题目：A transparent PVA-based polymer sunscreen protects retinal tissue from ultraviolet damage

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-026-73448-8

期刊：Nature Communications

摘要

紫外线（UV）会引发多种眼部疾病。佩戴太阳镜可阻挡50%的紫外线进入眼睛。由于存在刺激性和安全性问题，皮肤防晒霜被禁止用于眼部。目前几乎没有防晒霜既能用于眼部阻挡紫外线，又不会损害眼部功能。本文通过汉茨施反应，利用天然提取的醛类物质对商用人工泪液中的活性成分聚乙烯醇（PVA）进行改性，制得聚乙烯醇-丁香醛衍生物。该衍生物在水中质量分数为1%时，具有高防晒系数（SPF 80）、优异的抗紫外线性能((>99%))和高透明度（84%）；应用于雌性小鼠眼部时，半衰期长，急性刺激性极低，且长期安全性良好。经该聚合物保护的斑马鱼在紫外线照射后，眼部组织健康，视觉引导行为正常。对小鼠眼部进行聚合物处理可有效保护视网膜免受紫外线诱导损伤，这表明该聚合物有望作为眼部防晒霜使用。

引言

除了皮肤，眼睛是最容易受到阳光照射损伤的器官。约95%的人都知道紫外线（280–400纳米）会造成损伤会对皮肤造成伤害，而仅有7%的人知道紫外线会引发眼部疾病¹。累积的紫外线暴露已被认定为多种眼部疾病的诱因，包括翼状胬肉、皮质性白内障和光性角膜炎（图1a，左）。当阳光中的紫外线到达人眼时，超过95%的紫外线能量会被角膜、虹膜和晶状体吸收。在成年人中，仅有1%–2%的紫外线能到达视网膜；而在儿童（8–10岁）群体中，由于瞳孔更大、晶状体更清澈，这一比例升至2%–5%（图1a，右）²。儿童因紫外线暴露引发的视网膜应激反应可能导致黄斑变性和视力丧失，其严重程度远高于成年人。因此，儿童暴露于紫外线时出现眼部问题的概率比成年人更高。

图1：紫外线对眼睛的损伤与眼部紫外线防护。a，紫外线诱发的眼部疾病以及紫外线到达儿童（8-10岁）和成年人的视网膜 (( ≥25 years old)) b、当前的紫外线防护技术——佩戴太阳镜和使用传统的紫外线阻隔剂。c、一种用于保护眼睛免受紫外线损伤的聚乙烯醇（PVA）基防晒霜示意图。

眼睛是视觉器官，只有在直接接受光线时才能发挥功能，因此传统的紫外线防护方法无法有效保护眼睛免受紫外线照射。例如，佩戴太阳镜是防护眼睛免受紫外线辐射最常见的方式，但这会牺牲视觉清晰度。然而，与额头相距6毫米的太阳镜只能阻挡约45%的环境紫外线[(UV^{17})]。周边的、反射的和散射的紫外线仍会到达眼睛，甚至镜片的背反射紫外线也会增加眼睛的紫外线负担（图1b，(i)）。近期研发的含小分子紫外线吸收剂的防紫外线隐形眼镜可贴合眼球表面，有效阻止紫外线的背反射。但这类小分子紫外线吸收剂在使用过程中可能发生泄漏。为保证透明度，这类吸收剂的用量必须受限，这会导致紫外线防护效果不足。此外，干眼症患者佩戴隐形眼镜可能会感到不适。这些缺陷限制了防紫外线隐形眼镜的适用范围。  除此之外，有机紫外线阻断剂（如氧苯酮和阿伏苯宗）和无机纳米颗粒（如氧化锌和[(TiO_{2})]）已被广泛用于皮肤的紫外线防护。但用于眼部的紫外线吸收剂需具备安全性、透明性和水溶性。纳米颗粒会遮挡视线，而为提高有机紫外线阻断剂水溶性所添加的助剂（如乙醇、甘油）可能刺激甚至损伤眼睛。这些问题限制了传统紫外线阻断剂在眼部的适用性（图1b，(ii)）。  因此，眼部紫外线防护是一个被忽视的重要且棘手的问题。故而，研发一种能让各年龄段人群阻挡来自各个方向的紫外线、同时不损害眼睛视觉功能的策略，是一项迫切且具有挑战性的需求。

本研究中，我们通过汉茨希反应将天然丁香醛（SA）提取物引入聚乙烯醇（PVA）中，开发了一款专为眼部设计的抗紫外线聚合物防晒霜（图1c）。

我们采用聚乙烯醇（PVA）、硬脂醇（SA）以及汉茨希反应来研发眼部防晒霜，原因如下：1）聚乙烯醇（PVA）已作为活性成分应用于市售人工泪液28中。它水溶性好、生物相容性佳且易于改性29-31，是开发抗紫外线产品的理想载体用于眼部的聚合物。2）汉茨希反应可高效生成1,4-二氢吡啶（1,4-DHP），该物质具有抗紫外线特性，通过在1,4-DHP的C(4)位引入不同取代基，可调节其紫外吸收范围。3）水杨酸是一种具有抗氧化和抗炎作用的醛类物质，可从天然产物中提取，能够缓解紫外线诱导的生物损伤[34,35]。水杨酸分子中的芳香结构使其成为潜在的紫外线吸收剂]。水杨酸作为汉茨希反应的反应组分，具有优异的反应活性。本研究通过汉茨希反应将三种天然产物衍生的醛类物质引入聚乙烯醇（PVA）中，并筛选出含水杨酸的聚乙烯醇衍生物（PVA-SA），该物质在三种聚乙烯醇衍生物中展现出最佳的紫外线阻隔和抗氧化性能。

PVA-SA 在工作浓度（水中质量分数1%）下呈透明状；即便在低浓度（水中质量分数0.5%）下，其也拥有约80的高防晒系数（SPF），能遮蔽全部中波紫外线（UVB，280–320纳米）和长波紫外线（UVA，320–400纳米）。在细胞实验中，PVA-SA 表现出低急性细胞毒性与长期细胞毒性，可有效保护角膜上皮细胞系和原代人皮肤成纤维细胞，抵御紫外线诱导的DNA/RNA损伤、炎症、血管生成及细胞衰老。在斑马鱼实验中，紫外线会损伤斑马鱼眼睛，导致其视力下降、行为异常，而PVA-SA能有效保护眼睛免受紫外线损伤，受保护的斑马鱼与健康斑马鱼在行为和眼部组织学方面几乎无差异。在小鼠实验中，PVA-SA在短期和长期使用中均几乎无急性眼部刺激或肝肾毒性，还能有效保护小鼠视网膜免受紫外线损伤。这些结果表明，经合理设计的PVA衍生物是一种安全高效的眼部紫外线防护防晒霜，具备实际应用潜力。

结果

PVA衍生物的制备与表征

我们通过一锅法 Hantzsch 反应将几种天然产物衍生的醛（苯甲醛（BA）、4-羟基苯甲醛（HBA）和 SA）引入到 PVA 结构中，分别得到了三种水溶性 PVA 衍生物（PVA-BA、PVA-HBA 和 PVA-SA）（图 2a）。1,4-二氢吡啶（1,4-DHP）结构中 –NH– 基团的特征峰（8.7–8.9 ppm）以及苯基基团的特征峰（6.3–7.1在核磁共振（(^{1} H) NMR）谱图（图2b）中，所有PVA衍生物的ppm值均清晰可见。在PVA及PVA衍生物的傅里叶变换红外（FT-IR）谱图（图2c）中，PVA衍生物明显呈现出1,4-二氢吡啶（1,4-DHP）结构中与C–N键相关的吸收峰（1642–1630 cm⁻¹和约1170 cm⁻¹，(~ 1170 ~cm^{-1})）以及苯环的特征吸收峰（((1530-1480 ~cm^{-1}))）。根据X射线光电子能谱（XPS）数据得到的氮（N）和氧（O）原子百分比，计算得出PVA衍生物中哈茨希（Hantzsch）结构的接枝率：PVA-BA为7%，PVA-HBA和PVA-SA均为5%（补充表1）。通过凝胶渗透色谱（GPC）测得的PVA衍生物的重均分子量（Mw）——PVA-BA：33.4 kg·mol⁻¹（(33.4 ~kg ~mol^{-1})）、PVA-HBA：(44.2 ~kg ~mol^{-1})、PVA-SA：(37.1 ~kg ~mol^{-1})——均高于PVA的重均分子量（(M_{w})（GPC）：(31.6 ~kg ~mol^{-1})）（补充图1）。上述结果表明，PVA衍生物成功制备。

随后我们通过紫外-可见（UV–vis）透光率分析，使用不同浓度的聚合物水溶液测试了所制备聚合物的防紫外线性能（图2d、补充图2）。当PVA衍生物浓度达到5 mg/mL（0.5 wt%）时，PVA-SA溶液几乎能阻挡整个紫外光谱（UVB：280–320 nm；UVA：320–400 nm），而PVA-BA和PVA-HBA溶液仍有部分紫外线透过。

此外，紫外线诱导的生物损伤与氧化应激密切相关，在所有PVA衍生物中，PVA-SA对活性氮（RNS）和活性氧（ROS）的清除率最高（图2e）。因此，我们选择PVA-SA作为典型的PVA衍生物用于后续实验，原因在于其具备优异的抗紫外线性能和抗氧化能力。

我们使用模型分子（M-SA）研究了PVA-SA的紫外屏蔽机制，该分子的侧基结构与PVA-SA中的1,4-二氢吡啶（1,4-DHP）相似（补充图3a、b）。我们利用密度泛函理论（DFT）计算了M-SA中参与紫外光谱的最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道（LUMO）（图2f）。图2f展示了HOMO和LUMO的分布情况，表明在激发态下，电荷会从水杨酸（SA）环向1,4-二氢吡啶（1,4-DHP）环发生转移。经计算，M-SA在甲醇中的最高占据分子轨道能量（EHOMO）为−5.49电子伏特，最低未占据分子轨道能量（ELUMO）为−1.68电子伏特，能隙（(E_{gap })）为3.81电子伏特，对应波长为325纳米。理论吸收峰与实验吸收峰（364纳米，补充图）之间存在差异。3c) 处于合理偏差范围内，表明 M-SA 可通过从最高占据分子轨道到最低未占据分子轨道的电子跃迁吸收紫外辐射。

图2：PVA衍生物的制备与表征。a，PVA衍生物的合成示意图。b，PVA及PVA衍生物的(^{1} H)核磁共振（DMSO-(d 6)，400 MHz）谱图；c，红外光谱（FT-IR）谱图。d，PVA衍生物水溶液（5 mg/mL）的紫外-可见光透光率谱图及280–370 nm处的放大谱图。e，PVA衍生物对活性氮（RNS）和活性氧（ROS）的清除率。数据以平均值±标准差（(n=3)个独立样本）表示。f，采用密度泛函理论（DFT）计算得到的M-SA理论能带隙。源数据详见源数据文件。

PVA-SA 的细胞水平紫外线防护：细胞毒性及机制分析

我们使用人角膜上皮细胞系（HCE-T）通过评估PVA-SA的细胞毒性细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测。以聚乙烯醇（PVA）作为对照。将人角膜上皮细胞（HCE-T）与不同浓度（1 mg/mL–10 mg/mL）的PVA或PVA-SA共培养24小时后，细胞表现出高细胞存活率（超过90%），表明该聚合物具有低细胞毒性（补充图4）。我们进一步通过集落形成实验评估了PVA-SA的长期细胞毒性（补充图5）。单次或多次给药（5次）10 mg/mL PVA-SA组的集落与空白组相似，证明PVA-SA具有低长期细胞毒性。根据已报道的方法38，测得PVA-SA ((2 mg / cm^{2}))的防晒系数（SPF）为80。该数值与市售皮肤防晒霜（防晒系数50+）相当。此外，10 mg/mL（1%质量分数）的PVA-SA溶液几乎无色透明（透光率84%，波长400–800 nm）（补充图6）。因此，本研究选用10 mg/mL的PVA-SA进行细胞水平的紫外线防护实验。

将 HCE-T 细胞与 PVA 和 PVA-SA（10 毫克/毫升，置于培养基中）共培养，随后进行紫外线照射（UVA：365±3 纳米，(20 ~mW / cm^{2})）10 分钟（(120,000 ~J / m^{2})，相当于阳光中平均紫外线剂量的 2.5–12.6 年），之后在新鲜培养基中孵育 24 小时（图 3a）。直接暴露于紫外线辐射的细胞作为对照组（UVA 组）；仅在培养基中孵育的细胞作为空白组。我们采用二乙酸荧光素/碘化丙啶（FDA/PI）双染色法直观观察细胞活力。PVA-SA 组的存活细胞数量与空白组相近，而 UVA 组和 PVA 组的活细胞数量均少于空白组和 PVA-SA 组（补充图 7a）。通过 CCK-8 实验获得的定量数据与直观结果高度一致（补充图 7b）。这些结果表明，UVA 会抑制 HCE-T 细胞的增殖，PVA 无法缓解 UVA 对细胞的不良影响，而 PVA-SA 则能保护细胞免受紫外线损伤。

我们对HCE-T细胞系进行了全转录组RNA测序，以探究单独的紫外线和PVA-SA对细胞的影响。未处理的细胞作为非处理对照组（NC组）。结果表明，UVA和UVB均会通过诱导DNA/RNA损伤、炎症、血管生成和细胞衰老来造成细胞损伤，而10毫克/毫升的PVA-SA对细胞的影响微乎其微（补充图8-10）。随后，我们全面研究了PVA-SA处理下紫外线照射后的细胞保护机制（图3a）。PVA-SA处理导致了与UVA组相比，403个基因的表达下调，257个基因的表达上调（图3b）。

图3：紫外线照射后PVA-SA保护下HCE-T细胞的RNA序列分析。a，评估PVA-SA细胞紫外线保护作用的实验流程示意图。b，火山图显示UVA+PVA-SA组与UVA组相比的差异表达基因（DEGs）；p (p<0.05)、(|log 2 FC|>1)。采用DESeq2（双侧）进行差异表达分析，未对多重比较进行校正。c，与DNA/RNA转录及合成相关的差异表达基因的基因本体（GO）分析。弦代表转录组功能与基因之间的关系。左侧展示基因，旁边的热图呈现基因的对数倍变化（log FC）值；右侧展示各项功能。连接线将基因与其对应的富集功能相连。d，差异表达基因（DEGs）的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析结果。采用DESeq2双侧法进行差异表达分析，未对多重比较进行校正。e，UVA组与UVA+PVA-SA组中差异表达基因表达的热图。红色代表上调，蓝色代表下调。对照组为UVA组。f，与DNA/RNA合成、细胞周期、炎症、血管生成及衰老功能相关的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析；数据库来源：version-11-5.stringdb.org/organism/9606。g–i，基因集富集分析（GSEA）结果显示，与UVA组相比，UVA+PVA-SA组中RNA降解通路（g）、IL-17信号通路（h）和细胞衰老（i）基因集中的差异表达基因均呈下调趋势。

基因本体（GO）分析显示，差异表达基因（DEGs）主要富集在与DNA/RNA转录和合成相关的条目，如“RNA聚合酶II对转录的调控”和“序列特异性双链DNA结合”（图3c）。这些富集条目也与细胞周期密切相关，会影响细胞的生长和增殖。此外，差异表达基因还富集在与血管生成和炎症相关的条目，如“Notch信号通路的负调控”和“参与出芽血管生成的血管内皮细胞增殖的负调控”（补充图11）。同时，差异表达基因的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，HCET细胞系中显著富集的条目与细胞生长、黏附和增殖（如PI3K-Akt信号通路、细胞外基质受体相互作用、MAPK信号通路以及黏着斑）以及炎症（如Notch信号通路和IL-17信号通路）相关（图3d）。

此外，与衰老抑制相关的基因（如COL6A3、ITGA2）和血管生成抑制相关的基因（如THBS1）被PVA-SA上调，而与细胞周期抑制相关的基因（如CDKN1A、GADD45A）、炎症相关基因（如CXCL2、CXCL8、IL1B）以及血管生成相关基因（如VEGFA、ADM2）则被PVA-SA下调（图3e）。图3f展示了与差异表达基因相关的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），并揭示了上述生物学功能之间的密切关联。基因集富集分析（GSEA）结果表明，PVA-SA组与RNA降解、IL-17信号通路及细胞衰老呈负相关（图3g-i）。这些结果表明，PVA-SA能有效保护细胞免受UVA诱导的DNA/RNA损伤、炎症、血管生成和衰老，并为其提供了遗传机制。该聚合物对细胞的紫外线防护作用。

紫外线辐射主要通过直接诱导DNA损伤发挥毒性作用，导致DNA交联以及以氧化应激为初始损伤继发事件的继发性双链断裂。为研究PVA-SA如何保护细胞免受紫外线损伤，我们在UVA照射（365±3纳米，(120,000 ~J / m^{2})）前（预防组）和后（拯救组）分别将细胞与PVA-SA（培养基中浓度为10毫克/毫升）共培养。仅用UVA处理的细胞和未做任何处理的细胞分别作为对照组和空白组。我们通过γ-H2AX染色实验评估了各组细胞中受损的DNA（补充图12）。UVA组和拯救组可检测到明显的绿色荧光，而空白组和预防组的荧光则可忽略不计。γ-H2AX染色实验的结果与集落形成实验的结果高度一致（补充图13）。这些结果表明，PVA-SA通过直接阻挡UVA光线来保护细胞，而非通过缓解氧化应激来阻止细胞受到紫外线诱导的损伤，这可能是由于该高分子聚合物难以快速进入细胞所致。

紫外线照射下斑马鱼的行为分析

斑马鱼幼鱼因其多种视觉导向行为，如惊吓反应（突然光照下运动活性降低）和趋光性（从黑暗区域游向光亮区域）³⁹⁻⁴⁰，近年来被用作视觉研究的模式生物。它们的视觉发育迅速，且在视网膜组织、细胞组成和基因表达方面与哺乳动物相似⁴¹⁻⁴²。斑马鱼幼鱼体型小巧、眼睛硕大，因此便于在高通量实验中进行观察⁴³⁻⁴⁴。本研究中，我们在PVA-SA和PVA溶液（浓度10 mg/mL）中培养受精后72小时（72 hpf）的斑马鱼幼鱼，此时其视网膜神经发生过程已基本完成。随后，将这些幼鱼置于紫外照射（波长365±3 nm，编号(8,000 ~J / m^{2})，等效于阳光中平均紫外剂量的2–10个月）约30秒，再转移至新鲜培养基中。仅置于培养基中的幼鱼作为空白组，接受紫外照射的幼鱼作为对照组。培养24小时后，这些96 hpf幼鱼的游泳行为高度依赖视觉线索，我们采用高通量方式通过交替明暗条件对其进行惊吓反应测试。幼鱼的运动情况通过Noldus行为记录系统进行监测（图4a）。

惊跳反应是指斑马鱼幼鱼从黑暗环境切换到光亮环境后，在光线下的游动距离远小于黑暗环境的现象⁴⁵,⁴⁶。实验中，斑马鱼幼鱼先在黑暗中适应10分钟，随后经历三个明暗交替周期（每个周期为2分钟光照+2分钟黑暗）。图4b展示了单个周期内斑马鱼幼鱼的典型活动轨迹（补充视频1），可见各组幼鱼在黑暗阶段的游动距离均大于光照阶段。这一现象在三次明暗交替过程中均稳定出现，由此得到的交替游动距离定量数据（图4c）表明，不同组的幼鱼表现出不同程度的惊跳反应。

具体而言，与空白组相比，紫外线组在明处和暗处的游泳距离差异要小得多。紫外线+聚乙烯醇组表现出的距离差异略高于紫外线组。相反，紫外线+聚乙烯醇-海藻酸组与空白组的距离差异则较为接近（图4d）。这些结果表明，紫外线组的幼体对明暗突然变化的敏感度低于空白组，这可能是由紫外线对视觉、神经调节或代谢功能调节造成的损伤所致；同时，聚乙烯醇对幼体的紫外线防护效果较差，而聚乙烯醇-海藻酸则能有效保护幼体免受紫外线损伤。

随后我们进行了趋光性测试，以评估不同处理后幼虫的视觉完整性。我们用挡板将经预处理的幼虫（受精后96小时）限制在黑暗区域。移去挡板后，记录幼虫在光照区域的活动情况及数量（图4e、补充视频2）。通过直接观察发现，与空白组和UV+PVA-SA组相比，UV组和UV+PVA组的斑马鱼幼虫从黑暗区域游向光照区域的概率显著更低（图4f）。定量数据显示，UV组和UV+PVA组的30只幼虫中，分别仅有4只和5只从黑暗区域移动到光照区域，而空白组和UV+PVA-SA组的该数量分别为13只和10只（图4g）。这些结果表明，紫外线照射可能会损害幼虫的视觉、神经调节或代谢功能调节，导致趋光性下降；PVA对紫外线造成的损伤几乎没有防护作用，而PVA-SA则能保护幼虫免受紫外线的损害。

图4：紫外线照射后斑马鱼幼鱼的行为分析。a，斑马鱼幼鱼惊觉反应实验流程示意图。b，不同组幼鱼在一个明暗周期中的典型运动轨迹。c，明暗交替周期（光照2分钟，随后黑暗2分钟）对96小时受精后（hpf）斑马鱼幼鱼游动距离的影响。数据以平均值±标准差表示（n = 24条独立斑马鱼）。共统计96条幼鱼的结果。d，不同组幼鱼明场与暗场的游动距离差异。数据以平均值±标准差表示（n = 32条独立斑马鱼）。该实验独立重复三次，得到相似结果。结果采用独立样本单尾Student t检验进行统计分析，未对多重比较进行校正。e，斑马鱼幼鱼趋光性测试实验流程示意图。f，各组幼鱼光照区域幼鱼数量最多时的趋光性测试截图（n = 24条独立斑马鱼）。g，趋光性测试的统计数据。数据以平均值±标准差表示（n = 30条独立斑马鱼）。该实验独立重复三次，得到相似结果。源数据已作为源数据文件提供。

PVA-SA 对斑马鱼幼鱼眼睛的紫外线防护作用

我们进一步研究了紫外线对斑马鱼幼鱼眼睛的损伤以及PVASA对斑马鱼幼鱼眼睛的保护作用。我们用吖啶橙（AO）对上述预处理后的幼鱼（受精后96小时）进行染色，观察其眼部区域以检测凋亡细胞。紫外线组和紫外线+聚乙烯醇组的幼鱼眼部出现亮绿色斑点，这表明凋亡细胞中可能存在染色质浓缩（图5a，白色箭头）。相比之下，空白组和聚乙烯醇-海藻酸组几乎未检测到荧光信号，说明其眼部细胞的凋亡程度极低（图5a）。荧光强度的定量数据与定性结果高度一致（补充图14）。这些结果表明，紫外线照射会损伤幼鱼的眼部细胞，聚乙烯醇几乎无法抵御紫外线损伤，而聚乙烯醇-海藻酸则能有效阻挡紫外线照射，使眼部细胞几乎保持完好。

图5b展示了幼虫眼睛的组织学图像。紫外线组和紫外线+聚乙烯醇组幼虫的眼睛周围观察到炎性细胞浸润（图5b，红色圆圈），表明这两组均可能发生坏死。然而，紫外线+聚乙烯醇-海藻酸钠组幼虫的眼睛周围几乎未观察到炎性细胞。紫外线组和紫外线+聚乙烯醇组的神经节细胞层（GCL）出现明显间隙，这归因于细胞核缺失和结构紊乱（图5b，红色箭头，补充图15），定量数据也证实了这一点（图5c）。与健康幼虫相比，经紫外线和聚乙烯醇处理的幼虫，其神经节细胞层（GCL）、内丛状层（IPL）、内核层（INL）和光感受器层（PR）等各类眼细胞层的厚度均显著降低。但紫外线+聚乙烯醇-海藻酸钠组的细胞层厚度与空白组极为接近（图5b和5d）。通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色法检测，所有组均未观察到明显的紫外线诱导的DNA断裂（补充图16）。这些结果表明，聚乙烯醇-海藻酸钠能有效保护幼虫的眼睛结构免受紫外线照射的影响。

图5：PVA-SA 对斑马鱼眼睛的紫外线防护作用。a，不同组斑马鱼幼鱼眼睛的吖啶橙（AO）染色图像。白色箭头指示凋亡细胞。比例尺：50 微米。实验独立重复三次，结果相似。b，不同组斑马鱼幼鱼眼睛的苏木精-伊红（H&E）染色图像。箭头指示神经节细胞层（GCL）的间隙，圆圈指示紫外线组和 PVA 组中的炎症细胞浸润。比例尺：50 微米。c，不同组神经节细胞层（GCL）的细胞核数量。数据以平均值±标准差表示（n = 9 条独立斑马鱼）。结果采用独立样本单样本 t 检验进行统计学分析，未对多重比较进行校正。d，不同组神经节细胞层（GCL）、内网状层（IPL）、光感受器层（PR）、视网膜色素上皮层（RPE）和内核层（INL）的厚度。数据以平均值±标准差表示（n = 9 条独立斑马鱼）。每个样本的厚度在样本的不同位置测量五次。源数据已作为源数据文件提供。

PVA-SA 急性眼刺激性试验

我们通过开展急性眼部（实验）来评估PVA-SA作为滴眼液成分的局部安全性进行刺激性测试（图6a）。我们将健康小鼠分为四组，并用不同溶液处理，包括生理盐水（空白组）、十二烷基硫酸钠（SDS，2微升，100毫克/毫升的生理盐水溶液，用作阳性对照）⁴⁷、聚乙烯醇（PVA，2微升，100毫克/毫升的生理盐水溶液）以及PVA-海藻酸（PVA-SA，2微升，100毫克/毫升的生理盐水溶液）。在施加不同溶液5分钟后，用生理盐水冲洗小鼠眼睛。随后，我们分别在0.5、1.0、1.5、24、48和72小时使用裂隙灯显微镜观察眼部状况以及荧光素染色的角膜情况。处理0.5小时后，经SDS处理的小鼠出现眼睑肿胀、角膜混浊、角膜缺损和溃疡。经生理盐水、PVA和PVA-SA处理的小鼠，其眼睑和角膜仅出现少量异常（图6b和补充图17）。72小时后，生理盐水、PVA和PVA-SA处理组小鼠的眼睛仍保持健康，而SDS处理组小鼠的眼睛未完全恢复（图6b和补充图18a）。我们还采用16分制的评分标准对荧光素钠染色结果进行评分，以监测角膜状况⁴⁸。PVA组和PVA-SA组的评分在72小时内均保持为零，与生理盐水组的评分结果一致（补充图18b）。这些结果从定量角度证实，经生理盐水、PVA和PVA-SA处理的小鼠眼睛保持健康。

72小时后，我们处死小鼠并摘除其眼球，以组织学方式评估不同处理后眼球的结构和形态变化。H&E染色结果显示，经SDS处理的小鼠角膜上皮细胞出现明显脱落和破损（黑色箭头），而经生理盐水、PVA和PVA-SA处理的小鼠角膜上皮细胞排列致密、整齐且完整（图6c）；PVA组、PVA-SA组与生理盐水组之间的角膜厚度差异可忽略不计（补充图19a）。此外，所有组的虹膜和视网膜均组织学表现正常，表明不同溶液主要对角膜产生影响（补充图19b）。

我们还采用TUNEL法观察了不同角膜细胞的凋亡情况。SDS对角膜组织造成的损伤较为严重，呈现出明亮的荧光，而PVA-SA造成的损伤几乎无法检测到（图6d）。同时，PVA组和PVA-SA组中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素-6（IL-6）的表达也几乎可以忽略不计（补充图20）。这些结果表明，PVA-SA几乎不会引起急性眼部刺激。处理72小时。比例尺：1毫米。最下方一行展示角膜的放大图像。箭头指示SDS组中角膜的破裂细胞。比例尺：100微米。该实验独立重复三次，获得相似结果。d，小鼠角膜组织经不同处理72小时后的TUNEL染色。蓝色：DAPI，绿色：TUNEL。比例尺：200微米。该实验独立重复三次，获得相似结果。e，PVA-SA在小鼠眼部的滞留时间。数据以平均值±标准差表示（(n=3)个独立眼球）。f，小鼠视网膜经不同处理后的H&E染色图像。比例尺：50微米。g，不同组外核层的细胞核数量。数据以平均值±标准差表示（(n=5)个独立眼球）。结果的统计分析采用独立样本单尾Student's t检验，未对多重比较进行校正。h，PVA-SA经静脉注射的给药方案。i–l，健康小鼠以及静脉注射PVA（30毫克）和PVA-SA（30毫克）的小鼠在72小时后不同血清生物标志物水平（i，尿素；j，肌酐；k，天冬氨酸转氨酶（AST）；以及l，白蛋白（ALB））。通过将数据与健康组数据比较获得p值。数据以平均值±标准差表示（(n=6)只独立小鼠）。结果的统计分析采用独立样本单尾Student's t检验，未对多重比较进行校正。源数据作为源数据文件提供。

图6：PVA-SA的体内安全性及其对小鼠视网膜的防晒保护作用。a，急性眼刺激试验的实验流程示意图。b，不同处理后小鼠眼睛在0.5小时和24小时时的荧光素角膜染色典型裂隙灯图像。比例尺：1毫米。该实验独立重复三次，获得相似结果。c，不同处理后小鼠眼睛的H&E染色处理72小时。比例尺：1毫米。最下方一行展示角膜的放大图像。箭头指示SDS组中角膜的破裂细胞。比例尺：100微米。该实验独立重复三次，获得相似结果。d，小鼠角膜组织经不同处理72小时后的TUNEL染色。蓝色：DAPI，绿色：TUNEL。比例尺：200微米。该实验独立重复三次，获得相似结果。e，PVA-SA在小鼠眼部的滞留时间。数据以平均值±标准差表示（(n=3)个独立眼球）。f，小鼠视网膜经不同处理后的H&E染色图像。比例尺：50微米。g，不同组外核层的细胞核数量。数据以平均值±标准差表示（(n=5)个独立眼球）。结果的统计分析采用独立样本单尾Student's t检验，未对多重比较进行校正。h，PVA-SA经静脉注射的给药方案。i–l，健康小鼠以及静脉注射PVA（30毫克）和PVA-SA（30毫克）的小鼠在72小时后不同血清生物标志物水平（i，尿素；j，肌酐；k，天冬氨酸转氨酶（AST）；以及l，白蛋白（ALB））。通过将数据与健康组数据比较获得p值。数据以平均值±标准差表示（(n=6)只独立小鼠）。结果的统计分析采用独立样本单尾Student's t检验，未对多重比较进行校正。源数据作为源数据文件提供。

PVA-SA 的眼部滞留能力

随后我们通过荧光素试验探究了PVA-SA的眼部滞留能力。简要来说，我们用PVA-SA（2微升，100毫克/毫升的生理盐水溶液）处理小鼠，随后在给予PVA-SA后的不同时间点收集其眼部组织，并将组织浸泡在生理盐水中。PVA-SA中的1,4-二氢吡啶基团具有固有荧光，因此我们根据PVA-SA的标准曲线，通过检测含眼部组织的生理盐水溶液的荧光强度，来测定眼部残留的PVA-SA含量（补充图21）。如图6e所示，30分钟内眼部的PVA-SA残留量降至30.3%，这可能是由于小鼠通过鼻泪管以及眨眼、自由活动等正常生理行为，导致PVA-SA快速从眼部流失。给药60分钟和90分钟后，眼部滞留的PVA-SA量分别为13.0%和1.9%。经估算，PVA-SA在眼部的半衰期约为15分钟。

PVA-SA 对小鼠视网膜的紫外线防护作用

我们使用小鼠模型评估了PVA-SA的保护作用。我们向BALB/C小鼠的眼睛滴入PVASA溶液（2微升，浓度为100毫克/毫升，溶于生理盐水），随后将眼睛暴露在紫外线下（波长365±3纳米，编号(60,000 ~J / m^{2})）120秒（相当于阳光中平均紫外线剂量的1.2至6年）。24小时后，我们对小鼠实施安乐死并摘除其眼睛，以对眼部结构进行组织学评估，眼部的形态学变化。将健康小鼠和未接受任何处理的紫外线照射小鼠分别作为空白组和对照组（紫外线组）。苏木精-伊红（H&E）染色结果显示，与空白组相比，紫外线组小鼠视网膜细胞层（包括外网层（OPL）、外网核层（ONL）以及内节/外节（IS/OS））的厚度显著降低（图6f、补充图22）。同时，外网核层排列紊乱且出现明显的核丢失，内节/外节边界模糊，内节也排列紊乱并存在明显间隙。相反，紫外线+PVA-SA组小鼠的视网膜细胞层与空白组高度相似，细胞层排列整齐、形态正常，内节/外节边界清晰，且外网核层的细胞核数量未减少（图6f、6g、补充图22）。此外，免疫荧光染色结果清晰显示，紫外线组小鼠视网膜中存在白细胞介素-6（IL-6）的绿色信号，表明紫外线诱导了细胞损伤，而空白组和紫外线+PVA-SA组中几乎未观察到IL-6信号（补充图23）。这些结果证实，紫外线会对小鼠视网膜造成损伤，而抗紫外线的PVA-SA能有效保护受紫外线照射的小鼠视网膜。

PVA-SA的体内安全性评估

我们通过静脉注射的方式在小鼠体内测试了生理盐水溶液中PVA-SA的毒性（图6h）。PVA是一种公认的生物安全聚合物，已获得美国食品药品监督管理局批准用于人类49，因此将其作为对照。健康小鼠作为空白组。所有小鼠均耐受了高剂量的PVA（30毫克）和PVA-SA（30毫克，为眼部给药剂量的150倍），实验期间体重无明显下降（补充图24），也未表现出异常行为。注射72小时后，处死一半小鼠，分离其心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏，通过H&E染色进行组织学分析。器官组织学分析显示，组织损伤极小，病变也很少（补充图25）。采集血液以检测肝肾功能相关的血清生物标志物。与健康小鼠相比，尿素、肌酐、天冬氨酸转氨酶（AST）和白蛋白（ALB）水平无显著变化（图6i-l）。剩余小鼠在注射7天后被处死，采用相同方法进行检测。在主要器官的组织学分析中，注射聚合物的小鼠与健康小鼠之间几乎无差异，血清生物标志物水平（补充图26）。这些结果表明，PVA-SA对小鼠的肝脏和肾脏具有最小的不良影响，且生物安全性与PVA相近。

PVA-SA 的体内长期毒性

我们通过每天两次（上午8点和晚上8点各一次）向BALB/C小鼠眼部反复施用PVA-SA（2微升，100毫克/毫升的生理盐水溶液），持续14天，以此研究PVA-SA的体内长期毒性。以2微升生理盐水作为空白对照。我们分别在第(3^{rd })天、第(7 th)天和第(14^{th })天，使用裂隙灯显微镜观察眼部状况以及荧光素染色后的角膜（补充图27）。在14天的观察期内，生理盐水组和PVA-SA组处理的小鼠，其眼睑和角膜均未出现明显异常。生理盐水组与PVA-SA处理组均未检测到明显的绿色荧光，这表明角膜缺损和溃疡的情况可忽略不计。

14天后，我们处死小鼠并摘除其眼球，以组织学方式评估PVA-SA处理后眼球的结构和形态变化。TUNEL染色显示，生理盐水组和PVA-SA组均未观察到明显的亮荧光（补充图28a）。H&E染色结果表明，经PVA-SA处理的小鼠角膜上皮细胞排列致密、有序且完整，与生理盐水处理的小鼠角膜上皮细胞相似。同时，两组小鼠的虹膜和视网膜均保持组织学正常（补充图28b和c）。PVA-SA组中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的表达水平与空白组相比无显著差异（补充图28d和e）。这些结果证明，长期使用PVA-SA几乎不会对眼部产生刺激作用。

此外，对这些处死的小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行分离，通过苏木精-伊红（H&E）染色进行组织学分析。器官的组织学分析显示损伤极小，病变数量少（补充图29a）。收集血液以检测肝肾功能相关的血清生物标志物。与健康小鼠相比，尿素、肌酐、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和白蛋白（ALB）水平未出现显著变化（补充图29b-e）。这些结果表明，PVA-SA 在长期体内实验中使用时毒性极低。

讨论

在本研究中，我们选取了三种具有芳香结构的天然提取醛类，因其具有较高汉茨希反应中的反应活性以及在食品工业中作为香料的广泛应用。这些源自天然产物的醛类物质安全性高，还具有抗氧化、抗炎等生物活性，可减轻紫外线诱导的生物学损伤。然而，单独的SA对经UVA处理的细胞几乎没有保护作用，对UVB处理的细胞保护作用也较弱（补充图30）。它需要借助二甲基亚砜（DMSO）来提升水溶性，且不适用于眼部。本研究通过汉茨希反应将SA引入聚乙烯醇（PVA）结构中。得益于水溶性的PVA主链，SA的水溶性得到显著提升；同时，由于与汉茨希反应生成的固有抗紫外线1,4-二氢吡啶（1,4-DHP）结构结合，SA的抗紫外线能力也得到增强。因此，通过汉茨希反应将SA共价连接到PVA上，放大了SA的功效，得到了目标的水溶性、抗紫外线眼部专用聚合物。在未来的研究中，其他具有不饱和结构的天然/合成醛类（同样是潜在的紫外线吸收剂）也可通过类似方法进行研究，以扩充分子库并开发不同的眼部防晒产品。

水会显著衰减紫外线。本研究已将这一因素纳入考量。在这些实验中，我们将紫外线检测器放置在装有斑马鱼的培养皿或装有细胞的培养板下方，并扣除空培养皿或空培养板所吸收的剂量。同时，斑马鱼和细胞均位于容器底部。因此，本手稿中提及的剂量可能与斑马鱼胚胎眼部或培养细胞实际接收的剂量并非完全一致，但二者之间的差异应相对较小。

在本研究中，我们选用UVA作为细胞和斑马鱼实验的主要光源，因为它约占地球大气中紫外线总量的95%50,51。然而，在相同剂量下，UVB（在大气中占比约5%，且在高海拔地区或近地空间的含量高于地球表面）的能量高于UVA，可能会造成更严重的眼部损伤。例如，UVB是导致白内障的重要环境因素，而白内障会使超过1500万成年人失明((≥50 years old )^{52})。因此，我们还评估了PVA-SA对细胞的UVB防护作用。在UVB（312纳米，125 (125 mu W / cm^{2})）照射40分钟(3,000 ~J / m^{2})（相当于1.2至6年的平均阳光紫外线剂量）后，FDA/PI和CCK-8实验结果表明，UVB可能会抑制HCE-T细胞的增殖，且PVA无法抵御UVB对细胞的不良影响，而PVA-SA可预防UVB诱导的细胞损伤（补充图31）。此外，RNA测序结果表明，与UVA相比，PVA-SA对UVB的保护作用更侧重于抑制DNA/RNA损伤、炎症反应和细胞黏附（补充图32）。γ-H2AX染色实验和集落形成实验进一步表明，PVA-SA通过直接阻挡UVB光线来保护细胞，而非通过减轻氧化应激来防止细胞受到UV诱导的损伤（补充图33和图34）。这些结果表明，PVA-SA也是一种优异的抗UVB防护剂。

PVA-SA溶液的液层厚度会影响其紫外线防护效果。在相同的聚合物浓度下，液层越厚，吸收的紫外线越多。本研究中，由于充足培养基的需求，在细胞和斑马鱼实验中PVA-SA溶液的液层厚度约为2毫米，而在小鼠眼部实验中液层厚度小于1毫米。这些厚度远高于角膜与眼睑之间泪膜的厚度（3–40 ((3-40 mu m)^{53})）。但细胞实验中UVA和UVB的照射剂量分别为120000 J/m² b4d99352-1c5a-49a8-8cd7-5d98e15c29b² 和 (3,000 ~J / m^{2})²，斑马鱼实验中UVA的照射剂量为8000 J/m² (8,000 ~J / m^{2})²。这些紫外线的照射剂量远高于实际水平。因此，本研究得出的结果（使用比实际情况更厚的溶液来屏蔽远强于实际水平的紫外线）仅能证明该聚合物具备紫外线防护的潜力，其实际的紫外线防护效果仍需在实际应用中进一步评估。

除了永生化的HCE-T细胞系外，我们还研究了PVA-SA对原代人皮肤成纤维细胞的细胞毒性和保护作用，这些细胞并非永生化细胞，且会发生紫外线诱导的衰老。CCK-8检测和集落形成实验结果分别表明，PVA-SA具有较低的急性细胞毒性和长期细胞毒性（补充图35和36）。同时，CCK-8检测结果显示，PVA-SA能有效保护原代细胞免受UVA（365±3纳米，照射10分钟，总剂量(20 ~mW / cm^{2})）和UVB（312纳米，照射40分钟，总剂量125(125 mu W / cm^{2})）照射的损伤（补充图37）。RNA测序数据表明，PVA-SA可通过减轻DNA损伤、促进细胞生长与增殖来抵抗紫外线诱导的衰老（补充图38和39）。γ-H2AX染色实验和集落形成实验进一步研究表明，PVA-SA 可直接阻挡紫外线，并保护原代细胞免受 DNA 损伤等初始损伤，而非通过减轻氧化应激来防止细胞受到紫外线损伤（补充图 40-43）。这些结果表明，PVA-SA 对细胞系和原代细胞均具有低细胞毒性和优异的紫外线防护性能。

在斑马鱼实验中，斑马鱼与PVA-SA的共培养时间控制在一分钟以内。在如此短的时间内，添加到水中的聚合物仍可能通过鳃被吸收并引发全身效应。未来我们将针对斑马鱼对聚合物的吸收及其引发的全身效应展开详细研究。同时，本研究中斑马鱼幼鱼体型过小，无法仅让其眼部暴露于紫外线下，因此幼鱼视觉相关的异常行为可能是紫外线诱导的眼部损伤、神经调节异常或代谢功能调节异常导致的。基于此，未来研究中我们将采用更复杂的哺乳动物模型来评估聚合物对眼部的紫外线防护效果，以得出可靠结论。

由于角膜前流失和鼻泪管引流，大多数滴眼液的生物利用度较低54,55。滴眼液给药后约60%的活性成分会在2分钟内被清除，15-25分钟后几乎被完全清除(15-25 ~min^{56})。本研究中，PVA-SA在小鼠眼部的半衰期约为15分钟，远高于文献报道的数值。我们使用流变仪测定了10%（质量分数）PVA-SA溶液的黏度。当剪切速率在10至(2,000 ~s^{-1})范围内时，PVA-SA溶液表现为牛顿流体，稳态黏度约为67毫帕秒。当剪切速率超过2000秒⁻¹(2,000 ~s^{-1})时，其则表现为非牛顿流体的剪切稀化行为（补充图44）。同时，以水和透明质酸（0.2%，分子量：500至2000千克/摩尔）为主要成分的市售产品Eyestil PF，在10秒⁻¹的剪切速率下黏度约为20毫帕秒(10 ~s^{-1})，且在10至(10,000 ~s^{-15})范围内呈现出显著的剪切稀化现象。PVA-SA的分子量为37.1千克/摩尔，与Eyestil PF中的透明质酸（500至2000千克/摩尔）相比极低。因此，PVA-SA的长滞留时间可能归因于其100毫克/毫升（即10%质量分数）的高浓度带来的溶液高黏度，以及PVA-SA中的羟基可通过氢键与极性角膜表面相互作用。然而，在实际应用中，理想的眼部防晒产品应具备黏度相对较低，但在眼表的滞留时间较长。一种可行的策略是使用高分子量的聚乙烯醇（PVA）来制备抗紫外线聚合物。聚乙烯醇（PVA）主链上含有大量羟基，这些羟基能够增强聚合物与眼表之间的相互作用，从而使制得的抗紫外线聚合物即使在低浓度、低黏度的情况下，也能长期附着在眼表。

许多眼部疾病与氧化应激密切相关，例如干眼症57。未来的研究可探索利用具有优异抗氧化能力的PVA-SA来治疗这些眼部疾病。

总之，我们研发出一种可直接用于眼部的防晒霜，能够阻挡来自各个方向的紫外线，且不会影响眼部功能。我们通过汉茨希反应，将源自天然产物的BA、HBA和SA分别引入作为人工泪液成分的PVA中，制备出三种PVA衍生物（PVA-BA、PVA-HBA和PVA-SA）。经过一系列筛选，我们获得了高防晒系数（SPF值为80）的PVA-SA，其水溶液（质量分数1.0%）具有高透明度（84%）和优异的紫外线屏蔽率((>99%))。PVA-SA在短期和长期使用中均表现出低细胞毒性，能有效保护角膜上皮细胞和人原代皮肤成纤维细胞免受紫外线诱导的DNA/RNA损伤、炎症反应、血管生成及细胞衰老，从而使受保护的细胞保持与未暴露于紫外线的细胞相当的细胞活力。在体内实验中，PVA-SA可有效保护斑马鱼幼鱼免受紫外线损伤；因此，经PVA-SA保护的斑马鱼在紫外线照射后，其视觉引导行为（惊跳反应和趋光性）基本保持完整，眼部组织也维持健康。此外，PVA-SA还具备出色的长期生物安全性，对眼睛的急性刺激性极低，且在小鼠眼部能长时间留存，同时可有效保护小鼠视网膜免受紫外线诱导的损伤，这表明PVA-SA是一种安全有效的眼部抗紫外线材料。

这项以目标为导向的研究利用天然产物和多组分反应，成功开发出一款安全性和抗紫外线性能优异的眼部防晒霜，从而为开发高附加值生物材料提供了有效策略。

方法

PVA衍生物（PVA-BA、PVA-HBA和PVA-SA）的制备

PVA衍生物参照先前的文献58进行合成。以PVA-BA的制备为例。简要来说，使用前通过沉淀和透析对PVA-0588进行纯化，以去除抗氧化/抗紫外添加剂。将纯化后的PVA（1.1克，羟基物质的量约22毫摩尔）溶解于无水1-甲基-2-吡咯烷酮（NMP，10毫升）中，随后加入双乙烯酮（184.9毫克，2.2毫摩尔），将混合物在室温下搅拌1小时。接着，向反应体系中加入苯甲醛（256.8毫克，2.42毫摩尔）、5,5-二甲基-1,3-环己二酮（339.2毫克，2.42毫摩尔）、乙酸铵（279.8毫克，3.63毫摩尔）和甘氨酸（18.2毫克，0.24毫摩尔），将混合物保持在80℃下3.5小时，直接进行汉茨希反应。将混合物在丙酮中沉淀三次，经真空干燥后得到目标产物PVA-BA（1.50克，产率约89%）。

PVA-HBA和PVA-SA的制备方法类似，分别使用4-羟基苯甲醛（295.5毫克，2.42毫摩尔）和3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲醛（440.9毫克，2.42毫摩尔）替代苯甲醛，得到目标聚合物（PVA-HBA：1.55克，产率约91%；PVA-SA：1.68克，产率约92%）。

聚合物溶液的抗紫外线性能与透光性

通过紫外-可见光谱分析研究了聚合物溶液的防紫外线性能和透明度。利用透光率数据计算了UVA（320–400纳米）和UVB（280–320纳米）的阻隔率，以及可见光透光率（400–800纳米）。

UVA 的阻断率通过公式 1 计算得出，  [UVA blocking (%)=100-frac{int_{320}^{400} T(lambda) d lambda}{int_{320}^{400} d lambda}(%) quad]

其中 (T(lambda)) 是样品在波长 λ 处的透射率，(d lambda) 是带宽，λ 为波长。

UVB 的阻隔百分比通过公式 2 计算得出，  [UVB blocking (%)=100-frac{int_{280}^{320} T(lambda) d lambda}{int_{280}^{320} d lambda}(%) quad]

可见光透过率通过公式3计算得出，

[Visible light transmittance (%)=frac{int_{400}^{800} T(lambda) d lambda}{int_{400}^{800} d lambda} × 100 %]

防晒系数（SPF）测定

我们采用文献37中报道的方法测定了PVA-SA的SPF值。取一块石英玻璃（厚度：2毫米），贴上3M医用胶带（4厘米 ((4 ~cm^{2}))），随后在胶带上滴加PVA-SA水溶液（100微升，浓度80毫克/毫升，溶剂为(H_{2} O)）。样品在暗室中干燥20分钟后，于290-400纳米波长范围内测定透射光谱（光斑间隔：1纳米）。采用下述公式4对石英玻璃进行处理：

其中 (E_{lambda}=CIE) 为红斑光谱效应，(S_{lambda}) = 太阳光谱辐照度，(T_{lambda}) = 光谱样品的透光率

PVA衍生物的抗氧化能力

通过自由基清除实验评估了PVA衍生物的抗氧化能力（以ABTS+•作为活性氮物种的典型代表，以•OH作为活性氧物种的典型代表）。其中，ABTS+•活性氮的典型实例，羟自由基（•OH）作为活性氧的典型实例）。

ABTS**溶液参照先前文献2制备。简要来说，(ABTS^{+cdot})由含有2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)的水溶液（20毫升）制备而成酸）二铵盐（ABTS，4.0 毫摩尔）和过硫酸钾（1.41 毫摩尔）。该 (ABTS^{+cdot}) 溶液为在黑暗中放置14小时。

将(ABTS^{+cdot})溶液用去离子水稀释至734纳米处的吸光度约为0.8，然后加入加入96孔板中（190微升），随后加入PVA-BA溶液（10微升，2毫克/毫升）。吸光度在 734 纳米波长下，通过酶标仪测定了不同时间间隔下 (ABTS^{+cdot}) 溶液的吸光度。PVA-HBA并平行测试了PVA-SA溶液。以去离子水作为空白对照。以15分钟时的吸光度计算活性氮自由基清除率。结果以平均值±标准差表示，(n=3)。

活性氧清除率采用先前报道的方法60进行测定。简要来说，水溶液的配制如下将水杨酸（20微升，10毫摩尔/升）、硫酸亚铁（20微升，10毫摩尔/升）、(H_{2} O_{2})（20微升，10毫摩尔/升）和PVA-BA（100微升，10毫克/毫升）在96孔板中混合。将混合物在37℃下孵育15分钟；随后，在510纳米波长下记录水杨酸被羟基自由基（•OH）转化生成的2,3-二羟基苯甲酸的特征吸收。以同样的方法测试PVA-HBA和PVA-SA。以去离子水（100微升）作为空白对照。PVA衍生物对2,3-二羟基苯甲酸的抑制效率反映了其抗活性氧（anti-ROS）的能力。结果以平均值±(n=3)表示

根据以下公式5计算活性氮物质（RNS）或活性氧物质（ROS）的清除率，计算依据为吸光度的变化：  [Scavenging ratio (%)=frac{A_{b}-A_{s}}{A_{b}} × 100 % quad (5)]

其中Ab表示空白组的吸光度，(A_{s})表示实验组的吸光度。

模型分子（M-SA）的制备

该模型分子通过汉茨希反应合成。将乙酰乙酸乙酯（130.1毫克，1.0毫摩尔）、5,5-二甲基-1,3-环己二酮（140.2毫克，1.0毫摩尔）、3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲醛（182.2毫克，1.0毫摩尔）、乙酸铵（115.6毫克，1.5毫摩尔）和甘氨酸（7.51毫克，0.1毫摩尔）溶解于乙腈（1.0毫升）中。将该混合物在70摄氏度下保持3小时。随后，通过在去离子水中沉淀并使用乙醚洗涤三次，得到模型分子，为灰色粉末（394.8毫克，产率约95%）。

(^{1} H)NMR（400 MHz，DMSO-(d_{6})，δ/ppm）9.08（s，1H，CHNC），8.14（s，1H，OH），6.39（s，2H，ph），4.79（s，1H，CCHC），4.04（d，(J=7.1 ~Hz)，2H，(CH_{2} CH_{3})），3.67（s，6H，OCH3），2.46-2.27（m，2H，(CH_{2} C=O)），2.28（s，3H，(NHCCH_{3})），2.21-1.97（m，2H，(CH_{2} CNH)），1.21（t，(J=7.1 ~Hz)，3H，(CH_{2} CH_{3})），1.04（s，3H，(CH_{3} CCH_{3})），0.94（s，3H，(CH_{3} CCH_{3})）

(^{13} C)NMR（100 MHz， DMSO-(d_{6})，δ/ppm）195.07,167.57,150.13,147.88,144.88,138.57,134.29,110.38,105.38,104.57,59.54,56.24,50.71,35.81,32.56,29.83,26.64,18.69,14.75。

红外光谱（((v / cm^{-1}))）：3547、3277、3199、3075、2959、1691、1604、1484、1424、1378、1312、1280、1211、1170、1150、1116、1069、1030、979、918、855、778、707。

ESI-MS：实测值（理论值）：438.1890（438.1887）([M+Na^{+}])

M-SA的理论计算

所有计算均通过Gaussian 16软件包完成61。几何优化在(B 3 LYP^{62}-D 3(~BJ)^{63} / def 2-SVP^{64})基组水平下进行。频率计算采用与几何优化相同的理论水平，以确定稳定点为极小值（无虚频）。通过((SMD) ^{65})隐式溶剂化模型（溶剂化密度模型）考虑了甲醇的溶剂化效应。波函数分析通过Multiwfn66完成，轨道可视化则借助虚拟分子动力学软件（VMD）67实现。

细胞培养

HCE-T 细胞（货号：CL-0743，购自 Procell 生命科学与技术公司）培养于添加了 15% 胎牛血清、5 微克/毫升胰岛素、10 纳克/毫升人表皮生长因子以及 1% 青霉素和链霉素的德氏改良伊格尔培养基/营养混合物 F12（DMEM/F12）中（即 HCE-T 完全培养基）。原代人皮肤成纤维细胞培养于添加了 5% 胎牛血清、1% 成纤维细胞培养添加剂以及 1% 青霉素和链霉素的成纤维细胞培养基（FM）中。细胞于 37℃、5% (CO_{2}) 环境中培养，每日更换培养基以维持细胞指数生长期生长。

PVA-SA 的短期与长期细胞毒性

采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法评估PVA-SA的短期细胞毒性。简要来说，将HCE-T细胞（((~ 1 ×10^{5} cells / mL))）接种于96孔板中，每孔加入100微升HCE-T完全培养基。细胞贴壁后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，随后分别加入100微升含1、2、4、8、10毫克/毫升PVA-SA的培养基进行培养。24小时后，用PBS洗涤细胞，再加入100微升含10% CCK-8的培养基继续培养2小时，之后进行观察。将该96孔板放入酶标仪（(VICTOR ^{TM}) X3 PerkinElmer 2030 多标记微孔板检测仪）中，记录450纳米波长处的吸光度。以仅用培养基培养的细胞为阳性对照（细胞活力100%），无细胞的培养基为阴性对照（细胞活力0%），通过对比结果计算细胞活力。PVA溶液的制备与检测流程与上述一致，用于HCE-T细胞实验的对照测试。

通过集落形成实验评估了PVA-SA的长期细胞毒性。将HCE-T细胞（12孔板中约100个细胞/孔）与PVA-SA（培养基中浓度为10 mg/mL）孵育24小时在37摄氏度、5% (CO_{2})条件下。将细胞继续用正常培养基（单次给药组）或含PVA-SA（10毫克/毫升）的培养基（多次给药组，给药5次）培养10天。用4%水溶液的多聚甲醛在25摄氏度下固定菌落15分钟，再用0.1%的结晶紫水溶液在25摄氏度下染色15分钟，随后用磷酸盐缓冲液洗涤两次。将包含50个以上细胞的菌落记为存活细胞；数据以平均值±标准差((n=3))（n=3）表示，以未处理细胞的菌落数作为空白组并定义为100%。

PVA-SA对原代人真皮成纤维细胞的短期细胞毒性进行了类似的试验，PVA-SA对原代人真皮成纤维细胞的长期细胞毒性也进行了类似的试验，另外14天而不是10天，用ImageJ（1.51）计算结晶紫分数，并以未处理细胞的结晶紫分数为空白，定义为100%。

PVA-SA 的细胞紫外防护作用：细胞活力、γ-H2AX 染色实验及集落形成实验

通过二乙酸荧光素/碘化丙啶（FDA/PI）双染色实验评估了PVA-SA对细胞的紫外线防护作用。简要来说，将HCE-T细胞（((~ 1 ×10^{5} cells / mL))）接种于96孔板中，加入100微升HCE-T完全培养基。细胞贴壁后，用PBS洗涤，并在100微升含10毫克/毫升PVA-SA的培养基中孵育。随后，分别用UVA（365±3纳米，(20 ~mW / cm^{2})，照射10分钟）和UVB（312纳米，125 (125 mu W / cm^{2})，照射40分钟）对细胞进行照射。到达细胞的UVA和UVB照射剂量分别为120000焦耳/平方米（(120,000 ~J / m^{2})）和(3,000 ~J / m^{2})。照射结束后，细胞用PBS洗涤，并用新鲜培养基孵育24小时。随后加入PBS-FDA-PI混合液（FDA：3微克/毫升；PI：3微克/毫升），通过激光扫描共聚焦显微镜（ZEN black 2.3）同时观察活细胞（(lambda_{ex}=488 ~nm)、(lambda_{em}=493-560 ~nm)）和死细胞（(lambda_{ex}=543 ~nm)、(lambda_{em}=565-700 ~nm)）。细胞活力也通过上述CCK-8实验进行分析。未接受紫外线照射的纯培养基组细胞活力定义为100%。PVA溶液的制备和测试方法与之相同。

采用γ-H2AX染色实验检测紫外线照射后细胞内的DNA损伤情况。简要来说，我们在紫外线照射（UVA：365±3nm，(120,000 ~J / m^{2})；UVB：312nm，(3,000 ~J / m^{2})）之前或之后，用PVA-SA（浓度为10 mg/mL的培养基溶液）处理细胞。设置仅经紫外线处理的细胞组和未经处理的细胞组作为对照。

分别作为对照组和空白组。随后，我们按照制造商的方案，采用γ-H2AX染色实验评估各组的DNA损伤情况（磷酸化组蛋白H2AX（Ser139）兔单克隆抗体（碧云天）：类别：兔单克隆抗体（RabMAb）：一抗；产品编号：AF1201；同种型：IgG）。通过激光扫描共聚焦显微镜观察到DNA损伤细胞的绿色荧光（((lambda_{ex})、(=495 ~nm)、(lambda_{em}=515-520 ~nm)）。

采用集落形成实验检测辐射诱导的损伤及损伤修复情况。简要操作如下：将HCE-T细胞（12孔板中每孔约100个细胞）暴露于紫外线（UVA：365±(120,000 ~J / m^{2}) nm或UVB：312 nm，(3,000 ~J / m^{2}) nm），照射后更换培养液。将细胞于37℃、5%二氧化碳条件下继续培养10天。用4%多聚甲醛（(H_{2} O)）在25℃下固定集落15分钟，再用0.1%结晶紫水溶液在25℃下染色15分钟，随后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次。预防组中，细胞先与PVA-SA（10 mg/mL）共培养，再暴露于紫外线，照射后更换新鲜培养液继续培养；救援组中，细胞先接受紫外线照射，再用PVA-SA（10 mg/mL）培养24小时，之后更换新鲜培养液培养。将包含50个以上细胞的集落记为存活细胞；数据以均值±((n=3))表示，以未处理细胞的集落数作为空白组，并定义为100%。

研究人员同样采用集落形成实验，将原代人皮肤成纤维细胞暴露于紫外线14天（而非10天），以此检测PVA-SA对细胞的紫外线防护作用。通过ImageJ（1.51）软件计算结晶紫染色率，以未处理细胞的结晶紫染色率作为空白对照，并将其定义为100%。

RNA提取与文库构建

将HCE-T细胞（((~ 1 ×10^{5} cells / mL))）接种在HCE-T完全培养基（100 L）中的96孔板中。附着后，细胞用PBS洗涤，并在100 L含有10 mg/mL PVA-SA的培养基中孵育。然后，细胞分别进行以下两种处理。1）单独使用PVASA：将细胞分别在含有PVA-SA（10 mg/mL）的培养基中孵育10 min和40 min。2）PVA-SA保护：细胞分别用UVA（365(20 ~mW / cm^{2})，10 min）和UVB（312 nm，125(125 mu W / cm^{2})，40 min）照射。照射后，细胞用PBS处理后，置于新鲜培养基中孵育24小时。

随后，按照制造商的方案，使用 TRIzol 试剂（美国加利福尼亚州 Invitrogen 公司）提取总 RNA。使用 NanoDrop 2000 分光光度计（美国赛默飞世尔科技公司）评估 RNA 的纯度和定量。使用 Agilent 2100 生物分析仪（美国加利福尼亚州圣克拉拉市安捷伦科技公司）检测 RNA 的完整性。随后，根据制造商的说明，使用 VAHTS Universal V6 RNA 测序文库制备试剂盒构建文库。转录组测序及分析由中国上海欧易生物科技有限公司完成。

原代人皮肤成纤维细胞也进行了相同的检测。

RNA测序与差异表达基因分析

这些文库在 Illumina Novaseq 6000 平台上进行测序，生成了150 bp双端读数。首先使用 fastp 对 fastq 格式的原始读数进行处理，去除低质量读数以获得清洁读数。使用 HISAT2 软件将清洁读数比对到参考基因组。

使用DESeq2进行差异表达分析。将(P value <0.05)和(foldchange >)的1.5倍作为显著差异表达基因（DEGs）的阈值。使用R（v 3.2.0）对差异表达基因进行层次聚类分析，以展示不同组别和样本中基因的表达模式。

基于超几何分布，分别使用 R 语言（版本 3.2.0）对差异表达基因（DEGs）进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，以筛选显著富集的条目。

使用GSEA软件进行了基因集富集分析（GSEA）。该分析基于预设的基因集，并根据两种样本中基因的差异表达程度对基因进行排序。随后检验预设基因集是否在排序列表的顶部或底部富集。

动物实验

本研究的所有动物实验均严格遵循清华大学《实验动物管理与使用指南》开展，并经动物伦理委员会批准清华大学（批准号：20-TL1、20-TL1.G25-1）。所有实验动物操作均在麻醉状态下进行，并尽一切努力减少其痛苦。

本研究所用的所有斑马鱼胚胎和幼鱼均来自图宾根品系。受精卵购自中国斑马鱼资源中心，并在霍尔特弗特溶液（59 mM 氯化钠、0.67 mM 氯化钾、0.76 mM 氯化钙和 2.4 mM (NaHCO_{3})）中饲养。实验使用受精后72-96小时（hpf）的幼鱼。所有胚胎和幼鱼均饲养在28.5±0.5℃的培养箱中，光照周期为14小时光照/10小时黑暗（早8:30开灯）。由于所有实验用鱼均在受精后168小时前完成使用，未进行外源投喂。每日通过肉眼观察对每条幼鱼进行福利监测，检查其整体外观、游泳行为、身体姿态以及对轻微机械刺激的反应能力。任何出现应激迹象（如失去平衡、姿势异常或无反应）的个体均被立即安乐死。安乐死通过过量投喂甲磺酸三卡因（MS-222，3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）实现。

BALB/C小鼠（7周龄，16-20克，雌性）按照GB 14925-2023标准饲养在10小时黑暗/14小时光照的环境中（温度20-26℃，湿度40-70%）。小鼠喂食高压灭菌的标准饲料（配方等同于LabDiet 5K52，脂肪含量6%）和纯净水。每日通过肉眼观察每只动物的整体外观（被毛凌乱、弓背姿势）、体重以及对轻柔触碰的反应性来进行福利监测。任何出现痛苦迹象（如持续体重下降或无反应）的个体均被立即实施安乐死。安乐死通过二氧化碳((CO_{2}))吸入完成。

斑马鱼幼虫的紫外线照射处理

幼虫的饲养和处理方式与上述描述完全一致。首先，将60条斑马鱼幼虫（受精后72小时）置于PVA-SA溶液（10毫克/毫升，溶于霍尔特弗雷特溶液）中。随后，将幼虫置于UVA照射（365±3纳米）下约30秒。UVA照射剂量约为8000焦耳/平方米。照射完成后，将幼虫转移至新鲜的霍尔特弗雷特溶液中进行后续研究。其他培养基中的幼虫（纯霍尔特弗雷特溶液；含10毫克/毫升PVA的霍尔特弗雷特溶液；每组60条幼虫）也采用相同方法测试。未进行紫外线照射的纯霍尔特弗雷特溶液中的幼虫作为空白对照组。

惊响反应测试

紫外线照射24小时后，从上述各组中随机选取斑马鱼幼鱼（96小时胚胎期），每组24尾，转移至96孔板中单独饲养，以便于追踪和统计分析。在黑暗中适应10分钟后，对幼鱼进行3个周期的光照与黑暗交替刺激，每个周期为光照2分钟、黑暗2分钟，总时长12分钟。采用Noldus行为记录系统（Noldus信息技术公司）监测每尾幼鱼的活动情况。测试室温度控制在25±0.5℃。通过EthoVision XT16软件（Noldus信息技术公司）对视频中的幼鱼活动轨迹进行分析。

趋光性测试

紫外线照射24小时后，从上述各组中随机选取斑马鱼幼鱼（受精后96小时），每组30尾，转移至不同的玻璃培养皿中。将玻璃培养皿放置在一个黑白对半的圆形区域上，以模拟明暗环境。每组幼鱼通过挡板限制在培养皿的暗侧。移开挡板后，用摄像机记录幼鱼1分钟的行为，同时记录并分析暗侧和亮侧的幼鱼数量。

斑马鱼幼鱼眼细胞的凋亡检测

采用吖啶橙（AO）染色法检测斑马鱼幼鱼的凋亡位点。紫外线照射24小时后，从每组中随机选取幼鱼（96小时受精后，每组3条），转移至AO溶液（5微克/毫升，霍尔特弗雷特溶液）中。于28.5℃避光染色30分钟后，用新鲜的霍尔特弗雷特溶液洗涤幼鱼三次，以去除多余的AO。随后，用0.03%甲磺酸三卡因（MS-222）麻醉幼鱼2分钟，并固定在3%甲基纤维素中。调整幼鱼头部位置，使双眼处于同一垂直平面且相互重叠。通过激光扫描共聚焦显微镜观察眼部凋亡细胞。采用Image J软件对定量数据进行分析。

斑马鱼幼鱼眼睛的组织学分析

紫外线照射24小时后，将96小时 post-fertilization（hpf）的幼虫固定在4%多聚甲醛溶液中，然后进行石蜡包埋，并用苏木精-伊红（H&E）染色。通过数字病理切片扫描系统观察幼虫眼睛的组织学形态。定量数据为使用 Image J 软件进行分析。

急性眼刺激性试验

将8只BALB/C小鼠（7周龄，体重16-20克，雌性）随机分为四组，每组4只眼。随后，向小鼠眼部滴加PVA水溶液（2微升，生理盐水配制，浓度10%）和PVA-SA水溶液（2微升，生理盐水配制，浓度10%）。以生理盐水处理组作为空白组，以十二烷基硫酸钠（SDS，2微升，生理盐水配制，浓度10%）处理组作为对照组。孵育5分钟后，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗处理过的眼部三次。在不同时间点（0.5小时、1小时、1.5小时、24小时、48小时和72小时）拍摄照片并进行角膜荧光素钠染色检测。

随后，在给药72小时后处死小鼠，收集其眼睛分别进行苏木精-伊红（H&E）染色、免疫荧光染色（使用肿瘤坏死因子-α单克隆抗体，Proteintech公司产品：类别为适用于蛋白质印迹法（WB）、免疫组织化学法（IHC）、免疫荧光/免疫细胞化学法（IF/ICC）、免疫荧光-石蜡（IF-P）、酶联免疫吸附试验（ELISA）的肿瘤坏死因子-α单克隆抗体；货号60291-1-lg；克隆号7B8A11；小鼠源/免疫球蛋白G2b亚型）、白细胞介素-6多克隆抗体（Proteintech公司产品：类别为适用于蛋白质印迹法（WB）、酶联免疫吸附试验（ELISA）的白细胞介素-6多克隆抗体；货号26404-1-AP；兔源/免疫球蛋白G亚型）以及脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记（TUNEL）染色。

角膜荧光素染色评分

用1%的荧光素钠染色90秒后，在每个时间节点（0.5小时、1小时、1.5小时、24小时、48小时和72小时），使用裂隙灯配合钴蓝光对每组（每组4只眼）的角膜上皮进行评估。将角膜分为四个象限，分别进行评分。单眼的最终评分为各象限评分之和。评分标准：0分，无染色；1分，染色点少于30个；2分，染色点超过30个且无弥散现象；3分，存在明显的弥散性染色但无斑块状染色；4分，出现斑片状染色。

PVA-SA 的眼部滞留时间

18只BALB/c小鼠（7周龄，体重16–20克，雌性）被随机分为6组（每组6只眼），并用PVA-SA处理（2微升，100毫克/毫升，溶于生理盐水）。以生理盐水处理（2微升）的小鼠作为空白对照组。在给予PVA-SA后的不同时间点（10分钟、20分钟、30分钟、60分钟和90分钟），对小鼠实施安乐死，收集其眼球并浸泡在生理盐水中。（2 mL）1 h，然后，用荧光光度计测量含眼溶液的荧光强度（((lambda_{ex}=)365 nm，(lambda_{em}=442 ~nm)=442 nm），通过减去空白组的溶液荧光对不同时间点的荧光强度进行归一化，以监测不同时间点眼睛中PVA-SA的量。

PVA-SA 对小鼠视网膜的紫外线防护作用

我们将9只BALB/C小鼠（7周龄，体重16–20克，雌性）随机分为三组，每组6只眼。随后，向BALB/C小鼠的眼中滴入PVA-SA溶液（100毫克/毫升，生理盐水配制），再将眼部暴露于紫外光（365±3纳米，(60,000 ~J / m^{2})）下120秒（相当于阳光中平均紫外剂量的1.2–6年）。以健康小鼠和仅暴露于紫外光但未做任何处理的小鼠分别作为空白组和对照组（紫外光组）。

紫外线照射24小时后，对小鼠实施安乐死，将其眼球固定于4%多聚甲醛溶液中，随后进行石蜡包埋并采用苏木精-伊红染色法染色。同时收集眼球用于白细胞介素-6的免疫荧光染色，定量数据通过Image J软件进行分析。

PVA-SA 的体内急性毒性

(PVA-SA)对BALB/C小鼠（7周龄，16-20 g，雌性）的体内毒性通过静脉注射PVA-SA（30 mg，盐水中）对小鼠（12只小鼠/组）进行评估。小鼠（6只小鼠/组）在给予PVA-SA后3天通过二氧化碳窒息安乐死。收集血液并通过离心（3000 rpm，30 min，20 C）分离血清，通过自动生化分析仪（Sinnowa，南京，中国）在37下测量AST、ALB、尿素和crea值；通过H&E染色分离主要器官（心、肺、肝、肾和脾）用于组织学研究。健康小鼠作为空白。注射后7天，其余小鼠（6只小鼠/组）处死并用相同的方法进行测试。注射PVA（30毫克，盐水）的小鼠进行类似的测试。

PVA-SA 的体内长期毒性

将10只BALB/C小鼠（7周龄，体重16-20克，雌性）随机分为两组，每组5只小鼠，共10只眼睛。向小鼠眼部每日滴注生理盐水（2微升）和PVA-SA溶液（2微升，生理盐水配制的10%浓度），每次滴注间隔12小时（上午8点和晚上8点各一次），持续14天。分别于第(3rd)天、(7^{th })天和(14^{th })天拍摄照片并进行角膜荧光素钠染色检测。随后，在给予PVA-SA或生理盐水14天后，通过二氧化碳窒息法处死小鼠。收集其眼球，分别进行H&E染色以及TNF-α、IL-6免疫荧光染色和TUNEL染色。采集血液并通过离心（3000转/分钟，30分钟，20℃）分离血清，在37℃下使用全自动生化分析仪（南京 Sinnowa公司）检测AST、ALB、尿素和肌酐值；分离主要器官（心脏、肺、肝脏、肾脏和脾脏），通过H&E染色进行组织学研究。

SA的细胞毒性

采用CCK-8法评估SA的细胞毒性。简要来说，将HCE-T细胞（((~ 1 ×10^{5} cells / mL))）以100微升的体积接种于96孔板的HCE-T完全培养基中。细胞贴壁后，用PBS洗涤，随后在不同浓度（0.1−2 mg/mL，溶于0.2%体积分数的二甲基亚砜/培养基中）的SA作用下孵育。24小时后，用PBS洗涤细胞，再加入100微升含10% CCK-8的培养基培养2小时，随后进行观察。将该板放入酶标仪（(VICTOR ^{TM}) X3 珀金埃尔默2030多标记微孔板读数仪）中，记录450纳米处的吸光度。以仅用培养基培养的细胞（100%）作为阳性对照，无细胞的培养基（0%）作为阴性对照，通过与两者对比计算细胞活力。

SA的细胞抗紫外线保护作用

采用CCK-8法评估了SA对细胞的紫外线保护作用。简要来说，将HCE-T细胞（(~ 1 ×10^{5}) 个/毫升）接种于96孔板中，加入100微升HCE-T完全培养基。细胞贴壁后，用PBS洗涤，并在100微升含0.2毫克/毫升SA的培养基中孵育。随后，分别用UVA（365±3纳米，(20 ~mW / cm^{2})，照射10分钟）和UVB（312纳米，(125 mu W / cm^{2})，照射40分钟）对细胞进行照射。细胞实际接收的UVA和UVB照射剂量分别为120000焦耳/平方米（(120,000 ~J / m^{2})）和(3,000 ~J / m^{2})。照射结束后，细胞用PBS洗涤，在新鲜培养基中孵育24小时。之后，将细胞置于100微升含10% CCK-8的培养基中培养2小时，再进行观察。将该96孔板放入酶标仪（(VICTOR ^{TM}) 珀金埃尔默X3 2030多标记酶标仪）中，记录450纳米处的吸光度。将结果与阳性对照组（仅用培养基培养的细胞，设为100%）和阴性对照组（无细胞，设为0%）进行比较计算细胞活力。