题目：Schisandrin B alleviates high-glucose diet-induced oxidative stress, inflammation, and tissue injury in zebrafish and is associated with alterations in intestinal microbiota

原文链接：https://doi.org/10.3389/fvets.2026.1767061

期刊：frontiers in Veterinary Science

摘要

据报道，高糖饮食（HGD）会改变肠道微生物群，并诱发慢性炎症和氧化应激。本研究表明，五味子醇甲B（SchB）可显著减轻高糖饮食诱导的斑马鱼生理紊乱，重点涉及肝脏、肠道、大脑和视网膜等多种组织。结果显示，五味子醇甲B能减轻高糖饮食诱导的氧化应激、炎症反应和组织损伤。五味子醇甲B与降低活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平以及提高超氧化物歧化酶（SOD）活性相关。此外，经五味子醇甲B处理的组别中，氧化应激相关基因（Nrf2和HO-1）及炎症标志物（IL-1β、IL-8、TNF-α和Myd88）的mRNA表达水平得到显著调控。肠道微生物群分析表明，五味子醇甲B可提高微生物群的丰富度和多样性，并部分恢复高糖饮食诱导的微生物群失调。总体而言，这些研究结果表明，在高糖饮食条件下，五味子醇甲B对斑马鱼具有抗氧化和抗炎作用，且这些保护作用与肠道微生物群结构的改善相关。

关键词：高糖饮食、炎症、肠道微生物群、氧化应激、五味子醇甲B

引言

高糖饮食（HGD）与糖尿病、肥胖症和心血管疾病等多种代谢疾病的发病密切相关。来自动物和细胞研究的越来越多证据表明，高葡萄糖暴露会引发持续性炎症和氧化应激，进而激活多种促炎介质，包括白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-8（IL-8）等细胞因子。此外，长期高血糖会增强葡萄糖氧化并促进蛋白质的非酶糖基化，氧化糖基化蛋白随后会进一步降解，最终导致自由基的过量产生。在氧化与抗氧化反应的背景下，细胞内活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）以及超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶是高糖暴露触发的促炎信号通路。

氧和氮衍生的自由基对需氧生物至关重要，活性氧参与维持组织和细胞内氧化还原稳态的基本生化过程。生理健康对生物而言至关重要。然而，过量的氧化应激会损伤脂质、蛋白质和DNA，最终损害生物机体的健康。当促氧化过程与抗氧化防御之间的平衡被打破时，便会发生氧化应激，导致碳水化合物、脂质、蛋白质和核酸等细胞内大分子降解。这随后会造成器官和组织损伤以及功能障碍，进而导致氧化产物进一步积累，加剧损伤并形成恶性循环。核因子红细胞系2相关因子2（Nrf2）是一种氧化还原响应性转录因子，广泛表达于不同细胞类型中。Nrf2通路调控超过600个基因的表达，其中200多个基因编码的蛋白质与炎症、肿瘤发生、神经退行性疾病、衰老、心血管疾病及其他重大疾病相关。通过调控多个下游靶点，Nrf2介导多种保护作用，如抗炎反应、减轻钙超载以及抗氧化应激活性。血红素氧合酶-1（HO-1）是Nrf2调控的关键且被广泛研究的抗氧化基因。它与胆绿素还原酶结合释放胆红素，胆红素是最有效的内源性抗氧化剂之一，能有效中和活性氧（ROS）和活性氮（RNS）。抗氧化防御系统有助于抵消高血糖诱导的氧化应激所造成的病理性损伤，并能延缓胰岛素抵抗的进展。

肠道微生物群落因其在宿主代谢和免疫调节中的关键作用，与多种代谢性疾病的发生和发展密切相关。众所周知，高糖摄入会改变肠道菌群组成，并促进肥胖和代谢性疾病的发生。对肠道微生物群进行饮食调控会升高细菌脂多糖（LPS）的循环水平，这与胰岛素抵抗的发展以及糖耐量异常密切相关。此外，微生物来源的脂多糖与炎症反应及代谢性疾病的进展紧密相关。

在中医理论中，五味子素（Sch）是一类具有生物活性的木脂素，主要包括五味子素A、B和C，因其广泛的预防和治疗特性而受到认可。近期的药理学研究表明，五味子素B具有多种生物学效应，包括保肝、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤和抗焦虑作用。实验证据进一步显示，五味子素B能够提高细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性，抑制脂质过氧化，降低乳酸脱氢酶和丙二醛（MDA）水平，从而减少活性氧（ROS）的积累，直接清除自由基，并发挥强效的抗氧化功能。事实上，在相同浓度下，五味子素B对氧自由基，尤其是羟自由基的清除效果显著强于维生素C。

鉴于高糖饮食会破坏氧化还原稳态、激活炎症信号通路并诱导肠道菌群失调，因此制定有效策略来对抗这些病理过程具有重要意义。研究表明，SchB 能够增强抗氧化酶活性、抑制脂质过氧化并调节炎症介质。然而，SchB是否能同时减轻高葡萄糖饮食（HGD）诱导的氧化应激、减弱炎症反应并恢复肠道菌群组成，尚未得到系统研究。因此，本研究采用高葡萄糖饮食诱导的斑马鱼模型，全面评估SchB对肝脏、肠道、大脑和视网膜的保护作用，以及其对促炎细胞因子表达和肠道微生物群落相关变化的影响。这些研究结果有望有助于更深入地了解SchB作为营养干预手段在预防或缓解葡萄糖诱导的代谢紊乱方面的潜力。

结果

氧化与抗氧化指标

图1显示，与对照组相比，HGD组视网膜、大脑和肝脏中的活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平显著升高，超氧化物歧化酶（SOD）活性则明显降低。补充鼠李糖槲皮素（SchB）后（HGD+SchB组），肝脏、大脑和视网膜中的MDA水平分别下降约64%、44%和57%，这些组织中的ROS水平也分别下降约40%、30%和37%。与此同时，视网膜、大脑和肝脏中的SOD活性分别提高了约61%、79%和52%。

补加SchB可减轻HGD诱导的Nrf2/HO-1通路激活

图2显示，HGD显著上调了斑马鱼肝脏、大脑和视网膜中Nrf2和HO-1的表达对照组。补加五味子乙素可有效缓解这一氧化应激反应。与高脂高糖饮食组相比，高脂高糖饮食+五味子乙素组的所有检测组织中核因子E2相关因子2的表达均显著降低，同时血红素氧合酶-1的表达也相应下降。

图1 斑马鱼组织中的氧化与抗氧化指标。(A) 肝脏、大脑和视网膜中的丙二醛（MDA）含量；(B) 肝脏、大脑和视网膜中的超氧化物歧化酶（SOD）活性；(C) 肝脏、大脑和视网膜中的活性氧（ROS）水平。数据以平均值±标准差表示。(*p<0.05) 与对照组相比；("p<0.05) 与高糖组（HGD）相比。

图2（B）肝脏、大脑和视网膜中HO-1表达的倍数变化。结果以平均值±标准差表示。(*p<0.05) 与对照组相比；(p<0.05) 与cHGD组相比。五味子乙素对斑马鱼氧化应激相关基因mRNA表达的影响。（A）肝脏、大脑和视网膜中Nrf2表达的倍数变化。

五味子乙素的抗炎作用

与对照组相比，高糖饮食（HGD）暴露显著提高了肝脏、大脑和视网膜中IL-1β、IL-8、TNF-α和Myd88的表达水平。相比之下，SchB补充剂有效缓解了这种炎症激活。在高糖饮食+SchB组中，三种组织中IL-1β、IL-8、TNF- (alpha,)和Myd88的表达均显著降低，表明SchB具有显著的抗炎作用（图3）。

肝脏和肠道形态学观察

肝脏和肠道的组织学结果如图4所示。与对照组（图4A）相比，高脂饮食组（HGD组）的肝脏出现明显的空泡变性和显著的炎症细胞浸润（图4B）。仅给予五味子乙素（SchB）组未观察到明显的肝脏损伤（图4C）。给予五味子乙素可减轻高脂饮食诱导的肝脏空泡变性和炎症反应（图4D）。在肠道方面，对照组肠道形态正常（图4E）。与对照组相比，高脂饮食组肠道结构受损，表现为肠壁变薄、肠绒毛缩短。（图4F）。单独使用SchB的组未出现明显的肠道损伤（图4G）。补充SchB后，与HGD组相比，肠绒毛高度和肠壁厚度均显著增加（图4H）。

施氏大棘鳅对肠道菌群α多样性的影响

为评估微生物丰富度的变化，我们将ACE和Chao1两种估计方法应用于肠道微生物群落。计算得到的Chao1值范围约为110至230，而ACE值则在102至221之间波动（图5）。单因素方差分析显示，各组间的Chao1和ACE指数存在显著差异（((p<0.05))）。与对照组相比，高脂饮食组的微生物丰富度显著降低，而补充五味子乙烷后，微生物丰富度得到部分恢复。

研究人员还利用香农指数和辛普森指数进一步评估了群落的整体多样性。香农指数的范围约为1.9–5.2，而辛普森指数（优势度形式）在所有样本中的取值介于0.28至0.80之间。单因素方差分析显示，不同组之间的辛普森指数和香农指数存在显著差异（((p<0.05))）。与高葡萄糖饮食（HGD）组相比，摄入补肝汤（SchB）的斑马鱼香农多样性指数升高，辛普森指数值降低，这表明其群落均匀度得到改善，特定类群的优势度降低（图5）。相比之下，长期暴露于高葡萄糖饮食会显著抑制香农多样性并使辛普森指数值升高，这反映出生态复杂性降低和微生物群落失衡。总体而言，这些结果表明，补骨脂乙素可减轻高糖饮食诱导的肠道微生物多样性损伤，并有助于恢复更平衡的肠道菌群。

微生物群落组成

对每个实验组在门和属水平上的肠道微生物群落操作分类单元（OTUs）进行了分析。在门水平上，变形菌门、放线菌门、疣微菌门和厚壁菌门这四个优势类群占所有样本中序列的大部分（图6A）。然而，这些主要类群的相对丰度不同饮食处理组间存在显著差异。高葡萄糖喂养与变形菌门的显著富集相关，变形菌门通常与肠道菌群失调和炎症性疾病有关。值得注意的是，在补充SchB的斑马鱼中，这种富集现象被显著减弱（图6C-G）。相比之下，疣微菌门和厚壁菌门在高葡萄糖饮食暴露下相对丰度降低，但在SchB处理后部分恢复。

在属水平上，气单胞菌属、鲸杆菌属、分枝杆菌属、梭杆菌属和不动杆菌属是所有实验组的优势类群（图6B）。尽管如此，它们的相对贡献在响应____时存在显著差异饮食性葡萄糖升高及SchB干预效果。喂食高葡萄糖饮食（HGD）的斑马鱼显示气单胞菌属显著扩增，该菌属是常与肠道菌群失衡相关的机会致病菌属，同时其红细菌属的占比有所降低，且梭杆菌属。相比之下，补充SchB与气单胞菌属丰度的显著降低以及嗜水气单胞菌属和梭杆菌属水平的相应升高相关（图6H-L）。

图3 SchB对斑马鱼组织中inflammation-related基因表达的影响。（A-L）代表不同处理斑马鱼不同器官中inflammation-related基因（IL-1β、IL-8、TNF-α和Myd88）的表达水平。数据表示为平均值±SD。(*p<0.05)vs. ontrol组；(p<0.05)vs.cHGD组。

图4 斑马鱼肠道和肝脏的组织学分析。(A、E) 对照组；(B、F) 高脂饮食组；(C、G) 虾青素组；(D、H) 高脂饮食+虾青素组。

图5不同实验组斑马鱼肠道菌群的丰富度和多样性。（A）超1指数；（B）ACE指数；（C）香农指数；辛普森指数（优势形式）。数据以四分位数范围（(In=3)）的中位数表示。组间差异采用单向方差分析，然后采用Tukey的多重比较检验。方框上不同的字母表示显著差异（(<0.05>)

图6 不同组斑马鱼肠道菌群在门水平（A）和属水平（B）的结构与组成。（C-G）各组中代表性差异细菌门的相对丰度。（H-L）各组中代表性差异细菌属的相对丰度。数据以平均值±标准差表示。柱形上方不同字母表示组间存在显著差异（(<0.05)）

β多样性与潜在致病性分析

采用主坐标分析（PCoA）评估β多样性。图7展示了对照组和处理组鱼肠道微生物组的明显聚类。基于Bray-Curtis距离的PCoA分析显示，各组微生物群落存在明显聚类。置换多元方差分析（PERMANOVA）证实群落结构存在显著差异（((p<0.01))）。BugBase分析表明，补服五味子多糖（SchB）显著降低了肠道微生物群中潜在致病菌的相对丰度，并提高了胁迫耐受表型的比例。

讨论

血糖的持续升高会引发一系列有害反应，其中毒性活性物质发挥着核心作用。这会产生氧化应激，对脂质、蛋白质和DNA等多种生物分子造成损伤，导致显著的代谢功能障碍，这与以往的研究报告一致。糖毒性指的是血糖升高和过量摄入碳水化合物对细胞及组织产生的有害影响。高碳水化合物饮食会促进关键生脂酶的表达，进而推动肝脏脂肪合成，引发肝脂肪变性。近期研究还表明，糖毒性可通过触发内质网应激损伤肝细胞，最终导致肝细胞功能障碍和细胞死亡。此外，高血糖引发的氧化应激会加重肝损伤，多项以糖尿病动物模型为对象的研究均证实了这一点。

大脑是一种能量需求极高的器官，其功能依赖于通过糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化实现的高效三磷酸腺苷（ATP）生成。在高血糖状态下，还原糖可与蛋白质上的赖氨酸残基发生反应，生成晚期糖基化终末产物（AGEs）。来自人体研究和实验动物模型的大量证据表明，高血糖和低血糖均能诱发大脑的改变结构并损害神经认知功能。1型和2型糖尿病患者均出现的血糖持续升高，会引发影响神经系统、血管内皮和肾脏的慢性并发症。氧化应激通过促进细胞损伤和功能障碍，是这些糖尿病并发症发生与发展的关键因素。与这些研究结果一致，本研究发现高糖饮食会在斑马鱼的肝脏、视网膜和大脑中诱发明显的氧化应激相关细胞损伤，进一步凸显了糖毒性诱导的氧化应激对多个器官的有害影响。本研究中，高糖饮食组作为疾病模型，对照组则代表生理基线状态。该模型的可靠性体现在氧化应激指标、炎症基因表达、组织病理学和肠道菌群特征均出现一致的变化。

高血糖会激活多元醇通路，导致醛糖还原酶上调和山梨醇蓄积。这一级联反应通过增加NADPH消耗以及活性氧和活性氮的大量生成，引发氧化应激。抗氧化剂可保护细胞过程中关键分子不被氧化，并使细胞免受氧化应激诱导的损伤。 利用培养肝细胞开展的体外研究以及啮齿动物体内实验已证实，五味子乙素具有降血脂、抗氧化、抗内质网应激及抗炎的特性。此外，越来越多的证据表明五味子乙素具有神经保护作用，这在很大程度上归因于其能够减轻氧化应激介导的神经元损伤。

研究表明，黄芪甲苷（SchB）可抑制白介素-α72a16c0-2c9a-4dbe-ab16-a52e52ce1a6f和肿瘤坏死因子(-(x)的蛋白表达，并降低缺血半暗带区基质金属蛋白酶-2/9的磷酸化水平。因此，它能对大脑炎症起到保护作用，并防止金属蛋白酶的降解。此外，黄芪甲苷（SchB）还能通过抑制肿瘤坏死因子-α、白介素-6和前列腺素E2等促炎细胞因子的产生，减弱小胶质细胞介导的炎症反应。本研究发现，经黄芪甲苷（SchB）处理的实验组中，炎症因子水平发生了显著变化。这些结果支持了我们的假设，即黄芪甲苷（SchB）具有强效的抗炎作用，这与参与高糖饮食（HGD）诱导炎症反应的多种关键炎症介质表达降低有关。

图7 不同斑马鱼组肠道微生物群的β多样性及预测潜在致病性。(A) 基于Bray-Curtis距离的属水平细菌群落主坐标分析（PCoA）。组间差异通过PERMANOVA进行统计学评估。(B) 利用BugBase推断的肠道微生物群预测潜在致病表型。

此外，研究表明五味子乙素（SchB）可通过降低丙二醛（MDA）水平、增强超氧化物歧化酶（SOD）活性来减轻氧化应激，从而预防后肢缺血/再灌注诱导的肌肉损伤。值得注意的是，五味子乙素还具有组织特异性的抗氧化作用，在脑组织中也不例外。在本研究中，五味子乙素处理显著改善了氧化应激和炎症状态，表现为多种组织中超氧化物歧化酶水平升高，活性氧（ROS）和丙二醛水平降低。核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路极为复杂，因其处于广泛调控网络的核心位置。其表达与细胞内氧化应激程度密切相关。在其下游通路中，Nrf2/血红素加氧酶1（HO-1）轴是几乎所有细胞类型中都存在的关键抗氧化防御机制。血红素加氧酶（HO）系统包含三种同工酶：HO-1、HO-2和HO-3，三者均具有相同的催化活性。本研究中，高糖饮食激活了Nrf2和HO-1的水平，表明高糖会诱导细胞产生氧化应激。而五味子乙素能够恢复高糖饮食导致的Nrf2和HO-1表达升高，这提示五味子乙素可能有助于维持细胞的氧化还原平衡，不过Nrf2/HO-1通路的确切作用仍需进一步研究。

肝脏和肠道是鱼类消化及营养吸收的关键器官。在本研究中，高葡萄糖饮食（HGD）会使这两种组织出现明显的病理改变，包括肝细胞损伤、肠绒毛缩短以及肠壁变薄。与之相反，五味子乙素（SchB）对肝细胞和肠道形态展现出明确的保护作用。越来越多的证据表明，肠道菌群是肥胖及相关代谢性疾病的重要决定因素，这些疾病包括血脂异常、炎症和糖耐量受损。既往研究表明，高葡萄糖饮食（HGD）或高果糖饮食（HFD）会降低肠道菌群的丰富度和多样性，常导致小鼠肠道中变形菌门的丰度升高，而放线菌门的比例降低。本研究中，高葡萄糖饮食（HGD）显著降低了斑马鱼肠道菌群的丰富度和多样性。在门水平上，高葡萄糖饮食（HGD）提高了变形菌门的相对丰度，同时降低了厚壁菌门的丰度；在属水平上，高葡萄糖饮食（HGD）使气单胞菌属等机会致病菌的丰度升高，而鲸杆菌属等有益微生物的丰度降低，这或许可以解释高葡萄糖饮食（HGD）组中观察到的致病潜力增强的现象。相反，补充五味子乙素（SchB）则提升了肠道菌群的丰度和多样性，减少了机会致病菌的相对丰度，并促进了有益菌群的增殖。这些研究结果表明，在高葡萄糖饮食条件下，补充五味子乙素（SchB）与肠道菌群组成的显著改善密切相关，而这也与氧化应激和炎症反应的减轻相契合。尽管本研究观察到了微生物多样性和组成的明显改变，但并未对特定细菌类群与宿主表型之间的关系进行直接相关性分析。因此，肠道菌群在五味子乙素（SchB）保护作用中的贡献，应被视为一种强关联关系，而非已证实的因果关系。

结论

综上所述，本研究表明，五味子乙素（SchB）可减轻高糖饮食（HGD）诱导的斑马鱼炎症、氧化应激以及肝脏和肠道损伤，同时肠道菌群的组成及结构特征也发生显著改变。补充五味子乙素可提高微生物的丰富度和多样性，降低了机会致病菌的相对丰度，同时提高了有益菌分类群的丰度。重要的是，氧化应激和炎症反应的改善与肠道微生物群结构的同步变化密切相关。综合来看，这些研究结果表明，黄芪甲苷（SchB）对高脂饮食诱导的斑马鱼生理功能障碍具有保护潜力，也为其在营养和医药领域的进一步研究提供了理论依据。

材料与方法

鱼类

成年野生型斑马鱼（斑马鱼，4月龄，体重0.40±0.05克）购自中国武汉的中国斑马鱼资源中心（CZRC）。实验开始前，这些鱼被饲养在中国武汉金水海洋生物设备有限公司提供的台式水生系统中，在28±1℃的温度下，以12小时光照/12小时黑暗的周期饲养至少14天。

饲料制备与取样

SchB（((purity > 98%))）和D-葡萄糖购自美国密苏里州圣路易斯市的Sigma-Aldrich公司。SchB先溶解于二甲基亚砜（DMSO），再按指定浓度直接混入基础饲料中，制备得到添加SchB的饲料。对照组和高葡萄糖饮食（HGD）饲料中均加入等体积的DMSO，以排除溶剂本身可能带来的影响。体内毒性评估实验中，斑马鱼连续28天暴露于不同剂量的SchB（10、20、30、40、50和100毫克/千克），每个剂量组设置30条鱼。每日监测斑马鱼的存活率、行为变化（如游泳活动、摄食行为）以及整体健康状况。结果显示，剂量不超过30毫克/千克时，未观察到显著的死亡率或异常行为变化。基于上述结果，后续饲喂实验选取30毫克/千克作为实验剂量。

共360条斑马鱼被随机分为四个实验组：第1组（基础饲料组，对照组）、第2组（高糖饲料组，HGD）、第3组（基础饲料添加30毫克/千克五味子乙素组，SchB组）、第4组（高糖饲料添加30毫克/千克五味子乙素组，HGD+SchB组）。每组设置三个生物学重复，每个重复30条鱼。

对照组饲料的配方中不添加额外葡萄糖。高葡萄糖饲料（HGD）是在基础饲料中添加15%（重量比）葡萄糖配制而成的。该添加比例参考了鱼类营养学的既往研究，在这类研究中，高碳水化合物饲料通常含有约45%的总碳水化合物。考虑到本研究使用的基础饲料中碳水化合物含量约为30%，因此额外补充葡萄糖以提高碳水化合物水平并诱导代谢应激。

在投喂期的第28天，从每个养殖桶中随机取样4条鱼，使用50毫克/升的MS222（美国密苏里州圣路易斯市Sigma Aldrich公司）进行麻醉。进行生化测定、基因表达分析和组织学检查时，取组织（肝脏、肠道、大脑）以及视网膜）均从单条鱼体中采集，每个重复设置四个生物学样本（((n=4))）。进行微生物群分析时，将每个重复中四条鱼的肠道内容物混合制成一份复合样本，每组最终获得三个生物学重复（((n=3))）。所有样本均即时采集，经液氮快速冷冻后，于-80℃条件下保存，以待后续分析。

组织抗氧化指标

根据制造商的说明，使用商业检测试剂盒（中国南京建成生物工程研究所）测定了不同组织中活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）的水平以及超氧化物歧化酶（SOD）的活性。

选择视网膜进行抗氧化剂分析，是因为它对氧化应激高度敏感，且适合作为全身性氧化损伤的指标。

实时定量聚合酶链式反应

按照制造商的说明书，使用 TRIzol 试剂（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司）从组织中提取总 RNA。通过分光光度法测定 RNA 的浓度和纯度。使用逆转录试剂盒（中国南京诺唯赞生物科技股份有限公司）合成互补脱氧核糖核酸（cDNA）。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）系统，以 SYBR Green 染料为化学试剂进行定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）。基因特异性引物列于表1。以β-肌动蛋白为内参基因，采用2^ΔΔCt法计算相关基因的相对表达水平（包括白细胞介素-1β、白细胞介素-8、肿瘤坏死因子-α、髓样分化因子88、核因子E2相关因子2和血红素氧合酶-1）。

组织学分析

将肠道和肝脏组织置于4%多聚甲醛中固定24小时，经梯度乙醇系列（50%至95%）脱水后，进行石蜡包埋处理。将石蜡块切成5微米厚度的切片，并用苏木精-伊红（HE）进行染色。观察肠道组织和肝细胞的形态，并使用BX53显微镜（日本东京奥林巴斯公司）拍摄相关图像。

肠道微生物群分析

使用细菌DNA提取试剂盒（美国诺克斯维尔的Omega公司）提取肠道细菌的微生物基因组DNA。在50微升的PCR反应体系中，使用带条形码的引物338F和806R扩增细菌16S rDNA的V3-V4区。扩增程序为：95℃预变性1分钟，随后30个循环，每个循环包括95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸45秒，最后72℃终延伸10分钟。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离后，使用DNA凝胶回收试剂盒（美国诺克斯维尔的Omega公司）进行纯化。得到的扩增子随后在Illumina MiSeq平台上进行高通量测序。

使用 Mothur 软件包（v.1.30 版本）对序列读长进行质量控制和组装。随后，基于 97% 的序列相似性阈值，将处理后的读长聚类为操作分类单元（OTUs）。利用 Mothur 计算了基于丰度的覆盖度估计量（ACE）、Chao1、Shannon 以及 Simpson 指数等α多样性指标。基于属水平相对丰度数据计算的 Bray-Curtis 距离评估β多样性，并通过主坐标分析（PCoA）进行可视化。在功能表型预测方面，采用封闭参考法生成 OTU 表，并利用 BugBase 评估预测微生物表型的潜在致病性。

该测序数据已保存在中国国家生物信息中心（CNCB-NGDC）的基因组序列数据库（GSA）中，登录号为PRJCA062488。

统计分析

采用SPSS 26.0软件（美国伊利诺伊州芝加哥市SPSS公司）进行统计学分析。数据根据情况以均值±标准差或中位数及四分位数间距呈现。组间差异根据情况采用Student t检验或单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey多重比较检验。(A p-value <0.05)被认为具有统计学意义。