题目：Measuring morphogen transport over multiple spatial scales in live zebrafish embryos

原文链接：https://link.wtturl.cn/?target=https%3A%2F%2Fwww.nature.com%2Farticles%2Fs41467-026-73639-3&scene=im&aid=497858&lang=zh

期刊:Nature Communications

摘要

形态发生，即多细胞生物体的发育，由形态发生素（小型信号分子）调控，这些分子会在胚胎中形成浓度梯度。尽管这类梯度可通过多种机制形成，但稳定梯度的建立需要将形态发生素的扩散速率降低至少一个数量级，这一过程尚未被直接观测到。本文中，我们开发了基于单平面照明显微镜的空间荧光交叉相关光谱技术（SPIM-sFCCS），以直接测量早期斑马鱼胚胎中形态发生素Squint的扩散系数，并分析其随胚胎形貌和长度尺度的变化规律。Squint的扩散系数与其分子大小、间隙空间内的粘度以及可能存在的分子拥挤效应相关。研究发现，除上述通用参数外，Squint的扩散系数会在与胚胎细胞间隙直径相当的长度尺度上发生变化，且其扩散速率的降低受受体结合的调控，这一机制对梯度形成和胚胎模式建成至关重要。

引言

形态发生的核心是形态发生素的浓度梯度，它控制着细胞命运与模式。形态发生素的运动受其与细胞表面受体及细胞外基质相互作用的调控。这些相互作用触发关键下游基因、激活因子、抑制因子及降解通路的表达，所有这些共同在空间上塑造形态发生素梯度。因此，这些信号分子的迁移率是决定信号在胚胎中空间传播速率，以及生化信号通路和发育过程发生时间与位置的限制因素。因此，维持形态发生素跨空间的稳定转运动态，对于正常发育事件在正确的时间和地点发生至关重要。

为了将特定的位置信息传递到不同的细胞位置，形态发生素通过被动扩散[6]或主动运输（跨细胞转运[7]、[8]、[9]或细胞丝[10]）在空间中被转运。

在基于扩散的运输情况下，梯度的范围由扩散与配体降解速率的相互作用决定。梯度长度为sqrt{D / k}，其中D为扩散系数，k为配体的降解常数。尽管与配体抑制剂或其他形态发生原的相互作用，以及体积较大、易旋转分子固有的缓慢扩散也会影响梯度的形成，但这些机制的作用是改变有效运输或清除速率。

形态发生蛋白是低分子量的信号配体，因此具有较高的扩散系数(10-100 mu m^{2} / s)。此外，就现有数据而言，体内测得的降解率均较低(~ 10^{-4} / s)。这些参数会导致无效的梯度长度远大于胚胎。相应地，在较大区域内测得的整体形态发生蛋白扩散系数(D_{g l o b})比其局部扩散系数(D_{l o c})低一到两个数量级。从局部尺度到整体尺度，形态发生蛋白的扩散速度变慢这一现象出现在多种形态发生蛋白中，包括Nodals、Wnts、骨形态发生蛋白（BMP）和成纤维细胞生长因子（FGF）（及其中的参考文献），这对于在空间中建立稳定的浓度梯度至关重要。

已有多项体内研究证实了导致配体运动减慢的多种因素。曲折度，即细胞存在对粒子运动造成的阻碍，已被证明会减缓组织内分子的运动（及其中参考文献）。配体与细胞外基质成分结合或因这些成分的存在而受到物理阻碍，从而降低运动能力，这也被证明会导致形态发生素运动减慢。此外，有研究证实瞬时受体结合会通过减缓形态发生素在空间中的有效运动，从而阻碍其移动。事实上，已有研究表明，在合成配体-受体对中调节受体浓度能够影响配体的整体扩散率，且基于受体结合的阻碍足以在体内形成配体的合成浓度梯度。此外，研究人员还通过体内单粒子追踪技术证实了细胞外空间的几何结构会调节配体与受体的结合倾向。

尽管增速放缓的原因已得到充分证实，但每个因素对放缓的影响程度，以及这些因素共同阻碍技术普及的确切机制，仍需得到充分阐释。此外，持续的时间需要建立这些因素中的每一个产生从快到慢扩散转变的尺度。探索从分子大小依赖的迁移率向空间interaction-hindered迁移率转变的速率和规模可以更好地理解发生在特征长度尺度上的信号过程的速率，并有助于模拟发育过程。

为了了解形态发生素扩散减缓发生的程度和长度尺度，我们需要绘制出形态发生素扩散从局部到全局尺度的转变过程。然而，常用的体内形态发生素扩散测量技术无法覆盖所有空间尺度。利用光漂白后荧光恢复技术（FRAP）进行的 D_{glob } 测量，量化了扩散的荧光分子重新进入光漂白目标大区域（10-100 微米）时的荧光恢复速率。因此，该测量会受到组织形态或曲折度的影响，也会受到形态发生素与细胞外空间成分及细胞相互作用的影响（图1a-c）。另一方面，D_{loct }则通过单分子敏感技术进行测量。例如，体内荧光相关光谱技术（FCS） 量化了分子在共聚焦体积内进出扩散时荧光信号波动的时间跨度，但其测量范围受 to <1 mu m 限制。因此，该技术可获得不受阻碍的自由扩散系数，该系数仅由颗粒大小、粘度、温度以及可能的与细胞外基质的相互作用决定（图1c）。单粒子追踪技术（SPT）以极高的空间分辨率追踪单分子的时间轨迹。理论上，它可以追踪单分子的运动轨迹。但由于荧光团的光稳定性有限，单分子轨迹的长度很少超过几微米。上述两种技术均无法完全弥合局部与全局尺度之间的差距，因此中间长度尺度（1-10 微米）难以探测。因此，为了确定这些扩散调控因子的影响尺度并探究尺度依赖的转变过程，需要弥合局部 FCS 与全局 FRAP 测量之间介观尺度 (<10 mu m) 的空间信息差距（图1b、d）。

在本研究中，我们通过利用成像荧光相关光谱（Imaging FCS）中的空间互相关函数，探究从局域到全局长度尺度的迁移过程，以此填补这一信息空白。成像荧光相关光谱是一种荧光相关光谱（FCS）技术，它会照射样品的薄截面，并通过相机的快速读取，记录每个像素处由分子运动引起的强度波动。通过计算和评估像素自相关函数，该技术可提供扩散系数的空间分辨图谱。成像空间荧光互相关光谱（Imaging sFCCS）可采用相同方法实现，但其并非对每个像素的信号进行自相关，而是对不同距离的像素进行互相关。因此，成像空间荧光互相关光谱能够捕捉分子在图像内任意两点间扩散或流动的传输时间（图1d、e）。此前，空间荧光互相关光谱（sFCCS）主要通过双焦点荧光相关光谱或扫描荧光相关光谱技术实现，用于测量空间中两个不同点间的传输时间，进而获取目标分子的扩散系数或流速。然而，这类技术所获取的空间动力学信息仅局限于样品空间中的两个特定点或某一条线。基于成像技术的空间荧光互相关光谱，如对相关函数（pCF）分析和成像荧光相关光谱，能够实现更宽的空间范围捕捉任意像素组之间的动态变化。因此，它有助于获取有关分子相互作用的累积影响以及空间不同方向扩散障碍的信息，使人们能够将分子迁移率与环境的潜在微观结构关联起来。结合基于相机的荧光相关光谱技术（FCS），该方法已被用于探究活体中扩散动力学的空间依赖性异质性。

图 1 .不同空间尺度下的受阻扩散。a. 100 μm 尺度下的组织空间示意图。FRAP（光漂白恢复） 测量在此尺度开展（圆形覆盖区域），可同时捕捉组织迂曲度与受体结合对形态发生素扩散的共同阻碍作用。b. 组织放大空间示意图（图 1a 中方框区域），展示 20–30 μm 尺度下单细胞及其周边环境。形态发生素在细胞膜间的间隙中扩散，并与细胞表面受体发生相互作用。c. 细胞间隙进一步放大示意图（图 1b 中圆形区域），呈现由共聚焦显微镜观测体积决定的、衍射极限点（<1 μm） 的信息。在此尺度下，形态发生素可自由扩散，或与细胞外基质（ECM） 相互作用，从而在局部尺度阻碍其运动。d. 细胞间隙放大示意图（图 1b 中矩形区域），呈现 10 μm 尺度下两细胞间的膜间隙。形态发生素可与膜表面受体结合并短暂停留，在介观尺度阻碍其扩散。e. 空间互相关方法应用示意图，用于捕捉图 1d 中膜间隙内形态发生素在两个特定点间的转运信息。红色与蓝色互相关函数（CCF）曲线分别对应分子从白色框到红色框、白色框到蓝色框的转运过程。CCF 的峰值反映形态发生素在空间两点间扩散的平均转运时间；随着两点间距增大，峰值向更长时间偏移，因为分子需要更长时间扩散更远距离。此外，由于参与空间互相关的起始点分子集合重合概率降低，相关幅值会下降。

sFCCS 应用于光片成像数据的方法过去已被用于探究二维细胞膜上方向依赖性扩散及阻碍因素。本文中，我们展示了 sFCCS 在单平面照明显微镜（SPIM-sFCCS）中的三维应用，以探究三维环境中空间分布的有效扩散系数 (D_{e f f})。我们对 SPIM-sFCCS 现有的三维 FCS 拟合模型进行了修改，以考虑光片显微镜中像素间的信号串扰，从而实现空间上准确的信号 D_{eff } 估计。

我们运用SPIM-sFCCS技术研究形态发生因子Nodal的 Squint（Sqt）的动态变化，以捕捉其尺度依赖性的信号活动。Nodal信号对于斑马鱼早期胚胎的中胚层和内胚层诱导以及左右模式形成至关重要。由于Nodal在原肠胚形成过程中发挥重要作用，其动态变化和浓度梯度已得到广泛表征。Sqt是一种形态发生因子，因为它能以浓度依赖的方式在空间上诱导不同基因的表达。共聚焦荧光相关光谱（FCS）测定显示，Sqt的扩散系数为D_{l o c}，而荧光漂白恢复技术（FRAP）测定结果显示，其扩散系数可低至2 µm²/s。

尽管Sqt可能不会结合到细胞外蛋白聚糖上，这是因为其酸性残基使其具有更高的稳定性和较长的降解速率，但它能结合细胞表面受体Acvr2b、Acvr1a/1b以及共受体Oep。研究表明，Oep的过表达会增加Sqt的结合比例，并进一步降低D_{glob }；而同时敲低多种受体（Acvr1b-a/b）则会提高Sqt的D_{glob }。

受精后3-6小时，Nodal信号通路处于激活状态，此时囊胚组织中的细胞体积较大，且发生了多种组织层面的转变，形成了不同的组织密度。与后续阶段密度更高的组织不同，囊胚组织的细胞间隙明显更宽且大小不一，便于测量，这使其成为利用SPIM-sFCCS研究形态发生素减速机制的理想模型环境。

在此，我们首先利用类通道空间中的扩散模拟，探究并明确了细胞间间距的大小以及受体结合情况如何影响扩散规模与数值of D_{eff }。最后，我们通过实验验证了模拟结果。我们测量了不同长度下在细胞间隙间扩散的Sqt的D_{eff }，并发现只有当距离大于细胞间间距时，Sqt的扩散才会减慢并达到稳定态的扩散系数值。此外，敲除受体Acvr2b（此处使用的旁系同源物为Acvr2b-a，此前已被鉴定）或过表达抑制剂Lefty2，会使Sqt的稳定态D_{eff }升高至与分泌型EGFP（一种无相互作用的惰性蛋白）相近的数值，这表明受体结合会阻碍Sqt的扩散。

结果

计算机模拟受体结合

为了有效利用SPIM-sFCCS探究形态发生素在空间中减速的原因，我们首先确定了影响形态发生素扩散减速的物理化学因素。为此，我们模拟了结合可逆受体结合的形态发生素减速机制。我们将细胞间的空间建模为沿### 轴延伸的特定宽度的通道。尽管体内的细胞间隙宽度范围可从紧密连接处的(<100 ~nm)到宽细胞间隙中约10微米（与细胞直径相当），但我们采用0.5-5微米的通道宽度进行建模，以理解在与测量环境相似的空间中结合行为下的扩散过程。

模拟以0.01毫秒的时间步长运行了100,000步，得到1秒的模拟时间。所有模拟的粒子均从通道中部的(x, y)=(0,0)位置开始。粒子会随时间扩散，遇到通道壁时，会根据设定的结合概率（未特别说明时取值为0.9）发生结合或被反射。结合的粒子可按照设定的解结合概率（未特别说明时取值为0.01）解结合。这两个概率决定了受体的亲和力。D_{e f}是根据所有粒子在x方向的均方位移（RMSD）按固定时间间隔计算得出的（见图2a示意图）。

对于一个结合概率恒定为0.9、解离概率恒定为0.01的示例情况，不同宽度的通道在稳态下具有不同的有效扩散系数，且通道越窄，扩散系数D的降幅越大（5微米通道：降低至1.5倍，0.5微米通道：降低至8倍；见图2b）。在所有情况下，D_{eff }都能相对快速地收敛至稳态（在模拟时间的0.01至0.2秒内），且窄通道内的粒子比宽通道内的粒子更快达到稳态（补充图1a）。在空间域中，D_{eff }仅在距离大于通道宽度的位置收敛至稳态值（图2b）。总体而言，模拟结果显示扩散系数与通道宽度相关（图2b、c）。

将结合概率从0逐步调整至0.9，同时保持解离概率恒定为0.01，使稳态下的D_{eff }降低（补充图1b左和图1c左）。对于1微米的通道，结合概率设为最高值0.9时，扩散速度减慢了近5倍。当结合概率为0（即无结合发生）时，D_{eff }保持不变。相反，将解离概率从0.1降至0.001（反映出配体-受体亲和力提高），使扩散系数D显著降低（补充图1b右和图1c右）；当解离概率为0.001、结合概率为0.9且通道宽度为1微米时，扩散速度减慢程度接近50倍。即便结合概率为0.1、解离概率为0.001的组合，也使D降低了近3倍（补充图1c右）。对于给定的通道宽度，结合与解离概率的不同组合得到了相近的D_{eff }数值，表明结合和解离速率的协同效应影响着扩散。解离概率为0时，粒子无法在空间中分散，这凸显了可逆结合对于配体运输的必要性。

总体而言，这些模拟表明，通道样空间的几何限制促进了可逆结合，从而减缓了粒子在空间中的D_{eff }。基于这些模拟，在通道中测量一定距离内的D_{eff }，在受体存在结合的情况下，应得到与通道宽度相关的D_{eff }值。降低结合水平应增加D_{eff }，而在无结合的情况下，D_{eff }应保持不变，与通道宽度无关（图2c）。

图 2. 细胞膜间隙中结合型受阻扩散的模拟。a. 模拟中粒子在通道内扩散并与通道壁结合的示意图。一定时间内的有效扩散系数基于粒子在通道长度上的分布计算得出。b. 不同通道宽度下，有效扩散系数随距离的变化曲线。有效扩散系数从局部值下降，仅在由通道宽度决定的特定距离后才达到稳态值。c. 在 3.6 μm 固定距离下，不同模拟通道宽度与结合概率对应的有效扩散系数曲线（用于与图 5b、c 结果对比）。误差棒为 3 次独立模拟的标准差；实线为均值辅助线。若配体受到结合相关阻碍，稳态下的有效扩散系数依赖于通道宽度。

SPIM-sFCCS

首先，在组织中应用 SPIM-sFCCS 技术之前，我们推导了一种新的理论拟合模型用于数据分析。之所以需要该模型，是因为相邻相机像素间的串扰会产生伪自相关，要对数据进行正确评估就必须将这一因素考虑在内（图3a、b）。

众所周知，在多焦点共聚焦荧光相关光谱术（FCS）中，重叠的观测体积会导致探测器之间出现信号串扰。这种串扰源于激光束沿轴向穿过整个样品，产生的离焦荧光会被相邻的观测体积检测到。对相邻像素进行互相关运算时，由于像素会同时检测到同一分子，会出现伪自相关现象。通过在观测体积之间设置最小间距，可将这种串扰降至最低。

在SPIM-sFCCS中，这个问题的严重程度较低，因为光片具有有限的厚度，因此产生的离焦荧光更少。因此，未显示伪自相关的像素之间的最小距离更小。尽管如此，由于我们在SPIM-sFCCS中使用的是连续像素，像素之间的串扰可能会跨越相当大的距离，并在相关函数中引入伪自相关分量（图3a）。在我们的SPIM系统中，这种信号串扰可以在间距接近6个像素（2.4微米）的一对像素间被检测到（补充图2a）。

由于PSF_{x y}的观测体积重叠范围更大，串扰程度随其跨度的增加而增大（补充图2b）。由于较厚的光片会增加离焦贡献，串扰程度也会随光片厚度的增加而增大（补充图2c）。然而，在较大的分离距离下，信号串扰的影响并不显著（补充图2d）。

沃兰德等人（2010年）提出的拟合模型未考虑额外的串扰，也未考虑PSF_{x y}沿z方向的变化。该模型虽适用于自相关函数的拟合，却无法拟合互相关函数。

因此，我们基于Dertinger等人（2007年）的研究开发了一种改进的SPIM-FCS拟合函数，该函数通过将PSF_{x y}作为z的函数纳入模型来解释这种串扰，其原理与Rigler等人（1993年）中共聚焦显微镜观测体积的模型类似。附录C中给出了该拟合函数在x和y方向上任意分离距离及像素分箱情况下的推导过程（补充图3）。由于无法找到解析解，我们沿z轴对拟合模型进行了数值积分。数值模型中使用的步长经过优化，可准确拟合带有D>0.5 mu m^{2} / s的自相关函数（ACF）和互相关函数（CCF）（附录C-补充图4）。由于数值模型拟合的计算量较大，我们在图形处理器（GPU）上实现了数据拟合，使评估时间比基于中央处理器（CPU）的拟合缩短了60倍。

拟合模型针对不同距离和不同D值的3D模拟进行了测试。该模型能够捕捉不同距离（图3b）和不同扩散系数（图3c）下的额外串扰分量。对于自相关/互相关数据，拟合模型在模拟D值的20%误差范围内也能得出准确结果（图3d），准确拟合的空间范围取决于所测量的D值（详见“优化用于体内测量的SPIM-sFCCS”部分）。

将该模型应用于拟合溶液中荧光微球的 SPIM-sFCCS 测量的空间互相关（补充视频1），在考虑串扰导致的伪自相关分量增加的情况下，得到的扩散系数 D 在空间上保持恒定，与理论预期值的偏差在 20% 以内（图3e）。这些结果证实了该模型能够在三维空间中准确捕捉 D_{eff }。

图 3. 解决 SPIM-sFCCS 中的空间信号串扰问题。a. SPIM 观测体积示意图，展示观测体积在轴向发散区发生重叠，导致相机探测器上一对像素的探测体积在空间上重叠，进而产生信号串扰。由 BioRender 绘制。b. 模拟数据中不同间距下，改进拟合模型（实线）与原有模型（虚线）对平均互相关函数（散点）的拟合对比。间距以像素表示（1 像素 = 0.4 μm）。改进模型可捕捉短间距下的像素间信号串扰，原有模型则不能。c. 固定间距下，对不同模拟扩散系数的空间多点平均互相关函数（散点）与改进模型拟合曲线（实线）的对比。改进模型可在测试的扩散系数范围内，准确捕捉互相关函数中的信号串扰分量。d. 三维自由扩散模拟数据中，由空间平均互相关得到的扩散系数拟合结果。误差棒为 3 次独立模拟的标准差；实线为均值辅助线，虚线为真实值。改进模型可在一定间距范围内，准确获取多种扩散系数。e. 水中自由扩散荧光微球的自相关与互相关函数（蓝色）及对应拟合（红色）对比。GPU 加速的改进模型可捕捉短间距像素串扰，并给出空间恒定的扩散系数。

优化用于体内测量的SPIM-sFCCS技术

在将 SPIM-sFCCS 应用于活体实验之前，我们开发了数据评估策略以优化信噪比（SNR）。我们通过采集后对像素进行时空合并来实现这一目标，其中合并范围由待测量的特定浓度范围、扩散系数以及胚胎组织动态变化导致的有限测量时间共同决定。在荧光相关光谱术（FCS）中，信噪比会随记录的分子跃迁次数增加而提升。因此，延长测量时间可降低拟合参数的误差，并能在更长距离上实现准确的交叉相关函数（CCF）拟合（补充图5a、b）。同理，增大扩散系数能捕捉到更多的粒子跃迁，这同样能提升相关信号（补充图5c）并扩大拟合范围（图3d、补充图5d）。这一发现对本研究具有重要意义，因为斑马鱼配体在局部尺度的扩散系数范围为10-100 mu m^{2} / s。然而，对于高浓度的Ds（图3d中的60 mu m^{2} / s），由于相机的时间分辨率有限（约1毫秒），短距离（约0-3个像素）的估算结果准确性较差。

由于斑马鱼囊胚在受精后3至5小时处于动态变化状态，采用固定间隙空间和恒定膜间距的测量持续时间有限（受精后4小时为30至120秒，受精后5小时则少于20秒）。这些测量时长不足以提供SPIM-sFCCS测量所需的足够迁移统计数据。

为了改进SPIM-sFCCS采集后的信号统计数据，我们对两个感兴趣空间区域周围的像素进行了合并。像素合并增加了两个点之间被捕捉到的分子穿梭次数（图4a、补充图5e）。这反过来又提高了互相关函数的质量（图4b、c），以及所测扩散系数D的准确性和精密度（图4c、补充图5f）。

相关函数的振幅随噪声水平的升高而降低（补充图5g），并随每个分子的计数增加而升高（补充图5h）。为了在采集后提高信噪比，我们通过对帧进行时间分箱来增加采集曝光时间（图4d）。相关振幅有所增加，但其提升幅度不及每帧以同等增加的曝光时间进行采集时的提升幅度（图4e）。尽管如此，这种方法不仅可以在单次测量中同时使用短曝光和长曝光，还能降低来自……的偏差针对实验数据中长距离测量的短时滞时间拟合噪声（图4f）。

为了捕捉活体测量中的高速动态（测量流程参见方法/补充图6），我们根据所选感兴趣区域（ROI）的大小，以设备支持的最快帧率采集信号（曝光时间0.5毫秒至2毫秒，对应2000至500帧/秒）；同时使用比成像时更高的激光功率(60-600 ~W / cm^{2})，以确保每个分子能采集到足够的计数。对于互相关振幅较低的长距离测量（3.6-5.2微米），我们对帧进行时间合并，得到曝光时间为2-6毫秒的图像堆栈，从而提高信噪比以优化数据拟合效果。

细胞运动可产生对流，这会导致偏离简单扩散（补充图7a）。由于对流具有方向性，相关相关函数（CCFs）将取决于计算方向。只有当正向和反向相关函数（CCFs）给出相同的扩散系数时，才能假设不存在流动或定向输运（图4g）。正向与反向扩散系数（D）之间的差异表明偏离了简单扩散（补充图7b、c、d），此类数据被排除。

同样地，在间隙周围存在屏障的情况下，扩散进入屏障的分子会被反射（补充图7a）。这些被反射的分子对渡越统计的贡献会增加一倍，导致在屏障方向上测得的相关函数宽度大于远离屏障方向的相关函数宽度（补充图7e、f、g）。检验正向和反向D值等效性的方法有助于消除此类影响。

在通道沿z轴漂移的情况下，正向和反向的扩散系数可能会相等。但由于分子通过两点的时间变长，扩散系数的数值会被低估。此外，尽管我们已确保在分析时间窗口内通道间距保持恒定，但我们也认识到，即使双向扩散系数数值一致，通道宽度的细微变化或不可见轴向空间的影响，仍可能导致估算不准确。

我们比较了正向和反向的平均值 D_{fit } 值，并确保差值在 D 平均值的 30% 以内（有关此方法的示例，见图 4h、i）。在所有纳入的数据集中，D_{f w d} 与 D_{b w d} 之间的平均差值为 D 平均值的 11.4%。

图 4 .活体 SPIM-sFCCS 的信号提升策略。a. Imaging-FCS 支持以多种方式对多像素信号进行合并，用于开展 SPIM-sFCCS。b. 模拟数据中矩形与正方形像素合并的平均互相关函数（CCF）对比。正方形合并会使像素探测体积重叠，串扰高于矩形合并。c. 不同像素合并尺寸下原始互相关函数（蓝色）与拟合（红色）对比。增大合并尺寸可提升拟合效果并降低扩散系数标准差。d. 可对时序图像栈的连续帧进行合并，作为采集后提升等效曝光时间的另一种方式。e. 不同模拟信号强度下平均互相关幅值对比。幅值随曝光时间增加与噪声降低而升高；时间合并可提升幅值，但效果弱于直接增加曝光。f. 活体 Sqt-EGFP 测量的帧时间合并示例。时间合并可提升互相关幅值，且不改变峰值位置。g. 正向与反向互相关对比。正向与反向数值一致，可确保所测动力学为纯扩散，无漂移、流动或主动运动成分。h. 表达 Sqt-EGFP 胚胎的感兴趣区域（ROI）示例，用于展示正向与反向有效扩散系数的一致性。i. 图 4h 数据的正向与反向空间互相关结果。数值相近表明测得的扩散系数反映真实扩散成分，无细胞运动造成的伪影。

我们发现，至少30%的所有测量数据存在明显的组织运动，导致相关的浓度对比因子（CCFs）无法进行评估。40%的测量显示正向和反向扩散系数存在差异，这表明由于组织运动产生了对流流动。剩余30%的测量数据的正向和反向扩散系数相等，意味着仅存在扩散传输，我们仅对这部分数据进行了考量。

斑马鱼胚胎中依赖距离的形态发生素扩散

在带有受体结合的类通道空间中进行粒子扩散模拟的结果表明，扩散减缓及其产生的稳态D_{eff }与通道宽度相关，且该转变发生在与两个细胞间膜间距相当的长度尺度上。我们改进了拟合模型并考虑到信号微弱和细胞运动的影响，我们试图验证模拟结果在体内形态发生素动态变化中的适用性。

我们首先在固定距离9像素（对应3.6微米）的条件下，对比了不同膜间间距的通道类空间中Sqt的D_{eff }。从图5a和图5b中可以看出，在间距较小时，D_{eff }数值较低，最小间距下的~ 10mu m^{2} / s值最低。随着通道宽度增加，D_{eff }值持续上升，直至间距达到4微米，此后该数值在~ 51mu m^{2} / s水平保持稳定。此外，为对比通道宽度与狭窄空间内减速程度的影响，我们将狭窄空间和宽阔空间的结果进行了分组（图5c）。研究发现，与细胞间间距大于4微米的通道~ 51mu m^{2} / s相比，狭窄通道<2.5mu m: ~ 18mu m^{2} / s的D_{eff }值几乎下降了三倍(p<0.0001)。

我们还利用这些组来测量了在通道长度范围内从 D_{l o c} 到 D_{glob } 的转变过程（图5d）。结合受体结合模拟结果，在狭窄通道 (<2.5mu m) 中，D_{eff } 在距离为 2 微米处下降 9c20fd1-24b1-414f-8f49-954ab4a7dd46，并保持在较低水平（在 3.6、5.2 微米处分别为 p=0.005 和 0.02，对应 D_{lose } 和 D_{eff }），此后从 2 微米和 3.6 微米处开始 p=0.71、从 3.6 微米和 5.2 微米处开始 p=0.98，其在空间上保持相对恒定。对于宽度大于 4 微米的通道，D_{eff } 在空间上几乎无变化 p>0.3。中等宽度的通道与宽通道和窄通道具有相似的变化趋势 D_{l o c}，分别对应 p=0.90 和 0.23。与窄通道类似，在 2 微米处出现下降 p=0.0745，此后保持恒定 D_{eff } (~ 30-31 mu m^{2} / s；所有比较中 p>0.8) 均更高，其数值高于窄通道但低于宽通道 D_{eff }，在 5.2 微米处分别对应 p=0.1 和 0.02。总体而言，这一结果与模拟结果一致，表明下降幅度取决于细胞间间距，且 D_{eff } 会根据通道宽度收敛至不同数值。

由于已知 Sqt 能与激活素受体结合，我们探究了调节受体结合是否会影响 D eff 随空间的变化。为此，我们使用吗啉代寡核苷酸敲低了 Acvr2b（一种在体内已知能与 Sqt 结合的受体），并在 3.6 微米处测量了 D_{eff }，以与 Sqt-EGFP 的扩散散点图进行对比。我们发现，狭窄空间内的 D_{eff } 相较于天然 Sqt-EGFP 的数值有所升高，且观测到的 D_{eff } 值在 30-60mu m^{2} / s之间分布较广（图 5b）。将狭窄空间的数据合并后与 Sqt-EGFP 对比，结果显示扩散系数整体显著升高约 2 倍~ 18mu m^{2} / s 升至 ~ 35mu m^{2} / s；p=0.0007，而宽阔空间内的 D_{eff } 相较于 Sqt-EGFP 仅有轻微升高（约 51 升至 ~ 58mu m^{2} / s ; p=0.0742)；图 5b、c）。此外，我们测量了囊胚腔中 Sqt-EGFP 的浓度梯度长度，发现敲低 Acvr2b 会使测得的梯度长度显著增加（附录 G、补充图 8、补充表 1；p<0.0001）。

Lefty 蛋白是 Nodal 形态发生因子的已知抑制剂。它们通过直接结合 Nodal 配体或竞争性结合受体来阻止 Nodal 信号传导。在斑马鱼中，Lefty 蛋白会抑制 Squint 和 Cyclops，且在组织间隙中的扩散系数显著高于这两种因子。我们此前已证实，Squint 会在细胞外空间与 Lefty2 结合。本研究探讨了过表达 Lefty 蛋白是否能加快 Squint 的扩散速度，因为 Squint 与 Lefty 的直接相互作用以及 Lefty 蛋白的阻断作用均与此相关可用的受体结合位点总体上会减少 Squint 的瞬时结合。因此，我们通过在细胞外空间过表达 Lefty2-mCherry，检测了 Lefty 存在时 Sqt-EGFP 的 D_{eff }。与 Acvr2b 受体吗啉代实验结果类似，我们发现，与天然 Sqt-EGFP 的数值（约18 至 ~ 38mu m^{2} / s p=0.0037）相比，在狭窄空间中过表达 Lefty2 时，Sqt-EGFP 的扩散系数增加了两倍，而在宽阔空间中其 D_{eff } 基本保持不变（约51 至 ~ 51mu m^{2} / s；p=0.89，图5b、c）。

需要指出的是，在从宽通道向窄通道转变的过程中，从三维（宽通道）到二维（窄通道）的维度降低会使均方位移从6Dt变为4Dt[63,64]。由于我们的拟合模型无法考虑这一转变，这导致扩散系数D被低估了30%。我们使用sec-EGFP验证了这一预测，除了在宽空间中存在一个缓慢的异常值（比平均值慢>3个标准差）外，在窄通道空间p=0.0004、p=0.11（含异常值；图5b、c）中，观察到D出现了该数量级的表观降低。由于这一效应也适用于Sqt的扩散，因此窄空间中扩散系数30%的低估本应使35-40mu m^{2} / s。然而，在窄空间中测得的Sqt值低至10 mu m^{2} / s，平均值约为8mu m^{2} / s。只有在Acvr2b敲低或Lefty2过表达的情况下，才能恢复到~ 35-38mu m^{2} / s这一数值。

图 5 .活体类通道空间内的 sFCCS 测量结果。a. 表达 Sqt-EGFP 的胚胎中，在宽与窄类通道空间内测量3.6 μm间距下有效扩散系数(D_{eff})的对比（原始相关曲线：蓝色；拟合曲线：红色。宽通道样本量N_{ccf}=80，窄通道(N_{ccf}=13）。b. 在约3.6 μm间距下，对比不同通道宽度中 sec-EGFP、Sqt-EGFP、Sqt-EGFP+Acvr2b 敲低、Sqt-EGFP+Lefty2 过表达的D_{eff}。阴影区域为正向与反向测量的合并标准差，绘制值为两次测量分布的平均值。c. 将图 5b 结果按通道宽度分为窄通道（<2.5 μm）与宽通道（>4 μm） 统计。所有组别中，Sqt-EGFP 在窄通道内的扩散均显著慢于宽通道（p<0.0001；敲低 Acvr2b 与过表达 Lefty2 均能显著加快窄通道中 Sqt-EGFP 的扩散（分别为p=0.0007、p=0.0037）。d. 针对不同宽度通道，测量 Sqt-EGFP 的D_{eff}从局部扩散系数D_{loc}开始，在三个不同间距下的变化趋势。窄通道中，D_{eff}在超过通道宽度的距离上显著下降；宽通道中D_{eff}在空间上保持相对恒定（p>0.3）。

总体而言，这些结果表明，调节结合亲和力确实会影响形态发生因子在空间上的D_{eff }，因此这些形态发生因子会因结合作用而扩散受阻，并在细胞间距的长度尺度上发挥作用。

在所有宽通道中，以3.6微米测量的D_{eff }值（SqtEGFP的>4mu m为50-60mu m^{2} / s）和Sec-EGFP（70-80平方微米/秒）与先前共聚焦荧光相关光谱（FCS）测量获得的D_{l o c}值非常相似，这证明了共聚焦FCS与单平面照明显微镜-荧光相关光谱（SPIM-sFCCS）拟合结果的等效性。

为了进一步验证我们从Sqt-EGFP扩散实验中得出的观察结果的有效性，我们使用SPIM-sFCCS技术测量了BMP2b-sfGFP在不同空间区域的D_{eff }。骨形态发生蛋白（BMP）与结节信号（Nodal signalling）协同作用，共同构建斑马鱼早期胚胎的模式。与Squint蛋白类似，已有研究表明BMP2b在D_{lose }和D_{g l o b}数值上也存在差异，因此可用于与Sqt蛋白的实验结果进行对比。通过对一组有限的窄通道（中间宽度为2.5-4微米）在距离3.6微米处测得的D_{eff }数值，以及<2.5mu m和wide channels >4 mu m（详见附录H、补充图9、补充表2）进行分析，我们发现不同通道类型下配体的扩散动力学特征存在显著差异。研究发现，窄通道会显著限制配体的扩散，在体内环境中，与宽通道相比，窄通道使配体分子的扩散速度减慢了近4倍（56降至15mu m^{2} / s；p=0.0002），而2.5-4微米的中间宽度通道则得到了介于两者之间的(D_{eff })数值，该数值为~ 31 mu m^{2} / s。

讨论

量化体内形态发生素的动态变化对于理解形态发生至关重要。然而，包括荧光相关光谱法（FCS）、单粒子追踪（SPT）和荧光漂白恢复（FRAP）在内的现有技术探测的是不同的非重叠空间尺度，因此无法完整捕捉依赖空间尺度的动态变化。为了全面揭示曲折性对细胞外基质的各种影响不同长度尺度下的受体相互作用，因此需要能够衔接局部与整体动力学转变的技术。本文采用带有优化拟合模型和分析流程的 SPIM-sFCCS 技术，在中等长度尺度范围内对活体内的 D : f 进行了测量。

我们首先利用模拟来预测配体的Dffc在细胞间隙中随距离的变化规律，以及受体相互作用对其的影响。为此，我们采用单一有效结合(p_{bind })与解结合(pubind)概率作为通用受体的定性模型。我们认识到，实验涉及多种浓度随时间变化的受体和共受体，且它们各自对基于受体结合的受阻扩散的影响往往难以预测。尽管如此，这些通用模拟参数仍可反映它们的整体作用，且相关预测至少能定性捕捉受体相互作用对形态发生子动态变化的影响。

利用这一简化模型，可通过提高配体-受体亲和力（结合与解离概率）或改变受体浓度来调控受体相互作用。假设细胞膜上的受体表面浓度恒定，后者则等同于改变形成形态发生素扩散通道的细胞膜之间的间距。模拟结果表明，几何受限空间的相互作用，以及由结合与解离概率耦合参数决定的可逆结合动力学，共同在空间上降低了D_{eff }。这些模拟结果与库恩（Kuhn）等人及朱（Zhu）等人的研究结论一致，二人揭示了结合亲和力、受体浓度和空间紧密度对整体扩散的影响。此外，除了以往模拟研究的发现之外，本次模拟还帮助我们预测出，从自由扩散转变为受受体相互作用阻碍的扩散，其发生的长度尺度约为膜间距的数量级。

需要指出的是，我们对由通道宽度量化的空间紧密度与组织曲折度的影响进行了区分。曲折度衡量的是障碍物的影响，这些障碍物会增加粒子在空间中两点间扩散的路径长度。通过排除某些路径（主要是短直路径），在整体组织尺度上，当分子围绕细胞扩散时，总扩散系数似乎会降低。这可通过在大于细胞直径的尺度上进行FRAP测量来量化。但在膜间距尺度（等于或小于一个细胞直径），组织曲折度不会影响扩散率。

为了精确测量空间分布的 D_{eff }，我们必须重新推导理论 SPIMFCS 拟合模型。由于每个像素的检测体积较大，且光片的覆盖范围较广，相邻像素之间存在强烈且范围广泛的串扰。这一问题此前已被认识到，相关去卷积解决方案也已被提出。然而，对于 SPIM-sFCCS 技术而言，这会导致串扰效应增强，而此前推导的分析模型无法对此进行有效解释。虽然从这些模型中可以提取出正确的 D 值，但需要通过经验校准来实现，而这会高估观测体积。不过，该方法并不适用于 SPIM-sFCCS 技术，因此重新推导新的模型成为必要之举。

这种新推导的模型的缺点是无法找到解析解，需要通过数值积分来描述拟合函数，其减慢了数据评估速度。同时，这也使模型具有通用性，因为任何点扩散函数（PSF）模型都可以纳入数值函数中，甚至可以纳入实验性点扩散函数。数据拟合的另一种方法是通过卷积神经网络进行评估。最后，我们证明了借助所开发的数值拟合模型，我们能够在至少1-5微米的距离范围内提取出正确的扩散系数（D），这一范围涵盖了荧光相关光谱（FCS）与荧光恢复光漂白（FRAP）之间可触及的长度尺度，也是我们预期扩散系数（D）发生最剧烈变化的区间（图2b）。

随后我们将 SPIM-sFCCS 应用于活体胚胎中。由于 4 小时胚胎期的胚胎内部组织具有动态性，区分组织运动伪影、组织运动引发的对流以及扩散过程至关重要。此外，三维组织形貌和动力学的复杂性通常导致扩散系数（D值）分布广泛。为在高动态组织中优化 SPIM-sFCCS 技术，我们需要在有限的测量时间与可实现的信噪比（SNR）之间找到平衡点。由于早期胚胎组织运动速度快，会破坏相关函数，因此无法进行长时间测量（平均测量时间为 ≈90 ~s）。通过像素合并和帧合并可缓解由此产生的低信噪比问题，以获得合适的空间互相关结果并量化 D_{eff }。这些策略对于实现所示 3.6-5.2 微米间距的远距离测量至关重要。

考虑到这些局限性，我们将SPIM-sFCCS技术应用于节点形态发生因子Sqt的尺度依赖性扩散系数测量，该系数取决于受体浓度和通道宽度。尽管SPIM-sFCCS测量的误差（取决于信噪比）约为20%，但样本内和样本间的变异性会使总误差增至约40%至50%。样本内及样本间的变异性由两个因素导致。首先，生命系统中的间隙空间永远不会完全相同，即使在相同的通道状空间中，其宽度也会存在轻微变化。在模拟中，我们发现通道沿其长度的细微收窄或扩张会使D_{eff }增大或减小（补充图1e）。这会增加在膜间距离沿通道长度不均匀的通道中测得的D_{eff }的误差。其次，发育中的胚胎总会存在一定的组织动态变化。尽管我们排除了组织动态变化占主导的所有测量，但仍无法完全排除SPIM-sFCCS中组织动态变化带来的轻微影响。尽管如此，不同通道宽度下以及不同距离处，间隙空间中测得的扩散系数之间的差异仍具有统计学显著性（图5c、d）。

我们的测量结果支持了通道模拟预测，并且表明即使考虑到降维效应，Sqt 在狭窄通道的长度范围内速度至少降低2倍，而在宽阔空间中则不受影响。Acvr2b 受体敲低和 Lefty2 过表达均增加了 Sqt 在狭窄空间中的D_{eff }，同时不影响其在宽阔空间中的扩散，这证明了受体相互作用具有通道宽度依赖性效应。我们注意到内源性 Sqt 的存在，它可能与受竞争性结合，而内源性 Leftys 也可能与表达的 Sqt-EGFP 结合。这两种情况都会导致D_{eff }的高估。尽管如此，在相似的狭窄空间中，Lefty2 过表达和 Acvr2b 敲低存在时，Sqt-EGFP 的相对加速效果仍然显著。此外，对 BMP-2b 进行的 SPIM-sFCCS 测量也显示出差异D_{eff } 是在狭窄和宽阔空间中测得的，这表明空间依赖性结合阻碍扩散机制对于形态发生子具有普遍适用性。

对不同宽度通道中Sqt实验D值的更详细分析显示，D值随距离逐渐降低，且这一变化依赖于通道宽度，与模拟预测的结果一致。据我们所知，这是首次在体内跨0-5.2微米空间尺度同时测量扩散系数，捕捉到了形态发生子扩散的逐渐减慢现象，从而证明了SPIM-sFCCS技术的优势。

这些D_{eff }测量结果与此前报道的体内配体测量的受体结合受阻扩散一致。Kuhn T.等人此前通过单粒子追踪开展的测量在细胞-细胞界面空间中发现了三种不同的扩散群体，极低的扩散系数D表明存在固定群体~ 0.5 mu m^{2} / s，中间值(1.2-3mu m^{2} / s)表明存在膜结合扩散组分和快速扩散组分(16-17 mu m^{2} / s)。我们在狭窄通道中对Squint-EGFP的D_{eff }测量结果~ 18mu m^{2} / s与快速扩散组分高度吻合。遗憾的是，荧光相关光谱法（FCS）无法检测到固定组分，且如图3d和补充图5d所示，精准测量低扩散系数D值的空间范围(1-10mu m^{2} / s)非常有限，同时需要大幅延长测量时间，这在生长发育中的组织内难以实现。不过，采用双组分拟合模型对自相关曲线进行拟合，可检测到细胞外局部的快速扩散组分以及细胞膜附近的慢速扩散组分，该方法也已应用于以往形态发生原的荧光相关光谱法测量中。本研究中，我们仅对快速扩散组分的结果进行分析，因为我们认为该组分是在整个组织中扩散并减缓、且作为长距离信号传导主导因素的组分。

我们此前采用双色荧光相关光谱（FCCS）开展的研究显示，Acvr2b与Sqt具有高亲和力，解离常数为60 nM；与此一致的是，我们敲低Acvr2b的实验结果表明Sqt的扩散速度加快。我们的研究结果也与此前的受体敲低观察结果相符，即敲低Acvr1b-a/b或缺失共受体Oep后，分子扩散系数会升高。但与之相反的是，有研究显示过表达Acvr2b受体会使分子扩散系数出现小幅下降，且差异不显著；而提高Oep的表达量会增加结合分子的比例，但不会改变分子扩散系数。不过，通过荧光漂白恢复技术（FRAP）检测发现，过表达Oep会使分子扩散系数降低，这可能是因为高效的Oep共受体对配体的捕获能力增强，进而影响了其整体迁移能力。受体敲低会加快配体扩散，而受体过表达仅带来微小变化，这提示配体可能是受体结合系统的限制因素。过表达产生的过量受体未必能提高结合速率，而敲低受体则会减少配体结合时所受的空间阻碍。Oep、Acvr1b和Acvr2b受体在早期囊胚中广泛表达，且在胚胎边缘区域，Oep和Acvr1b-a的表达在后续阶段进一步富集—而在盾状期，Nodals在此处发挥活性，再加上Acvr2b在囊胚中的均匀表达，这些都为配体限制模型提供了支持。此外，通过补充Oep来抵消受体饱和的机制，也有助于维持高受体水平水平。未来需要开展其他受体的配体结合动力学及受体占有率定量实验，以验证配体受限的结合机制。

我们团队此前还证实，Wnt3 会在斑马鱼小脑24至48小时胚胎期的紧密间质空间中因受体结合而阻碍扩散，在此过程中，共受体LRP5的敲低会使D_{glob }数值升高。此外，有研究表明，小鼠体内的BMP4梯度是由狭窄间质空间中受几何结构限制的配体扩散，以及受体基底外侧定位受限共同作用形成的，这凸显了组织几何结构与受体结合的协同效应对形态发生素扩散的重要性。

我们的研究结果还可得出进一步预测。内源性节点信号在囊胚边缘区域高度活跃。由于这些边缘仍保留完整的细胞间黏附，该区域的膜间间隙小于100纳米，因此低于衍射极限。如此狭小的空间应会显著减缓配体的扩散速度。受衍射极限限制，我们无法对这种狭小空间进行量化。不过，基于我们的研究结果，我们推断在这些更致密的组织区域中，D_{eff }值将远低于我们在2微米通道中测得的10-20 mu m^{2} / s值。

基于我们与尺度相关的 D_{eff } 结果，我们在图6中阐释了一种合理的机制，即分子从局部到全局尺度的运动速度变慢。我们对 Sqt 蛋白在空间中 D_{e f f} 转变的测量结果表明，基于受体结合的、从分子量受限扩散模式到结合阻碍扩散模式的速度减缓，发生在一对细胞膜之间的间隙空间内（图6a）。超过膜间间距后，最终的 D_{eff } 值在整个间隙空间的长度上保持稳定。穿过膜间间隙后，分子会感受到组织的曲折度（图6a 右侧）。它们必须绕开细胞，这会延迟其扩散并造成进一步的速度减缓。我们预测，分子从快速的 D_{l o c} 转变为因受体结合（若适用，还包括与细胞外基质成分的相互作用）而速度降低的 D_{eff } 的过程，本身就发生在一个细胞直径的范围内。单个细胞尺度之后的最终 D_{glob } 由组织曲折度决定，这有助于形成浓度梯度（图6b）。在更宽阔的组织间隙中，受体结合带来的初始速度减缓并不显著。然而，全组织曲折度的影响会按比例降低 D_{eff }，从而使分子运动速度变慢，但其数值仍相对高于紧密排列的组织（图6b）。由于组织通常具有不同的细胞间距，整体有效扩散系数将是所有不同通道宽度下扩散系数的加权平均值。这或许可以解释在体内不同组织环境中，Nodal 蛋白及其他形态发生原的迁移率是如何被调控的。

图 6 .形态发生素在空间中减速以形成浓度梯度的可能机制。a. 不同尺度的相互作用如何影响形态发生素扩散的示意图：

· 在膜间隙内部尺度：形态发生素表现为自由扩散或受细胞外基质（ECM）作用的受阻扩散；

· 在膜间隙之外、类间隙通道内：形态发生素受到受体结合的阻碍；

· 在超出单个细胞间隙后：组织迂曲度使分子必须沿细胞边缘绕行更长路径，进一步减速。b. 形态发生素从局部快速扩散到全局慢速扩散的空间转变示意图。窄空间因受体结合概率更高，初始减速更显著；在超过通道长度后，两种空间的组织迂曲度影响相近，最终(D_{eff})在单个细胞直径尺度内趋于稳定。

虽然我们的研究仅聚焦于探究Sqt的扩散以及受体Acvr2b和抑制剂Lefty2的作用，但我们也认识到，要全面理解体内Nodal的动态变化，还需明确Lefty1的影响，以及Cyclops的动态变化及其与受体、抑制剂的相互作用。

以往的工程化梯度研究表明，基于受体的结合足以形成形态发生素梯度。此前的研究也表明，Nodal 梯度的形成受受体结合调控，且共受体 Oep 在边缘区域的优先定位以及受体的补充作用对其维持至关重要。我们的研究发现敲低Acvr2b会增加Sqt的梯度长度，这与此前关于在Acvr1b和Oep缺失时Sqt梯度长度增加的研究结果一致，且进一步补充了该结论。但必须指出，此前仅敲低Acvr2b-a并未观察到胚胎早期发育的表型缺陷，只有同时敲低两种Acvr2b受体（-a和-b）才出现了该缺陷，这表明可能存在类似Lefty1和2之间相互补偿机制的信号通路调控代偿机制。

中内胚层模式形成是Nodal信号通路的结果，即便囊胚层的间隙因药物诱导的流体化或致密化而受到扰动，该过程仍保持稳定。这表明细胞间间距及其所形成的组织排列，单独来看不太可能完全决定Nodal梯度的形成。稳定的模式形成在一定程度上可由Nodal抑制剂Lefty的代偿缓冲作用实现，此前研究已证实Lefty有助于限制Nodal的长距离扩散并调控Nodal信号的缩放。此外，Nodal信号通路不仅由浓度梯度决定，还受Nodal暴露时长的影响。与囊胚层中央区域相比，Nodal信号活跃的囊胚层边缘区域因边缘处存在局部的非经典Wnt11信号，其细胞间接触保持完整。研究表明，细胞间黏附的增强会提升Nodal信号活性，而Nodal信号的增强又会进一步稳固细胞间接触。细胞间接触强度及由此产生的Nodal信号的差异，导致了细胞命运的分化。

我们观察到Squint在通道宽度范围内迅速减慢，这提示存在一种物理机制，该机制不仅有助于限制节点信号的扩散，还能在节点信号活跃的边缘紧密细胞连接内促进节点信号传导。与这一解释相符的是，近期一篇预印本论文提出了节点-组织刚度反馈环路，其中节点信号驱动的组织硬化会进一步限制节点信号传导的长度尺度。

Leftys 是预先抑制且在后续时间表达的蛋白，可为节点信号传导提供时间窗口。此前研究表明，Lefty 需要快速扩散才能充分抑制节点的扩散。我们关于 Sqt 在 Lefty2 存在时加速扩散的结果表明，节点蛋白可能被快速清除，从而有效调控节点信号传导。

对斑马鱼形态发生因子扩散的初步测量表明，Sqt 遵循基于反应-扩散的模式系统及其抑制因子 Left y 。然而，形态发生因子的体内扩散测量也得出了一个令人困惑的观察结果，即存在快速的局部扩散系数 D 和缓慢的全局扩散系数 D（Fgf8 见 Yu S.R. 等人 ，Sqt、Cyc 和 Fgf8 见 Muller P. 等人 ），研究认为这种扩散减慢的原因是基于受体结合的捕获效应 。后续研究可靠地量化了 Sqt 在体内的扩散过程 ，以及它与受体和抑制因子的相互作用强度。后续研究还记录了 Sqt 的扩散在组织不同间质空间中的变化，以及其与受体 Oep 和 Acvr-1b 相互作用导致的扩散变化 ，并由此推断其梯度扩散范围也发生了改变 ，为受体阻碍扩散模型提供了更多证据。

我们基于SPIM-sFCCS的研究结果不仅证实了受体相互作用和组织几何结构对形态发生素扩散的共同影响，还将Acvr2b-a和Lefty2纳入Sqt扩散调控因子的列表；更重要的是，同步的空间D_{eff }测量揭示了扩散减缓发生的长度尺度。这使我们能够推断出此前无法获取的受阻扩散模型细节，为该模型奠定了更坚实的基础，同时也有助于弥合局部到整体的扩散转变间隙。

SPIM-sFCCS技术的实现为详细研究活胚胎中的扩散系数提供了实用工具。该技术可实现至少5微米中间范围的检测，这是更传统的测量技术无法企及的。我们从Sqt和BMP-2b获得的数据表明，形态发生素在细胞外空间的扩散会随距离减慢，这种扩散依赖于可逆的膜结合和细胞间间距，在与细胞直径相当的距离处就已有效降低了扩散系数D_{glob }。我们预计，随着技术的进一步发展，可在活胚胎中测量扩散系数的详细图谱，从而描绘出比目前更详尽的形态发生素运输图景。

方法

动物研究伦理审批

所有与斑马鱼相关的实验均按照新加坡国立大学机构动物护理与使用委员会批准的IACUC #BR18-1023或IACUC #BR22-0823方案开展。本研究中使用的所有斑马鱼均为新加坡国立大学生物科学系野生型（DBS WT）品系。胚胎取自新加坡国立大学比较医学动物饲养室或生物科学系鱼类养殖设施。所有实验均在受精后0-5小时（hpf）内进行，实验期间无法对胚胎的性别进行鉴定。

窄通道内扩散与结合的模拟

发育胚胎中形态发生素的扩散不仅受到组织几何结构的阻碍，还会因与细胞壁上受体的结合和解离而受阻。我们在二维空间中对这一情况的简化版本进行了模拟，构建了一个宽度为(d_{w i d t h})的通道，通道由两条平行于x轴的直线（代表细胞边界）界定。所有粒子均从通道的中心点开始扩散。模拟的时间步长设为Delta t=0.01 ~ms，扩散系数为D=60mu m^{2} / s。0.01毫秒的时间步长确保了60mu m^{2} / s下sqrt{4 D t}=0.049mu m的小步长，使得粒子需要多个步长才能穿过通道。粒子在通道内进行随机游走，在###和y方向的步长为Delta r，该步长取自均值为0、方差为2Ddt的高斯分布。一旦粒子撞击到其中一条壁，它将以Pbind的概率结合，或被反射；具体结果通过从0到1的均匀分布中抽取一个数，并将其与Pbind比较来确定。

被结合的粒子在下一步模拟中以解离概率 P_{unbind} 发生解离并继续扩散，该过程通过在 0 到 1 的均匀分布中随机抽取一个数值，并将其与 P_{unbind}比较来判定。由于所有粒子均从通道中心点出发，粒子沿x 轴（即沿通道方向）的分布情况，可用于衡量由自由扩散与瞬时结合–解离动力学共同决定的有效扩散系数 D_{eff}。在每个时间间隔（1 毫秒）内，粒沿 x 轴移动的距离采用均方根位移（RMSD）进行量化，该值根据粒子位置 x 的分布方差计算，表达式为：

在时刻 t，沿通道长度方向的有效扩散系数也可按下式确定：

每次模拟中的粒子数量均根据通道宽度进行缩放，比例为每微米通道宽度对应4000个粒子。这确保了有足够的粒子来形成高斯分布，从而能够对其方差进行恰当计算。对于不同收敛或发散形状通道的模拟（补充图1e），通道的收敛/发散率设定为16%（或32%，2 × 斜率）表示其宽度在10微米范围内的变化率。所有模拟均在Mathematica 12.3版（美国伊利诺伊州沃尔夫勒姆研究公司）中完成。

SPIM 装置

光片显微镜系统及采集设置基于Krieger等人（2015年）发表的细节，在此进行简要说明。激发EGFP所需的488纳米激光器（瑞典Cobolt AB公司，型号Cobolt 06-MLD 488nm 0488-06-01-0100-100）与用于激发mApple/mCherry的561纳米激光器（瑞典Cobolt AB公司，型号Cobolt 06-DPL 561nm 100 mW 056106-91-0100-100）共轴校准。两束激光被导入单模光纤（美国Qioptiq公司，型号kineFLEX-P-3-S-405..640-1.0-4.0-P2），光纤将激光束放大1.3倍。输出的激光束经扩束镜（美国Thorlabs公司，型号f_{1}=30 ~mmAC254-030-A、f_{2}=60 ~mm AC254-060A）进一步实现2倍扩束，以满足照明物镜后孔径的填充要求。随后，激光束通过焦距为75毫米的消色差柱面透镜（美国Thorlabs公司，型号ACY254-075-A），再经照明物镜（日本东京Olympus公司，型号SLMPLN 20×/0.25）出射。488纳米激光束形成的光片厚度半径约为1.1微米（1 / e^{2}），且在所有SPIM-sFCCS测量中保持一致。光片束腰与探测物镜（日本东京Olympus公司，型号LUMPLFLN 60×/1.0）的光轴对齐重合。探测物镜安装于定制样品腔一侧的安装孔中，并固定在压电物镜扫描仪（德国Physik Instruments公司，型号P-721 PIFOC）上，以纳米级精度控制物镜位置。样品安装在配备三线性定位系统的电动载物台上（德国Physik Instruments公司，型号Q-545 Q-Motion Precision Linear Stage），该载物台三轴均配备压电电机，同时搭配一个旋转台（德国Physik Instruments公司，型号DT-34 Miniature Rotation Stage）。荧光物镜检测到的发射光先通过带通滤光片（型号FF03-510/2025，赛洛克公司，美国）以捕获绿色荧光蛋白的发射光和荧光相关光谱，或通过双波段带通滤光片（型号FF01-512/630-25，赛洛克公司，美国）来评估红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白的共表达情况，随后经管透镜（型号LU074700，焦距180毫米，编号(f=180 ~mm)，奥林巴斯公司，日本东京）将其投射到电子倍增电荷耦合器件相机（型号Andor iXon3 860，128×128像素；安道尔科技公司，英国贝尔法斯特）上。通过翻转镜可将图像交替投射到大视场的科学互补金属氧化物半导体相机（型号OCRA-Flash4.0 V2；C11440；滨松公司，日本静冈）上，以观察胚胎的整体位置并确定目标区域。

时间序列堆叠图由 Andor Solis for Imaging 软件（4.31.3037.0 版）从 EMCCD 相机获取并以 TIFF 格式保存，随后根据曝光和测量时间的采集参数进行 SPIM-sFCCS 分析。

SPIM-sFCCS 自由扩散模拟

在 Imaging FCS 1.52 中完成了单平面照明显微镜（SPIM）下三维自由扩散的模拟，该软件是一款基于 ImageJ（http://imagej.nih.gov）的插件，其开发依托于 Sankaran 等人（2013 年） 中描述的二维全内反射荧光显微镜（TIRF）模拟，模拟所使用的参数如下文所示。简要而言，我们假设通过 60 倍、数值孔径（NA）为 1.0 的显微镜物镜收集 SPIM 的荧光信号。发射的信号被成像到像素尺寸为 24 皮米（物方像素 size =400 ~nm）的相机上，观测区域为 20×20 像素（对应 SPIM 中的 8 ×8mu m^{2}）。为确保观测区域/体积内粒子数自由波动，模拟空间在 x、y 维度的尺寸为观测区域的 3 倍，在 z 方向的尺寸为光片厚度（半径 (1 / e^{2}）的 20 倍，且观测体积位于模拟空间的中心。一定数量的粒子被随机分布在空间中。在每一个时间步长 Δt（Delta t）内，粒子在三个维度上分别按照均值为 0、方差为 2Dt 的高斯分布随机步长发生位移（其中 D 为扩散系数）。若粒子离开模拟空间，则在空间边界随机生成一个新粒子。时间步长 Δt（Delta t）被设为相机曝光时间 T（1 / 10^{th }），以考虑图像采集过程中的粒子运动。在每个模拟步长中，每个粒子发射的光子数量均从泊松分布中采样，均值为 cps×Δt（其中 cps 表示每个粒子每秒的计数分子亮度，F(z) 为比例因子，用于考虑激发强度的轴向依赖性）。发射的光子在相机上的分布概率由显微镜物镜在 xy 平面的点扩散函数（PSF）决定。点扩散函数近似为高斯函数，其半径为

在此处 (omega_{0}) 这一常数是通过校准实验得到的，实验确保了染料在水溶液中的扩散系数为常数，与分箱无关，且该常数被确定为 1。比例因子 F(z) 由下式给出光片强度在z 方向上服从高斯分布：

式中，(omega_{z}) 为光片厚度的 1/e² 半径。由于焦平面外的粒子会导致光子在相机上的分布更宽，因此光子会按照如下点扩散函数（PSF）进行弥散：

每10个模拟时间步长，将检测到的计数求和并投影到二维图像上，该时间步长对应图像堆栈中的一帧（ID：(T=10 Delta t)）。为进行SPIM-sFCCS分析，最多模拟500,000帧。为模拟相机噪声的影响，从高斯分布（均值为0，标准差对应ID：(sigma=N_{noise }）中随机抽取虚假计数，并添加到每一帧的每个像素上。

针对图3b、c、d；图4b、c、e以及补充图5中展示的模拟结果，图像堆栈的模拟与分析参数如下：5000个粒子；100000帧；曝光d3fac1b7-29d9-4be1-8a79-a2ae02faf596为30000次/秒；(omega_{x y}=515 ~nm对应的ωz/光片厚度=1.13微米；除特定子图另有说明外，均采用1×1分箱。

荧光微球测量步骤

基于先前描述的流程，对溶液中的荧光微球进行了扩散测量。简要来说，选用直径为100纳米、在515纳米波长处发射荧光信号的荧光微球（FluoSpheres，赛默飞世尔科技Invitrogen公司），将其储备液在水中稀释100倍，用于成像荧光相关光谱（Imaging-FCS）测量。微球溶液在测量前需经超声处理30分钟。取50微升微球溶液封装于热封的氟化乙烯丙烯共聚物（FEP）袋中，该薄膜厚度为25微米（德国博伦德（Bohlender）公司，货号S1833-04，规格1000×150×0.025毫米FEP箔）。将密封袋安装至样品池，采集荧光微球的信号以进行单平面照明显微镜-荧光相关光谱（SPIM-sFCCS）分析。测量时，在激光强度为12 ~W / cm^{2}的条件下，采集80000帧图像，每帧曝光时间为2毫秒。

mRNA 制备、显微注射、斑马鱼固定以及单平面照明显微镜成像

本研究使用的 Sqt-EGFP、sec-EGFP 以及 Left y2-mCherry 质粒构建体此前已由 Wang 等人（2016）发表。使用 NotI 限制性内切酶（美国新英格兰生物实验室公司）对质粒进行线性化处理。通过转录试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司的 AM1340 mMESSAGE mMACHINE SP6 转录试剂盒）从质粒中转录出 mRNA，再利用 Dynabeads mRNA 纯化试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司）对 mRNA 进行纯化。吗啉代寡核苷酸针对Acvr2b（美国GeneTools公司）的吗啉代反义寡核苷酸基于Albertson等人（2005年）报道的反义序列（GCAGAGAAGCGAACATATTCCTTT）。本文所用Acvr2b吗啉代的旁系同源基因为Acvr2b-a，该基因此前已被鉴定。

将10-15皮克的Squint-EGFP信使核糖核酸（mRNA）或分泌型增强绿色荧光蛋白（sec-EGFP）mRNA注射到八细胞期胚胎的单个细胞中，用于单平面照面显微镜荧光相关光谱（SPIM-FCS）测量（补充图6a左上）。该浓度高于此前共聚焦荧光相关光谱（confocal FCS）所使用的5-10皮克，以确保通过单平面照面显微镜系统和电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机捕获到足够的信号。较高的浓度可能会提高成像的信噪比（SNR），但会使相对于背景强度的强度波动更难被准确检测，而这对荧光相关光谱（FCS）而言至关重要。

进行吗啉寡聚核苷酸注射时，向两细胞阶段胚胎的每个细胞中注射吗啉寡聚核苷酸与PMT（质膜靶向序列）-mApple信使核糖核酸（mRNA）的混合物，以确保仅对受精胚胎进行注射。注射的吗啉寡聚核苷酸浓度为2.5微克/微升，该浓度与Albertson等人（2005年）的研究中用于敲低Acvr2b基因表达的浓度处于同一数量级。同时注射50皮克PMT-mApple信使核糖核酸（mRNA），以可视化含吗啉寡聚核苷酸的注射混合物在胚胎中的作用位置，并确保所测区域两侧的细胞膜上的Acvr2b受体均被敲低。

在胚胎两细胞阶段的每个细胞中均类似注射了Lefty2-mCherry信使核糖核酸（mRNA），总注射量约为60皮克（pg），以确保在细胞外空间实现充分的过表达。

本文所用的 Bmp2b-sfGFP 构建体此前由 Pomreinke 等人（2017 年）发表[12]。使用 NotI 限制性内切酶（美国新英格兰生物实验室公司）对质粒进行线性化处理。利用转录试剂盒（赛默飞世尔科技公司，美国，货号 AM1340 mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit）从质粒中转录出 mRNA，并使用 Zy moclean RN A Cl ean & Co ncentrator 试剂盒（美国泽摩研究公司）对其进行纯化。

与Sqt-EGFP mRNA微注射类似，为进行SPIM-FCS测量，将10-15皮克的Bmp2b-sfGFP mRNA注射到八细胞期胚胎的单个细胞中。

在体视荧光显微镜下，于受精后3小时（hpf）对胚胎进行绿色荧光蛋白（EGFP）/超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）/mApple/红色荧光蛋白（mCherry）表达情况的筛选（补充图6a 右上角）。进行单平面照面荧光相关光谱（SPIM-FCS）测量时，将筛选出的胚胎去除绒毛膜，悬浮于1%低熔点琼脂糖中（超纯低熔点琼脂糖，货号16520100，赛默飞世尔科技，美国），置于氟化乙烯丙烯（FEP）管内（内径1.1×1.5毫米，Adtech Polymer Engineering公司，英国）（补充图6a 左下角）。胚胎在受精后3.5至5小时之间进行固定和成像，此时严重的细胞运动尚未使荧光相关光谱（FCS）分析变得困难。

为最大限度减少成像伪影，将胚胎定向为：基于成像感兴趣区域的囊胚腔朝向最靠近的一侧，且胚胎的动物极尽可能靠近FEP管管壁。本质上，胚胎的动物极位于圆柱形管的一个象限内（补充图6a左下角）。这确保了进入管内的光片能够最佳地照亮胚胎组织的一个平面，同时检测物镜可在荧光穿过管和琼脂糖的过程中无损耗地捕获其发射的荧光。

首先，使用科学互补金属氧化物半导体相机（sCMOS）对胚胎进行成像，以观察胚胎的取向并选择一个较宽的感兴趣区域（221.9 微米 × 221.9 微米）（补充图6a 中下部）。选定该区域后，我们切换到电子倍增电荷耦合器件相机（EMCCD），对更小的感兴趣区域（51.2 微米 × 51.2 微米）进行成像（补充图6a 右下部分）。通过sCMOS相机成像还能让我们在荧光相关光谱（FCS）测量前观察到Lefty2-td番茄红蛋白（mCherry）和激活素受体2b吗啉寡核苷酸（与光可切换的番茄蛋白（PMT-mApple）混合使用）的整体分布情况（补充图6b、c）。为了找到膜间隙等合适的通道，我们使用低激光强度（30-60 瓦/平方厘米 (30-60 ~W / cm^{2}）和高曝光时间（50-100 毫秒）对组织间隙进行扫描，以减少光漂白。我们避开了存在细胞运动、阴影或散射伪影的感兴趣区域。为单平面照明显微镜-光谱荧光相关光谱（SPIMsFCCS）选定感兴趣区域并裁剪视场以实现高帧率后，我们以低曝光时间（0.4-2 毫秒）和高激光强度（(60-600 ~W / cm^{2})）记录了约5-20万帧的图像堆栈。由于我们控制了低表达浓度并选择了高帧率（这会带来较高的读出噪声），因此采用高激光强度，以确保荧光相关光谱（FCS）测量中波动强度达到最大化，同时不会对本研究中观察到的快速扩散分子造成显著光漂白。在误差范围内，该强度范围内的激光强度不会改变测得的扩散系数D[84]。单平面照明显微镜-光谱荧光相关光谱（SPIM-sFCCS）分析

SPIM-SFCCS 分析

我们使用一款 ImageJ 插件 ——Imaging FCS 1.52（已针对下述拟合模型进行修改），对采集与模拟得到的图像序列进行自相关与空间互相关计算。 对不同像素的荧光强度时间轨迹进行自相关运算；或对在 x、y 方向上相隔一定距离的两个特定像素的强度轨迹，按时间间隔τ进行互相关运算，计算公式如下：

对于自相关而言，δx和 δy 均为 0。通过将自相关曲线与互相关曲线拟合至自由三维扩散拟合模型，即可得到扩散系数。我们对 Wohland 等人（2010）[40] 推导的拟合公式进行了修正，以计入离焦粒子引发的像素间信号串扰（公式 4）。这一修正改变了探测体积，如图 3a 所示。由此得到的修正互相关模型为：

其中：

· a = 正方形像素的边长

· D= 扩散系数

· ωz= 光片厚度的 1/e² 半径

· r_x、r_y = 用于进行互相关计算的像素对在 x方向、y 方向上的间距

· ⟨C⟩= 时间平均浓度；浓度 C与像素观测体积 V 内的粒子数密度 N满足关系：⟨C⟩=⟨N⟩/V

该方程在 -2omega_{z} 与 2omega_{z} 之间进行了数值积分，以捕捉Z轴上高斯光束的几乎所有信息。上述方程的推导过程见附录C。

用于拟合的像素尺寸（a）值为400纳米，ω (工 号)的值为515纳米，ωz的值为1.13微米。

按照《优化用于体内测量的SPIM-sFCCS》一节中所述的方法，我们检查了记录数据中是否存在与运动和漂移相关的伪影：具体来说，我们核对了正向和反向拟合的结果，仅保留那些数值差异在平均扩散系数（D）值30%范围内的结果。

相机有限的时间分辨率（约1毫秒）可能导致自相关拟合不准确，无法捕捉图3d中快速扩散系数(60 mu m^{2} / s。此外，与模拟不同，细胞背景的轻微运动会导致采集数据的荧光强度轨迹出现与扩散无关的低频波动。这些伪影会影响更长滞后时间的相关性，通常会产生类似双组分自相关函数的相关曲线，或使单组分拟合偏向更低的扩散系数D值。因此，为了可靠地拟合采集数据的自相关函数，我们对像素进行分箱以形成较大区域，让分子停留足够时间以提供自相关统计数据，并且仅将早期滞后时间(<100 ~ms)纳入拟合范围（图3e以及图5d的结果）。

所有CCF均在假设仅存在一种扩散组分的前提下进行拟合。在荧光微球扩散分析中，选择感兴趣区域（ROI）以反映溶液中最低的拟合浓度N和最高的扩散系数D，确保使用来自光片的最薄体积，并避免纳入微球簇产生的任何强度尖峰，因为这些尖峰会导致相关性出现伪影。在活体测量分析中，选择感兴趣区域（ROI）以确保捕捉到宽度恒定的通道样空间，同时避免漂移相关伪影对结果产生偏差。通过测量宽度恒定通道最薄区域的半高全宽来量化通道宽度。由于使用的像素合并（binning）最大为4像素，空间维度的CCF通过5（2微米）、9（3.6微米）、13（5.2微米）的像素间距进行拆解分析（图5d）。

对于斜向通道（图4f、5a窄通道、补充图7c、9a、b中的示例），采用了x和y间距的组合，以获得与上述相同的间距。

统计学与可重复性

在 Mathematica 中对类通道空间的扩散进行模拟得到的结果（图2c、补充图1c、d）以及通过SPIM-sFCCS技术得到的结果（图3c、补充图5b、d、e、f）均来自对3个独立模拟种子的评估。针对不同的实验处理案例，在将基于通道宽度的结果划分为窄通道和宽通道两类时，通过对多个胚胎进行独立的通道测量完成了结果的重复验证，具体样本量详见图5c、5d的图例以及附录H补充表2的对应说明。同样，对于附录G补充表1中的Sqt EGFP梯度测量结果，在Acvr2b吗啉寡核苷酸处理组和未处理组的每一种情况下，均通过对多个胚胎进行独立测量实现了结果的重复验证。

在 Origin Pro 2026（美国马萨诸塞州北安普顿的 OriginLab 公司）中进行双侧 Welch 检验，以量化图 5c 和 5d 中不同通道类型之间的成对差异、图 5d 中不同分离距离之间的差异，并评估图 5c 中 Lefty2 蛋白添加或 Acvr2b 基因敲低的影响。

未使用任何统计方法预先确定样本量。对于SPIM-sFCCS技术，从测量的图像堆栈中裁剪出包含通道样空间的感兴趣区域（ROI），仅纳入通道内部区域进行评估。如“优化用于体内测量的SPIM-sFCCS（结果）”和“SPIM-sFCCS分析（方法）”章节所述，存在显著细胞运动的测量数据（占测量数据的30%），或其中D_{f w d}与D_{b w d}的数值与平均扩散系数（D）相差超过30%的测量数据被排除（占测量数据的40%）。完成该筛选步骤后，无额外数据被排除在分析之外。

数据可用性。本研究通过模拟生成的数据、SPIM-sFCCS测量和形态发生素梯度测量的原始数据文件，以及分析结果，已存放在新加坡国立大学学者库（NUS ScholarBank）数据库，收录编号为https://scholarbank.nus.edu.sg/handle/10635/318321。本研究生成的图表数据详见本文的源数据文件。