题目：Zebrafish dspb-/- mutant as a model for nondilated left ventricular cardiomyopathy: exploring cardiac dysfunction and exercise modulation

原文链接:https://doi.org/10.1186/s43556-026-00476-7

期刊：Molecular Biomedicine

摘要

DSP基因的截短变异体与非扩张性左心室心肌病（ND-LVC）相关，该病以心室功能受损但无扩张为特征。体力活动对DSP变异携带者的疾病发病、严重程度及进展的影响目前尚不清楚。本研究旨在构建携带人类DSP截短变异体的斑马鱼模型，从心功能、结构和基因表达方面对纯合dspb–/–突变体进行特征分析，并评估中等强度运动和耐力运动的影响。同时还分析了人类携带者的临床数据，以探讨体力活动、诊断年龄、疾病严重程度与心律失常事件之间的关系。研究采用CRISPR/Cas9技术构建dspb–/–斑马鱼模型（p.T449fs*），对其结构、功能和分子表型进行特征分析；应用中等强度运动训练方案，评估其对心功能、耐力能力和存活率的影响。体力活动活跃的人类携带者诊断年龄更小，但并未表现出疾病严重程度或事件发生率的增加。斑马鱼突变体存在基础收缩功能障碍、肌节结构紊乱和信号通路失调。值得注意的是，中等强度运动可部分恢复心功能并改善耐力，且不会增加死亡率。这些研究结果表明，运动可能是DSP相关ND-LVC的表型修饰因子，能够在不加速疾病进展的情况下改善功能结局。dspb–/–斑马鱼模型为探究生活方式因素与遗传性桥粒心肌病发病机制之间的相互作用提供了可靠的转化研究平台。

关键词 桥粒斑蛋白、截短变异、体力活动、心功能、非扩张型心肌病、斑马鱼模型

引言

ND-LVC 是一种近期提出的心肌病表型分类，其特征为在无心室扩张的情况下出现左心室功能或结构损伤。这一概念反映了对遗传性心肌病认识的演变，强调了在无典型扩张表型的情况下，破坏舒张或收缩功能的机制的重要性。ND-LVC 常与参与细胞骨架结构和盘间连接完整性的基因致病突变相关，如桥粒斑蛋白（DSP）、细丝蛋白-C（FLNC—截短突变）、结蛋白（DES）、核纤层蛋白 A/C（LMNA）和受磷蛋白（PLN）。这些基因的致病突变与心律失常和心源性猝死（SCD）风险增加的心肌病相关，尤其在年轻人和运动员中。尤其是 DSP 突变，与以左心室纤维化和心肌炎高患病率为特征的独特表型相关。尽管体育锻炼通常被认为有益，但其对心肌病患者的作用仍存在争议，因为高强度或长时间运动可能促进疾病进展，并诱发危及生命的心律失常。

桥粒由跨膜钙黏蛋白、犰狳蛋白以及桥粒斑蛋白组成，其中桥粒斑蛋白在维持心肌细胞间黏附及细胞骨架完整性方面发挥核心作用。这是由于桥粒与中间丝紧密关联。桥粒斑蛋白是首个被发现与常染色体显性致心律失常性心肌病（ACM）相关的桥粒基因。在西班牙穆尔西亚地区已发现一种具有奠基者效应的杂合性DSP无义变异（NM_004415.4: c.1339C>T, p.Q447*），截至目前已报道来自5个家族的39名携带者。该变异在40岁时的外显率高达83%。受影响的氨基酸残基位于桥粒斑蛋白的球状头部结构域之一内，该结构域介导与连环蛋白的相互作用。

斑马鱼模型已被广泛用于研究与人类疾病相关基因的直系同源基因的生物学功能。参与细胞间黏附的基因在发生突变时与ACM和ND-LVC相关，这类基因也已在斑马鱼中得到研究。斑马鱼中存在关键桥粒基因的直系同源基因，包括与人类基因氨基酸同源性达68%的桥粒胶蛋白（zfDsc），以及与人类对应基因同源性约61%的两个桥粒芯蛋白基因（zfDsgα和zfDsgβ）。在斑珠蛋白方面，斑马鱼拥有两个旁系同源基因dspa和dspb，二者共同构成了与人类DSP功能等效的基因。这些基因与人类DSP的同源性分别约为49%和44%，且表现出显著的功能保守性，支持其用于建模与DSP相关的心肌病。

本研究旨在在斑马鱼中重现人类DSP截短变异体，以构建ND-LVC模型。我们靶向斑马鱼dspb基因的第10外显子诱导突变，产生与人类变异体类似的提前终止密码子。在构建dspb −/− p.T449fs*（c.1340_1352delTGGCCA CTT ACA）利用CRISPR/Cas9技术构建G)模型后，我们的主要目标是对纯合突变斑马鱼进行表型鉴定，重点关注其心脏功能和组织学特征。此外，我们还评估了斑马鱼的存活率、基因表达情况，并探究了中等强度运动与耐力运动对其产生的影响。

结果

DSP截短变异携带者的临床特征及体育活动的影响

在携带DSP截短变异的45名受影响携带者中，13人（28.9%）报告进行中等强度或高强度体育活动，32人（71.1%）被归为久坐不动。活动组个体的诊断年龄显著更小（33.0±13.5岁 vs 47.1±13.7岁，p=0.008），且男性占比更高（76.9% vs 25.5%，p=0.002）（表S1）。久坐患者出现症状的比例更高（50.0% vs 7.6%，p=0.012），尤其是心悸症状（40.6% vs 0.0%，p=0.008）。共有16人（35.5%）符合非扩张型左心室心肌病（ND-LVC）的诊断标准（久坐组和中等/高强度运动组分别为11人[68.7%]和5人[31.2%]）。两组的心脏影像学参数，包括左心室射血分数（LVEF）、心室大小和心脏磁共振（CMR）上的晚期钆增强（LGE），均无显著差异。同样，两组在心律失常发生率、植入式心律转复除颤器（ICD）植入率或主要心脏事件发生率上也未观察到差异。Kaplan-Meier分析证实，有中等/高强度运动史的携带者诊断年龄显著早于久坐个体（对数秩检验(p=0.006)；风险比2.89[95%置信区间：1.42-5.87]；图1a）。相比之下，活动组和久坐组在无事件生存率上未观察到显著差异（图1b），体育活动与不良预后之间也无显著关联。

dspb -/- 斑马鱼模型的构建与验证：模拟人类 NDLVC 变异体

研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在斑马鱼dspb基因的第10外显子中引入了靶向变异。经桑格测序验证，该等位基因存在13个碱基对的缺失（c.1340_1352delTGGCCACTTACAG）。这一缺失会导致移码突变在449位密码子处产生一个提前终止密码子（p.T449fs*），与与ND-LVC相关的人类DSP无义变异p.Q447*同源（图S1）。

图1 .依据体力活动水平划分的DSP截短变异携带者中年龄依赖性外显率与无事件生存率。Kaplan-Meier曲线显示，与久坐/轻度体力活动者相比，中/高强度体力活动者的诊断年龄更早（a），而无事件生存率无差异（b）。调整后的风险比通过多变量Cox回归分析获得。风险人数显示于下方

dspb/斑马鱼的发育障碍与存活率降低

为了明确纯合子品系中观察到的表型背景，我们首先评估了部分dspb基因缺失所产生的影响。与野生型（wt）同窝仔相比，杂合子(d s p b^{+/-})胚胎和幼体的存活率、心率或整体形态均未出现显著差异（图S2），这表明单个功能性等位基因可维持早期发育和心脏稳态。相比之下，纯合子(d s p b^{-1-})突变体的存活率显著降低，与对照组相比出现过早致死现象，且存活率明显更低（图2a）。这些结果表明，完整的dspb功能对于正常胚胎发育和早期心脏稳定性至关重要。在受精后3天（3 dpf），(d s p b^{-1-})胚胎的体长较对照组显著缩短（野生型8.89±0.06 vs. (d s p b^{-/-} 8.68 pm 0.05、p<0.00002、n=100）。但在眼部形态上未观察到差异按体长归一化后的体型或心脏面积（图2b）。所有野生型胚胎的形态均正常，而(d s p b^{-1-})组的幼虫中，80%形态正常、6%死亡、4%卵未孵化，还有10%幼虫出现卵黄囊肿大（图2c-g）。

发育过程中桥粒基因及关键信号通路的失调

在20天胚胎期的斑马鱼幼虫中，(d s p b^{-1-})突变体表现与野生型幼虫相比，dspb 的表达水平更低。(p k p 2) 的表达也有所降低，而 dspa 的表达保持不变（图 S3a）。对成年组织的基因表达分析显示存在组织特异性改变（图 S3b-d）。在心脏组织中，dspb 的表达降低，而 pkp2 和 dspa 的表达升高，这提示存在代偿机制。在皮肤组织中也观察到了类似的模式。在尾部组织中，dspb 的表达同样降低；但 (p k p 2) 的表达并未升高，而 dspa 的表达显著升高。

进行了qPCR分析以评估Wnt/β-连环蛋白相关基因（ccnd1、myc）的表达情况在野生型和 (d s p b^{-/-}) 斑马鱼心脏的不同发育阶段，均检测到转化生长因子-β（TGF-β）/Smad2、Smad3 以及 Hippo/YAP-TAZ（ccn2a、ccn2b）信号通路的相关变化。在受精后第 6 天（6 dpf），(d s p b^{-/-}) 幼虫中的 ccnd1 基因显著下调，而 myc 基因的表达水平未发生改变。在受精后第 20 天（20 dpf），这两个基因均出现上调。在 TGF-β 信号通路中，Smad2 基因在 6 dpf 时表达下调（p<0.0001），至 20 dpf 时恢复至基线水平；而 Smad3 基因在 6 dpf 时无表达变化，在 20 dpf 时则出现上调（p<0.0001）。Hippo/YAP-TAZ 信号通路呈现动态调控特征：ccn2a 基因在 6 dpf 时表达下调（p<0.001），在 20 dpf 时表达上调（p<0.0001），而 ccn 2 b 基因则持续处于下调状态，仅在 20 dpf 时出现部分恢复（图 3a；表 S2）。在成体心脏（1 龄和 2.5 龄）中，(d s p b^{-/-}) 突变体的 ccndl 和 myc 基因在两个年龄阶段均显著降低。与之类似，Smad2 和 Smad3 基因的表达也明显下调，其中 2.5 龄突变体的 Smad3 基因出现部分恢复。在 Hippo/YAP-TAZ 信号通路中，ccn2a 和 ccn2b 基因在 1 龄时均表达下调；至 2.5 龄时，ccn2a 仍显著下调，而 ccn2b 则出现部分恢复（图 3b；表 S2）。

图2 . (d s p b^{-1-}) 幼虫的存活与发育受损情况。a  (d s p b^{-1}) 组与野生型（wt）组的存活分析（风险比 4.1 [95% 置信区间：2.4-6.9]；**** p<0.05）。检验方法：采用对数秩（Mantel-Cox 检验）和风险比（Mantel-Haenszel 法）的简单存活分析（Kaplan-Meier 法）。对比 3 天胚胎期（dpf）的幼虫。b  体长测量结果显示，野生型组与 (d s p b^{-1}) 组的体长存在显著差异（* 515a0d7d-33d9-4195-922d-e118229a9a75），(dspb) 组幼虫的体长普遍短于对照组。然而，以每个胚胎的体长进行标准化后的眼大小和心脏面积数据，未显示出统计学上的显著差异。野生型组所有胚胎均表现正常（，），而 (dspb) 组中，80% 为正常胚胎（，），10% 出现卵黄囊异常的胚胎（c、f），4% 为未孵化的卵（c、g），6% 为死亡幼虫（*** p<0.0002)，ns 表示无统计学意义）。样本量：(n=100)。

dspb-/- 斑马鱼的早发性且进行性心脏功能障碍

在3天pf时，(d s p b^{-/-})幼鱼表现出显著更高的与野生型对照组相比的心率（野生型为122.10±1.53次/分钟，(d s p b^{-/-} 143.20 pm 1.34)组为(p<0.0001)次/分钟）。这种心动过速表型从受精后3天持续至6天（图4a）。在成年斑马鱼（8月龄）中，超声心动图分析显示各组间存在显著差异（图4b-k；表S3）。(d s p b^{-1-})组的心率和呼吸频率均高于野生型对照组。此外，突变体的收缩期和舒张期面积显著减小。收缩期和舒张期容积均有所降低，心室流入参数也随之降低。突变体每搏输出量的降低与心输出量、射血分数和分数面积变化的降低相关。多普勒A(d s p b^{-/-}) 鱼的波值也显著更低。总体而言，这些发现表明 (d s p b^{-1-}) 变异体导致成年斑马鱼的心脏功能受损以及生理参数发生改变。

组织学与超微结构揭示的心肌结构异常

对移植心脏的宏观检查显示，野生型动物出现了年龄依赖性的变化，同时不同基因型之间也存在差异。在野生型组中，心脏大小随年龄增长逐渐减小。相比之下，(d s p b^{-1-})在幼年阶段，（其）心脏在长度、宽度、面积和周长方面均显著小于野生型（wt）心脏。而在成年阶段，这些差异不再显著幼年阶段，而在老年动物中，(d s p b^{-/-}) 品系的斑马鱼心脏则表现出与野生型心脏相比有增大的趋势（图5ab；表S4）。

进行了组织学分析，以评估组织组成、脂肪浸润情况以及心肌细胞稀疏或纤维化的迹象。野生型小鼠之间未观察到心室结构或细胞稀疏的差异进行了组织学分析，以评估组织组成、脂肪浸润情况以及心肌细胞稀疏或纤维化的迹象。野生型小鼠之间未观察到心室结构或细胞稀疏的差异且(d s p b^{-1-})斑马鱼在任何阶段均无此差异（表S4），也未出现相关迹象检测到纤维化替代（图S4，最后一组图）。两组仅在老年时观察到脂肪细胞浸润，且分布和程度相似（图S4，第三组图）。经甲苯胺蓝染色的半薄切片显示，野生型与(d s p b^{-/-})斑马鱼心脏在细胞组成和心肌结构上存在显著差异（图5c）。低倍镜下，d s p b^{-1-})样本的细胞密度有所增加大量深染的细胞核。在高倍镜下，野生型心肌组织呈现出结构规整的肌节以及相对稀疏的细胞核，而突变型心肌组织则出现圆形、密集堆积的细胞核积聚现象，且肌节形态结构明显紊乱。在 （注：原文末尾未完整，译文按现有内容翻译，保留原文未完结的状态）(d s p b^{-1-}) 心脏很可能反映了多种过程的共同作用，包括炎症细胞浸润（如巨噬细胞和中性粒细胞）、成纤维细胞的活化与增殖，以及与组织重塑相关的潜在凋亡或再生活动。

(d s p b^{-1-}) 斑马鱼的间隙连接完整性受损突变体。插入盘的代表性透射电子显微镜图像（图6a、b）突出了野生型与突变体心脏组织中细胞-细胞连接结构的差异。在野生型样本中，缝隙连接和黏着连接结构紧凑，细胞膜紧密贴合，电子致密斑块。相比之下，(d s p b^{-1-}) 突变体则表现为连接被破坏，膜间距离显著增加，表明力学性质发生改变心肌细胞间的耦合。图6a-b中的插图提供了连接结构的放大视图。连接参数的定量分析证实了这些发现（图6c）。各组间的平均连接长度相似（野生型1.55±0.19微米与(d s p b^{-/-} 1.31 pm 0.07 mu m)），而(d s p b^{-/-})组的膜间隙距离显著增加（0.39±0.05微米，野生型为0.06±0.005微米，p<0.0001），这表明存在显著的结构改变。此外，野生型样本中90.6%（29/32）的连接点被归为正常，而(d s p b{-1-})突变体中这一比例仅为9.6%（5/52），这表明闰盘的结构受到了显著破坏。对心肌组织的透射电子显微镜（TEM）分析还显示，不同基因型之间的肌节结构存在显著差异。野生型心肌细胞（图6d-e）展现出组织良好的收缩装置，具有清晰的Z线、排列整齐的肌原纤维以及界限分明的I带。线粒体分布均匀（图6f-g）表现出严重的肌节紊乱，其特征是I带清晰度丧失、Z线错位和肌原纤维行间距不规则。线粒体出现异常聚集，插入的椎间盘显示出碎片或不规则的结构。总体而言，(d s p b^{-/-})突变体表现出明显的心脏破坏超微结构，包括改变的肌节组织和插入的椎间盘结构。

图3. 野生型（wt）和(dspb) 个体在不同发育阶段的基因表达分析，其中a为幼虫阶段、b为成体阶段，旨在评估基础信号通路中关键基因的表达水平。为确定各基因在不同年龄组中的富集程度，以组成型基因rps11 作为对照计算倍数变化（**p<0.01、****p<0.001、****p<0.0001**）。误差线：均值标准误（SEM）。实验次数：幼虫阶段设2次生物学重复；1龄个体设3次生物学重复；2.5龄个体设2次生物学重复。统计检验：双因素方差分析（Two-way ANOVA）。样本量：6天龄（dpf）幼虫为20尾混合样本，20天龄（dpf）幼虫为10尾样本，各成体组均为3个心脏组织混合样本。

图4. 幼虫和成虫的心脏功能。a 3-6天胚胎期（dpf）dsp突变体幼虫的心率，通过每日计数幼虫心率并将dspb-1-的平均值与野生型（wt）(**** rho<0.0001)的平均值对比测得（bpm：次/分钟）样本量：3天胚胎期n=100；4天胚胎期n=70；5天胚胎期n=50 ; 6和dpf =50误差线：均值标准误（SEM）检验方法：学生t检验。b-k 训练前野生型和(dspb-1-)成虫的心脏功能，通过超声心动图测得。在dspb突变体中，两组在（b）更高的心率和呼吸频率、dsp中（c）更小的收缩和舒张面积、dspb中（d）更小的收缩和舒张容积、dspb中（e）更小的心室收缩和舒张入口、dspb中（f）每搏输出量降低、（g）心输出量降低、（h）射血分数降低、dspb中（i）分数面积变化降低以及dspb中（k）心房收缩值更低（<0.05和**p<0.01、****p<0.0001）均存在显著差异样本量：n=11误差线：均值标准误（SEM）检验方法：经Bonferroni校正的非配对多重t检验

图5.不同年龄斑马鱼心脏的宏观和组织学研究——wt和dspb之间的比较。a用蔡司Stemi 305立体显微镜获取心脏外植体后的图像，并测量心脏的长度、宽度、周长和面积。b测量显示wt心脏随着时间的推移而变小，而dspb-1-心脏在年轻时明显小于wt心脏，在老年时有尺寸增加的趋势（*p<0.05 **p<0.01)。(****p<0.001）样本大小：n=5 /genotype和年龄组。误差条：扫描电镜。测试：用邦费罗尼校正的双向方差分析。体重指数：体重指数。c来自wt和(d s p b^{-1-})突变体的成年斑马鱼心脏用甲苯胺蓝染色的半薄切片，以低（垂直面板）和高放大率（水平面板）显示。与wt对照组相比，突变心脏显示细胞密度增加，有许多小的、深色染色的细胞核和紊乱的心肌结构

桥粒蛋白的免疫荧光分析显示增加PKP2整合密度和PKP2阳性区域归一化为核区域在dspb-/-心与wt相比，而PKP2强度to-nuclear-intensity比率无显著差异（图S5）。相反，plakogobin在(d s p b^{-1-})心肌中显示显著更高的intensity-to-nuclear-intensity比率，而综合密度和蛋白质阳性面积与wt相当。这些发现表明桥粒蛋白质分布的基因型特异性重塑，支持透射电镜观察到的插盘结构变化。

运动干预不同程度改善dspb--1-成人心功能

对成年斑马鱼（8月龄）进行为期一个月的训练对(d s p b^{-/-})斑马鱼的心脏参数产生了显著影响斑马鱼。首先，两组均显示100%存活训练期结束后存活率均为100%。在(d s p b^{-/-})组中，运动后心率较运动前显著下降。训练后舒张面积显著增加，收缩压且(d s p b^{-/-})组的舒张期容积有所增加此外，每搏输出量和心输出量也得到了部分恢复，射血分数和面积变化分数同样如此。主动脉流出参数也有所改善。这些研究结果表明，持续的中等强度运动能够对(d s p b^{-/-})斑马鱼的心脏功能和结构产生正向调节作用（表S3；图7a-h）。

在耐力试验中，(d s p b^{-/-}) 突变体的表现相较于野生型（wt）组有所下降。野生型斑马鱼的总游动距离和累计运动时长均长于 (d s p b^{-/-}) 突变体，其活动时长也更长，静止频率更低。相反，突变体更多时间处于静止状态，尤其是在通道末端，这表明其对水流的抵抗力降低（表 S5；图 7i-k）。值得注意的是，接受了一个月中等强度训练的(d s p b^{-1-})突变体，其耐力相较于未训练的突变体有所提升。经过运动训练的(d s p b^{-/-})突变体表现出不动频率降低、不动时长缩短的现象（表S5和图7k）。图7l进一步展示了这一改善，EthoVision XT软件生成的热图显示，经过训练的(d s p b^{-1-})突变体的游泳模式与野生型鱼相似。这些发现表明，(d s p b^{-/-})突变体在持续中等强度运动后耐力得到了提升。相比之下，未训练的突变体无法逆流持续游泳，且从热图中可以看到，它们大多停留在通道末端，被水流冲离（图7l）。

讨论

体力活动在ND-LVC发病和进展中的作用，特别是在携带DSP截断变体的个体中，仍然不确定。在我们的队列中，从事中度到剧烈体力活动的携带者被诊断出的年龄明显低于久坐的个体。然而，这一早期诊断与结构或心律失常异常的严重程度增加无关，也与不良心血管事件的高发生率无关。Martínez-Solé等人也强调了这种不确定性。，他们报告说，尽管高强度运动在经典形式的ACM中可能是有害的，但其影响仍然存在争议，并且在非经典表型中定义不太明确，包括那些涉及DSP截断变体的表型。一个可能的解释是，身体活跃的个体接受更频繁的医学评估，导致更早的诊断，而久坐的携带者可能在更长的时间内仍未得到诊断。或者，在活跃个体中观察到的早期诊断和较温和的表型可能反映了运动的调节而不是有害影响。为了进一步探索这一假设，我们采用了(d s p b^{-/-})斑马鱼模型与人类(DSP)p. Q447*变体同源的截断突变。该变体表现出高外显率这一点在各地区队列中已有充分的文献记载。该模型使我们能够在受控的实验条件下探究疾病机制以及运动的影响。

图6 .wt和(dspb)突变体之间心脏组织间隙连接和肌节的结构差异，通过TEM观察。a，b wt（a）和dspb−/−b心脏组织间隙连接的代表性TEM图像。插图突出了超微结构差异。c定量wt和(dspb-1-)样本中的连接长度（左）和膜间间隙距离（右）。虽然总连接长度在基因型之间保持可比性，但膜间距离在(dspb-1-)心脏中显着增加，表明有缺陷的细胞-细胞粘附。样本大小：n=47 dspb-f-，(n=29)wt；误差条：SEM。(****p<0.0001，ns-不显著）。d，e wt心脏组织的TEM图像，显示wel对齐的肌节，明确定义的Z线和均匀分布的线粒体。完整的I带和规则的插入盘的存在反映了保留的心脏超微结构。(dspb-1-)突变心脏组织的透射电镜图像，突出肌节紊乱，I带清晰度丧失，Z排列中断，Z线较粗。线粒体聚集和不规则的插入盘也很明显，表明(dspb-f-)心脏严重的结构重塑和收缩功能受损。（红色箭头-Z线；红色矩形-I带；白色星号-线粒体）

利用该模型，我们发现了与ND-LVC相符的发育、功能和结构异常。突变体胚胎表现出存活率降低和发育延迟，其特征是体型更短体长增加且卵黄囊增大，表明胚胎发生受损。Asimaki 等人利用携带 plakoglobin 突变（2057del2）的致心律失常性心肌病转基因斑马鱼模型也报道了类似的研究结果，在该模型中，突变体胚胎的存活率显著降低至45%，而对照组的存活率为77%。

在(d s p b^{-1-})号幼虫中，这些幼虫在胚胎早期发育阶段之后存活下来发生后，明显的功能改变已显现。最显著的是，突变体早在3天胚胎期（dpf）就表现出心动过速，与野生型（wt）对照组相比，心率持续升高。这可能是对每搏输出量减少的一种代偿性反应，有助于维持心输出量。研究还观察到呼吸频率增加，进一步支持了心力衰竭样表型的存在。有趣的是，这与之前(DSP)和PKP2缺乏症的斑马鱼模型不同，这些模型报道的是心动过缓而非心动过速。在成年斑马鱼中，超声心动图分析证实了收缩和舒张功能障碍。我们的DSP模型与非致心律失常性右室心肌病伴左室受累（ND-LVC）的相关性比与经典致心律失常性右室心肌病（ACM）更密切，因为未观察到纤维化。心室年轻成年阶段的 (d s p b^{-1-}) 斑马鱼心室大小减小，尽管在人类DSP心肌病中通常不描述较小的心脏，但DSP无义突变携带者的心室代偿性增大也较为罕见。临床上，人类DSP相关心肌病通常被归类为左优势型致心律失常性心肌病，或归入新提出的ND-LVC表型分类。每搏输出量减少可能导致心输出量下降，并可能触发代偿性心动过速以维持心脏功能。

除了观察到的功能表型外，我们的研究结果表明，dspb基因的缺失可通过上调桥粒相关基因（如dspa和(p k p 2）得到部分补偿，这支持了桥粒成分间存在补偿机制的观点，与以往的研究结果一致。尽管如此，这种转录水平的调节似乎不足以维持正常的信号传导平衡，也无法阻止关键心脏信号通路的紊乱，包括Wnt (' beta)-连环蛋白、转化生长因子-β（TGF-β）以及Hippo/YAP-TAZ通路。

在Wnt(' beta)-连环蛋白通路中，(d s p b^{-1-})幼虫在6天龄（dpf）时ccnd1和myc基因的早期下调，表明其早期发育中心肌细胞增殖受损。有趣的是，这一趋势在20天龄时发生逆转，出现短暂的上调，这可能反映了机体为恢复增殖能力所做出的代偿性努力。尽管如此，在成年阶段，这两个基因始终保持持续下调，这说明Wnt信号通路的持续减弱很可能是突变心脏中心肌再生受损和结构异常的重要原因。这些研究结果与Wnt信号通路在心脏生物学中发挥的阶段特异性调控功能相一致。

关于转化生长因子-β（TGF-β）信号通路，dspb突变体在受精后20天（20 dpf）时smad2和smad3的表达增加，可能代表了对组织压力的早期纤维化或重塑反应，尤其是在发育中的心脏中。在成体中，仅smad3的部分持续上调，提示纤维化通路存在慢性低度激活。这可能与透射电镜（TEM）观察到的超微结构桥粒改变有关，也与TGF-β在病理性心脏重塑中的已知作用相符。Hippo/YAP-TAZ通路也表现出明显的时间性失调：ccn2a在受精后6天（6 dpf）被抑制，但在受精后20天（20 dpf）上调，而ccn2b在所有阶段均持续下调。这些结果表明，早期发育过程中细胞外基质重塑信号的正常激活出现异常，随后发生了延迟的代偿反应。在心脏再生中起关键作用的ccn2b持续被抑制，进一步证实了组织修复和维持功能受损。

这些研究结果共同表明，尽管桥粒基因的冗余性可能在一定程度上缓冲dspb缺失带来的结构影响，但下游信号通路的破坏却是强烈且持久的。基因表达模式的阶段特异性改变进一步印证了dspb在心脏发育过程中对于整合结构网络和信号网络至关重要这一观点。这些模式与在其他研究中观察到的结果相符ACM的斑马鱼模型，凸显了该模型与人类心脏疾病的相关性。

图7. 身体活动的影响。a-h (dspb-1-)突变体长期中等强度训练前后的结果，存在显著差异，突变体训练一个月后表现为：a 心率降低，b 舒张面积恢复正常，c 收缩/舒张容积恢复正常，d 每搏输出量恢复正常，e 心输出量恢复正常，f 射血分数恢复正常，g 分数面积变化恢复正常，同时h 主动脉流出量也恢复正常（* p<0.05、^{* *} p<0.01、****p<0.001、****p<0.0001）。误差线：均值标准误。样本量：野生型（wt）和(dspb)突变体训练前：n=1 1例；野生型（wt）和(dspb)突变体训练后：n=10 例。检验方法：采用Bonferroni校正的双因素方差分析。i-l 中等强度训练前后的耐力测定结果。结果显示，dspb-1-突变体相较于野生型（wt）组，更难适应高强度训练，但经过一段时间的中等强度训练后，耐力逐渐提升，EthoVision XT软件测定的部分参数可证实这一点（* p<0.05、** p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001）。误差线：均值标准误。样本量：n=4 例。检验方法：采用Bonferroni校正的双因素方差分析。（l上图）EthoVision XT软件生成的耐力测定过程运动热图，显示经过一个月游泳通道训练的dspb−/−突变体，其逆流游泳能力优于未接受前期训练的(dspb)突变体，因此训练后的(dspb)热图与野生型（wt）热图更为相似。（l下图）用于分析中等强度训练影响和耐力测定的游泳通道

新出现的证据表明，桥粒功能异常不仅会影响结构完整性，还会对细胞内信号网络产生作用。与以往的致心律失常性心肌病（ACM）模型一致，dspb 基因缺陷与 Wnt/β-连环蛋白、Hippo/YAP-TAZ 以及转化生长因子-β（TGF-β）通路的失调相关，这些通路参与了心肌细胞增殖、纤维化和病理性重构过程。这些发现进一步证实了在 ACM 表型中，桥粒破坏与适应不良的信号传导机制之间存在相互作用。

除了功能改变外，结构和超微结构分析还揭示了dspb-/-心脏中存在重要的心肌异常。对成年心脏的组织学评估显示，心肌组织未出现明显差异在(d s p b^{-1-})与野生型斑马鱼之间，心肌结构并无显著差异。其分布心肌细胞的结构似乎保持完好，未观察到纤维化替代的迹象。脂肪细胞浸润（通常与晚期心肌病相关）在两组老年个体中均存在，且定位和范围相似。这与其他 dspb 突变模型的研究结果形成对比，后者在后期出现心肌细胞稀疏、血管扩张和明显的脂肪生成。

甲苯胺蓝染色显示，(d s p b^{-1-}) 小鼠心脏的细胞核密度增加、细胞组成发生改变，这与非心肌细胞的增殖一致。这可能反映了早期的纤维化或炎症性重构，与人类 DSP 型心肌病相符——据报道，高达 20% 的患者会出现类似心肌炎的发作，而这些发作与疾病进展和心律失常相关。

野生型心肌细胞呈现出排列整齐的肌节，Z线边界清晰，I带结构完整。相比之下，dspb突变体表现出严重的肌节紊乱，Z线信号增强且I带显著缺失，这提示肌原纤维存在不稳定性。Song等人的一项研究也在携带Wnt信号通路负调控因子Pr72突变的斑马鱼模型中得到了类似结果，该模型同样出现肌节结构破坏和I带消失的现象。此外，Celeghin的桥粒斑蛋白模型中也观察到桥粒结构紊乱和定位异常。野生型心肌细胞的闰盘紧密贴合，桥粒和缝隙连接结构完整。然而，(d s p b^{-1-})突变体的闰盘出现破坏，表现为细胞间隙增宽、桥粒碎裂，这与细胞间黏附功能缺陷及连接完整性受损的情况相符。这些研究结果与Celeghin等人的报道一致，后者在桥粒斑蛋白缺陷的斑马鱼中也观察到类似的细胞间隙增宽现象。值得注意的是，Basso等人对致心律失常性心肌病患者样本进行的超微结构分析也证实了这一表型，研究发现与对照组相比，患者的黏着带间隙扩大。此外，在野生型样本中，线粒体分布均匀，通常环绕肌节。而在(d s p b^{-1-})样本中，线粒体呈簇状聚集在结构紊乱的肌节周围，这可能是对能量需求波动的一种适应性反应。

考虑到运动在其中的争议性作用在临床背景下，我们评估了其对成年个体的影响斑马鱼。经过一个月的适度训练，多项心脏功能参数部分恢复至野生型水平。类似地，耐力测试显示该训练的(d s p b^{-/-})突变体表现出了更好的穿孔性与未训练的突变体相比，其表现更佳，活动模式接近野生型鱼类。这些发现表明，适度运动或许能同时增强心脏功能和耐力。相比之下，未训练的突变体活动能力下降，逆水游动的能力也受损，大部分时间都待在水槽的下游端。值得注意的是，无论是长期训练还是高强度训练后，两组的存活率均保持在100%。

据我们所知，此前尚未有研究在长期运动后的成年斑马鱼DSP缺陷模型中评估心脏功能。虽然已有一项研究通过增加培养基粘度探究了轻度训练对斑马鱼幼鱼的影响，但该方案导致训练组的死亡率高于未训练组。因此，我们的研究提供了新的证据，表明适度运动可能为成年桥粒心肌病模型带来功能益处，且不会增加死亡风险。

近年来，已经开发了三种主要的斑马鱼dsp缺乏模型，每种模型都对desmoplakin在心脏发育和疾病中的作用提供了互补的见解。Giuliodori等人（2018年）基于吗啉的模型揭示了早期结构和功能心脏缺陷，而塞莱金等人（2023年）和我们自己的 (d s p b^{-/-}) 突变体品系重现了独特的特征以纵向研究的方式探讨桥粒斑蛋白心肌病。这些模型共同凸显了斑马鱼在研究遗传性心肌病中桥粒功能障碍方面的多功能性与转化价值。

我们的(d s p b^{-/-})模型具有几个显著的优势，包括从幼体早期到成年的纵向特征分析，以及对心脏功能、分子信号传导、结构重塑、存活率和运动反应的全面评估。对比时间线（表S6）总结了各模型的实验设计、生命阶段及所评估的表型结果，阐明了斑马鱼在其整个生命周期中从分子、结构和功能层面探究疾病机制的能力。

然而，也应承认存在一些局限性，包括对纤维化、心律失常等部分人类表型的复制不完全，斑马鱼与人类心脏在心脏生理学上的差异（两腔心脏与四腔心脏），以及目前缺乏治疗干预研究。尽管存在这些局限性，我们的研究结果结合以往的斑马鱼模型，凸显了斑马鱼作为一种强大的体内平台，在桥粒性心肌病的机制研究和治疗策略临床前评估方面的应用价值。

本研究的人体试验也存在若干局限性。与DSP相关的心肌病病例较为罕见，导致样本量相对较小，这限制了多变量分析的复杂度，也无法基于运动类型、家族聚集性，或针对诊断年龄和无事件生存期进行详细的基因型分层，开展可靠的亚组分析。有观点认为，体力活动较多的个体可能更容易获得医疗检查机会，这或许会对诊断年龄产生影响。但在本研究期间，我们所在地区并未针对运动员设置赛前筛查项目，因此无法用这一因素解释受试者在心电图或超声心动图评估机会上的差异。

结论

我们的 (d s p b^{-1-}）斑马鱼模型表现出一种特征性的ND-LVC表型包括基线收缩功能障碍、每搏输出量减少以及代偿性心动过速。心室大小也有所减小，这反映出心脏生长受损且收缩储备有限。该表型会随年龄变化，在斑马鱼整个生命周期中呈现动态进展，成年个体通过适度体育锻炼可使其部分恢复正常，同时这也能增强突变体的耐力。在结构层面，桥粒斑蛋白缺乏会导致肌节紊乱和连接重塑，这为了解DSP相关心肌病的病理生理机制提供了见解。这些变化还伴随着心脏关键信号通路（包括Wnt、转化生长因子-β和Hippo通路）的显著转录改变。

这些研究结果进一步证实，斑马鱼是探索遗传性心肌病患者生活方式干预的基因型特异性反应的强大转化模型，同时也支持在特定DSP变异携带者中，适度运动是一种潜在安全且有益的干预措施。

材料与方法

研究设计与终点指标

根据研究的预设目标，终点被分为主要（预先指定）或亨利指数＞112%被认为提示左心室病理性扩张，因此与扩张型心肌病（DCM）相符，而(values ≤112 %)则提示无扩张。据此，携带(LVEF <50%)和/或(Henry % ≤112 %)阳性晚期钆增强（LGE）的患者被归为非扩张型左心室致密化不全（NDLVC），而携带(Henry %>112%)的患者被归为扩张型心肌病（DCM）。采用(a >5-SD)阈值（高于远端心肌）对心脏磁共振（CMR）上的晚期钆增强（LGE）进行定量分析，并以左心室（LV）质量的百分比表示。左心室质量的(LGE > 15%)或特征性心外膜下/中层分布模式被认为具有临床意义。主要不良心脏事件（MACE）的定义遵循2023年欧洲心脏病学会（ESC）指南，包括持续性室性心律失常、心脏骤停复苏或心源性死亡。所有判定均在对患者体力活动状态不知情的情况下进行。体力活动相关信息为前瞻性收集。通过标准化问卷进行结构化电话访谈以核实数据。要求受试者报告临床诊断前3年中“典型一周”内所进行体力活动的类型、频率和持续时间。仅纳入经估算可使心率升至年龄预测最大心率70%以上的活动。

中等身体活动水平被定义为每周(between >2)且低于5小时，高强度身体活动则被定义为每周超过5小时。为便于对比并确保有足够的样本量，久坐或进行轻度身体活动的人群被归为久坐/轻度运动组，每周进行超过2小时身体活动的人群被归为中等/高强度运动组。运动类型根据EAPC分类标准分为“技巧型”“力量型”“混合型”和“耐力型”。为进行统计分析，将“技巧型”与“力量型”合并为一组，“混合型”与“耐力型”合并为一组。

所有操作均严格遵循《赫尔辛基宣言》及机构伦理标准进行。本研究方案经阿里克萨卡圣母大学医院伦理委员会审查并批准（批准号：2023–1–12HCUVA）。所有参与者在纳入研究前均已签署书面知情同意书。

斑马鱼的饲养与管理

斑马鱼（斑马拟丽鱼）购自斑马鱼国际资源中心，并按照标准流程饲养。水质参数通过自动化系统持续监测。动物处理与实验遵循欧盟2010/63/EU指令以及西班牙皇家法令53/2013制定的规程和准则。相关规程已获西班牙动物实验伦理委员会（CEEA）批准。Arrixaca大学医院-IMIB的图像（批准号A13211204，REGA ES300303340098）。

斑马鱼模型构建与实验设计

一条携带截短突变的斑马鱼 (d s p b^{-/-}) 突变品系利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了变异体（p.T449fs*），以模拟人类DSP p.Q447*变异体。对不同发育阶段的纯合突变体和野生型对照进行了分析。评估了幼鱼和成鱼的心脏功能，并对其结构、分子及存活表型进行了检测。详细的实验步骤见补充材料。

功能、结构与分子分析

通过对幼鱼进行基于显微镜的心率测量、对成年斑马鱼开展超声心动图检查来评估心脏功能。结构表征包含组织学和超微结构分析。采用定量聚合酶链式反应（qPCR）检测桥粒成分及关键信号通路的基因表达。详细的实验步骤见补充材料。

游泳能力测试

为评估游泳表现对突变体表型的影响，将动物置于游泳隧道中（图8d）。游泳表现通过定制的游泳隧道系统进行评估（尺寸：长度61厘米×内径10厘米）。每个隧道均直接与斑马鱼核心设施的水循环系统相连，确保温度（28.0℃±0.5℃）、pH值、电导率、溶解氧以及14:10小时的光暗周期保持一致。所有环境实验变量得到持续监测并记录®使用 Apex Fusion（海王星系统公司产品）进行实验。成年斑马鱼（雌雄混合）每缸五条为一组进行测试nel。野生型和(d s p b^{-1-})动物均被置于在独立的通道中，所有鱼群均在相同条件下完成了相同的流量控制训练方案。鱼群先在低流速（(3 ~cm ~s^{-1})，20%流量强度）下适应24小时。适应期结束后，鱼群接受为期四周、总计一个月的训练方案（图8a和图8c），随后进行持续一小时的最终耐力测试（图8b）。水流由电动泵产生，流量强度通过APEX Fusion软件（https://apexfusion.com/）控制。为期一个月的训练方案包含不同阶段的游泳训练，期间水流速度逐步提升。第一阶段，5分钟内将流速提升至(5.5 ~cm ~s^{-1})（50%强度）。第二阶段，鱼群以(10 ~cm ~s^{-1})（90%强度）进行最大强度游泳。第三阶段，水流逐步降至(5.5 ~cm ~s^{-1})（50%）强度）。在其余时间里，鱼在管道中以基础水流 (3 ~cm ~s^{-1})（20% 强度）游动。

图8 .游泳方案说明。a 为期一个月的中等强度训练计划，包含训练前后的超声心动图检测。b 针对已训练和未训练鱼类的高强度耐力训练方案。c 从第2天到第30天的为期一个月中等强度训练计划，展示了作为运动方案一部分的每日水流强度变化。d 将鱼类分为两组，放入游泳隧道中训练一个月。所有鱼类在每个隧道以5条为一组同时接受相同训练。

耐力训练方案

为评估耐力，对鱼进行了抗性测试，将从未接触过游泳隧道的鱼群作为对照组。该实验包括将(d s p b^{-/-})和对照组的每条鱼（无论是否经过前期训练）分别放置，在流速为 (12 ~cm ~s^{-1})（100%）的最大强度水流下进入游泳隧道持续一小时。将在隧道中接受了一个月游泳训练的组别与此前未进行过游泳训练的组别进行耐力对比（图8b）。

研究人员使用 EthoVision XT 软件（Noldus）对游泳耐力进行了评估。该软件会分析鱼类在隧道中游泳的视频录像，检测运动轨迹，生成热图，并且收集各类与运动相关的数据。该软件测量的参数包括总游动距离（厘米）、游动或静止状态的累计时长（秒）、频率，以及不同运动状态的累计时长。这些参数对实验条件下斑马鱼的耐力能力进行了全面评估。

统计分析

所有统计分析均使用GraphPad Prism 10软件（美国加利福尼亚州圣地亚哥市GraphPad Software公司）完成。除非另有说明，结果以平均值±标准误（SEM）表示。采用Shapiro-Wilk检验进行正态性分析。对于符合正态分布的定量变量，两组间比较采用Student’s t检验，多组间比较采用双向方差分析（ANOVA），随后进行Bonferroni事后检验校正。若不满足正态性假设，则采用Mann-Whitney U检验（两组）或Kruskal-Wallis检验（多组）。生存分析采用Kaplan-Meier估计法和Cox比例风险回归模型。采用对数秩检验（log-rank test）评估生存曲线的组间差异。多变量Cox比例风险模型用于估算校正后的风险比（HRs）及95%置信区间，同时考虑潜在混杂因素。协变量包括性别和身体活动状态（中等/高强度与久坐/轻度）。差异具有统计学意义的判定标准为：p<0.05（）、p<0.01（*）、p<0.001（***）、p<0.0001（），而p>0.05则表示无统计学意义（ns）。