题目：Hnrnpa1 is essential for early zebrafish development and lipid metabolism: insights from a novel zebrafish knockout model

原文链接：http://dx.doi.org/10.3389/fcell.2026.1789605

期刊：frontiers in Cell and Developmental Biology

摘要

RNA结合蛋白具有多种多样的细胞功能，且在疾病中常出现调控异常的情况。尽管它们具备多种细胞功能并与疾病密切相关，但人们对其生理功能的了解仍十分有限。本文介绍了一种新型斑马鱼RNA结合蛋白Hnrnpa1和Hnrnpa3的敲除模型。斑马鱼中Hnrnpa3的缺失并未表现出明显的形态学表型。同样，斑马鱼重复基因hnrnpa1的单突变体hnrnpa1a和hnrnpa1b也未出现可识别的表型，而hnrnpa1a;hnrnpa1b双突变体则具有胚胎致死性。这些双突变体表现出肌肉、血管和发育方面的缺陷，且卵黄延伸部分体积减小。代谢谱分析显示，hnrnpa1a;hnrnpa1b双突变体的脂质代谢发生了显著变化。本研究分析证实了Hnrnpa1参与多种细胞通路，包括脂质代谢的调控，为后续开展与HNRNPA相关疾病的治疗研究奠定了基础。

关键词：异质性核核糖核蛋白A1、代谢、神经退行性疾病、RNA结合蛋白、斑马鱼

引言

异质核核糖核蛋白（HNRNP）是一类具有多样性的蛋白质，其特征是能通过RNA识别基序（RRM）结合核酸。HNRNP在细胞核与细胞质之间穿梭，并通过与其他HNRNP蛋白结合形成多聚体蛋白复合物。它们在核酸代谢中执行多项重要功能，包括剪接、翻译调控以及RNA的转运与稳定性维持（Geuens等人，2016；Krecic与Swanson，1999）。人类HNRNP家族成员最初因结合RNA并形成核糖核蛋白（RNP）复合物的特性被鉴定时，按字母顺序从HNRNPA命名至HNRNPU（Dreyfuss等人，1988；Pinol-Roma等人，1988）。

部分 HNRNP 家族成员的突变与神经退行性疾病相关。例如，HNRNP 家族成员 43 千道尔顿 Tar-DNA 结合蛋白（TARDBP，TDP-43）是 97% 肌萎缩侧索硬化症的病理相关蛋白侧索硬化症（ALS）以及45%的额颞叶痴呆（FTD）病例中存在相关异常（Taylor等人，2016；Ling等人，2013）。TDP-43富含甘氨酸结构域的突变与家族性ALS相关，这进一步证实了其在疾病发生发展中的积极作用（Pesiridis等人，2009）。此外，研究发现HNRNPA3可与家族性ALS和FTD中与C9orf72相关的GGCCCC重复序列结合（Mori等人，2013），且在ALS患者大脑中，该蛋白会从细胞核中清除（Neumann等人，2006）。亲缘关系较近的HNRNPA/B和HNRNPA1蛋白，其富含甘氨酸结构域的致病性突变与多系统蛋白病（MSP）相关，这是一种以肌肉、大脑、运动神经元和骨骼退化为特征的疾病，同时也与少数家族性ALS病例相关（Kim等人，2013）。TDP-43、HNRNPA1和HNRNPA3具有相同的整体蛋白结构域组成，均包含两个RRM结构域和一个富含甘氨酸的结构域，它们可通过该结构域与彼此及其他RNA结合蛋白发生物理相互作用（Buratti等人，2005；D'Ambrogio等人，2009）。研究表明，这些蛋白会发生相分离（Molliex等人，2015），形成液滴，进而构建无膜的细胞区室。这些特征表明，TDP-43和HNRNPA蛋白因定位错误、异常相分离和聚集导致的功能异常，是ALS、FTD和MSP疾病进展的重要诱因（Alberti和Dormann，2019）。

尽管 HNRNP 家族成员与疾病存在明确关联，但其生理功能仍知之甚少。本研究旨在阐明与肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关的 HNRNP 家族成员的生理功能，以识别可能参与疾病发生的调控异常的下游靶点。我们此前已构建 TDP-43 敲除（KO）斑马鱼模型，本文则报道 Hnrpna 敲除斑马鱼的构建与分析结果。纯合的 hnrnpa1a、hnrnpa1b 及 hnrnpa3 单基因敲除斑马鱼可存活且具有繁殖能力。然而，hnrnpa1a−/−;/hnrnpa1b−/− 双基因敲除斑马鱼存在胚胎致死性，并表现出多种早期表型。其中最早且最显著的表型之一是幼虫卵黄延伸区的卵黄含量大幅减少。我们推测这一现象源于脂质代谢紊乱，而该紊乱可能会导致携带 HNRNPA1 突变的个体出现神经退行性病变。

结果

斑马鱼中的HNRNPA家族

在人类中，HNRNPA 亚家族由 HNRNPA0、HNRNPA1、HNRNPA1L2、HNRNPA2B2 和 HNRNPA3 组成（补充图 1A）。HNRNPA0 在斑马鱼中有 3 个直向同源物，分别命名为 Hnrnpa0a、Hnrnpa0b 和 Hnrnpa0l。在斑马鱼中，hnrnpa1a 和 hnrnpa1b 基因与人类 Hnrnpa1 基因座存在同线性关系（补充图 1A、B）（Postlethwait 等人，1998）。在斑马鱼中，未发现人类 HNRNPAB1 基因的直向同源物，且存在一个单独的 HNRNPA3 直向同源物，命名为 Hnrnpa3（补充图 1B）。总体而言，HNRNPA 亚家族在斑马鱼中高度保守（图 1A；补充图 1A）。

图1 .Hnrnpa1a、Hnrnpa1b和Hnrnpa3功能缺失等位基因的生成。(A) 斑马鱼Hnrnpa1a（青绿色）、Hnrnpa1b（蓝色）和Hnrnpa3（绿色）的结构域示意图。RRM = RNA识别结构域；甘氨酸富集区 = 富含甘氨酸的结构域。白色方框代表核定位信号。数字表示对应蛋白质的首个和最后一个氨基酸。(B) hnrnpa1a、hnrnpa1b和hnrnpa3基因座的基因组结构示意图。红色箭头头表示gRNA的结合位点。hnrnpa3外显子3中的符号代表hnrnpasa16864突变的位置。(C) 已生成等位基因的概览及等位基因命名。上方为参考野生型蛋白质序列。移码突变后生成的新氨基酸以红色标注。星号代表终止密码子。序列末端的数字表示对应蛋白质的预测长度。(D) 由于缺乏Hnrnpa1a特异性抗体，通过检测hnrnpa1amde14−/−突变体中的hnrnpa1a mRNA水平来评估其表达。hnrnpa1amde14−/−突变体大脑中hnrnpa1a mRNA水平显著降低。(* (< 0.02) 0.02) n = 4。误差线表示均值标准误。以rflp13a和elf1a2为参照进行标准化。采用t检验。(E) 利用Hnrnpa1b和Hnrnpa3特异性抗体进行的蛋白质印迹分析。Hnrnpa1b特异性条带在脑组织中未出现图1（续）样本取自hnrnpa1bmde13−/−和hnrnpa1b mde14−/−突变体，而在相应hnrnpa1b+/+同窝幼鼠的脑组织样本中检测到了Hnrnpa1b特异性信号。在所有取自hnrnpa3sa16864−/−突变体的脑组织样本中均未出现Hnrnpa3特异性条带，而在hnrnpa3+/+同窝幼鼠的脑组织样本中观察到了Hnrnpa3特异性信号（展示的数据来自两次生物学重复）。两种蛋白印迹实验中均以钙连蛋白作为上样对照。

hnrnpa1a、hnrnpa1b 与 hnrnpa3 功能缺失突变体的构建

为了在斑马鱼中生成 hnrnpa1a、hnrnpa1b 和 hnrnpa3 的功能缺失（loss-of-function, lof）等位基因，我们设计了靶向起始密码子附近第一个外显子的gRNA，以及另一个靶向下游外显子的gRNA（图1B）。选择gRNA靶位点附近的限制性酶切位点用于诱导突变的鉴定（补充图1C-E）。gRNA靶位点附近的PCR扩增子中限制性酶切位点的缺失表明基因组编辑事件为阳性。每个基因至少选择2个具有预测阅读框移位和提前终止密码子的等位基因用于进一步分析（图1C）。对于hnrnpa3基因座，我们额外分析了由惠康基金会桑格研究所斑马鱼诱变项目先前生成的(hnmpa3 3^{sal6864 })等位基因（Kettleborough等人，2013）。由于尚无针对Hnrnpa1a的特异性抗体，我们进行了qRT-PCR分析，发现hnrnpa1a mde14突变体中hnrnpa1a mRNA的含量显著降低，表明该等位基因为功能缺失型等位基因（图1D）。我们进一步通过蛋白质印迹分析证实，在相应的突变体中无法检测到Hnrnpa1b和Hnrnpa3蛋白，且hnrnpa1b mde15、(hnrmpal b^{mdele })和(hnrnpa 3^{sa16864 })均为功能缺失型等位基因（图1E）。

单突变体无明显表型

培育至纯合子后，我们未观察到任何明显的幼体形态学表型（图2A）。所有纯合子斑马鱼均能存活至成年且具有繁殖能力（n=((n>10))）。我们接下来对肌肉和运动神经元进行了研究，此前已有研究表明，Tardbp; Tardbpl双敲除突变体中这两种结构会受到影响（Schmid等人，2013）。

通过肌肉特异性抗体的免疫组织化学染色观察发现，纯合的hnrnpa1a、hnrnpa1b和hnrnpa3突变体斑马鱼幼虫具有野生型的肌肉形态（补充图S2A）。受精后30小时（hpf），尾部初级（CaP）运动神经元的轴突生长未出现长度缩短或分支异常（补充图S2B、C）。我们推测，在斑马鱼中，Hnrnpa1a和Hnrnpa1b可能存在功能冗余或相互交叉调控，从而掩盖了潜在的功能缺失表型，这与此前关于Tardbp和Tardbpl的研究报道一致（Schmid等人，2013；Hewamadduma等人，2013）。具体而言，我们发现Hnrnpa1a突变体中hnrnpa1b mRNA的表达水平上调，且Hnrnpa1a突变体中Hnrnpa1b蛋白的表达量也有所升高，而hnrnpa3突变体中未出现此现象（图2B、C）。这些结果表明，Hnrnpa1a和Hnrnpa1b参与了维持野生型水平稳态的反馈调控机制，在另一旁系同源基因缺失时会发生上调表达。

图2. Hnrnpa1a和Hnrnpa1b单一KO鱼由于功能补偿而不显示表型。（A）hnrnpa−/−单一突变体没有显示明显的形态表型。5 dpf旧野生型、hnrnpa1a−/−、hnrnpa1b−/−和hnrnpa3−/−突变体的图像。侧视图。左前。图像是用Axio Scope A1拍摄的。（B）Hnrnpa1a和Hnrnpa1b但不是Hnrnpa3补偿彼此的损失。hnrnpa1a的mRNA水平在hnrnpa1b−/−（(****p<0.0001)：(n=4)和hnmpa3（(***p<0.0001)i(n=4))突变体的大脑中显著上调。归一化为rflp13a和elfia2。误差条表示SEM。未配对的t检验。使用相同的cDNA复制了两次qRT-PCR结果。（C）hnrnpa1a−/−突变体的大脑中Hnrnpa1b水平显著上调（(Ihnrnpala)： 1(**p<0.001)L(n=8)：(hnrnpa1a)：(***p<0.0001)(n=8)，与野生型兄弟姐妹相比，hnrnpa3/突变体的大脑中Hnrnpa3水平没有变化（p>0.69，(n=4)0.69，n=4）。与野生型兄弟姐妹相比，hnrnpa1a−/−突变体（(<p>1.1)(n=8)和hnrnpab突变体（(<p>0.64).(n=8))0.64，n=8）的大脑中Hnrnpa3水平没有变化。学生的t检验。误差条表明S.E.M.Calnexin作为加载对照。统计显著性定义为p(p<0.05)0.05.n.s，不显著。

Hnrnpa1a/1b 双突变体为胚胎致死型

为了揭示斑马鱼中 Hnrnpa1 可能存在的表型，我们分析了双纯合子 hnrnpa1a−/−；hnrnpa1b−/− 胚胎（下文简称 hnrnpa1 双敲除（dKO）胚胎）。使用可与 Hnrnpa1a 和 Hnrnpa1b 发生交叉反应的抗体进行蛋白质印迹分析，在 hnrnpa1a−/− 成年单突变体大脑中检测到清晰的信号，而在 hnrnpa1 双敲除个体中则无此信号，这表明两个等位基因均未检测到可检测的蛋白质水平（图 3A）。首个可观察到的形态学表型是卵黄延伸在受精后24小时左右出现特征性的进行性变薄，且该现象会愈发明显随着时间的推移（图3B，4A）。肌肉异常在30 hpf左右明显（图3C）。CaP运动神经元的生长轴突在30 hpf时长度严重减少，表明发育迟缓或生长缺陷（图3D）。此外，hnrnpa1 dKO在30 hpf时细胞死亡增加，如标记凋亡和坏死细胞的嘧啶橙染色增加所示（图3E）。此外，我们观察到30和46 hpf时由于错误的节段间血管（ISV）导致心包血流受损（补充图3A）。为了直接评估hnrnpa1 dKO是否发育延迟，我们测量了30和48 hpf时的头干角度（补充图3C，D）。这个角度是随着胚胎的发育，其角度逐渐变小，且可作为斑马鱼早期胚胎分期的直接测量指标。在两个时间点，我们均观察到其角度小于表型正常的野生型同胞，这表明发育迟缓（补充图3C、D）。hnrnpa1 双敲除斑马鱼色素沉着出现延迟也证实了这一点（图4A）。hnrnpa1 双敲除斑马鱼在幼体早期阶段死亡，无法发育至成体阶段。

图3. Hnrnpa1双敲除（dKO）斑马鱼表现出脂质、肌肉、运动神经元表型并伴随细胞死亡增加**（A）HA1-CT（VM）AN351抗体可检测Hnrnpa1a和Hnrnpa1b，在野生型、hnrnpa1a⁻/⁻和hnrnpa1b⁻/⁻斑马鱼的大脑中，可检测到Hnrnpa1a和Hnrnpa1b预期大小的条带。在30小时胚胎期（hpf）的hnrnpa1双敲除胚胎中，未检测到预期大小的条带，进一步证实Hnrnpa1蛋白完全缺失（曝光过度的蛋白印迹以显示泳道5中无条带）。微管蛋白作为上样对照。（B）48小时胚胎期后，hnrnpa1双敲除胚胎表现出血流减少和卵黄延伸部变薄（箭头所示）。（C）用α-辅肌动蛋白特异性抗体（绿色）对30小时胚胎期的野生型和hnrnpa1双敲除胚胎进行抗体染色；用肌球蛋白特异性抗体ZE-BO-1F4（绿色）对30小时胚胎期的野生型和hnrnpa1双敲除胚胎进行抗体染色。图像通过共聚焦激光扫描显微镜在488纳米激光下拍摄，侧视图，前方朝左，比例尺为25微米。（D）30小时胚胎期野生型与hnrnpa1双敲除突变体经znp-1抗体全标本免疫荧光（IF）染色的示例，展示了卵黄延伸末端前方的四条CaP轴突。图像通过转盘式活细胞成像系统拍摄，为最大强度投影图，侧视图，前方朝左，比例尺：25微米。对30小时胚胎期野生型（橙色）和hnrnpa1敲除（红色）斑马鱼CaP轴突长度的比较显示，hnrnpa1双敲除斑马鱼的CaP轴突生长减少。误差棒表示均值标准误（S.E.M.），采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）及Bonferroni事后检验。（E）hnrnpa1双敲除斑马鱼脊髓中细胞死亡增加。野生型和hnrnpa1双敲除斑马鱼经吖啶橙（绿色）染色的图像，吖啶橙可被凋亡和坏死细胞摄取（仅显示躯干部分脊髓），侧视图，前方朝左，为10张0.9微米图像堆叠的最大强度投影。图像通过激光扫描共聚焦显微镜在488纳米激光下拍摄。对野生型和hnrnpa1双敲除斑马鱼脊髓内吖啶橙阳性细胞的定量分析显示，hnrnpa1双敲除斑马鱼中吖啶橙阳性细胞数量显著增加。误差棒表示均值标准误（S.E.M.）；每个实验使用的胚胎数；采用Student's t检验。比例尺为40微米。

Hnrnpa1 基因敲除幼虫的脂质分布改变

在24小时受精后（hpf），首先可观察到卵黄延伸区的变细，具体表现为卵黄与卵黄延伸区（卵黄的尾部延伸部分）交界处出现明显的变细（图4A）。随着时间推移，卵黄延伸区逐渐变细，到72小时受精后几乎完全消失。对卵黄延伸区二维面积的定量分析（图4B）显示，30小时受精后的hnrnpa1双基因敲除（dKO）突变体中，该区域的面积显著减小。卵黄主要由脂质和蛋白质组成，为发育中的胚胎提供能量。为评估潜在的脂质表型，我们使用油红O（ORO）对中性脂质进行染色。野生型胚胎的卵黄、卵黄延伸区和头部均可检测到染色信号，这一脂质染色模式与既往报道的油红O染色结果一致（Fraher等人，2015）。相比之下，hnrnpa1双基因敲除胚胎的卵黄延伸区脂质标记水平显著降低；而胚胎体内则观察到更多的脂质染色（图4C），这表明其脂质转运和/或代谢过程受损。

图4. Hnrnpa1双敲除胚胎存在脂质代谢缺陷。(A) hnrnpa1双敲除胚胎的卵黄延伸区变薄。展示了野生型（上图）和hnrnpa1双敲除（下图）胚胎在24小时胚胎期、30小时胚胎期和48小时胚胎期的图像。24小时胚胎期时，hnrnpa1双敲除胚胎除卵黄延伸区出现小凸起（箭头所示）外，与野生型同胞胚胎几乎无明显差异。30小时胚胎期后，hnrnpa1双敲除胚胎的卵黄延伸区开始变薄，该表型随时间逐渐加重，48小时胚胎期至72小时胚胎期时卵黄延伸区严重缩短。侧视图，左侧为前端。图像通过Axio Scope A1显微镜拍摄。(B) 示意图展示了30小时胚胎期卵黄延伸区的测量区域（红色标注），该区域用于定量分析。对30小时胚胎期卵黄延伸区二维面积的定量分析显示，与野生型相比，hnrnpa1双敲除胚胎的卵黄延伸区面积显著减小。学生t检验 (In =13)：(+++p<0.0001))。误差棒代表均值标准误。(C) 油红O染色显示头部结构、卵黄、卵黄延伸区以及脊髓周围结构。30小时胚胎期的hnrnpa1双敲除胚胎的卵黄延伸区中性脂质含量减少。此外，hnrnpa1双敲除胚胎的躯干部位中性脂质摄取量增加（箭头所示）。侧视图，左侧为前端。图像通过Axio Scope A1显微镜拍摄。

Hnrnpa1基因的缺失会影响与脂质代谢相关基因的表达

我们接下来探究了hnrnpa1双敲除（dKO）模型中受影响的分子通路与基因，旨在鉴定导致卵黄和脂质表型的关键调控因子。对30小时受精后（hpf）的hnrnpa1双敲除斑马鱼进行批量RNA测序，随后使用DESeq2软件（Love等人，2014年）进行差异表达基因（DEG）分析，共鉴定出614个差异调控基因，其表达变化倍数超过两倍，校正后p值阈值设为0.001（log2倍变化≤-1或>1且p<0.001）。其中315个基因表达下调，299个基因表达上调（补充表S1）。这些基因中，排名前40的基因（log2倍变化≤-1或>1）以热图形式展示（图5）。通过STRING数据库并采用预设默认参数进行蛋白质-蛋白质相互作用分析和基因集富集分析（Szklarczyk等人，2019年），结果显示“细胞周期”为核心富集簇，同时还涉及p53信号通路、叉头框O（foxo）信号通路、嘌呤代谢、Notch信号通路等（补充图4；补充表S2）。这一发现与HNRNPA在癌症中的作用（Roy等人，2017年）一致，也与双敲除斑马鱼发育延迟的表型相符。

我们接下来通过qRT-PCR选择一些自上而下的命中来验证我们的测序命中。从列表中下调的转录本，载脂蛋白Da1（apoda.1）和跨膜糖蛋白NMB（gpnmb）也被qRT-PCR强烈下调（图5B）。从上调的基因列表中，我们验证了各种细胞周期相关命中（ccne1，cdkn1a，cdkn2a/b，gadd45aa，p53，rbl2），这些命中都被显著上调，除了ccne1（补充图4）。重要的是，我们还观察到hnrnpa1a转录本的4.3倍下调和hnrnpa1b转录本的2.2倍下调，证实了我们之前的RT-PCR结果，即突变等位基因的mRNA显著降低。突变的转录本并不完全缺席，因为突变的mRNA仍然被转录，并且很可能仅通过无意义介导的mRNA衰变部分降解。这些发现进一步验证了我们的RNA测序数据集。

重要的是，我们发现了脂质转运蛋白的显著失调。除了apoda.1，低密度脂蛋白受体适配器蛋白1b和4a（ldlpap1b；ldlPap4a）和脂肪酸结合蛋白4和11b（Fabp7a；Fabp11b）明显失调（ldlpap1b2倍；ldlPap4a 2.2倍；Fabp7a 5.5倍；Fabp11b2.6倍）。这些命中与Hnrnpa1 dKO中的脂质转运表型一致，有助于改变脂质分布和减少蛋黄延伸表型。

图5 .与野生型相比，hnrnpa1 双敲除（dKO）中异常调控转录本的热图及实时定量聚合酶链式反应（qRT）分析。(A) hnrnpa1 双敲除中前20个上调和下调转录本的热图（log2倍变化≤-1或≥1且调整后P值≤0.001）。框选基因突出了hnrnpa1 双敲除中与脂质代谢相关的异常调控基因。(B) 野生型和hnrnpa1 双敲除中apoda.1和gpnmb的实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）结果。学生t检验（((n=13)：(+++p<0.0001)）。误差线代表均值标准误（S.E.M）

代谢谱确定了hnrnpa1 dKO中突出的脂质变化

为了确定hnrnpa1 dKO是否患有与脂质分布改变相关的代谢紊乱，我们进行了有针对性的代谢组学分析，并比较了野生型和hnrnpa1 dKO中180种代谢物的小组（补充表S3,4）。50种顶级错误调节代谢物如图6A所示。虽然氨基酸和酰基肉碱（C4、C18、C14:2、C18:1等）减少很少，但我们注意到主要是glycerophospholipids和少数氨基酸明显增加。此外，己糖（包括葡萄糖）的总和也增加了。重要的是，短链酰基肉碱与游离肉碱（C2+3）/C0）和乙酰肉碱与游离肉碱C2/C0的比率显著降低，表明β-氧化减少（补充图5）。总之，Hnrnpa1的损失导致β-氧化减少，这与胚胎中脂质的积累和积累一致，它们不能代谢为ATP。

图6. hnrnpa1 dKO的代谢分析。hnrnpa1 dKO中前50种上调和下调代谢物的热图。红框突出显示hnrnpa1 dKO中的H1代谢物。

讨论

在人类中，HNRNPA亚组分为HNRNPA1、HNRNPA1/B2、HNRNPA3和HNRNPA0（Geuens et al.，2016）。该亚组仅在斑马鱼中部分保守。HNRNPA1复制到Hnrnpa1a和Hnrnpa1b，在斑马鱼中没有发现HNRNPA1/B2的同源序列。我们假设复制的Hnrnpa1基因要么接管缺失同源序列的功能，要么HNRNPA1/B2仅在哺乳动物中需要，但在硬骨鱼等低级脊椎动物中不需要。

尽管HNRNPA1是细胞中最丰富的蛋白质之一（Dreyfuss et al.，1993； Beck et al.，2011），但对其体内功能的了解仍然相对较少。在小鼠中，由于严重的肌肉问题，KO导致早期胚胎致死（Liu et al.，2017）。同一项研究报告了严重的血管表型，心脏水肿和背轴异常以及斑马鱼中hnrnpa1bMO击倒后的胚胎致死性。相比之下，我们对遗传突变体的分析表明，由于另一个paralog的功能补偿，仅损失一个paralog hnrnpa1a和hnrnpa1b不显示任何形态表型。潜在地，本研究中使用的MO可以击倒斑马鱼同源物或突变体，并且KO表型不相同，因为MO KD不能通过转录适应来补偿，并引起表型，而蛋白质功能的丧失可能在KO中得到补偿（Rossi等人，2015年；Kontarakis和Stainier，2020年；Sztal和Stainier，2020年）。hnrnpa1a和hnrnpa1b的RNA转录本在我们的突变体，与由突变引起的无意义介导的RNA衰变一致，这是转录适应的先决条件（Rossi等人，2015；Kontarakis和Stainier，2020；Sztal和Stainier，2020）。

与哺乳动物HNRNPA1剪接和RNA调节一致，据报道，斑马鱼Hnrnpa1b在早期发育过程中通过调节pri-mir-430调节母体向合子的转变（Despic等人，2017年），并在斑马鱼早期发育过程中与核糖体蛋白Rpl22合作进行剪接调节（Zhang等人，2017年）。这些发现突出了其在跨脊椎动物剪接调节中的重要和保守作用（朱等人，2001年）。我们进一步表明，Hnrnpa3功能的丧失不会导致斑马鱼的形态表型，并且没有上调，从而可能通过hnrnpa1a和hnrnpa1b进行补偿。虽然Hnrnpa1和Tardbp/Tardbpl（也是异源核RNA结合蛋白类的成员）具有非常戏剧性的胚胎和幼虫表型，并且在斑马鱼中具有胚胎致死性，但令人惊讶的是，Hnrnp3在斑马鱼中没有明显的形态表型在小鼠中，主要异构体HnrnpA3a的KO在出生后不久会导致致死性，并且已被证明对神经元祖细胞分裂很重要（Ou et al.，2020）。未来对斑马鱼hnrnpa3突变体的RNA测序分析将阐明其他RNA结合蛋白是否能够补偿，KO表型是否微妙，或者Hnrnpa3是否对斑马鱼的生存非必需。

Hnrnpa1 dKO斑马鱼的RNA测序和通路分析揭示了其在细胞周期调节中的突出作用。在人类中，HNRNPA1先前已被证明在人类中的多种不同肿瘤中高度上调，包括肺癌、卵巢癌和结肠癌（Liu et al.，2016； Rodriguez-A et al.，2017；Ushigome et al.，2005；Nishikawa et al.，2019）。因此，细胞周期的调节是斑马鱼和人类HNRNPA1的保守特征。在人类中传达肿瘤进展的机制包括丙酮酸激酶等关键代谢基因的剪接改变（Chen et al.，2010）、miRNAs的调节（Rodriguez-A et al.，2017）和恶性转化的调节（Roy et al.，2017）。丙酮酸激酶作为促进人类肿瘤形成的主要因素之一的剪接在斑马鱼Hnrnpa1 dKO中没有改变（数据未显示），这表明不同的细胞周期调节靶标（Roy等人，2017）。

最近，HNRNPA1 及 HNRNPA2/B1 低复杂度结构域的突变与神经退行性疾病多系统蛋白病（MSP）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关（Kim 等人，2013；Taylor，2015）。这些突变会增加蛋白质在疾病状态下的聚集倾向，并促进其相分离形成应激颗粒等无膜细胞器（Kim 等人，2013；Molliex 等人，2015）。这种改变无膜细胞器动力学的变化被认为会损害细胞应对应激源的能力并由此促进神经退行性病变（Kim 等人，2013；Molliex 等人，2015；Taylor，2015；Purice 与 Taylor，2018）。与这一假说一致，许多其他蛋白质（如密切相关的 TDP-43）在其低复杂度结构域发生疾病相关突变后，同样表现出聚集倾向增强的特征。尽管二者存在诸多相似之处，但斑马鱼中 TDP-43 与 Hnrnpa1 的缺失会导致显著的表型差异以及不同的 RNA 测序图谱（数据未展示）。斑马鱼中 Tardbp 与 Tardbpl 的缺失也不会出现 Hnrnpa1 双敲除（dKO）小鼠所呈现的卵黄延伸和脂质积累表型（Schmid 等人，2013），这表明二者具有不同的细胞功能。

本研究发现，斑马鱼中与年龄相关且具有神经保护作用的因子ApoD会因Hnrnpa1功能缺失而下调。ApoD属于亲脂蛋白家族，能够结合疏水性小分子，已被证实其在脂质代谢、脂质转运中发挥重要作用，并具有神经保护功能（Rassart等人，2020）。ApoD在衰老过程中会显著上调，可保护细胞免受氧化应激损伤（Dassati等人，2014；Martinez-Pinilla等人，2015）。ApoD基因敲除小鼠会出现皮质神经元丢失的情况，这凸显了其在神经元存活中的重要性（Dassati等人，2014）。在阿尔茨海默病、精神分裂症和中风等多种神经退行性疾病中，ApoD表达会上调（Dassati等人，2014；Bhatia等人，2019），但在包涵体肌病（Hamann等人，2017）、散发性肌萎缩侧索硬化症（Ranjan等人，2016）等疾病中则表达下调。在Hnrnpa1双基因敲除斑马鱼中，我们观察到卵黄向胚胎的脂质转运增加，这些脂质会在胚胎中积累，因为无法通过β-氧化进一步代谢。我们推测，ApoD表达下调会导致胚胎中部分脂肪酸无法通过β-氧化供能，这是因为我们检测到部分酰基肉碱（C4、C18、C14:2、C18:1等）水平降低，而这类物质是脂肪酸通过线粒体膜进行β-氧化所必需的，同时胚胎中甘油磷脂含量也有所升高。

此外，核内 HNRNPA1 的缺失以及 ApoD 的下调会削弱细胞对氧化应激的反应，破坏脂质运输，从而可能在 HNRNPA1 聚集相关疾病中加速神经元细胞死亡。因此，恢复肌萎缩侧索硬化症（ALS）和肌萎缩性侧索硬化症伴进行性肌阵挛（MSP）患者体内的 ApoD 水平，或许能为提高运动神经元的存活率提供一种有价值的治疗策略。

总之，通过在斑马鱼中构建Hnrnpa1和Hnrnpa3功能丧失模型，并对Hnrnpa1双敲除（dKO）表型进行详细的分子和代谢组学分析，研究人员发现脂质代谢严重紊乱以及ApoD表达下调，这一发现对神经退行性疾病的研究具有潜在意义。