题目：GFPT1 as a cross-ancestry validated target for degenerative spinal disease: genetic association in a Chinese cohort and functional characterization in zebrafish

原文链接:https://doi.org/10.1038/s42003-026-10320-x

期刊：Communications Biology

摘要

退行性脊柱疾病（DSD），包括椎管狭窄症和脊柱关节病，目前缺乏有效的药物治疗手段。为识别可药物治疗的靶点并评估跨祖先适用性，本研究整合多组学分析，采用基于摘要数据的孟德尔随机化（SMR）、共定位分析以及双样本孟德尔随机化，结合欧洲人群全血、外周血和脑脊液的表达数量性状位点/蛋白数量性状位点（eQTL/pQTL）数据集，随后在中国队列中进行全基因组测序（WGS）验证。研究共识别出7个与椎管狭窄症相关的基因/蛋白，以及5个与脊柱关节病相关的基因/蛋白，其中GFPT1、GPX1和SERPINA1为两种疾病共有。双样本孟德尔随机化进一步证实了这些靶点与退行性脊柱疾病的因果关联。全表型孟德尔随机化优先筛选结果显示，GFPT1和GPX1为优选候选靶点，它们无预测的不良反应，且对高血压可能具有潜在益处。在中国队列（67例腰椎管狭窄症患者和100例健康对照）中，全基因组测序识别出4个与腰椎管狭窄症风险相关的GFPT1顺式表达数量性状位点（cis-eQTL）（rs13016371、rs35392088、rs12997521和rs13019789）；所有风险等位基因均与GFPT1表达升高相关，且24名变异携带者的影像学检查均显示存在L4/L5节段椎管狭窄。可药物性分析确定IOX1是唯一靶向GFPT1的临床前阶段化合物，分子对接结果证实其能与GFPT1紧密结合（结合能为-6.39千卡/摩尔）。功能实验表明，IOX1可直接抑制GFPT1的酶活性，并诱导6-磷酸果糖的积累。在斑马鱼模型中，IOX1能显著挽救GFPT1诱导的退行性表型。这些研究结果证实GFPT1是经跨祖先验证的退行性脊柱疾病治疗靶点，并提名IOX1为极具潜力的疾病修饰候选药物。

关键词：退行性脊柱疾病、GFPT1、跨祖先验证、斑马鱼模型、治疗靶点、孟德尔随机化

引言

退行性脊柱病（DSD），如椎管狭窄症和脊柱关节病，是由脊柱结构（包括椎骨、椎间盘及支持组织）的自然退变引发的。该病主要发病人群为中老年人，常表现为慢性颈痛或背痛、活动受限，且生活质量显著下降¹ˏ²。随着全球人口老龄化，退行性脊柱病的患病率和社会负担持续攀升，给医疗系统及患者均带来了巨大挑战。目前，该病的治疗仍高度依赖手术干预来缓解症状。然而，这些手术存在术后感染和脊柱退行性变加速等风险3,4。

新兴证据强调遗传因素是椎间盘退变疾病（DSD）发病机制的关键促成因素。研究已发现众多与椎间盘退变疾病相关的遗传变异和易感基因，尤其是那些影响脊柱完整性、骨质疏松易感性和炎症反应等关键生物学过程的基因。典型例子包括：COL1A1、COL1A2、COL9A、COL9A2、COL9A3、ACAN 和 CILP 与腰椎间盘突出症中椎间盘的组成相关；VDR 以及 (E R) 与骨骼结构相关；MMP3 和 IL1 参与椎间盘内的基质降解。尽管在遗传学方面取得了这些进展，但椎间盘退变疾病的分子治疗靶点仍基本未被明确。因此，更深入地了解与椎间盘退变疾病相关的遗传因素，能够加深我们对其病因的认识，并为预防策略、分子治疗以及靶向药物研发奠定基础。

可成药靶点的识别是药物研发中关键的第一步。尽管多组学研究的进展加速了疾病相关生物标志物和治疗靶点的发现，但蛋白质组学与转录组学数据之间的交叉验证显著提高了这些研究结果的可靠性。这一点在表达数量性状位点（eQTLs）和蛋白质数量性状位点（pQTLs）的表达中尤为明显，这些位点与基因和蛋白质表达水平存在强烈相关性8,9。目前，孟德尔随机化（MR）方法主要利用这些来自欧洲人群的多组学数据集，结合疾病全基因组关联研究（GWAS）汇总统计数据，将因果基因/蛋白质作为候选靶点进行优先排序治疗靶点。然而，该策略仅在欧洲裔人群中验证了靶点的可行性，严重限制了其跨人群的普适性。通过利用来自不同人群的全基因组测序（WGS）数据开展跨种族验证，能够显著提升这些靶点的通用性和可靠性。此外，将全基因组测序与临床实践深度融合，结合个体电子健康记录和定量临床影像数据，不仅可以分析多层疾病调控网络、评估患者的遗传风险，还能大幅增强候选靶点的生物学合理性，以及其作为跨种族治疗靶点的潜力10。

本研究以全血、外周血和脑脊液来源的大规模表达数量性状位点（eQTL）和蛋白数量性状位点（pQTL）数据为暴露因素，结合两种退行性脊柱疾病（DSD）表型（椎管狭窄症和脊椎关节病）的全基因组关联研究（GWAS）汇总统计数据，开展整合性基因位点分析（SMR）、共定位分析和全表型孟德尔随机化（MR）分析，旨在筛选具有良好安全性的治疗靶点。本研究的创新之处在于，利用中国腰椎管狭窄症（LSS）患者的全基因组测序（WGS）数据，验证了优先筛选靶点的跨祖先适用性。随后通过药物预测和分子对接技术评估靶点的成药性，并探索治疗退行性脊柱疾病的潜在药物。进一步通过斑马鱼模型开展药理学验证，以确认候选化合物的治疗潜力。

结果

通过SMR分析和共定位分析识别退行性脊柱疾病的候选可药物基因

整体研究设计的细节和数据来源分别展示于图1和补充数据1。研究人员针对eQTLGen联盟中2235个具备可用索引顺式eQTL信号的全血可药物基因，与两种椎间盘疾病（椎管狭窄和脊椎关节病）表型进行了SMR分析。经FDR校正（FDR_(P<0.05）及HEIDI检验( P_{-}HEIDI >0.05)后，共识别出6个与椎管狭窄相关的基因（图2A及补充数据2），其比值比（ORs）范围为0.74（95%置信区间，0.63-0.86）至1.70（95%置信区间，1.37-2.11）（图2D及补充数据2）。此外，经错误发现率（FDR）校正后，发现4个基因与脊柱病变相关（FDR_(P<0.05），以及异质性在连锁不平衡下的独立性检验（HEIDI test (P_{-} HEIDI >0.05）（图2A及补充数据3），其比值比（OR）范围为0.67（95%置信区间，0.55-0.82）至1.50（95%置信区间，1.25-1.81）（图2E及补充数据3）。在CAGE联盟中，对1593个具有可用索引顺式表达数量性状位点（cis-eQTL）信号的外周血可药物基因开展了与两种发育性脊柱畸形（DSD）表型相关的甲基化敏感性回归（SMR）分析。经FDR校正后，鉴定出3个与椎管狭窄相关的基因（FDR_(P<0.05）以及HEIDI检验（P_{-} HEIDI >0.05）（图2B及补充数据2），其OR范围为0.74（95%置信区间，0.64-0.86）至1.19（95%置信区间，1.13-1.25）（图2D及补充数据2）。对于脊柱病变，经FDR校正（FDR_P<0.05）及HEIDI检验（ P_{-}HEIDI >0.05)_HEIDI>0.05）后鉴定出3个基因（图2B及补充数据3），其OR范围为1.07（95%置信区间，1.04-1.09）至1.11（95%置信区间，1.07-1.16）（图2E及补充数据3）。同时，对NIAGADS联盟中151个具有可用索引顺式蛋白数量性状位点（cis-pQTL）信号的脑脊液可药物蛋白开展了SMR分析。该分析经FDR校正后，鉴定出3个与椎管狭窄相关的脑脊液蛋白（FDR_(FDR P<0.05）以及HEIDI检验（P_{-} HEIDI >0.05）（图2C及补充数据2），其OR范围为0.44（95%置信区间，0.29-0.67）至0.83（95%置信区间，0.76-0.89）（图2D及补充数据2）。对于脊柱病变，经FDR校正（FDR P<0.05）及HEIDI检验（P_{-} HEIDI >0.05）后鉴定出2个脑脊液蛋白（图2C及补充数据3），其OR范围为0.48（95%置信区间，0.33-0.69）至0.86（95%置信区间，0.80-0.92）（图2E及补充数据3）。

图1. 研究设计流程图。DSD：退行性脊柱病；CSF：脑脊液；SS：椎管狭窄；SO：脊椎病；SMR：基于汇总数据的孟德尔随机化；ciseQTL，顺式表达数量性状位点；cis-pQTL，顺式蛋白质数量性状位点；FDR，错误发现率；PH4，H4的后验支持概率；WGS，全基因组测序。

图2. 展示SMR分析结果的火山图和森林图。A：来自eQTLGen数据库、FDR为P<0.05的基因火山图。B：来自CAGE数据库、FDR为 P<0.05的基因火山图。C：来自NIAGADS数据库、FDR为 P<0.05的脑脊液蛋白火山图。D：展示椎管狭窄症SMR分析结果（FDR为P<0.05）的比值比（95%置信区间）森林图。E：展示脊椎病SMR分析结果（FDR为 P<0.05）的比值比（95%置信区间）森林图。OR：比值比；SMR：基于汇总数据的孟德尔随机化；CI：置信区间。

接下来，我们采用贝叶斯方法对通过SMR鉴定出的与退行性脊柱疾病（椎管狭窄和脊椎病）相关的潜在因果可药物化基因进行共定位分析。该分析显示，与椎管狭窄相关的7个基因/蛋白质（GFPT1、GPX1、LYG1、DLK1、HLA-C、STK36和SERPINA1）具有较高的共定位支持度（P_{H 4}>0.8)，见图3A和补充数据4），而与脊椎病相关的5个基因/蛋白质（GFPT1、STK25、STK36、GPX1和SERPINA1）也表现出较高的共定位支持度（PH_{4}>0.8)，见图3B和补充数据4）。

图3. 可药物基因与DSD两种表型的共定位分析。A：可药物基因与椎管狭窄的共定位分析柱状图。B：可药物基因与脊柱病的共定位分析柱状图。颜色代表基因来源的数据库；柱长和数值代表PH4值。

值得注意的是，通过SMR和共定位分析在全血和脑脊液中鉴定出的3个基因/蛋白（GFPT1、GPX1和SERPINA1）均与椎管狭窄症和脊椎病相关。GFPT1水平升高（椎管狭窄症的比值比：1.19，95%置信区间：1.13-1.24；脊椎病的比值比：1.11，95%置信区间：1.07-1.16）和GPX1水平升高（椎管狭窄症的比值比：1.70，95%置信区间：1.37-2.11；脊椎病的比值比：1.50，95%置信区间：1.25-1.81）可能会增加患椎管狭窄症和脊椎病的风险，而SERPINA1水平降低（椎管狭窄症的比值比：0.44，95%置信区间：0.29-0.67；脊椎病的比值比：0.48，95%置信区间：0.33-0.69）则可能导致椎管狭窄症和脊椎病的发生（图2D、E及补充数据2、3）。因此，这3个基因/蛋白有望作为退行性脊柱疾病的潜在治疗靶点。

双样本孟德尔随机化验证

为进一步明确3个基因/蛋白与发育性结构缺陷（DSD）之间的因果关系，我们开展了两样本孟德尔随机化（MR）分析。由于谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶1（GFPT1）拥有多个工具变量（IVs），故采用逆方差加权（IVW）法进行MR分析；而谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）和丝氨酸蛋白酶抑制剂A1（SERPINA1）均仅含一个工具变量，因此采用沃尔比率法进行MR分析。本研究用于分析的所有工具变量的F统计量均大于10（补充数据5）。结果显示，GFPT1（椎管狭窄症的比值比[OR]：1.18，95%置信区间[CI]：1.09-1.27；脊椎病的OR：1.12，95%CI：1.04-1.21）、GPX1（椎管狭窄症的OR：1.70，95%CI：1.39-2.07；脊椎病的OR：1.50，95%CI：1.26-1.79）和SERPINA1（椎管狭窄症的OR：0.44，95%CI：0.31-0.63；脊椎病的OR：0.48，95%CI：0.35-0.65）均与椎管狭窄症和脊椎病的发病风险相关，且效应方向与结构方程模型（SMR）结果一致（补充数据6）。此外，针对使用多个工具变量的MR分析结果进行了敏感性分析：GFPT1与椎管狭窄症的敏感性检验未发现水平多效性（P underline pleiotropy =0.81），异质性检验（MR Egger法）P=0.06（IVW)=0.13）；GFPT1与脊椎病之间未检测到水平多效性（P underline pleiotropy =0.70），尽管MR Egger法检出异质性（P异质性=( MR Egger )=0.03），但后续的IVW法未检出异质性（P异质性=(IVW)=0.05），证明两样本MR分析结果具有可靠性样本孟德尔随机化分析结果稳健（补充数据6）。双样本孟德尔随机化分析进一步证实了3种基因/蛋白（GFPT1、GPX1和SREPINA1）与迟发性干燥综合征存在显著的因果关系，表明这些基因/蛋白有望成为治疗迟发性干燥综合征的药物靶点。

与DSD相关的候选可药物基因的全表型组孟德尔随机化分析

为评估靶向这3个候选可药物基因组是否会引发副作用并评估药物给药的安全性，我们在UKB-SAIGE中对782种非DSD疾病或性状进行了全表型组孟德尔随机化（MR）分析。用于分析的3个可药物基因的工具变量（IVs）与此前用于双样本MR分析的一致。通过全表型组MR分析并结合错误发现率（FDR）校正（FDR_ (P<0.05），我们发现GFPT1和GPX1水平升高会增加高血压风险（GFPT1：比值比[OR]=1.07，95%置信区间[CI]=1.04-1.11；GPX1：OR=1.30，95% CI=1.15-1.47）及原发性高血压风险（GFPT1：OR=1.07，95% CI=1.04-1.10；GPX1：OR=1.30，95% CI=1.15-1.47），且效应方向与DSD的效应方向一致（图4A、B及补充数据7、8）。然而，SERPINA1水平的变化与35种疾病或性状相关，其中20种与DSD的效应相反（图4C及补充数据9）。这一结果表明，靶向GFPT1和GPX1治疗DSD的药物靶点可能无副作用，且对治疗DSD、高血压和原发性高血压有益；而靶向SERPINA1的药物靶点则可能存在副作用。

图4. 3个可药物基因的全表型组孟德尔随机化分析。A：曼哈顿图展示了GFPT1与782种非性发育异常疾病或性状之间的潜在因果关系。B：曼哈顿图展示了GPX1与782种非性发育异常疾病或性状之间的潜在因果关系。C：曼哈顿图展示了SERPINA1与782种非性发育异常疾病或性状之间的潜在因果关系。X轴代表表型类别，Y轴代表 -log10(FDR_P)。黑色虚线之外的散点表示疾病或性状与可药物基因之间存在显著相关性（FDR_ P<0.05）。SERPINA1的全表型组孟德尔随机化结果仅展示了每个表型类别中与SERPINA1相关性最强的疾病或性状。FDR_P：经错误发现率校正后的P值。

中国腰椎管狭窄症人群中GFPT1和GPX1的顺式表达数量性状位点突变频率统计

为了探究GFPT1表达量的变化是否会影响中国人群中的腰椎管狭窄症（LSS），我们以eQTLGen联盟提供的6613个GFPT1的顺式表达数量性状位点（cis-eQTLs）和3489个GPX1的顺式表达数量性状位点（cis-eQTLs）作为背景参考进行了分析（补充图1和图2）。我们从67名腰椎管狭窄症（LSS）患者和100名健康对照者的全基因组测序（WGS）数据中提取了GFPT1和GPX1的所有突变位点，并剔除了ClinVar数据库中已知为良性的突变位点。最终在GFPT1中鉴定出179个单核苷酸多态性（SNPs）LSS患者中存在211个单核苷酸多态性（SNP），而健康对照组中为0个；GPX1基因在LSS患者中存在1个SNP，对照组中为0个（补充图1和图2）。将LSS患者、健康对照组的基因位点与eQTLGen联盟的背景参考数据进行交集分析，我们发现GFPT1基因的82个SNP和GPX1基因的0个SNP在这三个数据集中均为共有（补充图1和图2）。对1000基因组东亚人群、健康对照组和LSS患者中这82个GFPT1基因SNP的分析显示，LSS患者中4个顺式表达数量性状位点（cis-eQTL）的突变频率升高（补充数据10）。值得注意的是，这4个位点——rs13016371、rs35392088、rs12997521和rs13019789——均来自血液组织的eQTL数据（eQTLGen联盟），这些位点在分析中均表现出显著的正向效应，表明其风险等位基因与GFPT1基因表达水平升高相关（补充数据11）。在我们的研究队列中，这些位点的突变频率如下：rs13016371为0.358208955（24/67），rs35392088为0.328358209（22/67），rs12997521为0.313432836（21/67），rs13019789为0.313432836（21/67）。这些频率均高于1000基因组东亚人群（所有位点均为0%）和健康对照组（所有位点均为0%）的水平（图5A，补充数据10）。维恩图分析显示，20名患者同时携带这4个突变，1名患者缺失rs35392088，1名患者缺失rs12997521，2名患者仅携带rs13016371（图5B）。所有24名携带至少1个上述突变的患者（患者编号(with ≥1）在影像学检查中均表现为L4/L5节段腰椎管狭窄（图5C）。这些研究结果表明，GFPT1基因表达的改变可能会增加腰椎管狭窄症（LSS）的发病风险，进一步验证了我们的孟德尔随机化（MR）结果，并提示GFPT1基因可作为中国人群中椎间盘退行性疾病（DSD）的潜在治疗靶点。

图5. 中国腰椎管狭窄症患者的全基因组测序及影像学分析。A：GFPT1突变位点及其在腰椎管狭窄症患者、1000基因组东亚人群和健康对照中的频率统计。B：韦恩图展示GFPT1的4个顺式表达数量性状基因座（rs13016371、rs35392088、rs12997521和rs13019789）所对应的病例数量分布统计。C：24例携带GFPT1 4个顺式表达数量性状基因座（rs13016371、rs35392088、rs12997521和rs13019789）的腰椎管狭窄症患者的影像学数据。

成药性评估与分子对接

我们查询了药物数据库（DGIdb、ChEMBL 和 Drugbank 在线数据库）以评估 GFPT1 的成药性，发现 IOX1 是目前唯一靶向 GFPT1 的临床前阶段化合物（补充数据12）。为了评估 IOX1 与 GFPT1 之间的相互作用模式和亲和力，我们开展了分子对接分析。通过对疏水相互作用、氢键、π-阳离子相互作用以及盐桥形成的分析可知，作为 GFPT1 抑制剂的 IOX1 与 GFPT1 具有很强的结合亲和力（结合能：-6.39 千卡/摩尔）（图6A）。这种多模态结合特征，再加上良好的能量动力学特性，使IOX1成为治疗DSD的有潜力候选药物，值得进一步研究。

IOX1 直接抑制 GFPT1 的活性

为了明确 IOX1 是否直接抑制 GFPT1 的酶活性（而非通过其组蛋白去甲基化酶抑制活性间接发挥作用），我们开展了体外及细胞内酶功能分析。首先，通过谷氨酸脱氢酶法，我们发现 IOX1 可显著抑制 GFPT1 的酶活性，这一现象在野生型和 GFPT1 过表达的 HEK293T 细胞中均有体现（图 6B、补充数据 13，独立生物学样本编号 n=3）。随后，通过监测 GFPT1 的底物果糖-6-磷酸（F-6-P）的代谢动态变化，我们观察到 IOX1 处理后，野生型和 GFPT1 过表达的 HEK293T 细胞中 F-6-P 均出现显著积累（图 6B、补充数据 13，独立生物学样本编号 n=3）。这表明 IOX1 对细胞内 GFPT1 的催化通量存在直接抑制作用。综上，体外酶活性测定与细胞内代谢通量分析的结果一致，证实 IOX1 可在功能层面直接抑制 GFPT1 的酶活性。

GFPT1过表达会导致斑马鱼出现脊柱特异性缺陷，而IOX1可逆转该缺陷

鉴于四个优先的顺式表达数量性状位点（cis-eQTL）在人类遗传分析中均一致指向GFPT1表达增加为风险方向，我们通过在斑马鱼胚胎中过表达野生型人类GFPT1信使核糖核酸（mRNA，转录本编号NM_002056），在体内构建了基因推断的“高表达”状态。该策略旨在重现孟德尔随机化分析提示的功能获得性条件，而非模拟某一特定编码变异。

在受精后3天进行的蛋白质印迹分析证实，与对照组相比，注射胚胎中GFPT1蛋白水平显著升高，验证了外源mRNA的有效翻译（补充图4-6、补充数据14）。因此，后续的表型变化可归因于真实的GFPT1过表达，而非注射相关的人为误差。

此前有研究报道 GFPT1 缺乏会损害神经肌肉传递，因此我们接下来评估了 GFPT1 过表达是否可能诱发继发性神经肌肉异常，而这些异常或许能解释身体弯曲的改变。在受精后3天（3 dpf），偏振光双折射分析显示，GFPT1 过表达胚胎的体节结构和肌纤维排列均正常。鬼笔环肽染色进一步证实肌节结构和肌动蛋白丝组织得以保留。此外，α-银环蛇毒素（α-BTX）免疫荧光分析表明，神经肌肉接头（NMJ）处的乙酰胆碱受体聚集与分布均正常，未检测到结构缺陷（补充图7，斑马鱼胚胎编号n=8）。这些结果表明，在本实验条件下，GFPT1 过表达不会破坏肌肉完整性或神经肌肉接头的结构。

相比之下，到受精后7天（7 dpf），过表达GFPT1的斑马鱼出现明显的脊柱弯曲，体长也有所缩短（图6C和D，n=8 斑马鱼胚胎）。通过苏木精-伊红（HE）染色进行的组织学分析显示，弯曲部位的脊索空泡发育存在明显缺陷，同时伴有炎性细胞浸润。LysoTracker染色进一步证实脊索内的空泡形成受到损伤（图6C，n=8 斑马鱼胚胎）。与此同时，与椎间盘退变（DSD）相关的标志基因表达显著失调（图6E，补充数据15，n=3 数据15，n=3个独立的生物学样本），成骨和成软骨分化标志物的表达水平相较于野生型对照组显著下调（图6F，补充数据15，n=3 独立生物学样本）。综上，这些研究结果表明，GFPT1水平异常升高会破坏脊柱发育，这一过程可能通过损伤脊索成熟和引发局部炎症反应实现，从而再现了与退行性脊柱疾病相关的关键病理特征。值得注意的是，用5毫克/升的IOX1处理过表达GFPT1的斑马鱼，可显著改善脊柱弯曲情况并恢复体长（图6C和D，n=8 斑马鱼胚胎）。这种表型恢复伴随着脊索结构的改善，以及与DSD、成骨和成软骨相关的基因表达恢复正常（图6E和F，补充数据15，n=3个独立的n=3 独立生物学样本）。这些结果证实，通过药物抑制GFPT1可IOX1 逆转了 GFPT1 过表达诱导的关键结构和分子异常，支持其在 DSD 中的治疗潜力。

图6. IOX1作为DSD潜在治疗药物的分子对接及体内实验分析。A：IOX1与GFPT1的分子对接结果。B：GFPT1酶活性及F-6-P含量的测定。C：对照组、GFPT1过表达组和IOX1处理组斑马鱼脊柱与脊索的发育表型。D：对照组、GFPT1过表达组和IOX1处理组斑马鱼体长的统计图。E：对照组、GFPT1过表达组和IOX1处理组斑马鱼中DSD相关标记基因的相对表达水平。F：对照组、GFPT1过表达组和IOX1处理组斑马鱼中成骨和成软骨标记基因的相对表达水平。黑白实线为标尺，前两条黑色实线分别代表200μm和100μm，白色实线代表20μm。B、E、F中每个数据点代表独立的生物学样本（n=3个独立生物学样本），D中每个数据点代表1条斑马鱼胚胎（n=8条斑马鱼胚胎）。数据为三次独立实验的平均值±标准误，*{*} p<0.05、** p<0.01和* * * p<0.001（Student's t检验）。

讨论

据我们所知，本研究是首个通过整合先天性脊柱侧凸相关表型的全基因组关联研究（GWAS）大规模数据与4463个潜在可药物化基因，开展系统性跨组织、多组学孟德尔随机化（MR）研究以识别与先天性脊柱侧凸相关治疗靶点的研究。通过孟德尔随机化和共定位分析，我们的研究揭示了7个与椎管狭窄相关的候选可药物化基因，以及5个与颈椎病相关的候选可药物化基因/蛋白质。其中，GFPT1、GPX1和SERPINA1成为两种疾病共有的治疗靶点，全表型孟德尔随机化分析证实GFPT1和GPX1具有良好的安全性特征。关键的是，我们在中国人群队列中通过全基因组测序验证了GFPT1表达水平与腰椎管狭窄症（LSS）发病风险的关联。分子对接实验证实IOX1与GFPT1存在稳定结合，进一步揭示了GFPT1的可药物化潜力。后续斑马鱼实验证实IOX1在改善先天性脊柱侧凸表型方面具有治疗效果。因此，GFPT1有望成为治疗先天性脊柱侧凸的跨祖先治疗靶点。

GFPT1 是己糖胺生物合成途径中的主要限速酶。尽管 GFPT1 的失调已被证实与先天性重症肌无力和乙酰胆碱缺乏相关，但此前尚无研究探讨其与 11、12 型发育性脊柱畸形（DSD）的关联。既往研究表明，GFPT1 的表达在破骨细胞分化过程中会上调 13。我们的孟德尔随机化（MR）分析显示，GFPT1 表达降低会增加椎管狭窄和脊柱关节病的发病风险。全基因组测序（WGS）验证进一步证实，在中国人群中，GFPT1 表达变异与腰椎管狭窄症（LSS）的易感性相关。因此，我们推测血液中 GFPT1 水平升高可能会促进破骨细胞增殖，破坏骨重塑稳态，最终导致椎管狭窄和脊柱关节病的发生。本研究首次提出 GFPT1 在 DSD 发病机制中的潜在作用，值得进一步开展机制研究。

尽管GFPT1是发育性脊柱畸形（DSD）的优先治疗靶点，但GPX1和SERPINA1的潜力仍需通过实验验证其成药性和生物学机制来进一步研究。GPX1作为一种含硒谷胱甘肽过氧化物酶，与软骨稳态相关：低硒状态与以软骨畸形为特征的骨关节病相关¹⁴。此外，敲低GPX1会抑制ATDC5细胞的软骨分化，且GPX1突变与骨关节病显著相关¹⁵,¹⁶。然而，目前尚无深入研究探讨GPX1与DSD之间的密切关系。我们的孟德尔随机化（MR）和共定位分析表明，血液中GPX1水平升高可能增加脊柱狭窄和脊柱病的风险。因此，我们假设GPX1过表达可能促进过度软骨形成，进而诱发DSD。SERPINA1编码一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，其上调已被证实可缓解椎间盘退变¹⁷。我们的MR研究进一步证实，脑脊液中SERPINA1水平降低会增加脊柱狭窄和脊柱病的风险，后续共定位分析也验证了这一发现。

源自DGIdb数据库的GFPT1抑制剂IOX1在分子对接研究中表现出对GFPT1的强结合亲和力，这表明其对于存在GFPT1异常过表达的疾病具有治疗潜力，例如本研究中发现的DSD风险升高情况。药理学实验进一步证实，IOX1能有效挽救GFPT1过表达斑马鱼的脊柱弯曲缺陷。IOX1是一种广谱2-氧代戊二酸（2OG）加氧酶抑制剂，可抑制多种加氧酶活性¹⁸。该药物已被广泛应用于多种疾病的药物研发领域。现有证据表明IOX1具有显著的抗炎特性，凸显了其在炎症性疾病治疗中的应用前景¹⁹。此外，它在结直肠癌等癌症的治疗中也展现出疗效，但其在DSD治疗中的相关作用尚未见报道²⁰。鉴于炎症在DSD发病机制中的既定作用，我们推测IOX1可能通过双重机制缓解DSD的进展：一是直接抑制GFPT1（已在对接实验和斑马鱼模型中得到验证），二是抑制炎症级联反应。

本研究的优势与创新点如下。首先，这是首次对发育性睡眠障碍（DSD）的药物靶点进行大规模筛选，整合多组织数据进行顺式孟德尔随机化（SMR）和共定位分析，筛选出多个可为DSD治疗提供潜在靶点的基因。其次，通过全表孟德尔随机化（Phenome-wide MR）对这些候选靶点的潜在副作用、有益效应及成药性进行了评估。第三，通过全基因组测序（WGS）在中国人群中进一步验证了GFPT1的临床相关性及跨祖先适用性，证实其与长睡眠者睡眠障碍（LSS）风险相关，进一步确立了其作为DSD治疗靶点的候选资格。最后，开展了体内实验，进一步提升了IOX1作为DSD治疗药物的生物学合理性。

本研究存在一定局限性。首先，研究结果表明GFPT1可能通过涉及破骨细胞、成骨细胞和软骨形成的机制影响脊柱发育，但目前缺乏哺乳动物系统中直接的细胞和机制学证据，例如破骨细胞生成实验、软骨细胞分化模型或髓核细胞实验等。未来研究应优先开展这些功能验证，以明确相关的具体细胞通路。其次，本研究的功能解读主要基于血液或脑脊液来源的QTL数据，而四个筛选出的遗传变异在脊柱相关细胞类型（如软骨、椎间盘或骨组织）中的调控作用尚未得到系统验证。后续需借助疾病相关细胞模型或组织特异性QTL资源开展进一步研究，以确认其局部调控功能。第三，整合不同分析平台的QTL数据可能为研究分析引入异质性。此外，尽管本研究检测了大量基因，但仍可能遗漏了eQTLGen、CAGE和NIAGADS数据集中缺乏合适工具变量的部分重要基因。最后，已识别基因对发育性脊柱疾病风险的预测价值，还需在独立临床队列中开展深入研究。后续研究中，我们计划结合体外哺乳动物细胞模型、类器官系统和共培养实验来弥补这些不足，旨在将这些遗传研究发现转化为具有生物学和临床应用价值的机制。

综上所述，我们在血液和脑脊液中发现了3个与2种退行性脊柱疾病（腰椎管狭窄症和脊椎病）表型相关的潜在药物靶点（GFPT1、GPX1和SERPINA1）。其中，针对GFPT1和GPX1开发退行性脊柱疾病治疗药物未显示潜在副作用。中国人群队列的全基因组测序分析表明，GFPT1与腰椎管狭窄症的发病风险相关，凸显了其跨种族适用性。分子对接实验证实GFPT1具有良好的成药性，提示IOX1可能是治疗GFPT1异常表达所致退行性脊柱疾病的潜在治疗剂。体内药理实验进一步证实了IOX1治疗退行性脊柱疾病的潜力。这些研究结果为退行性脊柱疾病的遗传机制和治疗策略提供了新见解。但需注意，本研究结论尚处于初步阶段，仍需通过临床和实验研究进一步验证。

方法

研究设计

本孟德尔随机化研究依据《加强流行病学观察性研究报告的STROBE-MR》指南开展。

图1展示了本研究设计的示意图。暴露因素所需的eQTL和pQTL数据来源于3个渠道：eQTLGen联盟、CAGE和NIAGADS（补充数据1）。作为结局指标的DSD相关表型数据来自FinnGen R9研究和英国生物银行研究（补充数据1）。本研究使用的公开GWAS、eQTL和pQTL汇总统计数据均来源于已有伦理批准和参与者知情同意的研究，相关信息在原始出版物中已有报道。本项涉及人类参与者的研究已获内蒙古医科大学医学伦理委员会批准（批准号：YKD202301033）。所有参与者在血样采集和全基因组测序分析前均签署了书面知情同意书。本研究未使用任何软件进行数据收集。研究严格遵守所有与人类研究参与者相关的伦理规范。

可药物靶向基因列表

本研究中讨论的可药物化基因源自 Finan C 等人的一篇综述，该综述在 20300 个蛋白质编码基因中识别出了 4479 个可药物化基因。本研究剔除了 16 个假基因，使用了剩余 4463 个具有独特基因符号的基因²⁵。

QTL 数据来源

eQTLGen联盟对37个队列的31684份血液样本开展了大规模荟萃分析，鉴定出16989个基因的顺式表达数量性状位点（cis-eQTLs）²⁰。本研究将其与4463个潜在可药物化基因取交集后，得到2235个可药物化基因。本研究使用的1593个外周血可药物化基因的顺式-eQTLs来自CAGE数据库，该研究通过全基因组关联分析纳入了2765名个体的8080个外周血基因²¹。本研究采用的151个脑脊液可药物化基因的顺式蛋白数量性状位点（cis-pQTLs）源自NIAGADS数据库，该数据库包含对181种脑脊液蛋白（涉及835名个体）进行全基因组关联分析后得到的汇总统计数据²²。上述顺式数量性状位点（cis-QTLs）的窗口大小均为1兆碱基（1Mb），全基因组显著水平的cis-QTLs（P<5 ×10^{-8}）被纳入SMR分析。SMR分析过程中，以1000 Genomes计划的欧洲人群参考数据为基准进行了聚类分析。

双性发育异常两种表型的数据源

芬恩基因R9研究和英国生物银行研究提供了两种退行性脊柱疾病表型（包括椎管狭窄和脊椎病）的全基因组关联分析汇总统计数据。芬恩基因和英国生物银行中患有这两种退行性脊柱疾病表型的所有参与者均为欧洲血统23,24，且基础研究数据同时包含女性和男性参与者。芬恩基因R9研究是一项综合性基因组学研究，对来自芬兰生物银行的50万余份样本进行了分析。在该研究中，R9研究包含18,989例椎管狭窄病例和19,892例脊椎病病例，共有270,964名对照参与者23。我们还从英国生物银行获取了两种退行性脊柱疾病表型的汇总数据，其中包括3,733例椎管狭窄病例和5,077例脊椎病病例。患脊柱炎，共设置391,917名对照24。研究基于广义线性混合模型（GLMM），运用SAIGE软件对英国生物银行数据进行分析。研究人员借助GLMM对英国生物银行中约1400个表型码二元表型进行细致分析，涉及约2800万个变异位点，涵盖英国40万名白种人样本。这一方法有效缓解了全基因组关联研究（GWAS）中因病例与对照样本失衡引发的多重假阳性及复杂人群结构问题24。研究以FinnGen和英国生物银行（UKB）中双氢睾酮脱发症（DSD）两种表型的全基因组关联研究（GWAS）元分析结果，作为SMR分析的结局指标。

全基因组关联研究荟萃分析

在进行元分析之前，先对芬根（FinnGen）和英国生物银行（UKB）中双相情感障碍（DSD）的两种表型（椎管狭窄和脊椎病）开展质量控制（QC），包括剔除缺失数据、无意义数值（P>1 以及β值为无穷大或0的情况）、重复的单核苷酸多态性（SNPs）以及MAF<0.5%相关的SNPs，以获得清洗后的数据26。随后使用METAL工具对清洗后的数据进行进一步的全基因组关联分析（GWAS）元分析。本研究采用基于标准误的GWAS元分析方法，同时对所有数据集进行基因组控制、样本重叠校正和等位基因频率追踪27。使用CMplot软件包绘制曼哈顿图（补充图3），以展示双相情感障碍两种表型的GWAS元分析结果28。

SMR分析

我们使用SMR软件工具（1.3.1版）对全基因组显著水平的顺式数量性状位点（cis-QTLs）以及先天性脊柱侧弯和脊柱关节病两种性发育异常（DSD）表型进行了SMR分析（P<5 ×10^{-8}）。我们进一步进行了错误发现率（FDR）校正以去除假阳性结果（FDR_P>0.05），该校正通过R软件（4.3.1版）中的“p.adjust”函数完成。我们还使用R包ggplot2（3.4.4版）绘制火山图和森林图，以可视化呈现FDR校正结果。

双样本孟德尔随机化分析

我们使用TwoSampleMR软件包（0.5.7版）对可药物基因以及两种椎间盘疾病（椎管狭窄和脊椎病）表型进行了双样本孟德尔随机化（MR）分析，以验证孟德尔随机化结合表达数量性状位点（SMR）的分析结果。为满足MR分析中有效工具变量（IVs）对纳入单核苷酸多态性（SNPs）的前提条件，我们采用PLINK软件（1.9版）和ieugwasr工具（0.1.5版），按照以下标准筛选SNPs：首先选取与可药物基因显著相关的SNPs（P<5 times)、10^{-8} ）；随后进行连锁不平衡（LD）聚类分析以筛选SNPs（r^{2}<0.001)，筛选范围为10000千碱基对）。30. 最后，提取出这些独立显著的SNP作为工具变量，并进一步对其进行量化分析通过F统计量进行分析，其中(F-statistics >10)为工具变量的有效性提供了强有力的证据30。这些工具变量也被用于后续的全表型组孟德尔随机化分析。对于包含多个变异的工具变量，我们采用逆方差加权孟德尔随机化法；对于仅单个工具变量，则采用沃尔德比率法。利用ggplot2绘制的森林图展示了双样本孟德尔随机化分析的结果。

敏感性分析

为了提高研究结果的稳健性，我们开展了敏感性分析。在SMR分析中，我们使用SMR软件工具进行了HEIDI检验。我们选取了带有P<1.57 times和10^{-3}标记的顺式数量性状位点（cis-QTL）进行HEIDI检验29。每次HEIDI检验所需的cis-QTL数量最小值为3，最大值为20 29。若满足P_HEIDI > 0.05条件，则表明不存在异质性2。在两样本孟德尔随机化（MR）分析中，我们进行了水平多效性检验和异质性检验。这些检验分别通过TwoSampleMR包中的“mr_pleiotropy_test”和“mr_heterogeneity”函数完成。我们采用MR Egger法和逆方差加权（IVW）法开展水平多效性检验。若满足(P_{-}pleiotropy >0.05)条件，则说明分析中纳入的单核苷酸多态性（SNPs）未受水平多效性影响。我们使用Cochran Q检验来确定分析中各SNPs之间是否存在异质性。若满足(P_{-}heterogeneity >0.05)条件，则表明不存在异质性。

共定位分析

本研究采用Coloc R包（5.2.3版）及贝叶斯方法进行共定位分析[31]。该贝叶斯方法针对以下假设计算后验概率：（i）H0：特定基因组区域内，可药物基因水平（性状1）及DSD的两种表型（椎管狭窄症和脊椎关节病）均无因果变异；（ii）H1：特定基因组区域内，仅性状1存在一个因果变异；（iii）H2：特定基因组区域内，仅性状2存在一个因果变异；（iv）H3：特定基因组区域内，性状1和性状2分别存在两个不同的因果变异；（v）H4：特定基因组区域内，性状1和性状2存在一个共享因果变异。本研究分别设定了SNP仅与性状1相关的先验概率（p1)对应(1 ×10^{-4}）、SNP仅与性状2相关的先验概率（p2)对应1 ×10^{-4}），以及SNP与两种性状均相关的先验概率（p1)对应(1 ×10^{-5}）。若两个信号（was ≥0.8）之间共享因果变异的后验概率（PH4）≥0.8，则认为该结果为共定位提供了强有力的支持；将共定位提供中等支持的判定标准定义为(0.5<PH_{4}<0.8^{31})。本研究使用R包ggplot2绘制柱状图，直观呈现共定位分析结果。这一严谨的方法保障了研究结果的有效性，也为深入理解DSD的遗传基础提供了助力。

全表型组孟德尔随机化

为预测药物安全性和靶向不良反应风险，本研究开展了全表型组孟德尔随机化（MR）分析，基于英国生物银行-SAIGE 24（UKB-SAIGE 24）的欧洲人群数据，系统推断了既往可成药基因表达对782种非性发育障碍（DSD）疾病或性状的因果效应，这些疾病或性状的样本量均超过500。疾病相关单核苷酸多态性（SNP）的汇总统计数据从SAIGE全基因组关联研究（GWAS）数据库下载（网址：https://www.leelabsg.org/resources）。

腰椎管狭窄症患者外周血样本采集

从符合以下纳入标准的中国长段综合征（LSS）患者中采集外周血样本：1）经临床症状和体征确诊，2）影像学影像学证据（X射线、计算机断层扫描或磁共振成像），以及3）由(≥2)资深骨科专家达成的共识。该研究队列包含了女性和男性参与者。按照标准采血流程，血液被采集至乙二胺四乙酸钠抗凝管中。每位成年参与者采集至少5毫升血液，并均分到两支预冷试管中。试管需立即倒置8-10次，以确保抗凝剂充分混匀。样本在初始储存在-80℃前，需进行肉眼检查，确认无溶血或凝血现象。对于( <2 years)的中间保存，样本需保存在-20℃，并经历(with ≤5)次冻融循环。所有样本均采用干冰运输，且在整个保管过程中持续进行温度监测32。

全基因组测序分析

采用DNBSEQ平台进行全基因组测序（WGS）。过滤掉低质量、接头污染以及N碱基比例过高的读段后，每个样本平均获得650,678,982条纯净读段（共97,601,847,381个碱基对）。各样本的纯净读段均表现出较高的Q20和Q30值，表明测序质量良好，平均GC含量为40.93%。利用Burrows-Wheeler比对工具（BWA）将每个样本的读段与参考基因组（GRCh38）序列进行比对。平均99.99%的读段能比对到参考基因组，其中95.13%为唯一比对到参考基因组的读段，重复读段的平均比例为0.87%。去除重复读段后，平均测序深度达32.66倍，每个样本的全基因组区域平均至少有一条读段覆盖。基于比对结果，利用基因组分析工具包（GATK）分析BAM文件中的单核苷酸多态性（SNPs）和插入缺失（InDels），并通过ANNOVAR对结果进行注释，以供后续分析使用。

从eQTLGen联盟中提取并利用GFPT1的顺式eQTL作为背景参考20。提取LSS患者和健康对照全基因组测序数据中GFPT1的所有突变位点，同时排除ClinVar数据库中列出的所有已知良性或可能良性的位点36。对LSS患者、健康对照中经过筛选的基因位点与利用维恩图对来自eQTLGen联盟的背景参考进行可视化。随后，分析交集内这些顺式表达数量性状位点在千人基因组东亚人群、健康对照者和LSS患者中的突变频率，以鉴定出在LSS中突变频率发生显著改变的顺式表达数量性状位点。本文报道的原始序列数据已提交至中国国家生物信息中心/中国科学院北京基因组研究所国家组学数据中心的基因组序列档案库，获取号为GSA-Human: HRA017983。这些数据可通过GSA-Human在https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human 进行受控访问37,38。

成药性

为确定所鉴定的基因是否含有靶向药物，本研究使用DGIdb（4.0版）、ChEMBL和Drugbank在线数据库（6.0版）检索已知药物39-41。为更细致地评估成药可行性，我们根据监管批准情况将所鉴定的靶向基因和药物分为以下几类：（i）已获批（靶向药物已获得批准）；（ii）临床试验阶段（靶向药物目前正在开展临床试验研究）；（iii）临床前阶段（靶向药物处于临床前研发管线）；（iv）成药潜力未知（该靶向药物的最高研发阶段尚不明确）。

分子对接

为进一步开展实验验证并优化潜在药物设计，我们对候选药物及其靶点进行了分子对接，以评估结合能和相互作用模式，从而筛选出与DSD靶点具有强相互作用的药物。本研究使用的小分子结构数据来源于PubChem数据库，GFPT1的蛋白结构则来自蛋白质数据库（PDB）中的6R4E条目42。首先，我们去除了蛋白和配体结构中的所有水分子，并添加极性氢原子。将网格框中心定位以覆盖各蛋白的结构域，同时保证分子具有不受限制的柔性。随后，进行了配体与蛋白的分子对接采用半柔性对接方法进行，所有操作均通过 AutoDock4（4.2.6 版）完成43. 最后，使用蛋白-配体相互作用分析器（PLIP）网站对配体与蛋白质之间的相互作用模式进行可视化配体与蛋白质之间的相互作用模式 44。

细胞培养与质粒转染

HEK293T细胞（中国Procell，货号CL-0005）接种于添加了10%胎牛血清（美国Gibco）和1%链霉素-青霉素（美国Gibco）的杜氏改良伊格尔培养基（美国Gibco）中，于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。GFPT1（NM_002056）-pCMV6-Myc-DDK质粒（货号RC207225）购自美国OriGene公司。按照制造商的说明书，使用脂质转染试剂3000（美国Invitrogen）对细胞进行转染45。

GFPT1 酶活性测定

为直接评估 GFPT1 的酶活性，用 100 μM IOX1 处理野生型 HEK293T 细胞以及转染了 GFPT1（NM_002056）-pCMV6-Myc-DDK 质粒的 HEK293T 细胞 12 小时，随后收集细胞⁴⁶。使用特异性裂解缓冲液进行细胞裂解，该缓冲液由 50 mM (KH_{2} PO_{4}) 磷酸盐、10 mM EDTA、5 mM 还原型谷胱甘肽、12 mM 6-磷酸葡萄糖酸钠和 1 mM 苯甲基磺酰氟组成，pH 调至 7.6。取 100 μL 细胞裂解液，加入等体积的反应缓冲液，使总体积达到 200 μL。反应缓冲液包含 100 mM (KH_{2} PO_{4})、10 mM 6-磷酸果糖、6.0 mM 谷氨酰胺、0.3 mM 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸、50 mM KCl 以及 6 单位牛肝来源的谷氨酸脱氢酶（GDH），pH 调至 7.6。将反应体系在 37 ℃ 下孵育 45 分钟，随后使用酶标仪（日本 Bioeko 公司）在 370 nm 波长下实时监测吸光度变化⁴⁷,⁴⁸。此外，为进一步验证 IOX1 对 GFPT1 酶活性的抑制作用，我们使用 6-磷酸果糖（F-6-P）含量检测试剂盒（G0878F，格锐思生物）测定其直接底物 F-6-P 的含量。检测流程（样品制备、反应液配制、检测）严格按照试剂盒说明书进行。

斑马鱼饲养与胚胎收集

从中国斑马鱼资源中心（CZRC）购买AB品系斑马鱼。所有成年野生型斑马鱼（AB品系，ZDB-GENO-960809-7）饲养于28.5℃的循环水系统中，光照周期为14小时光照/10小时黑暗。通过自然交配获得胚胎，并按先前描述的方法对胚胎进行分期。为确保实验的生物学可重复性并最大程度减少批次特异性偏差，所有实验均使用从多个独立批次收集的胚胎进行（每个实验组至少3个批次）。每个处理组和对照组均采用不同亲本组的胚胎，并在多次繁殖周期中重复实验。为抑制色素沉着，胚胎经0.03%的1-苯基-2-硫脲（美国Sigma公司）处理⁴⁹。所有斑马鱼胚胎均通过冰冷水低温休克实施安乐死。本研究中的所有斑马鱼实验均获西北大学实验动物管理与伦理委员会批准（批准号：NWU-AWC-20241104Z），并严格遵守所有动物实验相关的伦理法规。

mRNA的合成与显微注射

将全长人 GFPT1（NM_002056）cDNA 克隆到 pCS2+ 质粒中，使用 mMESSAGE mMACHINE SP6 转录试剂盒（美国 Invitrogen 公司）合成带帽的人 GFPT1 mRNA。使用 PLI-100A Plus 皮升注射器（美国 Harvard 公司），在 1-2 细胞阶段向每个胚胎注射 200 皮克人 GFPT1 mRNA 45。

蛋白质免疫印迹分析

使用含有蛋白酶抑制剂混合物（Pierce，88666）的RIPA缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，1% NP-40，1% SDS，1 mM EDTA和150 mM NaCl）从斑马鱼胚胎中提取总蛋白。在受精后3天（dpf）收集总共50-80个胚胎，并在冰上快速冷冻。离心后收集上清液，使用BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白（10-20 μg）在12%的凝胶上进行分离SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转印至PVDF膜。膜用含5%脱脂牛奶的TBST封闭，于4℃与Flag（HT201-01，1:1000，ProteinFind）和β-肌动蛋白（HC201-01，1:1000，ProteinFind）一抗孵育过夜。洗涤后，膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗在室温下孵育1小时。使用增强化学发光法（ECL）检测信号，并通过ChemiDoc成像系统进行成像。条带强度采用ImageJ软件定量，并以β-肌动蛋白为参照进行标准化⁴⁹。

通过双折射和鬼笔环肽染色分析骨骼肌结构

在受精后3天（3 dpf），胚胎用0.02%的三卡因（MS-222）进行麻醉，然后固定在2%低熔点琼脂糖中。使用配备偏振滤光片的徕卡DM2500显微镜获取骨骼肌结构的双折射图像⁴⁹。对于鬼笔环肽染色，将受精后3天的幼虫在4°C条件下于4%多聚甲醛（PFA）中固定过夜，随后在室温下用含0.1% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBS）透化20-30分钟。将样品与鬼笔环肽工作液（在PBS中1:200稀释）在室温避光条件下孵育120分钟。用PBS洗涤后，使用日本尼康SMZ25显微镜在488纳米激发光下拍摄荧光图像，以可视化丝状肌动蛋白（F-actin）⁴⁹。

α-银环蛇毒素染色

3天龄的斑马鱼幼鱼在4℃下用4%多聚甲醛固定过夜。样品用磷酸盐缓冲液洗涤后，于−20℃用预冷的丙酮通透处理15分钟。随后，幼鱼在4℃下与Alexa Fluor 488标记的α-银环蛇毒素（α-BTX；磷酸盐缓冲液中1:200稀释）孵育过夜。孵育结束后，样品用PBSTx（含0.5% Triton X-100的磷酸盐缓冲液）洗涤三次。使用日本尼康SMZ25显微镜在488纳米激发光下获取荧光图像。

药物拯救实验

IOX1（T6545；TargetMol）是一种GFPT1抑制剂，其储备液以40 mg/mL的浓度溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，于-20℃条件下保存。实验分为三组：对照组（仅用DMSO处理）、GFPT1过表达组、GFPT1过表达联合IOX1处理的干预组。对GFPT1过表达斑马鱼的IOX1处理从受精后3天（dpf）开始，将胚胎浸泡于含5 mg/L IOX1的卵水溶液中；对照组胚胎则用含相同终浓度DMSO的卵水溶液处理。所有胚胎均置于28.5℃培养，每24小时更换一次溶液。受精后7天（dpf），对对照组、GFPT1过表达组及IOX1处理组的斑马鱼胚胎，使用0.02%三卡因（MS-222）进行麻醉，固定于2%低熔点琼脂糖中，通过SMZ25显微镜（日本尼康公司）进行观察并拍照。采用ImageJ软件对7 dpf胚胎的体长进行分析与记录。

苏木精-伊红染色

为评估斑马鱼脊髓的组织病理学变化，将7天龄（dpf）的胚胎在4℃的4%多聚甲醛（PFA）中固定过夜。固定后，样品进行脱钙处理，包埋于石蜡中，并切成5微米的切片。随后将切片进行苏木精-伊红（H&E）染色，在尼康（日本）SMZ25体视显微镜下观察，以进行组织病理学分析。

LysoTraker染色

为评估斑马鱼脊索囊泡的发育情况，收集7天龄（dpf）的斑马鱼胚胎，并用磷酸盐缓冲液（PBS）彻底洗涤三次。随后，将样品用浓度为10微摩尔（μM）的LysoTracker Green DND-26（40738ES50，上海源叶生物科技有限公司）染色1至2小时。染色完成后，再次用PBS洗涤样品三次，以去除残留染料。最后，使用多模式转盘共聚焦显微镜（Dragonfly 200，英国）对样品进行观察，记录其形态。以及脊索囊泡的分布情况。

实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析

使用TRIzol™试剂（Ambion，USA）从每组30个完整的斑马鱼幼体中提取总RNA，并使用SuperScript™系统（Invitgen，USA）对每个样品中的1μg RNA进行逆转录。qRT-PCR使用SYBR Green PCR Master Mix（Kapa生物系统，USA）对来自不同斑马鱼批次的三个独立生物重复进行，如前所述。对于每个生物重复，PCR反应以技术三份的形式运行，在统计分析之前对技术重复进行平均54。PCR方案包括在95℃下初始变性3分钟，然后在95℃下进行40个循环，持续3秒，60℃持续20秒。引物序列列在补充数据16中。所有引物均使用NCBI Primer-BLAST设计以跨越外显子-外显子连接，生成80-200bp的扩增子，而没有显着的二级结构或引物-二聚体潜力。通过单峰熔融曲线分析和琼脂糖凝胶电泳证实产品特异性。管家基因gapdh作为标准化参考。

统计学与可重复性

采用2^−ΔΔCt相对定量法分析实时荧光定量PCR数据。对于每个生物学重复，取技术重复三次的平均值作为单个数据点。数据以至少三次独立生物学重复的平均倍数变化±标准误均值（SEM）表示。采用Shapiro-Wilk检验评估所有数据集的正态性。除非另有说明，所有统计检验均为双侧检验。根据检验结果，符合正态分布的数据采用参数检验分析：两组间比较采用双侧Student’s t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）结合Duncan多重比较检验；不符合正态分布假设的数据则采用相应的非参数检验：两组间比较采用双侧Mann–Whitney U检验，多组间比较采用双侧Kruskal-Wallis检验结合Dunn事后检验组间比较。统计学显著性定义为P<0.05。所有统计分析均使用GraphPad Prism软件（8.0.2.263版）进行。随机化不适用于人类遗传分析。对于实验分析，样本和胚胎根据预先设定的研究设计进行分配，未采用正式的随机化程序。盲法不适用于人类遗传分析，实验分析中的结果评估也未在盲法条件下进行。