知因素[，而结构丰富化可能会减少可用的游泳空间，从而降低斑马鱼感知到的养殖密度。在首次两次交配设置中，约在受精后90天或更晚时间点测定性别比例。对于8号养殖缸对（Tüpfel-Longfin野生型），仅在丰富化条件下发育出雌性。这可能是由于其存活率较低，导致养殖密度偏低，而已知低养殖密度有利于雌性性别决定[25]。总体而言，在非丰富化和丰富化条件下养殖的每个养殖缸中，雌性比例分别平均为60%和66%，未发现显著差异（图3C、3D）。

图3 结构富集对养殖期间存活率和性别比例的影响。(A) 在约90天胚胎期（dpf）对8对设置或未设置结构富集的水箱养殖后的存活率进行评估。(B) 非富营养化水箱的平均存活率为74%（蓝色虚线），富营养化水箱为77%（红色虚线）。对配对水箱（富营养化组减非富营养化组）进行成对比较，存活率差异为-16%至+20%，平均差异为4%（虚线），但该差异无统计学意义。(C) 在前两次交配时测定每个水箱的雌性比例。(D) 非富营养化养殖和富营养化养殖的平均雌性性别比例分别为60%和66%（虚线）。成对比较

有研究表明，结构丰富化的一个好处是能减轻斑马鱼的压力和焦虑情绪。我们推测，这可能会提高成功交配的次数和产卵量，尤其是在前两次交配时——此时斑马鱼尚未适应对其的操作以及交配缸的新环境，这一因素可能会增强它们的应激反应。因此，在需要进行交配时，我们将在非丰富化或丰富化环境中饲养的成对家缸斑马鱼进行平行分组。平均而言，在首次和第二次交配中，丰富化环境饲养的斑马鱼表现并未更优：成功交配的鱼缸占比分别为61±24%和82±19%，而非丰富化环境饲养的斑马鱼对应占比为64±20%和75±20%（图4A、4C）。同样，在这两次交配中，斑马鱼的产卵数量也未出现显著差异：丰富化环境饲养的斑马鱼平均产卵量为68±55枚和122±58枚，而非丰富化环境饲养的斑马鱼平均产卵量为72±43枚和127±56枚（图4B、4D）。

图4 结构富集对交配成功率和产卵量的影响。评估了鱼类成年后进行的前两次交配，评估依据是饲养期间配对的非富集组（蓝色）与富集组（红色）水箱之间的差异。由于仅在富集水箱8中发现雌性鱼，因此没有交配成功率和产卵数量的相关结果（无数据）。无论是第一次交配（A、B）还是第二次交配（C、D），交配成功率（A、C）或每次交配的平均产卵量（B、D）均未出现显著差异。平均值的标准差由误差棒表示，(n=7-8)

接下来，我们评估了富养环境水箱中的斑马鱼与非富养条件下相比，其位置偏好行为是否存在差异。为此，我们区分了两种情况：在我们的实验设施中，约一半的白天时段会持续开展人类活动，包括标准的饲养操作、鱼类繁殖以及实验准备工作。总体而言，鱼类不会因设施内的日常工作表现出任何应激反应，但出于好奇或对投喂的期待，它们往往会更靠近水箱前部。在对水箱1至4的共72组图像进行鱼类位置偏好分析后发现，非富养水箱中，斑马鱼对左右两侧的占据比例均等（49:51）；但当左侧放置人工植物时，它们会避开左侧区域，比例为36:64（图5A-5C）。进一步观察发现，非富养水箱中的斑马鱼更偏爱中间区域的开阔水域，而非缸壁，三者比例为24:48:28；而在富养水箱中，它们则更靠近右侧缸壁，而非植物旁区域，比例为14:45:41（图5D）。在未受干扰的斑马鱼身上也观察到了类似结果，尽管趋势稍弱但仍具有显著性：富养水箱中斑马鱼的左右比例为44:56，左中右比例为20:47:33（图5E、5F）。

并非所有已知存在于水箱中的鱼都能在一张照片中被计数，但检测到的鱼的数量不受人工植物存在的影响。直接观察时，未富集和富集水箱的检测率均为83±9%（图5C、5D）；在未富集或富集条件下，未受干扰和视频记录的鱼的检测率分别为74±12%和75±9%（图5E、5F）。

图5 结构丰富化对场所偏好的影响。研究了1-4号鱼缸对的场所偏好情况。(A) 展示了四个丰富化饲养缸中的一个的代表性图像，用于确定鱼的位置。(B) 将鱼的位置（红色圆圈）与数字模板叠加，把鱼缸均分为左右两部分（黑色虚线）或左、中、右三部分（红色虚线）。蓝色虚线表示水位，随后统计各区域的鱼的数量。(C) 有人在场时，非丰富化鱼缸中的鱼在左右两侧的分布比例为49:51，而在丰富化条件下，鱼更偏好开阔区域而非植物区域，比例为36:64。(D) 分为三个区域时，非丰富化鱼缸中的鱼更偏爱中间的开阔水域，而非左右两侧的有壁区域，比例为24:48:28；在丰富化鱼缸中，鱼则避开左侧的植物区域，更靠近右侧壁停留，比例为14:45:41。(E) 无人干扰时，非丰富化鱼缸中的鱼在左右两侧的分布比例为50:50，而存在植物时，鱼再次更偏好开阔区域而非植物区域，比例为44:56。(F) 分为三个区域时，非丰富化鱼缸中未受干扰的鱼更偏爱中间的开阔水域，而非左右两侧的有壁区域((27:43:30))；在丰富化鱼缸中，鱼也会避开左侧的植物区域，比例为20:47:33。误差线表示标准差，(n=36)，ns=无显著差异，(p<0.05) 关芳 (p<0.001)。

来自5号、6号、7号和8号鱼缸的鱼存活率不同，导致各自的饲养密度分别为3.5、4.1、5.5和2.5尾/升。通过直接观察对富集鱼缸中的位置偏好进行分析，结果显示，与饲养密度较高的鱼相比，鱼数量较少、饲养密度较低的鱼缸中，鱼对放置有人工植物的左侧区域的相对回避行为更为明显（图6A）。在2.5或3.5尾/升的密度下，仅有14%和7%的鱼停留在植物区域，而在4.1或5.5尾/升的密度下，这一比例分别为28%和23%。与之前的观察结果相反，饲养密度较低的鱼群中，超过50%的鱼更倾向于紧贴右侧壁，而在饲养密度较高的情况下，这一比例仅为30%至35%。当这些鱼处于不受干扰的状态并被录像记录时，也观察到了同样的现象，不过这一比例再次为程度较小（图6B）。在这种情况下，只有放养密度最低（2.5尾/升）的鱼表现出与其他鱼不同的行为，它们中有43%停留在右壁附近，这一比例显著高于其他水箱中31%至34%的鱼。

图6 养殖密度对位置偏好的影响。对养殖密度（鱼/升）不同的富集型养殖箱5、6、7、8进行9次位置偏好观察。(A) 有人类存在时，养殖密度较低（2.5或3.5鱼/升）的鱼对左侧富集箱区域的回避行为增加，对右侧壁区域的偏好更强。(B) 与养殖密度较高的水箱相比，养殖密度最低（2.5鱼/升）且未受干扰的鱼仍更偏好右侧壁区域。误差线表示标准差，样本量n=9，(n=9)、(* p<0.05)、(** p<0.01)、(**** p<0.001)

结构富集的另一个问题是病原体风险增加。连续使用两个月后，我们未在人工植物上观察到生物膜生长，反而在面积相对较小的吸盘上发现了生物膜。为评估细菌总载量整体升高的风险，我们通过总微生物计数对1号和2号储水罐组的水样在三个不同周次进行了分析（图7A）。1号储水罐组在未富集和富集条件下，每毫升菌落形成单位（CFU）的平均值分别为4633和5673；2号储水罐组则分别为2387和14620（图7B）。重复测量单因素方差分析未发现显著差异((p=0.446))。总体而言，这些数值与我们整个储水系统的数值处于同一范围，从集水坑采集的样本在最后三次测量中的平均值为8843 CFU/毫升。

图7结构富集对病原体风险的影响。 (A) 从养殖池后方左下角采集水样，无论添加（+）或不添加（-）富集结构，养殖池中的菌落形成单位/毫升（CFU/mL）均无显著差异。(B)将对1号和2号菌株进行三次检测，并接种于PCA培养基上以测定总微生物数量。以无菌水作为对照。水对照组（ctrl）的第三次计数为0，无法在对数坐标上显示。水平条代表平均值，(n=3)

最后，我们希望研究交配过程中结构性丰富环境的影响，将其作为另一种常规进行的饲养操作。本实验仅使用了3号和4号养殖缸配对的斑马鱼（图宾根野生型）。与前一项实验（图4）不同，此次所有鱼均来自同一个原养殖缸，无论是否设置丰富环境，随后被随机分配到三个不同的养殖缸中，这些养殖缸分别配备了单色底砂（无丰富环境）、砾石图案或砾石图案。外加植物（图2）。砾石图片的可打印版本已作为补充材料提供（补充图2）。在非富集条件下，分别以等色米色沙土为底、在交配箱下放置砾石图片进行富集，或在箱内除砾石图片外再放置人工植物，每次交配平均产卵量分别为149枚、124枚或135枚。（图8）。通过对这些条件中任意一个进行重复测量单因素方差分析计算，未发现显著差异 ((p=0.564))。

图8. 交配过程中结构富集的影响。将野生型图宾根鱼反复与不同富集环境进行交配配对，并统计所产鱼卵的数量。平均而言，仅在鱼缸下方放置砾石图片，或在交配鱼缸中同时放置砾石图片和人工植物，均未使交配产生的鱼卵数量发生显著变化。圆点代表单个实验结果；水平条代表平均值。误差棒表示标准差，每组进行(n=25)次交配

讨论

除了伦理和法律义务外，科学界已达成共识：实验动物的饲养条件需要不断改进，以确保获得最佳的数据质量。此外，在不同环境条件下利用鱼类开展研究所产生的研究数据，其可重复性也受到标准化程度不足这一问题的影响]。有观点认为，结构性丰容实际上能提高数据的可靠性，因为即便使用标准化程度较低的设施，鱼类的适应能力也更强。就斑马鱼而言，饲养系统中设置人工植物是否能改善动物福利，目前仍存在持续的讨论。根据利德斯特等人（Lidster et al.）的最新调查以及我们审阅的100篇最新斑马鱼相关论文，目前仅有少数饲养设施采用了结构性丰容，至少它们未公开相关使用情况。相关顾虑包括效益不明确、成本问题、病原体感染风险、化学物质溶出以及鱼类攻击性增强等。要让结构性丰容在饲养设施中被广泛接受并实施，其优势必须明显超过劣势。然而，鱼类福利的改善情况难以直接衡量。此外，饲养工作更关注长期影响，但目前仅有少数研究针对这一方向展开。尽管如此，首项关于斑马鱼结构性丰容效果的系统综述发现，尽管存在诸多混杂因素，但总体而言，其积极效果依然显著。

因此，我们决定在斑马鱼养殖设施中引入人工植物作为一种新型的结构丰容方式，并在一年时间里对比标准养殖模式监测其效果。我们选用的是经认证的无浸出聚乙烯材质植物，单缸成本仅3至5欧元，整排养殖架的总成本根据植物搭配不同也低于100欧元。经过一年多的持续使用，且经历了多次80摄氏度的洗碗机清洗后，该材质未出现任何劣化迹象，我们预计这些植物可使用数年。我们能将植物放置在鱼缸中，既不阻碍水流，也不影响日常的鱼类检查，这一点从位置偏好分析期间从鱼缸拍摄的图片和视频中鱼类的检出率相近得到了验证。我们未发现植物表面生物膜生长增多，也未检测到丰容鱼缸水中总微生物数量的增加，这表明我们养殖系统的紫外线消毒足以将微生物负荷维持在较低水平]。在观察期内，没有鱼类因出现患病迹象而被移出鱼缸。因此，目前仍不清楚丰容是改善了鱼类健康，还是干扰了患病鱼类的识别。总体而言，我们得出结论：所选的丰容方式成本低廉、易于实施，且不会对系统水质或鱼类健康产生不利影响。

我们尚未系统探究领地行为或攻击性对鱼类的影响。我们偶尔观察到，单条鱼会停留在植物附近，并将其他游来的鱼赶走，这表明这些个体对该位置有较高的偏好。这种行为从未持续到次日，且在此期间似乎并未影响到其余鱼群的行为，它们仍在开阔水域平静地游动。关于结构丰富化如何影响攻击行为，目前已有相互矛盾的报道，未来还需进一步探究饲养密度、丰富化的具体形式等因素的何种组合会诱发或抑制攻击行为。

根据我们的经验，实施结构性丰容的主要弊端是会给动物饲养员带来少量但无法避免的额外工作量，我们估算一个装有50个丰容水箱的完整饲养架每月需要一人小时的工作量。这包括准备或更换合适的结构性丰容材料、在水箱中对其进行维护（比如重新固定松动的结构或在清洁时重新布置水箱内的结构），以及使用后对植物进行清洁。

为确定结构丰容的益处，我们主要采用了对本设施工作而言最重要的观测指标，而这些指标本就已确立并持续进行评估。将我们新培育的品系在有无丰容条件下的存活率、性别比例、交配成功率和产卵数量进行对比后，未发现具有统计学显著性的影响。在最后一个观测案例中（丰容的8号养殖池，斑鳍鲷野生型），存活率尤其低。这很可能是由于该批鱼卵质量不佳，因为亲本品系已老化，且在获得少量鱼卵前已多次交配失败。这些鱼卵未达到标准质量，但为维持品系仍需对其进行培育。该案例或许无法与其他品系相提并论，但我们并未将其数据剔除，因为它反映了养殖设施中常见的问题。遗憾的是，这导致标准差远高于最初预期，因此我们未能收集到足够样本以达到统计学显著性。这与Lee等人2019年报道的存活率显著提升29%形成对比，而该结果之所以可能实现，很可能是因为其研究仅调查了单批鱼卵。需要考虑的是，在他们的研究中，非丰容条件下的存活率仅为54%，而采用丰容后存活率升至83%，这一水平与我们实验室在非丰容条件下观测到的结果相近[8]。总体而言，我们已建立了极高的卫生标准，持续监测水质并保持优良状态，且所有养殖池都铺设了砾石作为丰容设施，因此可以推测，添加人工植物未必能带来与Lee等人2019年研究中那样显著的改善效果。不过，若能在更大的数据集下得到验证，我们仍认为养殖池丰容条件下鱼类存活率平均提升4%这一结果具有生物学意义。

另一项研究表明，在有结构丰富环境中饲养6个月的斑马鱼群焦虑程度更低。关于繁殖力，我们假设添加人工植物可能有助于减少焦虑和压力，从而提高交配成功率和产卵量，但无论是在饲养缸中添加植物还是在交配缸中添加，我们都未观察到任何效果感谢。这与伍德沃德等人的研究结果基本一致，他们在大多数实验条件下也未观察到差异。相比之下，韦弗等人报告称，由于环境结构丰富化，鱼类的产卵量大幅增加。其中一个原因可能是初始应激水平存在差异。如果在非丰富化条件下应激水平本就较低，那么进一步降低的幅度可能就不显著了。森·萨尔马等人在研究放养密度对鱼类应激水平的影响时发现，即便在1尾/升的极低密度下，皮质醇水平也处于高位；而当密度提升至3尾/升或6尾/升时，皮质醇水平显著下降，这一密度更贴合我们养殖中的实际情况。根据我们的经验，年轻且健康的鱼（受精后3至12个月，mpf）即便在无任何环境装饰的饲养缸中也能轻松且成功交配。但对于年龄较大的鱼，或近亲繁殖程度较高、否则繁殖力较低的品系，在交配缸中铺设砾石布景，或设置浅水区与深水区，能够提高交配成功的概率。因此，未来研究人工水草的添加是否能改善老龄鱼的健康状况和繁殖能力，将具有重要意义（((> 15 mpf))）。

到目前为止，支持结构富集的最有力证据来自场所偏好实验，该实验表明斑马鱼更愿意占据结构更复杂的区域，而非空荡的养殖箱。与此同时，这种高度群居的鱼类表现出强烈的群游行为，而这种行为只能在开阔水域中进行。通过在大型竞技场中观察野生斑马鱼，有研究表明，对更多植被的偏好甚至可能超过对更大群体的渴望。此外，与野生斑马鱼相比，实验室养殖的斑马鱼经驯化后，对富集环境的整体偏好并未改变，但相关的详细对比研究较少，值得进一步探究。鉴于目前商业养殖箱的容量可达10升，要同时为斑马鱼提供与其天然栖息地（广阔的池塘和河流）中那样的大群聚环境和丰富的栖息环境，仍是一项挑战。

因此，我们希望研究结构丰富化对养殖池内鱼类位置偏好的长期影响。此外，动物饲养设施通常是人员往来频繁的场所，我们还探究了人类活动对这种偏好的影响。研究发现，在未进行结构丰富化的条件下，鱼类对养殖池的左右两侧并无偏好，反而更倾向于池中央的开阔水域，而非两侧有墙体的区域。当在养殖池左侧放置人工叶片后，鱼类出现在该区域的概率显著降低，转而更多地游向中央区域或此前较少停留的右侧墙体。无论是否有人类在场，这一效应均会出现，但在有人类在场的情况下表现得更为明显。此时，即便是远处被感知到的人类活动，也会因好奇心或觅食预期，将鱼类吸引至更靠近池前的位置。这种效应的强弱还与养殖密度相关，鱼类数量越多，靠近植物的频率也越高。我们得出结论，只有当鱼类不愿进一步提升鱼群的凝聚力，且需要与周边其他鱼类保持平均距离时，它们才会进入结构丰富化的区域。在无外界干扰的情况下，有结构丰富化时鱼类的分布与未丰富化时更为接近。一种可能的解释是，无干扰状态下鱼类的平均游动速度较慢，因此能更靠近人工植物，或是更多占据养殖池的后部区域，这使得位置偏好的变化不再显著。而与未丰富化条件的剩余差异，或许仅源于植物占据的物理空间，并非鱼类行为受到诱导而发生改变。这一点需要在未来开展更深入的研究。不过，与最初的研究假设相反，人工植物显然无法将更多鱼类吸引至其周边区域，往好里说，鱼类对植物的存在无动于衷；往坏里说，鱼类会因自由游动空间受限，被迫前往通常不会停留的区域。

本研究方法的一个局限性在于，为避免对饲养环境造成重大改变，水箱之间未进行视觉隔离。因此，富集环境水箱中的植物仅被部分遮挡，非富集环境水箱中的鱼类很可能能够看到它们。满足动物的需求并非始终需要互动行为。以斑马鱼为例，已有研究表明，砾石图片的吸引力几乎与砾石本身相当，而仅同胞鱼的图像就能吸引斑马鱼[37]。由此推测，植物的作用可能并非结构丰富化，而是视觉丰富化，这或许限制了配对水箱中前两次交配的交配成功率与产卵数量的效应量。进一步研究水箱外额外放置图片是否能提升斑马鱼的福利状况具有重要意义，因为这将能规避在水箱内放置物品所引发的诸多问题。

总体而言，还需要进一步研究，明确在养殖行业典型的养殖密度和数量下，何种结构和形式的环境丰容能够提升鱼类的福利水平。这类丰容还应降低鱼群中等级制度形成的可能性，或至少为弱势或具有攻击性的鱼类提供足够的躲避场所。此外，环境丰容带来的可衡量健康益处——例如幼鱼存活率的提升或成鱼繁殖能力的改善——必须超过视觉检查时漏检病鱼所带来的风险。基于我们对鱼群栖息场所偏好的研究结果，鱼类似乎更偏爱开阔水域，而非靠近鱼缸壁的区域。这就引出了一个问题：更大的鱼缸是否总是更优？或者说，结合所养殖鱼类的数量，何种鱼缸的容积和尺寸能实现最佳的动物福利？最后，即便鱼类仅偶尔与结构性环境丰容产生互动，其认知能力可能得到提升这一潜力也应展开更深入的研究，因为已有证据表明，在丰容环境下饲养实验室或野生捕获的斑马鱼，可提升其学习能力。

总而言之，我们认为在以往的研究中，由于缺乏标准化以及饲养流程和体系存在重大差异，导致了不同的实验结果，或是结构丰容的效果呈现出不同程度的变化。我们发现，在本实验设施中引入结构丰容的成本较低，且未对鱼类产生不利影响，但也未显现出显著的益处。在此基础上，还需要更大样本量的额外数据来确定这些更细微的影响，而这是我们小型实验设施目前无法实现的。因此，我们也鼓励其他实验设施测试新的适用的丰容形式，并针对其特定环境报告研究结果，以推动关于良好饲养实践的公开探讨。最重要的是，未来需要通过长期观察，更详细地研究鱼类的攻击行为或位置偏好等行为。正如以往针对老年动物的研究所示，更结构化的环境对于鱼类在高龄阶段维持健康和认知功能可能尤为重要。